專利名稱：：HGFβ鏈變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)和生長因子調(diào)節(jié)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及HGF/c-met信號途徑的調(diào)節(jié)劑，和所述調(diào)節(jié)劑的用途。背景肝細胞生長因子(HGF),也稱為散播因子(scatterfactor,SF),是Met(Bottaroetal.，1991)的配體，Met是由c-m"原癌基因(Cooperetal.,1984a&b)編碼的受體酪氨酸激酶。結(jié)合Met的HGF誘導(dǎo)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化，胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化引起復(fù)雜的胞內(nèi)途徑復(fù)合物系列(set)的活化，其引發(fā)許多細胞類型中的細胞生長、分化和遷移；幾篇最近發(fā)表的綜述提供了全面的概述(Birchmeieretal.,2003;TrusolinoandComoglio,2002;Mauliketal.,2002)。除了其在胚胎發(fā)育和組織再生中固有的重要性，HGF/Met信號途徑也已涉及侵襲性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中并因而代表感興趣的治療學(xué)輩巴標(Birchmeieretal.,2003;trusolinoandComoglio,2002;Danilkovitch陽MiagkovaandZbar,2002;Maetal"2003)。HGF屬于纖溶酶原相關(guān)生長因子家族，包括含有N-末端指狀結(jié)構(gòu)域(N)和四個Kringle(Kl-K4)結(jié)構(gòu)域的69kDaa-鏈，和與來自ClanPA(S)/FamilySl的糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Nakamuraetal.,1989;Donateetal"1994;Rawlingsetal"2002)具有高度相似性的34kDaP-鏈。像纖溶酶原和其它絲氨酸蛋白酶酶原一樣，HGF以單鏈前體形式(scHGF)分泌。scHGF結(jié)合細胞表面上或胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，如syndecan-l(Derkseneta1.，2002)。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結(jié)合N結(jié)構(gòu)域(Hartmannetal.,1998),其也對高親和力Met結(jié)合位于Kl中的氨基酸有促進作用(Lokkeretal.,199勺。雖然scHGF能夠以高親和力結(jié)合Met,但是它不能激活受體(Lokkeretal.，1992;Hartmannetal.,1992)。HGF信號活性的獲得依scHGF在Arg494-Va1495的蛋白水解裂解(活化)而定，所述蛋白水解裂解引起成熟HGF即二硫4定連接的ot/p異二聚體的形成(Lokkeretal.,1992;Hartmannetal.，1992;Naldinietal.,1992)。HGF的蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域(HGFp陽鏈)缺乏催化活性，因為它缺少發(fā)現(xiàn)于所有絲氨酸蛋白酶中的所需的Asp[cl02]-His[c57]-Ser[c195](在整個括號中的標準糜蛋白酶原編號)催化三聯(lián)體(peronaandCraik,1995;Hedstrom,2002),具有Gln534[c57]和Tyr673[cl95]。由于其在調(diào)節(jié)HGF活性中的重要性，該方法必須由HGF轉(zhuǎn)化酶及其相應(yīng)的生理學(xué)抑制劑所嚴格控制。scHGF活化由包括肝細胞生長因子活化劑(HGFA)(Miyazawaetal.，1993)、基質(zhì)蛋白酶(matriptase)/MT陽SPl(Takeuchietal.1999;Linetal.,1999)、尿激酶型纖溶酶原激活物(Naldinietal.，1992)、因子XIIa(Shimomuraetal.,1995)、因子XIa(Peeketal.，2002)和血漿激肽釋放酶(plasmakallikrein)(Peeketal.,2002)的糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶在體外介導(dǎo)。類似于scHGF,這些蛋白酶作為無活性的前體產(chǎn)生；它們的酶學(xué)活性也由其它的激活性蛋白酶以及Kunitz-和絲酶抑制蛋白(serpin)-型抑制劑所嚴格調(diào)節(jié)。已經(jīng)描述了絲氨酸蛋白酶和它們的激活過程(Donateetal.,1994)。在絲氨酸蛋白酶中，酶原的活化裂解影響所謂的'活化結(jié)構(gòu)域'的構(gòu)象重排，產(chǎn)生正確的活性部位和底物/抑制劑相互作用區(qū)域。所述活化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成命名為[cl40]-、[cl80]-和[c220]-環(huán)的三個表面暴露的環(huán)，并且新形成的N-末端插入到疏水嚢中(HuberandBode,1978)。在同源配體/受體對巨噬細胞刺激蛋白(MSP)/Ron中，絲氨酸蛋白酶樣MSPp-鏈提供受體結(jié)合的主要能量(Wangetal"1997;MillerandLeonard,1998)。這自HGF/Met系統(tǒng)中逆轉(zhuǎn)，在該系統(tǒng)中Met殘基的高親和力受體結(jié)合部位位于HGFa-鏈中(Lokkeretal.，1994;Okigakietal.,1992)。在正常細胞機能中和臨床紊亂的病源學(xué)中，HGF/Met信號軸的重要性表明需要開發(fā)基于調(diào)節(jié)該信號軸的高效治療學(xué)手段。然而，特別是考慮到對HGF-HGF和HGF/Met相互作用的機理了解較少，該途徑的復(fù)雜性已經(jīng)延緩了這方面的進展，并且使開發(fā)一些手段的需求更為突出，這些手段基于對HGF-HGF和HGF/Met相互作用的作用機制的更深了解。下文公開的本發(fā)明滿足了該需求并提供其它益處。本文引用的所有文獻，包括專利申請和出版物均整體加入作為參考。
發(fā)明內(nèi)容肝細胞生長因子(HGF)、纖溶酶原相關(guān)生長因子結(jié)合于其受體酪氨酸激酶Met(本文也稱為C-Met、c-Met或c-met)，其參與發(fā)育、組織再生和侵襲性腫瘤生長。絲氨酸蛋白酶樣HGFp-鏈自身結(jié)合Met。除了結(jié)合Met,還不清楚HGFP鏈中的哪些區(qū)域和具體殘基是影響通過HGF/Met途徑的適當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。我們預(yù)測p鏈內(nèi)的特定區(qū)域/位點對適當(dāng)?shù)腍GF功能活性作出重要貢獻，其中這些貢獻可能涉及或者可能不涉及HGF卩鏈與其關(guān)聯(lián)受體的結(jié)合。本文描述的結(jié)果表明HGFf3鏈N端區(qū)域和/或二聚化區(qū)域中的突變能夠破壞HGF/Met生物學(xué)功能，基本上削弱或基本上不削弱HGF(尤其是HGF(3鏈)與C-Met的結(jié)合。通常但不是必然地，這些突變不涉及野生型HGF的被認為包括'活化結(jié)構(gòu)域，或'活性部位區(qū)域，的位點。本文描述的突變分析提供了設(shè)計許多HGF突變的基礎(chǔ)，所述HGF突變能夠抑制涉及一系列功效的野生型HGF/HGF和HGF/c-met相互作用。本文描述了這些突變的例子。這些突變能夠與野生型HGF竟爭與c-met的結(jié)合，然而顯示影響c-met相關(guān)生物學(xué)功能的能力降低。HGF/c-met軸的完全或?qū)嵸|(zhì)性抑制不是所希望的情形是特別有益的；這是特別要關(guān)注的，因為HGF和c-met在正常細胞和組織中的表達無所不在。這些突變體也能夠用作治療病理學(xué)病癥的有益的治療劑，其中所述病癥中減弱的但非完全缺失的HGF/c-met生物學(xué)活性是需要的。本發(fā)明的方法和組合物至少部分地基于這些發(fā)現(xiàn)，以下更詳細i也描述所述方法和組合物。一個方面，本發(fā)明提供包含HGF突變體的HGF/C-Met拮抗劑分子，所述HGF突變體在HGFP鏈N端區(qū)域和/或HGFP鏈二聚化區(qū)域包含突變。HGF(3鏈N端區(qū)域中的突變可以是削弱HGF(3鏈N-末端插入到HGF結(jié)合嚢(pocket)中的任何突變。在一個實施方案中，所得HGF卩鏈突變體以相對于野生型HGF(3鏈而言減弱的結(jié)合親和力結(jié)合C-Met。在一個實施方案中，所得HGF(3鏈突變體以基本上與野生型HGFp鏈相當(dāng)?shù)挠H和力結(jié)合C-Met。在一個實施方案中，所得包含突變的HGFP鏈的全長HGF以相對于全長野生型HGF而言減弱的結(jié)合親和力結(jié)合C-Met。在一個實施方案中，所得包含突變的HGF卩鏈的全長HGF以與全長野生型HGF基本上相當(dāng)?shù)挠H和力結(jié)合C-Met。在一個實施方案中，突變在Pl，位置內(nèi)或者靠近Pl，位置(即，495[cl6])，其中所述突變產(chǎn)生可裂解的HGF突變體，并且其中所述HGF(3鏈的N-末端未插入到活性部位/結(jié)合嚢中。不能插入到活性部位/結(jié)合嚢中的例子包括但不限于這樣的構(gòu)型，其中所述突變體在(i)疏水性相互作用、和(ii)涉及N-末端與Asp672[c]194的鹽橋形成中任一方面或同時兩方面有缺陷，例如，N-末端帶有突變的情況，例如，帶有正電荷的取代氨基酸殘基或帶有插入的氨基酸殘基。在一個實施方案中，經(jīng)由該突變體的信號減弱。在一個實施方案中，突變處于位點P1'、P2'、P3'和P4'中一HGF(3鏈二聚化結(jié)構(gòu)域中的突變可以是預(yù)期將減弱兩個HGFp鏈之間的接觸以減弱兩個鏈(因此為兩個HGF分子)的二聚化的任何突變。從HGF復(fù)合體的氨基酸結(jié)構(gòu)來看這些突變將是明顯的，例如Kirchhoferetal.，JBiolChem.(2004),279(38):39915-24中所描述的。相關(guān)氨基酸位點包括但不限于本文所描述的那些。在一個實施方案中，所得HGF突變體具有減弱的與另一條HGFP鏈二聚化的能力。在一個實施方案中，HGF(3鏈二聚化區(qū)域中的突變基本上不減弱所得HGF突變體與C-Met的結(jié)合。二聚化結(jié)構(gòu)域指與另一條HGF卩鏈相互作用形成二聚體的HGFP鏈的區(qū)域(例如，在HGF/Met活化復(fù)合體中)。當(dāng)proHGF裂解時，HGFP鏈經(jīng)歷構(gòu)象變化。HGFp鏈N-末端殘基495與殘基Asp672形成鹽橋。在一些實施方案中，HGF|3的二聚化區(qū)域包括相應(yīng)于自HGF(3的大約495至502位殘基、包括Y619、T620、G621的[cl40環(huán)]氨基酸、包括662至665位的[cl80]環(huán)氨基酸、或其混合中的至少一個氨基酸殘基(直至所有氨基酸殘基)，或者基本上由其組成，或者由其組成。在一個實施方案中，所述二聚化結(jié)構(gòu)域包括位于靠近/接近以上列出的一個或多個位點的位置，因此預(yù)測將影響所述的一個或多個位點。例如，在該實施方案中，所述二聚化結(jié)構(gòu)域可以進一步包括位點622和626。一個方面，本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑分子在HGFP鏈N端區(qū)域(Nterminalregion)包含突變，其中所述突變處于位點V495、G498、R502加T503、和/或D672。突變可以是改變HGF卩鏈N端區(qū)域的一級、二級和/或三級結(jié)構(gòu)的任何形式的突變。例如，在一個實施方案中，HGF(3鏈N端區(qū)域中的突變是取代、插入和/或刪除，如V495G、V495A、G498I、G498P、G498V、R502de加T503del、或D672N。在另一個實施方案中，HGF(3鏈N端區(qū)域中的突變是V495的刪除。改變HGF(3鏈N端區(qū)域的一級、二級和/或三級結(jié)構(gòu)的突變也可能處于不在HGF(3鏈N端區(qū)域本身中的氨基酸位點。例如，消除與HGF卩鏈N末端形成鹽橋的D672的突變(例如，D672N)也將預(yù)期改變HGFP鏈N端區(qū)域的一級、二級和/或三級結(jié)構(gòu)。因此，HGF(3鏈N端區(qū)域和HGFp鏈二聚化區(qū)域的突變并不必然互相排斥。例如，如本文所述，以及圖l所例舉的，預(yù)期特定位點的突變將同時影響HGF(3鏈的N端和二聚化結(jié)構(gòu)域。一個方面，本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑分子在HGFp鏈二聚化結(jié)構(gòu)域包含突變，其中所述突變處于位點N497、G498、P500、在或靠近T501和R502、或R502的位置。突變可以是改變HGF(3鏈二聚化區(qū)域的一級、二級和/或三級結(jié)構(gòu)的任何形式的突變。將改變HGF(3鏈二聚化區(qū)域的結(jié)構(gòu)的突變的例子包括向野生型序列中引入帶電的或具有大型側(cè)鏈(例如，體積大的)的殘基的突變，由此帶電的殘基可能引起排斥作用而大型側(cè)鏈可能引起不利的空間相互作用。此外，也可以引入半胱氨酸突變(例如，L622C、I664C、P500C、和N497C)，其可用于被特定的硫醇烷基化試劑如包含馬來酰亞胺和鹵代乙酰(haloacetyl)基團的那些試劑所修飾。在一個實施方案中，HGF卩鏈二聚化區(qū)域中的突變是取代、插入和/或刪除，如N497R或K;G498A或S;P500W、H或E;T501和R502之間的插入(例如，插入R和/或S);或R502del。在一個實施方案中，位點N497的突變不是N497F、A或E。在一個實施方案中，突變處于位點495至503中的一個或多個位置，其中這樣的突變可能改變HGF(3鏈二聚化和/或與受體的結(jié)合。在另一個實施方案中，影響二聚化結(jié)構(gòu)域的突變可以與二聚化結(jié)構(gòu)域外的一個或多個位點中的突變組合，例如，位于或靠近494-495裂解部位的突變。例如，在預(yù)期不能裂解的(例如R494E:V495G雙突變體)并且同時在二聚化結(jié)構(gòu)域中包含突變的突變體中，其仍將顯示減弱的生物學(xué)功能，即使這樣的突變體確實在體內(nèi)被裂解。在本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑分子的一些實施方案中，所述分子在位點534、578、619、673、692、693、694、695、696、699、和/或702包含野生型氨基酸。在本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑的一些實施方案中，所述拮抗劑在位點1^622處包含突變(例如，LM2C或K);在W"處包含突變(例如，I623C);在D626處包含突變(例如，D626K);在L622加D626處包含突變(例如，L622K加D626K);在K663處包含突變(例如，K663C);在1664處包含突變(例如，I664C);在R502處包含突變(例如，502C);在P500處包含突變(例如，PWOC);在NM處包含突變(例如，N497C);在II494加1623處包含突變(例如，R494E加I623C);在N497加G498處包含突變(例如，N497R加G498A、或N497K加G498A);在N497加P500處包含突變(例如，N497R加P500H、或N497K加P500H);在G498力。P500處包含突變(例如，G498A加P500H);在N497加G498加P500處包含突變(例如，N497R加G498A加P500H、或N497K加G498A加P500H);在N497加L622處包含突變(例如，N497R加L622K、或N497K加L622K);在N497加D626處包含突變(例如N497R加D626K、或N497K加D626K);在N497加L622力。D626處包含突變(例如，N497R加L622K加D626K、或N497K加L622K加D626K)。在一個實施方案中，本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑分子〗叉在HGF活性部位包含突變或者同時包含本文所述的一個或多個突變。所述活性部位的突變包括位點667和/或704的突變。合適的突變包括由C或W取代這兩個位點的其中一個或同時取代兩個。通常，本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑分子包括在HGF(3鏈中具有突變的HGF分子，所述突變減弱正常情況下與野生型HGF有關(guān)的一種或多種生物學(xué)特性。例如，在一個實施方案中，相對于野生型HGF，所述分子具有減弱的C-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力(例如，Met磷酸化)。在另一個實施方案中，相對于野生型HGF,所述分子具有減弱的刺激細胞遷移的能力。在另一個實施方案中，相對于野生型HGF，所述分子具有減弱的刺激細胞增殖的能力。在另一個實施方案中，相對于野生型HGF,所述分子具有減弱的刺激血管發(fā)生(angiogenesis)的能力。本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑分子通常至少包括HGFa鏈的一部分，該部分涉及與Met的結(jié)合，連接到本文所述的突變的HGF(3鏈。如本文所描述的突變分析所示，HGFP鏈中的特定區(qū)域和其中的特定氨基酸位點在調(diào)節(jié)HGF生物學(xué)功能中扮演重要角色。相應(yīng)地，一個方面，本發(fā)明也提供特異性地靶向這些區(qū)域的HGF/Met調(diào)節(jié)劑。