專利名稱：一種寡核苷酸及其治療肺癌的用途的制作方法
技術領域：
這個發(fā)明提供了含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或及其功能性類似物，以及應用該寡核苷酸或其功能性類 似物治療肺癌的用途。
背景技術：
肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤。肺癌可被分為兩種基本的類型小細胞性肺癌(small cell lung cancer ， SCLC)和非小細胞性肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。小細胞性肺癌也被稱為燕 麥細胞癌(oat cell cancer)。小細胞性肺癌約占所有肺癌的20 %，非小細胞性肺癌約占所有肺癌的80 %。 非小細胞性肺癌又可被分為腺癌(Adenocarcinoma),鱗狀細胞癌(Squamous cell type)和大細胞癌。 腺癌約占所有肺癌的40%，鱗狀細胞癌約占所有肺癌的30%，大細胞癌約占所有肺癌的10%。肺癌的治療方 法有手術治療，放射治療和化學藥物治療(化療)和采用其它"抗腫瘤制劑"所進行的治療(Harold Varmus. The New Era in Cancer Research, Science, 2006, Vol, 312: 1162-1165)。本發(fā)明提供了含5' CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能性類似物，以及應用該寡核苷酸或其功能性類似 物用于治療肺癌的用途。本發(fā)明提供的含5' CGTCGTTCG 3'寡核苷酸或其功能性類似物含 5' CGTCGTTCG3'序列。本發(fā)明提供的含5' CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能性類似物可以含有1個，2個 或2個以上的5' CGTCGTTCG3'序列。本發(fā)明提供的含5' CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能性類似物可以 刺激人外周血單個核細胞的增生，刺激人外周血單個核細胞產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)。本發(fā)明提供的含 5' CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能性類似物可以抑制肺癌細胞的生長。本發(fā)明提供的含5' CGTCGTTCG3' 寡核苷酸或其功能性類似物可以通抑制肺癌細胞生長的方式治療肺癌，也可通過增強免疫反應的方式發(fā)揮 抗肺癌的作用。發(fā)明內(nèi)容1、 本發(fā)明提供了提供了含5' CGTCGTTCG3'寡核苷酸，該核苷酸可以被化學修飾，此修飾包括但不限 于磷酸骨架修飾，如部分地或全部地磷硫?；蚨虼姿狨バ揎棥＝?jīng)化學修飾的該由本發(fā)明提供的寡核苷 酸是相對應的寡核苷酸的功能性類似物。2、 本發(fā)明提供了應用含5' CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能性類似物可用于治療肺癌的用途。3、 本發(fā)明提供的含5' CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能性類似物可增強免疫反應。4、 在應用本發(fā)明提供的含5' CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能性類似物在治療肺癌時，可將該寡核苷 酸或其功能性類似物用藥物性載體承載后應用。本發(fā)明提供的寡核苷酸或其功能性類似物可經(jīng)腸道、非腸 道(如皮下注射、肌肉注射和靜脈注射等)、局部和呼吸道途徑應用。 5、 本發(fā)明提供的含5'CGTCGTTCG3，寡核苷酸或其功能性類似物作為主要成分可形成各種藥物組合 物或劑型。包含有效治療劑量的該類寡核苷酸或其功能性類似物的這些藥物組合物可被用于治療肺癌的用途。6、 在治療肺癌時，本發(fā)明提供的含5'CGTCGTTCG3，寡核苷酸或其功能性類似物可以單獨應用，或 自身組合應用，或和其它一種或兒種抗腫瘤制劑聯(lián)合應用。7、 在治療肺癌時，本發(fā)明提供的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能性類似物可由遞送載體承載應用。


圖1描述了含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸對人外周血單個核細胞增生的刺激作用。 CpG2006 (5'-tcg tcg ttt tgt cgt tttg tcg tt-3，)和CpG C 2216 (5'-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3')是 兩個對照ODN。圖2描述了含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸刺激人外周血單個核細胞產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)的作用。 CpG2006 (5'-tcg tcg ttt tgt cgt tttg tcg tt-3，)和CpG C 2216 (5'-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3，)是 兩個對照ODN。圖3、描繪了含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸對肺癌細胞生長的抑制作用。CpG2006 (5，-tcg teg ttt tgt cgt tttg tcg tt-3，)和CpG C 2216 (5'-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3，)是 兩個對照ODN。發(fā)明詳細說明除非特別強調(diào)，本發(fā)明中的術語具有可以被本發(fā)明所屬領域內(nèi)技術人員所理解的通常意義。若出現(xiàn)含 義上的沖突，應遵從本詳細說明的解釋、界定或說明。"寡核苷酸"寡核苷酸是由糖(如脫氧核糖)，磷酸基團和堿基組成的單核苷酸連接而形成的分子，其中糖分子和堿基連接成核苷(nucleoside),核苷由磷酸基團連接形成核苷酸(nucleotide),形成核苷的 堿基有嘧啶和嘌呤，嘧啶有胸腺嘧啶(thymine,縮寫為T或t)和胞嘧啶(cytosine，縮寫為C或c)，嘌 呤有腺嘌呤(adenine,縮寫為A或a)和鳥嘌呤(guanine,縮寫為G或g)。在本發(fā)明屮，寡核苷酸指的 是寡脫氧核苷酸。寡核苷酸可由人工合成，也可以從細胞、細菌和病毒中獲得。本發(fā)明提供的寡核苷酸是 含5'CGTCGTTCG3'的寡核苷酸，其中的C是胞噴啶或其衍生物，T是胸腺嘧啶或其衍生物，A是腺嘌呤 或起衍生物，G是鳥嘌呤或其衍生物。本發(fā)明提供的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸包括但不限r(nóng)具有下述 序列和命名的寡核苷酸 YW111 (SEQIDNO:1): 5'-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3'(21bp)YW112 (SEQIDNO:2): 5'-TCGTCGTCGTTCGAT-3' (15bp)