這樣的調(diào)節(jié)劑包括核酸如適體(aptamer)、和多肽如結(jié)合肽和抗體。如此處所用的，數(shù)字前的字母表示野生型人HGF多肽中在所述數(shù)字指示的氨基酸位點發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)的野生型氨基酸，所述數(shù)字后的字母(如果存在的話)表示突變型/氨基酸(例如，氨基酸取代、刪除(dd)或插入(ins))。一個方面，本發(fā)明提供具有HGF/c-met調(diào)節(jié)活性的HGF突變體，例如HGF/c-met活性的拮抗劑或者顯示減小的但非缺失的HGF生物學(xué)活性(例如，細胞生長刺激活性)的HGF變體。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑能夠在體內(nèi)或體外抑制野生型HGF的生物學(xué)活性(這種生物學(xué)活性包括但不限于受體磷酸化、刺激細胞增殖、促進細胞存活、促進血管發(fā)生、誘導(dǎo)/促進細胞遷移)。在一個實施方案中，HGF突變體提供減弱的細胞生長促進活性(例如，細胞增殖、細胞存活、血管發(fā)生、細胞遷移)。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑分子與野生型HGF竟爭與Met的結(jié)合。在一些實施方案中，所述分子抑制c-met受體多聚化(例如，二聚化)。在一些實施方案中，所述分子包括變異的(突變的)P鏈，所述變異的(突變的)P鏈具有減弱的與另一條(3鏈分子相互作用(例如，多聚化/二聚化)的能力。在一些實施方案中，所述分子抑制HGFP鏈多聚化(例如，二聚化)。在一些實施方案中，所述分子結(jié)合c-met但顯示減弱的c-met活化的能力(例如，由減弱的c-met磷酸化、減弱的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化、和/或減弱的HGF/c-met依賴的細胞遷移、細胞增殖、細胞存活、細胞形態(tài)發(fā)生、血管發(fā)生等表示。)在相對于野生型的相應(yīng)序列而言一個或多個位點發(fā)生突變的本發(fā)明的任何分子中，所述突變可以為改變相應(yīng)野生型殘基的功能效果的任何形式?？梢砸员绢I(lǐng)域已知的(和/或根據(jù)經(jīng)驗確定的)任何合適的方式獲得突變，例如通過取代、插入、添加和/或刪除。在一些實施方案中，突變包括非-保守用氨基酸如丙氨酸和絲氨酸取代。一個方面，分子/物質(zhì)(例如，HGF/c-met調(diào)節(jié)劑，如本文所述的)連接到毒素如細胞毒劑。這些分子/物質(zhì)可以與添加劑/增強劑如放射劑(radiationagent)和/或化療劑一起配制或施用。本發(fā)明還提供用于調(diào)節(jié)疾病狀況的方法和組合物，所迷疾病狀況與HGF/c-met信號軸的調(diào)節(jié)障礙有關(guān)。因此，一個方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)患者c-met活化的方法，所述方法包括為所述患者施用本發(fā)明的HGF/c-met拮抗劑分子，由此c-met活化被調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，所述分子是抑制HGF/c-met活性的HGF/c-met拮抗劑。在一個實施方案中，所述拮抗劑抑制野生型HGFP與c-met的特異性結(jié)合。一個方面，本發(fā)明提供治療患者與c-met活化相關(guān)的病理學(xué)狀況的方法，所述方法包括為所述患者施用本發(fā)明的c-met拮#元劑，由此c-met活4匕^皮舉p制。HGF/c-met信號途徑涉及多種生物學(xué)和生理機能，包括例如細胞生長刺激(例如細胞增殖、細胞存活、細胞遷移、細胞形態(tài)發(fā)生)和血管發(fā)生。因此，另一方面，本發(fā)明提供抑制c-met激活的細胞生長(例如增殖和/或存活)的方法，所述方法包括將細胞或組織與本發(fā)明的拮抗劑接觸，由此與c-met活化有關(guān)的細胞增殖被抑制。又一方面，本發(fā)明提供抑制血管發(fā)生的方法，所述方法包括為患與異常血管發(fā)生有關(guān)的病癥的細胞、組織、和/或患者施用本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑，由此血管發(fā)生^皮抑制。一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的拮抗劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于疾病如癌癥、肺瘤、細胞增殖紊亂、免疫(如自身免疫性)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂的治療性和/或預(yù)防性治療。所述拮抗劑可以是本文所述的任何形式，包括抗體、抗體片段、多肽(例如，寡肽、HGF多肽突變體/變異體)、核酸(適體)、或其組合。一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的核酸在制備藥物中的用途，所述藥物用于疾病如癌癥、腫瘤、細胞增殖紊亂、免疫(如自身免疫性)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂的治療性和/或預(yù)防性治療。一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的表達載體在制備藥物中的用途，所述藥物用于疾病如癌癥、腫瘤、細胞增殖紊亂、免疫(如自身免疫性)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂的治療性和/或預(yù)防性治療。一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的宿主細胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于疾病如癌癥、腫瘤、細胞增殖紊亂、免疫(如自身免疫性)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂的治療性和/或預(yù)防性治療。一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的制品在制備藥物中的用途，所述藥物用于疾病如癌癥、腫瘤、細胞增殖紊亂、免疫(如自身免疫性)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂的治療性和/或預(yù)防性治療。一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的試劑盒(kit)在制備藥物中的用途，所述藥物用于疾病如癌癥、腫瘤、細胞增殖紊亂、免疫(如自身免疫性)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂的治療性和/或預(yù)防性治療。一個方面，本發(fā)明提供抑制c-met激活的細胞增殖的方法，所述方法包括將細胞或組織與有效量的本發(fā)明的拮抗劑接觸，由此與c-met活化有關(guān)的細胞增殖被抑制。一個方面，本發(fā)明提供治療患者與c-met活化的調(diào)節(jié)障礙相關(guān)的病理學(xué)狀況的方法，所述方法包括為所述患者施用有效量的本發(fā)明的拮抗劑，由此所述癥狀^皮治療。一個方面，本發(fā)明提供抑制表達c-met或肝細胞生長因子的細胞生長的方法，或者同時，所述方法包括將所述細胞與本發(fā)明的c-met拮抗劑接觸，由此引發(fā)所述細胞的生長抑制。在一個實施方案中，用由不同細胞表達的HGF(例如，通過旁分泌效應(yīng))4矣觸所述細胞。一個方面，本發(fā)明提供治療學(xué)上治療患有癌性腫瘤的哺乳動物的方法，所述癌性腫瘤包括表達c-met和/或肝細胞生長因子的細胞，所述方法包括為所述哺乳動物施用有效量的本發(fā)明的拮抗劑，由此有效地治療所述哺乳動物。在一個實施方案中，用由不同細胞表達的HGF(例如，通過旁分泌效應(yīng))接觸所述細胞。一個方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防與增強的c-met和/或肝細胞生長因子表達或活性有關(guān)的細胞增殖性紊亂的方法，所述方法包括為需要這種治療的患者施用有效量的本發(fā)明的拮抗劑，由此有效地治療或預(yù)防所述細胞增殖性紊亂。在一個實施方案中，所述增殖性紊亂是癌癥。一個方面，本發(fā)明提供抑制細胞生長的方法，其中所述細胞生長至少部分地依賴于c-met和/或肝細胞生長因子的生長促進效應(yīng)，所述方法包括將所述細胞與有效量的本發(fā)明的拮抗劑接觸，由此抑制所述細胞的生長。在一個實施方案中，用由不同細胞表達的HGF(例如，通過旁分泌效應(yīng))接觸所述細月包。一個方面，本發(fā)明提供治療學(xué)上治療哺乳動物腫瘤的方法，其中所述腫瘤的生長至少部分地依賴于c-met和/或肝細胞生長因子的生長強化效應(yīng)，所述方法包括將所述細胞與有效量的本發(fā)明的拮抗劑接觸，由此有效地治療所述腫瘤。在一個實施方案中，用由不同細胞表達的HGF(例如，通過旁分泌效應(yīng))4妾觸所述細月包。本發(fā)明的方法可用于影響任何合適的病理狀態(tài)，例如與HGF/c-met信號途徑的調(diào)節(jié)障礙有關(guān)的細胞和/或組織。一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中作為靶標的細胞是癌細胞。例如，癌細胞可以是選自下組的一種乳腺癌細胞、結(jié)腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭狀癌細胞(例如，曱狀腺的)、結(jié)腸癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞、宮頸癌細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細胞、骨肉瘤細胞、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、頭頸鱗狀癌細胞、黑素瘤細胞、多發(fā)性骨髓瘤(MultipleMyeloma)細胞、和白血病細胞。一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中作為靶標的細胞是過度增殖和/或增生的細胞。一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中作為靶標的細胞是發(fā)育不良的細胞。在又一實施方案中，在本發(fā)明的方法中作為靶標的細胞是轉(zhuǎn)移性細胞。本發(fā)明的方法可以進一步包括附加的治療步驟。例如，在一個實施方案中，所述方法進一步包括其中將靶細胞和/或組織(例如，癌細胞)暴露于放射治療或化療劑的步驟。在一個實施方案中，本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑分子與一種或多種其它治療劑例如erlotinib(TARCEVA⑧)、pemetrexed(ALIMTA⑧)、bevacizumab(AVASTIN⑧)、gefitinib(IRESSA⑧)、trastuzumab(HERCEPTIN⑧)、和rituximab(RITUXAN⑧)一起施用于患者。組合(聯(lián)合)治療中治療劑的施用可以同時或順序進行。如本文所述，c-met活化是重要的生物學(xué)過程，其中的調(diào)節(jié)障礙引發(fā)許多病理學(xué)狀況。相應(yīng)地，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，作為靶標的細胞(例如，癌細胞)是與相同組織起源的正常細胞相比c-met的活化增強的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法引發(fā)靶細胞的死亡。例如，與本發(fā)明的拮抗劑接觸可能導(dǎo)致細胞通過c-met途徑傳輸信號的無能，這引發(fā)細胞死亡。c-met活化(以及由此發(fā)生的信號傳輸)的調(diào)節(jié)障礙可能是許多細胞變化包括例如HGF(c-met的關(guān)聯(lián)配體)和/或c-met自身的過表達的結(jié)果。相應(yīng)地,在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括把細胞作為目標，其中與相同組織起源的正常細胞相比所述細胞(例如，癌細胞)更多地表達c-met或肝細月包生長因子，或同時更多地表達兩者。c-met-表達細胞可能由來自許多來源即自分泌或旁分泌方式中的HGF所調(diào)節(jié)。例如，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，用不同細胞中表達的肝細胞生長因子接觸/結(jié)合靶細胞(例如，經(jīng)由旁分泌效應(yīng))。所述不同細胞可以是相同或不同組織起源的。在一個實施方案中，用由所述靶細胞自身表達的HGF接觸/結(jié)合靶細胞(例如，經(jīng)由自分泌效應(yīng)/環(huán))。在一些實施方案中，本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑包括HGF突變體，所述突變體包括增強其抑制性和/或治療學(xué)效應(yīng)(包括，例如，增強的親和力、改善的藥代動力學(xué)特性(如半衰期、穩(wěn)定性、清除率)、對于患者來說減弱的毒性)的修飾。這些修飾包括例如涉及糖基化、聚乙二醇化、用非天然發(fā)生的但功能等效的氨基酸、連接基團等取代。合適的修飾是本領(lǐng)域熟知的，而且必要時可以根據(jù)經(jīng)驗確定。一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的一種或多種HGF/c-met拮抗劑和載體的組合物。在一個實施方案中，所述載體是藥學(xué)上可接受的。一個方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的HGF/c-met拮抗劑的核酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼HGF/c-met拮抗劑，該拮抗劑為多肽或者包含多肽(例如，HGF突變體/變體)。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼HGF/c-met拮抗劑，該拮抗劑為抗體或其片段或者包括抗體或其片段。一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核酸的載體。一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細胞。載體可以是任何類型的，例如重組載體如表達載體?？梢允褂枚喾N宿主細胞中的任何一種。在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞，例如，大腸桿菌。在一個實施方案中，宿主細胞是真核細胞，例如哺乳動物細胞如中華倉鼠卵巢CCHO)細胞。一個方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的HGF/c-met拮抗劑的方法。例如，本發(fā)明提供制備拮抗劑的方法，所述拮抗劑是或者包括抗體(或其片段)，所述方法包括在合適的宿主細胞中表達編碼所述抗體(或其片段)的重組載體，并回收所述抗體。在另一個例子中，本發(fā)明提供制備HGF/c-met拮抗劑的方法，所述HGF/c-met拮抗劑是或者包括多肽(如HGF突變體/變體)，所述方法包括在合適的宿主細胞中表達編碼所述多肽的本發(fā)明的重組載體，并回收所述多肽。一個方面，本發(fā)明提供包含容器的制品；并且組合物包含于所述容器內(nèi)，其中所述組合物包含一種或多種本發(fā)明的HGF/c-met拮抗劑。在一個實施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的核酸。在一個實施方案中，包含HGF/c-met拮抗劑的組合物進一步包含載體，在一些實施方案中所述載體是藥學(xué)上可接受的。在一個實施方案中，本發(fā)明的制品進一步包括為患者施用所述組合物的說明。一個方面，本發(fā)明提供包括第一容器和第二容器的試劑盒，所述第一容器包含含有本發(fā)明的一種或多種HGF/c-met拮抗劑的組合物，第二容器含有緩沖液。在一個實施方案中，所述緩沖液是藥學(xué)上可接受的。在一個實施方案中，包含HGF/c-met拮抗劑的組合物進一步包含載體，在一些實施方案中所述載體是藥學(xué)上可接受的。在一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒進一步包括為患者施用所述組合物的說明。附圖簡述圖l(A)描述不同HGF突變體的特征。舉例說明了HGFP鏈N-末端插入和HGFp鏈二聚化突變體。"細胞遷移"數(shù)據(jù)與包含所示突變的全長HGF存在下MDA-MB435細胞的遷移有關(guān)，以野生型HGF存在下的遷移的百分數(shù)表示。"HGF(3/MetlgG結(jié)合"數(shù)據(jù)和HGF(3鏈(包含所示的突變)與MetlgG的結(jié)合有關(guān)，以竟爭結(jié)合測試中ICs。(突變體)與ICso(野生型)的比值表示。在這些數(shù)據(jù)中，WT指C604S突變體；HGF卩突變體也包含該突變。^:作為一般性參考，如果預(yù)期其破壞潛在的(3鏈-P鏈相互作用，則所述突變以粗體表示，如果預(yù)期其破壞N-末端的插入，則所述突變以斜體和加下劃線(粗體或非粗體)表示。這些預(yù)期基于針對各個突變所觀測到的或預(yù)期的主要影響-即，對(3鏈-P鏈相互作用的影響或者對P鏈N-末端插入到活性部位/結(jié)合嚢中的能力的影響。盡管如此，熟練技術(shù)人員能夠輕易地確定特定突變是否可能具有一種或兩種影響，是否在圖1A中如此表示。例如，在一些情況下，突變可能同時影響P鏈-(3鏈相互作用和N-末端的插入，或者在一些情況下，如所預(yù)期的那樣，根據(jù)經(jīng)驗判斷，圖1A中所示的影響卩鏈-(3鏈相互作用的突變可能顯示影響N-末端的插入。類似地，明顯"減弱的，，Met結(jié)合值以斜體表示，明顯"正常的，，結(jié)合值以粗體表示，雖然"減弱，，和"正常，，的程度是相對的。(B)竟爭結(jié)合測試中測定的包含所示突變的全長HGF與Met的結(jié)合。數(shù)據(jù)表示為IC5Q(mut)與ICso(野生型)的比值。(C)包含所示突變的全長HGF對細胞遷移和增殖的抑制。突變HGF和野生型HGF存在時細胞遷移和增殖活性的量(對于遷移，1nM野生型HGF;對于增殖，0.25nM野生型HGF)以僅有野生型HGF存在時觀測到的活性百分數(shù)表示。圖2(A)A549細胞中，所示HGF突變體對HGF-依賴的Met磷酸化的抑制；R424A:R494E指單鏈HGF。Met磷酸化的量以RLU(相對發(fā)光單位(relativelightunit))表示。(B)A549肺癌細胞中，所示HGF突變體對HGF-依賴的Met磷酸化的抑制。Met磷酸化的量以對照的百分數(shù)表示(其為0.5nM野生型HGF存在時觀測到的量)。圖3(A)和(B)野生型和突變HGF存在時A549細胞中Met的磷酸化。Met磷酸化的量以各個野生型HGF濃度下，在野生型HGF存在下觀測到的最大磷酸化百分數(shù)表示。圖4突變HGF存在時的血管發(fā)生活性。血管發(fā)生量以所示HGF突變體存在時的每珠新芽數(shù)(新芽數(shù)/珠)(sprouts/bead)表示。實施本發(fā)明的方式本發(fā)明提供調(diào)節(jié)HGF/c-met信號途徑的方法、組合物、試劑盒和制品。本文提供了這些方法、組合物、試劑盒和制品的詳情。一般技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實施將使用常規(guī)分子生物學(xué)(重組技術(shù))、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、和免疫學(xué)技術(shù)，其為本領(lǐng)域公知常識。在文獻如"MolecularCloning:ALaboratoryManual",第二版,(Sambrooketal.,1989);"OligonucleotideSynthesis，，(M.J.Gait，ed.,1984);"AnimalCellCulture，，(R.I.Freshney,ed.,1987);"MethodsinEnzymology，，(AcademicPress,Inc.);"CurrentProtocolsinMolecularBiology，，(F.M.Ausubeletal"編，1987,定期更新；"PCR:ThePolymeraseChainReaction",(Mullisetal.，編，1994);"APracticalGuidetoMolecularCloning，，(PerbalBernardV.,1988)中充分地闡述了這些技術(shù)。定義如本文所用，所給予的氨基酸的名稱可以是所屬領(lǐng)域已接受的下述一種或多種形式，所有這些本文中可互換使用(i)全名(例如，色氨酸、絲氨酸、甘氨酸等)，(ii)三字母縮寫(例如，Trp、Ser、Gly等)，和(iii)一字母名稱(例如，W、S、G等)。相對于肽或多肽序列的"氨基酸序列同一性百分數(shù)"定義為在比對序列并引入空位(如有必要)，以獲得序列一致性最大百分數(shù)，并且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分后，候選序列中與特定肽或多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分數(shù)。為了確定氨基酸序列同一性百分數(shù)的目的而進行的比對可以以本領(lǐng)域熟知的多種方式實現(xiàn)，例如，利用公眾可獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定測量比對的合適參數(shù)，包括實施所比較的序列全長的比對所需的任何算法。然而，對于本文的目的，利用如US專利6,828,146所述的序列比較計算機程序ALIGN-2獲得氨基酸序列同一性％的值。如本文所用的，術(shù)語"肽"和"多肽"可互換使用，除了術(shù)語"肽"通常指包含少于200個連續(xù)氨基酸的多肽之外。術(shù)語"肽，，通常指連續(xù)的相對短的由肽酰鍵連接的氨基酸序列。典型地但非必然地，肽具有大約2至50個氨基酸、4-40個氨基酸或10-30個氨基酸的長度。本文所用術(shù)語"載體"意指能夠轉(zhuǎn)運已經(jīng)連接到其上的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是"質(zhì)粒"，指附加的DNA片段可以連接在其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是噬菌體載體。另一種類型的載體是病毒載體，其中附加的DNA片段可以連接到所述病毒基因組中。某些載體能夠在其所引入的宿主細胞中自主復(fù)制(例如，具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。當(dāng)引入到宿主細胞中時，其它載體(例如，非附加體哺乳動物載體)能夠整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些載體能夠引導(dǎo)其所可操作連接的基因的表達。本文中這樣的載體稱為"重組表達載體"(或者簡單地說，"重組載體")。通常，重組DNA技術(shù)中表達載體往往以質(zhì)粒形式應(yīng)用。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。"多核苷酸"，或者"核酸"，本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸的多聚物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者能夠由DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入到多聚物中的任何底物。多核苷酸可以包括修飾的核苷酸，如曱基化核苷酸及其類似物。如果存在，可以在多聚物組裝之前或之后修飾核苷酸結(jié)構(gòu)。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打斷。合成后可以進一步修飾多核苦酸，例如通過偶聯(lián)標記。其它類型的修飾包括例如"帽子"、用其類似物取代一個或多個天然發(fā)生的核苷酸、核苷酸間修飾，例如具有不帶電荷的連接的那些(例如，膦酸曱酯(methylphosphonate)、磷酸三酯(phosphotriester)、磷酰胺酯(phosphoamidates)、氨基曱酸酯等)和具有帶電荷的連接的那些(例如，硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)等)、含有附加部分(pendantmoiety)如蛋白質(zhì)的那些(例如，核酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-賴氨酸等)、具有嵌入劑(intercalators)的那些(例如，吖啶、補骨脂素(psoralen)等)、含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的那些、包含烷化劑(alkylators)的那些、具有修飾鍵的那些(例如，a端基異構(gòu)(anomeric)核酸等)，以及所述多核苷酸的未修飾形式。另外，通常存在于糖中的任何羥基可以例如用膦酸基、磷酸基替換，用標準保護基保護，或者被活化以在附加的核苷酸上產(chǎn)生附加的鍵，或者可以偶聯(lián)于固體或半固體支持物上。5'和3'端OH可以被磷酸化或者用胺類或1至20個碳原子的有機加帽基團取代。其它羥基也可以衍生為標準保護基。多核苷酸還可以包含本領(lǐng)域通常已知的核糖或脫氧核糖的糖的類似形式，包括例如2'-O-曱基-、2'-0-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖、碳環(huán)糖類似物、ct-端基異構(gòu)糖、差向異構(gòu)糖如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖(lyxoses)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptuloses)、非環(huán)狀類似物和脫堿基(abasic)核苷類似物如甲基核糖核苷。一個或多個磷酸二酯鍵可以被其它連接基團所取代。這些連接基團包括但不限于磷酸酯用P(O)S("硫代酸酯，，(thioate))、P(S)S("二硫代酸酯，，(dithioate))、(0)NR2("酰胺酯"(amidate))、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("曱縮醛，，(formacetal))替代，其中R或R'各自獨立為H或者取代或未取代的烷基(l-20個C),任選含有醚(-O-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。本文所用"寡核苷酸"通常指短的、一般為單鏈的合成多核苷酸，其長度通常但非必然小于約200個核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸"和"多核苷酸"不是互相排斥的。以上對多核苷酸的描述同樣完全適用于寡核苷酸。除非特別指明，本文所用術(shù)語"肝細胞生長因子"或"HGF，指任何天然的或變異的(無論是天然的還是合成的)HGF多肽，其能夠在允許發(fā)生這種進程的條件下激活HGF/c-met信號途徑。術(shù)語"野生型HGF"通常指包含天然發(fā)生的HGF蛋白的氨基酸序列的多肽。術(shù)語"野生型HGF序列"通常指發(fā)現(xiàn)于天然發(fā)生的HGF中的氨基酸序列。本文所用短語"基本上不削弱"、"基本上不減弱"、"基本上類似"或"基本上等同"、及其變化形式表示兩個數(shù)值之間足夠高的相似程度，以致于所述領(lǐng)域的技術(shù)人員將所述兩個數(shù)值之間的差異視為在用所述數(shù)值度量的生物學(xué)特征的上下文中幾乎沒有生物學(xué)意義。所述兩個數(shù)值之間的差異優(yōu)選小于約50%、優(yōu)選小于約40%、優(yōu)選小于約30%、優(yōu)選小于約20%、優(yōu)選小于約10%。"兩個數(shù)值"的例子包括與野生型蛋白質(zhì)有關(guān)的數(shù)值和與所述蛋白質(zhì)的突變形式有關(guān)的數(shù)值。術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白，，在最廣義上可互換使用，包括單克隆抗體(例如，全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性)，也可能包括特定抗體片段(如本文中更詳細描述的)。抗體可以是人的、人源化的和/或親合成熟的。"抗體片段，，只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留至少一種、優(yōu)選大多數(shù)或全部功能，所述功能正常情況下與存在于完整抗體中的那部分相關(guān)。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合部位，因此保留了結(jié)合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段例如包含F(xiàn)c區(qū)的一種抗體片段保留了正常情況下與存在于完整抗體中的Fc區(qū)相關(guān)的生物學(xué)功能中的至少一種，如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)節(jié)、ADCC功能和補體結(jié)合。在一個實施方案中，抗體片段是具有基本上近似于完整抗體的體內(nèi)半衰期的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可能包含一個抗原結(jié)合臂，該抗原結(jié)合臂連接到能夠賦予所述片段體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列上。本文所用術(shù)語"單克隆抗體"指由基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體，即除了可能少量存在的天然發(fā)生的突變之外，組成所述群體的單個抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原。另外，與典型地包括針對不同決定簇(表位)的多克隆抗體制品相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。本文中單克隆抗體特別包括"嵌合"抗體以及這些抗體的片段，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列等同或同源，而鏈的其余部分與源于其它物種或?qū)儆诹硪环N抗體類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列等同或同源，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性(美國專利4,816,567;和Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。"人源化"形式的非人(例如，鼠)抗體為包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在很大程度上，人源化抗體指其中來自受體高變區(qū)的殘基被來自非人物種(供體抗體)高變區(qū)的殘基所置換的人免疫球蛋白(受體抗體)，所述非人物種為例如具有所需特異性、親和力、和能力的小鼠、大鼠、兔或非人靈長類。一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基所置換。另外，人源化抗體可以包含受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。構(gòu)建了這些修飾以進一步改善抗體性能?？偟膩碚f，人源化抗體基本上包含至少一個、典型地兩個可變區(qū)的全部，其中所有的或者基本上所有的高變環(huán)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些高變環(huán)，并且所有的或者基本上所有的FR均為人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。更多詳情參見Jonesa/.，iVafwre321:522-525(1986);Riechmanna/.，A^fwre332:323-329(1988);和Presta，C釘.沐1m".腸/.2:593-596(1992)。也可參見其中引用的下述綜述"i侖文和文獻VaswaniandHamilton,j〃er^，y^AmacS;/wwwwo/.1:105-115(1998);Harris,B/oc/zem.5bc.77ywii3c/7'cws23:1035-1038(1995);HurleandGross,Cwr.pp.所ofec/.5:428-433(1994)。"人抗體，，指擁有相應(yīng)于由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體，和/或已別排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。"親和力成熟的，，抗體指在其一個或多個CDRs中有一個或多個改變的抗體，與不擁有那些改變的親本抗體相比，所述改變導(dǎo)致抗體對抗原的親和力提高。優(yōu)選的親和成熟抗體對目標抗原將有納摩爾或者甚至皮摩爾親和力。親和力成熟抗體通過本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)。Marksez1a/,所o/rec/z"o/ogy10:779-783(1992)描述了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進行的親和力成熟。Barbase"/.淑.&/，腦91:3809-3813(1994);Schierda/.G冊169:147-155(1995);Yeltonefa/.J/mw磨/.155:1994-2004(1995);Jackson""/.，/mm,/.154(7):3310-9(1995);和Hawkins"a/'Mo/.所o/.226:889-896(1992)描述了CDR和/或框架的隨機誘變。"阻斷"抗體或"拮抗劑，，抗體指抑制或減弱其結(jié)合抗原的生物學(xué)活性的本文所用"激動劑抗體"指模擬感興趣多肽的至少其中一種功能活性的抗體。"紊亂"或"病理學(xué)狀況"指將受益于用本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法治療的任何狀況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括那些使哺乳動物易感染所述紊亂(病癥)的病理學(xué)狀況。本文所要治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤或癌癥；非白血病和淋巴惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形細胞、下丘腦及其它腺體、巨口盆細胞、上皮、基質(zhì)和嚢胚腔的病癥；以及炎性、免疫學(xué)、神經(jīng)變性病癥、血管發(fā)生相關(guān)紊亂和與線粒體或代謝缺陷有關(guān)的病癥。術(shù)語"細胞增殖性紊亂(病癥)"和"增殖性紊亂(病癥)"指與一定程度的異常細胞增殖有關(guān)的紊亂(病癥)。在一個實施方案中，所述細胞增殖性紊亂(病癥)是癌癥。本文所用"腫瘤"指所有腫瘤細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，以及所有前癌性和癌性細胞和組織。本文提到的術(shù)語"癌癥"、"癌性的"、"細胞增殖性紊亂(病癥)，，、"增殖性紊亂(病癥)"和"腫瘤"不是互相排斥的。術(shù)語"癌癥"和"癌性的"指或者描述典型地以無限制的細胞生長/增殖為特征的哺乳動物生理學(xué)病癥。癌癥的例子包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、和白血病。這些癌癥更特別的例子包括多發(fā)性骨髓瘤、鱗狀細胞癌、小纟田胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌(squamouscarcinoma)、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝臟癌癥、膀胱癌、肝細胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌(例如，腎細胞癌)、肝臟癌癥(livercancer)、前列腺癌、陰道癌、曱狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)和多種類型的頭頸癌。抗體。本文所用"治療"指臨床干預(yù)以試圖改變正在治療的個體或細胞的天然過程，可以為了預(yù)防或者在臨床病理學(xué)過程中進行。所期望的治療效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或反復(fù)、減輕癥狀、減弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、降低疾病發(fā)展的速率、改善或緩和疾病狀況、和緩解或改善預(yù)后。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體用于延緩疾病或紊亂的發(fā)生。"有效量"指在劑量和時間上有效獲得所需的治療學(xué)或預(yù)防性結(jié)果必需的量。本發(fā)明的物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑的"治療有效量"可根據(jù)一些因素如個體的疾病狀況、年齡、性別、和體重以及所述物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力而有所不同。治療有效量還指所述物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑的治療學(xué)上有利的作用超過了其中的任何毒性或不良作用的量。"預(yù)防有效量"指在劑量和時間上，有效獲得所需的預(yù)防性結(jié)果必需的量。典型地但非必然地，由于用于患者的預(yù)防劑量在疾病之前或者在疾病的早期，因而預(yù)防學(xué)有效量將小于治療學(xué)有效量。術(shù)語"細胞毒劑，，在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re'86、Re188、Sm153、Bim、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑例如曱氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、長春堿類(vincaalkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊普(etoposide))、多柔比星(doxorubicin),美法侖(melphalan)、絲裂霉素C(mitomycinC)、苯丁酸氮芥(chlorambucil柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑、酶及其片段如溶核酶、抗生素、和毒素諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體、以及以下公開的多種抗腫瘤或抗癌藥劑。其它細胞毒劑描述如下。殺腫瘤藥劑導(dǎo)致腫瘤細胞的破壞。"化療劑，，指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物。化療劑的例子包括烷化劑類(alkylatingagents)，諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);碌酸烷基酯類(alkylsulfonates),諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和艱泊舒凡(piposulfan);氮丙口定類(aziridines),諸如笨佐j齊派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥—,派(meturedepa)禾口烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙4掌石克^R/岸酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三輕曱蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸一支內(nèi)酉旨類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜樹石咸(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan);苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素l和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189禾口CB1-TM1);艾對留塞〉各素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每纟帛才卬素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards),諸長口苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、月旦石粦酰胺(cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酉交氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲石岸胺(trofosfamide)、尿嘧咬氮芥(uracilmustard);亞；肖脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素丫11和加利車霉素11(參見例如Agnew,C7^附./"http://.￡d33:183-186(1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA;二膦酉臾鹽類(bisphosphonates),諸^口氯膦酉吏鹽(clodronate);i矣斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克4立霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramydn)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮—5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epimbicin)、依索比星(esorubicin)、4尹達比星(idambicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromydn、噪呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司4也丁(zinostatin)、佐柔比星(zombicin);抗代謝物類，諸如曱氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧咬(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨蟲茉呤(methotrexate)、*萊羅？令(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);。票呤類似物，i者如氟達4立濱(fludarabine)、6-3克基嘌口令(mercaptopurine)、硫咪。票呤(thiamiprine)、石克鳥。票呤(thioguanine);嘧咬類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苦(azacitidine)、6-氮尿香(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依i若4也濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表石克左*醇(epitiostanol)、美名,.烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲)各司坦(trilostane);葉酸#卜充劑，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酉交(aminolevulinicacid);恩尿口密口定(eniluracil);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptini腿acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物石威類(maytansinoids),i者如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米4乇胍腙(mitoguazone);米4乇蒽醌(mitoxantrone);莫艱達醇(mopidamol);二胺硝吖口定(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);外匕柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酉吏(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋鍺(spirogermanium);纟田交纟連孢菌酮酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疾孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蟲它行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine);達卡巴漆(dacarbazine);甘露莫司'汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);派泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖月包香(ambinoside)("Ara-C，，)；環(huán)石奔酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids),例如TAXOL帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANECremophor-free、帕利他塞的清蛋白改造納米茅貞4立制劑(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg，IUinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne畫PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);GEMZAR⑧吉西他濱(gemcitabine);6-硫鳥噪呤(thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶p令(methotrexate);4白類似4勿，i者3口"頃4自(cisplatin)禾口卡4白(carboplatin);長春堿(vinblastine);柏(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone);長春新堿(vincristine);NAVELBINE長春瑞濱(vinorelbine);能滅瘤(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依達曲沙(edatrexate);道i若霉素(daunomycin);氨基蟲萊口令(aminopterin);xeloda;伊本膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸類(retinoids),諸如視黃酸(retinoicacid);卡培他濱(capecitabine);以及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。上述定義"化療劑，，還包括擔(dān)負調(diào)節(jié)或抑制作用于腫瘤的激素的抗激素制劑例如抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基4也莫昔芬(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)、和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抑制芳香化酶的芳香化酶抑制劑，其調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素的生產(chǎn)，例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸曱地孕S同(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏氯唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)、和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole);以及抗雄激素例如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(>0乂&(^31^116)(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制參與粘附細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因表達的那些，例如，PKC-a、Ralf和H-Ras;核酶如VEGF表達抑制劑(例如，ANGIOZYME⑧核酶)和HER2表達抑制劑；疫苗如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗、和VAXID⑧疫苗；PROLEUKINrlL-2;LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶l抑制劑；ABARELIXrmRH;以及上述任何一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。本文中使用"生長抑制劑"時指抑制細胞生長的化合物或組合物，所述細胞的生長依賴于體外或體內(nèi)HGF/c-met活化。因此，所述生長抑制劑可以是明顯減小S期HGF/c-met-依賴細胞的百分數(shù)的抑制劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期運轉(zhuǎn)(在非S期位置)的試劑，如誘導(dǎo)Gl停滯和M-期停滯的試劑。經(jīng)典M-期阻斷劑包括長春堿類(長春新堿和長春堿)、紫杉烷類(taxanes)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑如多柔比星、表柔比星(epimbicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷、和博來霉素(bleomycin)。阻滯G1的那些藥劑也溢出到S-期停滯中，例如，DNA烷化劑如他莫昔芬、強的松(prednisone)、達卡巴口秦(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、順粕、曱氨蟲萊呤(methotrexate)、5-氟尿嘧。定、和ara-C?？梢栽赥heMolecularBasisofCancer,MendelsohnandIsrael,eds.,第1章，Murakamietal.(WBSaunders:Philadelphia,1995)標題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs"，尤其是第13頁中查找更多信息。紫杉烷類(帕利他塞(paclitaxel)和多西他塞(docetaxel))都是源于紫杉樹的抗癌藥。多西他塞(TAXOTERE⑧，Rhone-PoulencRorer),源于歐洲紫杉，是帕利他塞的半合成類似物(TAXOL,Bristol-MyersSquibb)。帕利他塞和多西他塞促進來自微管蛋白二聚體的微管的組裝并通過阻止解聚而穩(wěn)定微管，導(dǎo)致細胞中有絲分裂的抑制。"多柔比星"是蒽環(huán)類抗生素。多柔比星的化學(xué)全稱是(8S-順式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脫氧-a-L-來蘇』比喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8，ll-三羥基羥基乙?；?-l-曱氧基-5,12-萘二酮((8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione)HGF/Met拮抗劑-肽/多肽(包括抗體)本發(fā)明的一個方面有關(guān)HGF(3鏈-(3鏈相互作用和HGF-Met相互作用的分離的肽/多肽和抗體調(diào)節(jié)劑。在一個實施方案中，調(diào)節(jié)劑(如肽/多肽和抗體)可以利用標準蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過合適的純化方案從細胞或組織來源分離。在另一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)劑通過重組DNA技術(shù)制備。作為重組表達的替代方案，調(diào)節(jié)劑可以利用標準肽合成技術(shù)化學(xué)合成。本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑分子包括圖1中描述的那些。本發(fā)明還提供突變的或變異的蛋白質(zhì)，其中任一殘基與這些肽/多肽的相應(yīng)殘基相比可以變化，雖然仍然編碼保持調(diào)節(jié)活性的肽/多肽。在一個實施方案中，肽/多肽拮抗劑的變體與所參照的肽/多肽拮抗劑的序列有至少50%、60%、70°/0、80%、90%、95%、98%、99%的氨基酸序列同一性。大體上，根據(jù)本領(lǐng)域接受的結(jié)合測試定量單位/度量，所述變體與所參照的結(jié)合肽/多肽拮抗劑相比基本上顯示相同或更高的結(jié)合親和力，例如至少為所參照的結(jié)合肽/多肽/配體的結(jié)合親和力的0.75X、0.8X、0.9X、l.OX、1.25X或1.5X,同時保留了所期望程度的拮抗劑活性。大體上，本發(fā)明的變體包括序列中特定位點的殘基已被其它氨基酸所取代的變體，還包括在親本蛋白質(zhì)/肽的兩個殘基之間插入附加的一個或多個殘基的可能性以及從親本序列刪除一個或多個殘基或向親本序列添加一個或多個殘基的可能性。本發(fā)明包括任何氨基酸取代、插入、或刪除。在理想狀況下，所述取代是本文所述的保守性取代。"分離的"或"純化的"肽、多肽、蛋白質(zhì)或生物學(xué)活性片段是從其天然環(huán)境成分中分離和/或回收的。污染物組分包括典型地會干擾多肽的診斷或治療用途的材料，可以包括酶、激素、和其它的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)材料。以非所需污染材料(污染物)的干重計，優(yōu)選具有少于30%、優(yōu)選少于20%、10°/。、且優(yōu)選少于5%的污染物的制品基本上認為是分離的。分離的、重組生產(chǎn)的肽/多肽或其生物學(xué)活性部分優(yōu)選基本上是無培養(yǎng)基的，即優(yōu)選培養(yǎng)基占肽/多肽制品量的20%以下、優(yōu)選約10%以下、優(yōu)選約5%以下。污染物的例子包括細胞碎片、培養(yǎng)基、和所述肽/多肽體外合成期間使用和產(chǎn)生的物質(zhì)。肽/多肽的保守性取代如表A中"優(yōu)選取代"欄所示。如果這些取代導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，那么可以引入表A中命名為"示例性取代"或依照下述的關(guān)于氨基酸類別的更實質(zhì)性的改變，并篩選產(chǎn)物。表A<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>胎/多胎生物學(xué)特性的實質(zhì)性改變伴隨選擇取代,所述取代對維持(A)取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象，(b)目標部位分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積的影響方面差異顯著?；诔Ｒ妭?cè)鏈特性將天然發(fā)生的殘基分為以下的組(1)疏水性氨基酸正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性親水性氨基酸cys、ser、thr;(3)酸性氨基酸:Asp、Glu;(4)石咸'l"生氨基酉lt:asn、gln、his、lys、arg;(5)影響鏈方向的殘基Gly、Pro;和(6)芳香氨基酸Trp、Tyr、Phe。非保守性取代必然會伴隨用這些類別中其中一類的成員交換另一類。還可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的信息制備抗體調(diào)節(jié)劑的變體，而基本上不影響抗體的活性。例如，抗體變體在抗體分子可以至少有一個氨基酸殘基被不同的殘基所替換。對于抗體，最感興趣的取代誘變部位通常包括高變區(qū)，但也預(yù)期框架區(qū)(FR)變化。對于抗體，一種取代變體類型涉及取代親本抗體的一個或多個高變區(qū)殘基(例如人源化抗體或人抗體)。通常，選擇用于進一步開發(fā)的所得變體相對于生產(chǎn)所述變體的親本抗體而言會具有改善的生物學(xué)特性。用于生產(chǎn)這些取代變體的適當(dāng)路線涉及利用噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，突變幾個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)，在每個位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。如此產(chǎn)生的抗體作為融合物從絲狀噬菌體顆粒展示，所述融合物融合于M13的基因III產(chǎn)物，包裝在每個顆粒內(nèi)部。然后如本文所述篩選噬菌體展示變體的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點，可以進行丙氨酸掃描誘變，以鑒定明顯促進抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基?；蛘撸虺酥?，分析抗原抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體與抗原之間的接觸點可能是有益的。根據(jù)本文詳細描述的技術(shù)，這些接觸的殘基和鄰近的殘基是用于取代的候選殘基。一旦制備了這樣的變體，如本文所述篩選這一系列變體，可以選擇在一種或多種相關(guān)測試中具有優(yōu)越特性的抗體用于進一步的開發(fā)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然發(fā)生的氨基酸序列變體的情況下)或者通過寡核普酸介導(dǎo)的(或定點)誘變、PCR誘變、以及早先制備的變體或抗體的非變異型式的盒式誘變?？赡芟Ｍ诒景l(fā)明的免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)引入一個或多個氨基酸修飾，從而獲得Fc區(qū)變體。所述Fc區(qū)變體可以包含人Fc區(qū)序列(例如，人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))，其在一個或多個氨基酸位點包含氨基酸修飾(例如取代)，包括鉸鏈半胱氨酸的修飾。在一個實施方案中，所述Fc區(qū)變體可以顯示改變的新生兒Fc受體(neonatalFcreceptor,FcRn)結(jié)合親和力。這樣的變異的Fc區(qū)在Fc區(qū)氨基酸位點238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447中的任何一個或多個位點處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基編號為Kabat中的EU索引的編號。與FcRn有減弱的結(jié)合的Fc區(qū)變體可以在Fc區(qū)氨基酸位點252、253、254、255、288、309、386、388、楊、415、433、435、436、439或447中的任何一個或多個位點處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中殘基的編號為Kabat中EU索引的編號?；蛘撸鲜鯢c區(qū)變體與FcRn可以顯示增強的結(jié)合，并在Fc區(qū)氨基酸位點238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的任何一個或多個位點處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基編號為Kabat中EU索引的編號。與FqR有減弱的結(jié)合的Fc區(qū)變體在Fc區(qū)氨基酸位點238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439中的任何一個或多個位點處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基編號為Kabat中EU索引的編號。例如，所述Fc區(qū)變體可以顯示與FcYRI減弱的結(jié)合，在Fc區(qū)氨基酸位點238、265、269、270、327或329中的任何一個或多個位點處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基編號為Kabat中EU索引的編號。所述Fc區(qū)變體可以顯示與Fc7RII減弱的結(jié)合，在Fc區(qū)氨基酸位點238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439中的任何一個或多個位點處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基編號為Kabat中EU索引的編號。感興趣的Fc區(qū)變體可以顯示與FcyRIII減弱的結(jié)合，在Fc區(qū)氨基酸位點238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437中的任何一個或多個位點處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基編號為Kabat中EU索引的編號。具有改變(即增強或減弱)的Clq結(jié)合和/或補體依賴的細胞毒(CDC)的Fc區(qū)變體描述于W099/51642。這樣的變體可在Fc區(qū)氨基酸位點270、322、326、327、329、331、333或334中的一個或多個位點處包含氨基酸取代。也可參見Duncan&WinterAtowre322:738-40(1988);美國專利5,648,260;美國專利5，624,821;和涉及Fc區(qū)變體的W094/2935L載體構(gòu)建編碼本文所述的肽/多肽的多核香酸序列可以利用標準重組:忮術(shù)獲得。所需的多核苷酸序列可以從合適的細胞來源分離并測序?？贵w的細胞來源可能包括抗體產(chǎn)生細胞如雜交瘤細胞?；蛘撸梢岳煤塑账岷铣蓛x或PCR技術(shù)合成多核苦酸。一旦獲得編碼免疫球蛋白的序列，就將其插入到能夠在宿主細胞中復(fù)制并表達異源多核苷酸的重組載體中。許多本領(lǐng)域可獲得的已知載體能夠用于本發(fā)明的目的。合適載體的選擇將主要取決于所要插入到載體中的核酸的大小和要用所述載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細胞。每種載體包含多種成分，這取決于其功能(異源多核苷酸的擴增或表達，或兩者都有)及其與其所駐留的特定宿主細胞的相容性。載體組分通常包括但不限于復(fù)制起點(尤其是當(dāng)所述載體插入到原核細胞中時)、選擇標志基因、啟動子、核糖體結(jié)合部位(RBS)、信號序列、異源核酸插入物和轉(zhuǎn)錄終止序列。通常，包含源于與宿主細胞相容的物種的復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體與這些宿主一起使用。所述載體通常攜帶復(fù)制位點，以及能夠在轉(zhuǎn)化的細胞中提供表型選擇的標志序列。例如，典型地用源于大腸桿菌物種的質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322包含編碼氨千青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，并因此提供了鑒別轉(zhuǎn)化細胞的便利手段。pBR322、其衍生物、或者其它微生物質(zhì)粒或噬菌體也可以包含或者被修飾而包含啟動子，所述啟動子能夠被所述微生物利用而表達內(nèi)源性蛋白。此外，包含能夠與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體能夠用作與這些宿主相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)化載體。例如，在制備重組載體時可以利用噬菌體如入GEM.TM.-ll，所述重組載體可用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主細月包如大腸桿菌LE392。根據(jù)特定場合的需要，本發(fā)明可以使用組成性啟動子或可誘導(dǎo)的啟動子，這可以由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所確定。由多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子是熟知的。可以通過從DNA源去除啟動子而將所選啟動子可操作地連接到編碼本文所述多肽的順反子DNA,其中啟動子的去除通過限制酶消化和將分離的啟動子序列插入到所選載體中而實現(xiàn)。天然啟動子序列和許多異源啟動子均可用于直接擴增和/或表達目標基因。然而，異源啟動子是優(yōu)選的，因為與天然目標多肽啟動子相比，它們通常容許所表達的目標基因的更強的轉(zhuǎn)錄和更高的產(chǎn)率。適于與原核生物宿主一起使用的啟動子包括PhoA啟動子、(3-半乳糖酶(galactamase)和乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子如toc或rrc啟動子。然而，在細菌中有功能的其它啟動子(如其它已知的細菌或噬菌體啟動子)同樣是合適的。已經(jīng)公開了它們的核苷酸序列，從而使熟練技術(shù)人員能夠利用接頭或銜接子將它們可操作地連接至編碼目標輕鏈和重鏈的順反子(Siebenlistetal.(1980)Cdl20:269)以提供任何所需的限制性位點。在一些實施方案中，重組載體中的每個順反子都包含引導(dǎo)所表達的多肽跨膜轉(zhuǎn)運的分泌信號序列組分。通常，所述信號序列可以是所述載體的組分，或者可以是插入到載體中的目標多肽DNA的一部分。為了本發(fā)明的目的而選擇的信號序列應(yīng)當(dāng)是被宿主細胞識別和加工(即被信號肽酶裂解的)的信號序列。對于不識別和加工相對于異源多肽為天然的信號序列的原核生物宿主細胞來說，用例如選自下組的原核生物信號序列取代所述信號序列堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩(wěn)定的腸毒素II(STII)前導(dǎo)序列、LamB、PhoE、Pe舊、OmpA和MBP。適于表達多肽的原核生物宿主細胞包括古細菌(archaebacteria)和真細菌(Eubacteria)，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物?？捎眉毦睦影òＯＪ蠗U菌(Escherichia)(例如，大腸埃希氏菌(大腸桿菌))、芽孑包桿菌(Bacilli)(例如，枯草芽孑包軒菌(B.subtilis))、腸桿菌(Enterobacterial假單胞菌(Pseudomonas)各菌種(例如，銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)),鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、凈占質(zhì)沙、雷氏菌(Serratiamarcescens)、克雷4白氏菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、志賀氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)、或副球菌(Paracoccus)。優(yōu)選使用革蘭氏陰性細胞。優(yōu)選所述宿主細胞應(yīng)當(dāng)分泌最小量的蛋白水解酶，可以根據(jù)需要在細胞培養(yǎng)物中加入附加的蛋白酶抑制劑。肽/多肽生產(chǎn)用上述表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞并培養(yǎng)在經(jīng)改良的常規(guī)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基經(jīng)改良適合于誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴增編碼所需序列的基因。轉(zhuǎn)染指宿主細胞攝取表達載體，無論事實上是否有任何編碼序列表達。許多轉(zhuǎn)染的方法是普通熟練技術(shù)人員已知的，例如，CaP04沉淀和電穿孔。轉(zhuǎn)化意思是作為染色體外成分或者以染色體組成部分的方式向原核生物宿主中引入DNA以使所述DNA為可復(fù)制的。取決于所4吏用的宿主細胞，利用適合于這種細胞的標準技術(shù)完成轉(zhuǎn)化。使用氯化鈣的鈣處理通常用于包含實質(zhì)性細胞壁屏障的細菌細胞。另一種轉(zhuǎn)化方法使用聚乙二醇/DMSO。所使用的又一種技術(shù)為電穿孔。用于生產(chǎn)本發(fā)明的肽/多肽的原核細胞培養(yǎng)于本領(lǐng)域已知的適于培養(yǎng)所選擇的宿主細胞的培養(yǎng)基中。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基的例子包括luriabroth(LB)加必需的營養(yǎng)添加物。在優(yōu)選實施方案中，所述培養(yǎng)基還包含選擇藥劑，以選擇性地允許包含所述表達載體的原核細胞的生長，所述選擇藥劑根據(jù)所述表達載體的構(gòu)建而選擇。例如，向培養(yǎng)基添加氨千青霉素用于表明氨芐青霉素抗性基因的細胞的生長。除了碳、氮、和無機磷酸鹽源之外，還可以包含合適濃度的任何必需添加物，這些必需添加物單獨加入或者作為與另一種添加物的混合物或培養(yǎng)基如復(fù)合氮源加入。任選所述培養(yǎng)基可以包含一種或多種選自下組的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基醋酸鹽(酯)、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。將所述原核生物宿主細胞培養(yǎng)于適當(dāng)溫度下。例如，對于大腸桿菌的生長，所述優(yōu)選溫度自約20。C至約39。C，更優(yōu)選自約25°C至約37。C,更加優(yōu)選為約30。C。培養(yǎng)基的pH可以為約5到9范圍內(nèi)的任何pH,主要取決于宿主生物。對于大腸桿菌，pH優(yōu)選為約6.8至約7.4,更優(yōu)選約7.0。如果在表達載體中使用可誘導(dǎo)的啟動子，在適于活化所述啟動子的條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。例如，如果用PhoA啟動子控制轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以培養(yǎng)在磷酸鹽-限制培養(yǎng)基中用于誘導(dǎo)。根據(jù)所使用的載體構(gòu)建體，可以使用許多其它的誘導(dǎo)物，這是本領(lǐng)域已知的。本文所述在微生物中表達的肽/多肽可以分泌到宿主細胞的周質(zhì)中并從中回收。蛋白質(zhì)回收典型地包括破壞所述微生物，通常通過滲透性休克、超聲處理或裂解這樣的手段進行。破壞細胞后，可以通過離心或過濾除去細胞碎片或完整細胞。可以通過例如親合樹脂層析進一步純化蛋白質(zhì)。或者，可以將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到培養(yǎng)基中并從中分離?？梢詮呐囵B(yǎng)物除去細胞，過濾并濃縮培養(yǎng)物上清以進一步純化所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)?？梢岳猛ǔＲ阎姆椒ǚ蛛x并鑒別表達的多肽，例如免疫親合或離子交換柱上的分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC;在硅石(silica)或陽離子交換樹脂如DEAE上層析；層析聚焦(chromatofocusing);SDS-PAGE;石克酸銨沉淀；利用例如SephadexG-75凝膠過濾；疏水親合樹脂、利用固定于基質(zhì)上的適當(dāng)抗原的配體親合以及Western印跡測i式。除原核生物宿主細胞之外，真核宿主細胞系統(tǒng)也是本領(lǐng)域沿用已久的。適當(dāng)?shù)乃拗靼ú溉閯游锛毎道鏑HO、和昆蟲細胞例如下述的那些。肽/多肽純化可以純化生產(chǎn)的肽/多肽以獲得基本上均質(zhì)的制品用于進一步的測試和應(yīng)用?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標準蛋白質(zhì)純化方法。下述方法是示例性的適當(dāng)?shù)募兓椒庖哂H合或離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石或陽離子交換樹脂如DEAE上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、和利用例如SephadexG-75的凝膠過濾。本發(fā)明的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供基于在HGFp鏈特定區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的突變的多種方法，所述突變導(dǎo)致所述分子生物學(xué)活性的改變，從而這樣的突變分子在HGF/Met途徑的調(diào)節(jié)中顯示拮抗效應(yīng)。許多物質(zhì)或分子(包括肽/多肽等)可以用作根據(jù)本發(fā)明的方法中的治療劑。可以根據(jù)已知的方法配制這些物質(zhì)或分子以制備藥學(xué)上可用的組合物，從而此處的產(chǎn)品與藥學(xué)上可接受的載體媒介物組合為混合物。通過將具有所需純度的活性成分與可選的生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合而制備凍干制劑或水溶液形式的治療學(xué)制劑(Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(19S0))?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所使用的劑量和濃度對于受體來說是無毒的，包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機酸緩沖液；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、白明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA;糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽反離子(counterions)如鈉；和/或非離子型表面活性劑如TWEENTM、PLURON1CSTm或PEG。要用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這通過在凍干和重建之前或之后的無菌過濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。本文的治療劑組合物通常置于具有無菌存取口的容器中，例如靜脈內(nèi)使用的溶液袋或帶有可用皮下注射針穿透的塞子的管形瓶。給藥途徑依照已知的方法，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)(intraarterial)或損傷部位內(nèi)等途徑、局部施用、或通過緩釋系統(tǒng)注射或輸注。本發(fā)明的藥物組合物的劑量和所需藥物濃度可以依據(jù)預(yù)想的特定用途而改變。合適的劑量或給藥途徑的確定是普通熟練醫(yī)師所熟知的。動物試驗為確定人類治療的有效劑量提供可靠的指導(dǎo)。可以按照Mordenti,J.andChappell,W."Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics"InToxicokineticsandNewDrugDevelopment,Yacobietal.，Eds.,PergamonPress,NewYork1989,pp.42-96制定的原則度量物種間的有效劑量。當(dāng)體內(nèi)施用本發(fā)明的物質(zhì)或分子時，根據(jù)給藥途徑，正常劑量可以為每天自約10ng/kg直至100mg/kg哺乳動物體重或更多，優(yōu)選約l嗎/kg/天至10mg/kg/天。文獻中提供了關(guān)于特定劑量和遞送方法的指導(dǎo)；參見例如美國專利4,657,760;5,206,344;或5，225,212。預(yù)期不同的制劑對不同的治療化合物和不同的病癥將是有效的，例如以一種器官或組織為目標的給藥可能需要以不同于對另一種器官或組織的方式遞送。需要以具有釋放特征的制劑方式持續(xù)施用物質(zhì)或分子時，可預(yù)期微嚢化的物質(zhì)或分子，其中所述釋放特征適于需要施用所述物質(zhì)或分子的任何疾病或紊亂的治療。已經(jīng)用人生長激素(rhGH)、干擾素-(rhIFN-)、白介素-2、和MNrgpl20成功地獲得了用于緩釋的重組蛋白的微嚢化。Johnsonetal.,Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993);Horaetal.,Bio/Technology,8:755-758(1990);Cleland，"DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems,"inVaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach,PowellandNewman,eds,(PlenumPress:NewYork,1995)，pp.439-462;WO97/03692，WO96/40072,WO96/07399;和美國專利5,654,010。由于聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly-lactic-coglycolicacid,PLGA)的生物相容性和廣泛的可生物降解特性，用其開發(fā)了這些蛋白質(zhì)的緩釋制劑。PLGA的降解產(chǎn)物乳酸和輕基乙酸能夠在人體內(nèi)很快清除。另夕卜，根據(jù)其分子量和成分，可以將該多聚物的降解能力從數(shù)月調(diào)節(jié)至數(shù)年。Lewis,"Controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer,"in:M.ChasinandR.Langer(Eds.),BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekker:NewYork,1990),pp.1-41。鑒定HGF(3鏈內(nèi)在HGF/Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中對于HGF功能至關(guān)重要的區(qū)域提供了HGF(3鏈內(nèi)拮抗劑能夠靶向的位點。潛在的拮抗劑的例子包括結(jié)合HGF[3鏈N-末端和/或二聚化區(qū)域的寡核苷酸(其可以是適體(aptamer))、以及特別是抗體包括但不限于多克隆和單克隆抗體和抗體片段、單鏈抗體、抗獨特型抗體、以及這樣的抗體或片段的嵌合的或人源化的型式、以及人抗體和抗體片段。適體是能夠結(jié)合目標分子的核酸分子。適體的生產(chǎn)和治療學(xué)用途是本領(lǐng)域熟知的。參見例如美國專利5,475,096,和Macugen(Eyetech,NewYork)治療年齡相關(guān)黃斑變性的治療學(xué)功效。如本文所述，本發(fā)明的HGF/Met拮抗劑物質(zhì)/分子可以是肽或多肽(包括抗體)。獲得這種肽和多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括從肽和多肽文庫篩選結(jié)合適當(dāng)?shù)哪繕丝乖慕Y(jié)合劑。在一個實施方案中，適當(dāng)?shù)哪繕丝乖琀GF(3鏈(或其包含N-末端和/或二聚化區(qū)域的部分)，本文將詳細描述該目標抗原。在一個實施方案中，適當(dāng)?shù)哪繕丝乖瓕琈et,例如Met的胞外結(jié)構(gòu)域。肽和多肽文庫是本領(lǐng)域熟知的，也可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法制備。參見例如，Clarketal.，美國專利6,121,416;和Garrardetal.,5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717、和5,658,727。融合于異源蛋白成分如噬菌體外殼蛋白的肽和多肽文庫是本領(lǐng)域熟知的，例如Clarketal.和Garrardetal.，^7J:所描述的。第一種所選擇的肽或多肽結(jié)合劑的變體可以通過篩選肽或多肽的突變體以獲得感興趣的特征(例如增強目標結(jié)合親和力、增強藥代動力學(xué)、減弱的毒性、提高的治療指數(shù)等)而獲得。例如感興趣的特征可以是結(jié)合Met的能力，但激活HGF相關(guān)生物學(xué)活性如細胞增殖、Met磷酸化、細胞遷移、和血管發(fā)生的能力減弱。誘變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，突變的區(qū)域?qū)⒃贖GFP鏈內(nèi)，特別是本文所述與HGFP鏈N-末端插入和/或(3鏈-|3鏈二聚化有關(guān)的位點。另外，掃描誘變技術(shù)(如基于丙氨酸掃描的那些)尤其可能有助于評估肽或多肽內(nèi)各個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)和/或功能重要性?？梢酝ㄟ^檢測候選物質(zhì)/分子在體外或體內(nèi)測試中的調(diào)節(jié)能力來確定本發(fā)明的候選物質(zhì)/分子調(diào)節(jié)HGF/c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或與所述信號有關(guān)的生物學(xué)活性的能力，這是本領(lǐng)域熟知的，例如Okigakietal.，/^Li:;Matsumotoetal.，^J:;Dateetal.,FEBSLet.(1997),420:1-6;Lokkeretal.，/^7J:;Hartmannetal.,^7J:;Kirchhoferetal.,JBiol.Chem.(2004),279:39915-24;Stamosetal.(2004)EMBOJ.23:2325-35;Kirchhoferetal.,FEBSLett.(2005)579:1945-50;和Nakatsuetal.(Microvasc.Res.66:102，2003)中戶斤述。HGF(3鏈抗體本發(fā)明進一步提供包括應(yīng)用抗體的方法。示例性抗體包括多克隆、單克隆、人源化、雙特異性、和異源偶聯(lián)抗體。1.多克隆抗體抗體可以包含多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是熟練技術(shù)人員已知的?？梢岳缤ㄟ^注射一次或多次免疫制劑和，如果需要的話，佐劑在哺乳動物中產(chǎn)生多克隆抗體。典型地，免疫制劑和/或佐劑通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射而注射于哺乳動物。所述免疫制劑可以包括HGF(3鏈(或其一部分)或其融合蛋白。將免疫制劑偶聯(lián)于已知在被免疫的哺乳動物體內(nèi)為免疫原性的蛋白質(zhì)可能是有用的。這種免疫原性蛋白的例子包括但不限于匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白、和大豆胰蛋白酶抑制劑。可以使用的佐劑的例子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰脂質(zhì)A(MonophosphoryllipidA，MPLA)、合成的trehalosedicorynomycolate)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員無需過度實驗即可選擇免疫方案。2.單克隆抗體或者所述抗體可以是單克隆抗體。可以用雜交瘤方法，如KohlerandMilstein,Nature,256:495(1975)描述的方法制備單克隆抗體。在雜交瘤方法中，用免疫制劑免疫小鼠、倉鼠、或其他適當(dāng)?shù)乃拗鲃游?，以激發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異地結(jié)合所述免疫制劑?；蛘?，可以體外免疫淋巴細胞。所述免疫制劑將典型地包括HGF卩鏈(或其一部分)或其融合蛋白。通常，如果需要人類起源的細胞，則使用外周血單個核細胞("PBLs")，或者如果需要非人哺乳動物來源的則使用脾細胞或淋巴結(jié)細胞。然后用適當(dāng)?shù)娜诤蟿┤缇垡叶紝⒘馨图毎c永生細胞系融合，以形成雜交瘤細胞[Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)pp.59-103]。永生細胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒類動物、牛和人類起源的骨髓瘤細胞。通常使用大鼠或者小鼠骨髓瘤細胞系?？梢詫㈦s交瘤細胞培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的永生細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本細胞缺乏次黃。票呤鳥噪呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),用于所述雜交瘤的培養(yǎng)基典型地將包括次黃。票呤、氨基蝶呤、和胸苷("HAT培養(yǎng)基")，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷細胞的生長。優(yōu)選的永生細胞系是那些有效地融合、支持所選擇的抗體生產(chǎn)細胞穩(wěn)定高水平地表達抗體、并對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基^:感的細胞系。更優(yōu)選的永生細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，其可以例如從SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California和美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,Virginia獲得。也已描述了人骨髓瘤和小鼠-人雜交瘤細胞系用于生產(chǎn)人單克隆抗體[Kozbor,J.Immunol.，111:3001(1984);Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker,Inc.,NewYork,(1987)pp,51-63]。然后可以測試培養(yǎng)所述雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中抗HGF(M連單克隆抗體的存在。優(yōu)選通過免疫沉淀或者通過體外結(jié)合測試如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)測定由所述雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這些技術(shù)和測試是本領(lǐng)域已知的。例如可以通過MunsonandPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析測定單克隆抗體的結(jié)合親和力。鑒定所需的雜交瘤細胞后，可以通過有限稀釋程序亞克隆所述克隆并用標準方法培養(yǎng)[Goding,^A]。用于該目的的適當(dāng)培養(yǎng)基包括例如Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium和RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘撸鲭s交瘤細胞可以在哺乳動物中作為腹水體內(nèi)培養(yǎng)。由所述亞克隆分泌的單克隆抗體可以用傳統(tǒng)免疫球蛋白純化程序，例如蛋白質(zhì)A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親合層析從培養(yǎng)基、腹水流體分離或純化。所述單克隆抗體也可以用重組DNA方法，如美國專利4,816,567中描述的那些方法制備。利用常規(guī)程序(例如，通過使用能夠特異地結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的寡核普酸探針)可以很容易地分離編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA并測序。本發(fā)明的雜交瘤細胞用作這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離了DNA,可以將其置于表達載體中，然后將其轉(zhuǎn)染到原本不生產(chǎn)免疫球蛋白的宿主細胞如猿猴COS細胞、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞中，以實現(xiàn)單克隆抗體在重組宿主細胞中的合成。也可以例如通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列取代同源鼠序列[美國專利4,816,567;Morrisonetal.,/^丄]或者通過將免疫球蛋白編碼序列連接到非-免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列而改造DNA。這樣的非-免疫球蛋白多肽可以尋皮本發(fā)明抗體的恒定區(qū)取代，或者可以被本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合部位的可變區(qū)取代，以構(gòu)建嵌合二價抗體。所述抗體可以是單價抗體。制備單價抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾重鏈的重組表達。通常在Fc區(qū)中的任一點截斷重鏈以阻止重鏈交聯(lián)?；蛘撸嚓P(guān)半胱氨酸殘基被另一種氨基酸殘基取代或者被刪除以阻止交聯(lián)。體外方法也適于制備單價抗體。消化抗體以生產(chǎn)其片段尤其是Fab片段可以利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)實現(xiàn)。還可以通過篩選以適當(dāng)?shù)?所需的親和力結(jié)合HGF卩鏈(或等效物)的抗體或抗體片段噬菌體展示文庫獲得抗體。這些技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，例如，美國專利5,750,373;5,780,279;5,821,047;6'040，136;5,427,908;5,580,717及其中的參考文獻所公開的。3.人和人源化抗體本發(fā)明的HGF(3鏈抗體可以進一步包含人源化抗體或人抗體。人源化形式的非人(例如，鼠)抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其它的抗原結(jié)合子序列)，其包含源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括其中來自受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)的CDR的殘基所置換的人免疫球蛋白(受體抗體)，所述非人物種為例如具有所需特異性、親和力、和能力的小鼠、大鼠或兔。一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)殘基由相應(yīng)的非人殘基所置換。人源化抗體也可以包含在受體抗體中和引入的CDR或框架序列中均未發(fā)現(xiàn)的殘基?？偟膩碚f，人源化抗體包含至少一個、和典型地兩個可變區(qū)的基本上全部的序列，其中所有的或者基本上所有的CDR區(qū)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些CDR區(qū)，并且所有的或者基本上所有的FR區(qū)為人免疫球蛋白Fc區(qū)共有序列。人源化抗體最佳地還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)典型地人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。[Jonesetal.，Nature,321:522-525(1986);Riechmannetal.，Nature,H2:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.，2:593-596(1992)]。人源化非-人抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。通常人源化抗體具有從非人來源導(dǎo)入的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被認為是"引入的"殘基，其典型地從"引入的"可變區(qū)獲取?；旧峡梢园凑誛inter及其同事的方法實施人源化[Jonesetal.,Nature,^11:522-525(1986);Riechmannetal"Nature,112:323-327(1988);Verhoeyenetal.,Science,239:1534-1536(1988)]，通過用嚙齒類動物CDRs或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列。因此，這樣的"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中基本上小于化抗體典型地為人抗體，在該人抗體中，一些CDR殘基可能還有一些FR殘基被來自嚙齒類動物抗體的類似位點所取代。人抗體還可以利用本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)生產(chǎn)，包括噬菌體展示文庫[HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.，222:381(1991);Marksetal.,J.Mol.Biol.，222:581(1991)]。Cole等和Boerner等描述的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Coleetal"MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985)和Boerneretal.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。類似地，可以通過將人免疫球蛋白基因座引入到轉(zhuǎn)基因動物中而制備人抗體，例如引入到內(nèi)源免疫球蛋白基因已被部分或完全滅活的小鼠中。攻擊后，觀測人抗體的產(chǎn)生，其在各個方面都非常類似于在人體中觀測的結(jié)果，包括基因重排、組裝、和抗體的全體成員(repertoire)。例如，在美國專利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016,以及下述科學(xué)出版物中描述了該方法Marks"a/"Bio/Technology辺，779-783(1992);Lonberg"a/.'Nature368856-859(1994);Morrison,Nature368,812-13(1994);Fishwild&a/.，NatureBiotechnologyM,845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14,826(1996);LonbergandHuszar,Intern.Usv.Immunol.1365-93(1995)。所述抗體也可以是利用如上所述的已知的選擇和/或誘變方法實現(xiàn)親和力成熟的。優(yōu)選的親和力成熟抗體具有比起始抗體(通常為鼠抗體、人源化抗體或人抗體)大5倍、更優(yōu)選10倍、再優(yōu)選20或30倍的親和力，其中所述成熟抗體從所述起始抗體制備。4.雙特異性抗體雙特異性抗體是單克隆的優(yōu)選人的或人源化的抗體，其具有針對至少兩個不同抗原的結(jié)合特異性。在當(dāng)前例子中，其中一種結(jié)合特異性是針對HGFP鏈的，另一種是針對任何其它抗原的，且優(yōu)選針對細胞表面蛋白或受體或受體亞基。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達，其中所述兩個重鏈具有不同的特異性[MilsteinandCuello,Nature,305:537-539(1983)1。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些四體瘤(quadromas)生產(chǎn)10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確的分子的純化通常通過親和層析步驟完成。公開于1993年5月13日的WO93媚29和Trauneckeretal.,EMBOJ.,10:3655-3659(1991)中公開了類似的方法。具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合部位)可以融合于免疫球蛋白恒定區(qū)序列。所述融合優(yōu)選與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合，所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)至少包括鉸鏈區(qū)的一部分、CH2區(qū)和CH3區(qū)。優(yōu)選在至少一種融合物中存在有第一個重鏈恒定區(qū)(CH1)，其包含與輕鏈結(jié)合必需的位點。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，如果需要的話，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入到各自獨立的表達載體中，共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物中。生產(chǎn)雙特異性抗體的更多詳情參見例如，Sureshetal.，MethodsinEnzymology,121:210(1986)。依據(jù)WO96/27011中描述的另一種方法，可以工程化一對抗體分子之間的接觸面(interface),以最大化從重組細胞培養(yǎng)物中回收的異源二聚體的百分比。優(yōu)選的接觸面至少包括抗體恒定區(qū)的一部分CH3區(qū)。在該方法中，來自第一抗體分子接觸面的一個或多個小型氨基酸側(cè)鏈被更大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)所替換。通過用較小的氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大的氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的接觸面上形成了與大型側(cè)鏈大小相同或相似的補償"腔"。這提供了增加異二聚體產(chǎn)率的機制，所述產(chǎn)率超過不需要的終產(chǎn)物如同二聚體的產(chǎn)率。抗體)。文獻中已描述了從抗體片段生產(chǎn)雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可以用化學(xué)連接制備雙特異性抗體。Brennanetal"Science229:81(1985)描述了一種方法，在該方法中通過完整抗體的蛋白水解生產(chǎn)F(ab，)2片段。在二巰基配位劑亞砷酸鈉的存在下還原這些片段，以穩(wěn)定附近的二巰基并阻止分子間二硫化物的形成。然后將所得到的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)槿趸交撬?TNB)衍生物。然后通過巰基乙胺還原，將其中一種Fab'-TOB書f生物再轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。所生產(chǎn)的雙特異性抗體可用作酶選擇性固定的試劑?？梢灾苯訌拇竽c桿菌回收Fab，片段并化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalabyetal.，J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab，)2分子的生產(chǎn)。將從大腸桿菌各自獨立分泌的每種Fab'片段在體外定向化學(xué)偶聯(lián)，形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞，還激發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤目標的裂解活性。已經(jīng)描述了多種直接從重組細胞培養(yǎng)物中制備分離的雙特異性抗體片段的技術(shù)。例如，已用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)了雙特異性抗體。Kostelnyefa/.,LImmunol.148(5):1547-1553(1992)。通過基因融合將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接于兩種不同抗體的Fab'部分。在絞鏈區(qū)還原抗體同二聚體以形成單體，然后再將其氧化，形成抗體異二聚體。該方法還可用于抗體同二聚體的生產(chǎn)。Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的"雙抗體(diabody)"技術(shù)已提供了制備雙特異性抗體片段的替代機制。所述片段包含通過連接序列連接到輕鏈可變區(qū)(vo的重鏈可變區(qū)(VH),連"t妄序列非常短，不允許兩個結(jié)構(gòu)域在同一條鏈上配對。因此，迫使一個片段的Vh和V^結(jié)構(gòu)域與另一片段的互補Vl和VH結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合部位。還報導(dǎo)了利用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見，Gruberg/a/.,J.Immunol.152:5368(1994)?？梢灶A(yù)期超過二價的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt"fl/.，iImmunol,147:60(1991)。示例性雙特異性抗體可以結(jié)合HGF(3鏈上的兩個不同表位或者結(jié)合HGF(3鏈上的表位和另一種多肽(例如，c-met或HGFa鏈)上的表位。5.異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩個共價連接的抗體組成。已建議用這些抗體將免疫系統(tǒng)細胞引導(dǎo)到不需要的細胞[美國專利4,676,980],用于HIV感染的治療[WO91/00360;WO92/200373;EP03089]。預(yù)期可以利用合成蛋白化學(xué)中已知的方法包括涉及交聯(lián)劑的方法體外制備抗體。例如，可以利用二硫鍵交換反應(yīng)或者通過形成硫醚鍵構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的適當(dāng)試劑的例子包括亞氨基硫醇酯/鹽(iminothiolate)和4-巰基丁酰亞胺酸曱酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和例如美國專利4,676,980中公開的那些。6.效應(yīng)器功能工程化對于效應(yīng)器功能，可能希望改造本發(fā)明的抗體，以增強所述抗體在治療癌癥中的效能。例如，可以將半胱氨酸殘基引入到Fc區(qū)中，從而允許在該區(qū)域形成鏈間二硫鍵。如此制備的同二聚體抗體可能具有改善的內(nèi)在化能力和/或增強的補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)。參見Carone/a/.，J.ExpMed.，176:1191-1195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。也可以如Wolffetal.CancerResearch,53:2560-2565(1993)所述用雜合雙功能交聯(lián)連接劑制備具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體?；蛘撸梢怨こ袒贵w使之具有雙Fc區(qū)，可能由此具有增強的補體裂解和ADCC能力。參見Stevenson"a/.，Anti-CancerDrugDesign,3:219-230(1989)。7.免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及包含偶聯(lián)于細胞毒劑如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶學(xué)活性毒素，或其片段)、或放射性同位素(即放射性偶聯(lián)物)的抗體的免疫偶聯(lián)物。以上已經(jīng)描述了用于生產(chǎn)這種免疫偶聯(lián)物的化療劑?？梢允褂玫拿笇W(xué)活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A纟連(來自4同纟錄"(艮單月包菌/^ez/iicw7(9"asaerwg7'waa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(v4/eW/fe/oW")毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(尸/^to/acaamen'ca憩)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Moworafcac/zflra油'fl)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草Oapaowor/a0^cz'"(3"力4中制物、白初十毒蛋白(gelonin)、絲片木霉素(mitogdlin)、局P艮曲菌素(restrictocin)、f》霉素(phenomycin)、依"i若霉素(enomycin),口單^^孢菌素(trichothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。例子包括^Bi、mI、131In、WY和1861^。利用多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑制備抗體和細胞毒劑的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)劑為例如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對-重氮笨曱?；?乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaetal.,Science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的l-異硫氰酸根合苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。在另一個實施方案中，所述抗體可以偶^:于"受體"(如鏈霉親和素)以用于腫瘤預(yù)靶向，其中將抗體-受體偶聯(lián)物施用于患者，然后用澄清劑(clearingagent)從循環(huán)中去除未結(jié)合的偶聯(lián)物，接下來施用偶聯(lián)于細胞毒劑(例如，放射性核苦酸)的"配體"(例如，抗生物素蛋白)。8.免疫脂質(zhì)體本文公開的抗體也可配制為免疫脂質(zhì)體。包含所述抗體的脂質(zhì)體通過本4頁i或已歡口的方法制備，i口EpsteinWa/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,3688(19S5);Hwang"fl/"Proc.NatlAcad.Sci.USA,22:4030(1980);和美國專利4,485,045和4,544,545中描述的。美國專利5,013,556公開了循環(huán)時間增加的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體可以用脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)法生產(chǎn)，所述脂質(zhì)組合物包含磷脂酰膽堿、膽固醇、和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。通過孔徑確定的濾器擠出脂質(zhì)體，產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體?？梢酝ㄟ^二石克化物交換反應(yīng)如Martin"a/.,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)所述將本發(fā)明抗體的Fab'片段偶聯(lián)于脂質(zhì)體?；焺?如多柔比星)任選包含在所述脂質(zhì)體內(nèi)。參見Gabizon"a/.,J.NationalCancerInst.,81(19):1484(1989)。9.抗體的藥物組合物可以以藥物組合物的形式施用抗體以治療許多紊亂(病癥)。如果將完整抗體用作抑制劑，則優(yōu)選內(nèi)在化抗體。然而，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(lipofections)或脂質(zhì)體也可以用于將本發(fā)明的抗體遞送到需要的細胞中。使用抗體片段時，最小的抑制性片段是優(yōu)選的。例如，基于抗體的可變區(qū)序列，可以設(shè)計保留了結(jié)合HGFP鏈和/或干擾HGF(3鏈和c-met之間的相互作用、千擾HGF[3鏈N-末端插入、和/或干擾HGF卩鏈-p鏈相互作用的能力的肽和多肽分子。可以化學(xué)合成和/或通過DNA重組技術(shù)生產(chǎn)這些肽和多肽。參見，例如，Marasco"Proc.Natl.Acad.Sd.USA,巡7889-7893(1993)。本文的制劑也可以包含一種以上的對所治療的特定病癥來說必需的活性化合物，優(yōu)選具有互補活性而相互之間又沒有不利影響的那些活性化合物?；蛘?，或除此之外，所述組合物可以包含增強其功能的藥糸l例如細胞毒劑、細胞因子、化療劑、或生長抑制性藥劑。這樣的分子在組合藥物中適合以對預(yù)定目標有效的量提供。例如，也可以通過團聚技術(shù)或界面聚合將活性成分包裝于所制備的微膠嚢中，例如分別包裝于羥曱基纖維素或白明膠-微膠嚢和聚-(甲基丙烯酸曱酉旨)微膠嚢中，包裝于膠狀藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒、和納米膠嚢)或者包裝于常規(guī)乳液中。這些技術(shù)公開于Remington'sPharmaceuticalSciences,/^7上要用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這很容易通過除菌濾膜過濾而實現(xiàn)。可以制備緩釋制品。適當(dāng)?shù)木忈屩破返睦影ò贵w的固態(tài)疏水性聚合物半透性基質(zhì)，其中基質(zhì)為成形產(chǎn)品形式的，例如，薄膜、或微膠囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-丙烯酸曱酯)、或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羥丁酸。多聚物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能夠使分子釋放超過100天，而特定的水凝膠釋放蛋白較短的時間。當(dāng)包裹的抗體長期殘留于體內(nèi)時，它們由于暴露于37°C的濕氣而產(chǎn)生變性或凝集，導(dǎo)致生物學(xué)活性的喪失和可能的免疫原性改變?？梢愿鶕?jù)所涉及的機理設(shè)計用于穩(wěn)定化的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集原理是通過硫代-二硫鍵交換而形成了分子間S-S鍵，那么可以通過修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制濕度、利用合適的添加劑、以及生成特異性多聚物基質(zhì)組合物而實現(xiàn)穩(wěn)定化。以下是本發(fā)明的方法和組合物的例子。在給出了以上提供的一般描述的前提下，可以理解能夠?qū)嵤┰S多其它具體方案。實施例才才誶+和方法基本上如Kirchhofer"a/.,JBiol,Chem.(2004),279:39915-24;Stamos"。/.(7004)EMBOJ.23:2325-35中所述制備HGF突變體。利用Kirchhofer等,/^7蘭和Stamos等，/^7J:所述試劑和方法實施Met結(jié)合和MDA-MB435細胞遷移測試?；旧先鏚irchhofer等，/^7J:所述利用A549細胞實施Met磷酸化測試。除了利用50ng/mlHGF以劑量依賴的方式添加HGF突變體以抑制磷酸化之外，以類似的方法實施Met磷酸化的抑制?；旧先鏚irchhoferetal.,FEBSLett.(2005)579:1945-50所述在BxPC3測試中實施細胞增殖抑制。基本上如Nakatsuetal.(Microvasc.Res,66:102，2003)所述實施體外血管發(fā)生測試。在6天的試驗期間，每隔一天以10|ig/ml的濃度向培養(yǎng)基中添加HGF突變體。試驗結(jié)束時定量每J朱新芽數(shù)(numberofsproutsperbead),以4個獨立試驗的平均值士SD表示。結(jié)果利用竟爭ELISA測試鑒定具有所示突變的HGF(3鏈突變體(僅僅為(3鏈和作為全長HGF)與野生型HGFP鏈(僅僅P鏈和全長HGF)相比較的MetIgG結(jié)合能力。為了最小化任何潛在的二硫鍵連接的二聚體形成，在C604S背景制備野生型HGF(3和HGF(3鏈突變體；這樣野生型HGFp事實上為HGF卩C604S。此外，在細胞遷移測試中評估所選擇的全長2個鏈HGF突變體(fUll-length2-chainHGFmutant)對生物學(xué)功能的影響(如果有的話)，其為P鏈中突變的結(jié)果。結(jié)果示于圖1A、B、C。如圖2所示，HGF突變體G4981以劑量依賴的方式抑制Met的HGF-依賴的磷酸化；還顯示了HGF突變體R424A:R494E(單鏈HGF)的結(jié)果。如圖3所示，與野生型HGF相比，在Met磷酸化測試中，HGF突變體G498I和G498P激活Met明顯減弱；也顯示了HGF突變體R424A:R494E的結(jié)果。Met的HGF-依賴的磷酸化以劑量依賴的方式調(diào)節(jié)。突變體HGFG498I和G498P還抑制BxPC3細胞增殖，具有野生型HGF的2.5°/。和56%的活性。另外，在體外測試中，所選擇的10嗎/ml濃度的全長HGF突變體(D672N、V495G、G498I、R424A:R494E)抑制血管發(fā)生(圖4),這樣進一步證實了HGFp鏈(以及所選其突變)對HGF的整體生物學(xué)功能的重要性。部分參考文獻Angeloni，D.，Danilkovitch-Miagkova，A.,Miagkov,A.，Leonard,E.丄，andLerman,M.I.(2004).ThesolublesemadomainoftheRONreceptorinhibitsMSP-inducedreceptoractivation.J.Biol.Chem.,279，3726-3732.Birchmeier,C.,Birchmeier，W"Gherardi，E.,andVandeWoude,G.F.(2003).Met,metastasis,motilityandmore.NatureRev.Mol.CellBiol.《915-925.Boose,J.A.,Kuismanen,E.，Gerard,R.,Sambrook,J.,andGething，M.J.(1989).Thesingle-chainformoftissue-typeplasminogenactivatorhascatalyticactivity:Studieswithamutantenzymethatlacksthecleavagesite.Biochemistry2S,638-643.Bottaro,D.P.,Rubin,J.S.,Faletto，D.L,Chan,A.M.,Kmiecik,T.E.,VandeWoude,GF.,andAaronson，S.A.(1991).Identificationofthehepatocytegrowth'factorreceptorasthec-metproto-oncogeneproduct.Science257,802-804.BrozeJr.,G.J.(2001).ProteinZ-dependentregulationofcoagulation.Thromb.Haemost.S(5，8-13.CCP4(1994).TheCCP4suite:Programsforproteincrystallography.ActaCrystallogrZ)50,760-763.Chirgadzeetal.,FEBSLetters(1998),430:126-129.Cohen,G.H.(1997).Align-aprogramtosuperimposeproteincoordinates,accountingforinsertionsanddeletions.JAppl.Crystallog,1160-1161.Cooper,C.S.，Blair,D.G.，Oskarsson,M.K.,Tainsky，M.A.,Eader,L.A.,andVandeWoude,G.F.(1984a).Characterizationofhumantransforminggenesfromchemicallytransformed,temtocarcinoma,andpancreaticcarcinomacelllines.CancerRes.",1-10.Cooper,C.S.,Park,M.,Blair，D,G"Tainsky,M.A.,Huebner，K.,Croce,C.M.,andVandeWoude,G,F.(1984b).Molecularcloningofanewtransforminggenefromachemicallytransformedhumancellline.Nature3/7,29-33.Danilkovitch,A.,Miller,M.，andLeonard,E.J.(1999).Interactionofmacrophage-stimulatingproteinwithitsreceptor.J.Biol.Chem.27《29937-29943.Danilkovitch-Miagkova,A.，andZbar,B.(2002).DysregulationofMetreceptortyrosinekinaseactivityininvasivetumors.J.Clin.Invest.709,863-867.Dateetal"FEBSLett.(1997),徵1-6.Dennis,MS.,Eigenbrot,C.,Skelton，N.J.，Ultsch,M.H.,Santell,L.,Dwyer，M.A.,O'Connell,M.R,andLazarus，R.A.(2000).PeptideexositeinhibitorsoffactorVilaasanticoagulants.Nature豐似,465-470.Derksen,RW.，Keehnen,R.M.J.,Evers,L.M.，vanOers，M.H.J.,Spaargaren,M.，andPals,S.T,(2002).Cellsurfaceproteoglycansyndecan-1mediateshepatocytegrowthfactorbindingandpromotesMetsignallinginmultiplemyeloma.Blood卯，1405-1410.DiCera,E.,Guinto,E.R.,Vindigni，A.，Dang,Q.D.,Ayala，Y.M.，Wuyi,M.，andTulinsky,A.(1995).TheNa+bindingsiteofthrombin.J.Biol.Chem.276，22089-22092.Dickinson,C.D.,Kelly，C.R.,andRuf，W.(1996).IdentificationofsurfaceresiduesmediatingtissuefactorbindingandcatalyticflmctionoftheserineproteasefactorVila.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，14379-14384.Donate,LE.,Gherardi,E.,Srinivasan,N.,Sowdhamini,R.,Aparicio,S.,andBlundell,T.L.(1994》Molecularevolutionanddomainstructureofplasminogen-relatedgrowthfactors(HGF/SFandHGFl/MSP).ProteinSci.3,2378-2394.Drain,J.,Bishop,J.R.,andHajduk,S.L.(2001).Haptoglobin-relatedproteinmediatestrypanosomelyticfactorbindingtoTrypanosomes.J.Biol.Chem.風(fēng)30254-30260.Gherardi,E.,Youles,ME.,Miguel,R.N.,Blundell,T.L.，Iamele,L.，Gough,J.,Bandyopadhyay,A.,Hartmann,G.,andButler,P.J.(2003).FunctionalmapanddomainstructureofMET,theproductofthec-metprotooncogeneandreceptorforhepatocytegrowthfactor/scatterfactor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA12039-12044.Hartmann,G.,Naldini,L.,Weidner,K.M.，Sachs，M.,Vigna,E.，Comoglio,P.M.,andBirchmeier,W.(1992).Afunctionaldomainintheheavychainofscatterfactor/hepatocytegrowthfactorbindsthec-Metreceptorandinducescelldissociation.Proc.Natl.Acad.Sci.USAS9，11574-11578.Hartmann,G"Prospero,T.,Brinkmann,V"Ozcelik，C.,Winter,G"Hepple，J"Batley，S.,Bladt,R,Sachs,M.,Birchmeier,C.'"(1998).EngineeredmutantsofHGF/SFwithreducedbindingtoheparansulphateproteoglycans,decreasedclearanceandenhancedactivityinvivo.Curr.Biol.S,125-134.Hedstrom,L.(2002).Serineproteasemechanismandspecificity.Chem.Rev.風(fēng)4501-4523.Huber，R.，andBode,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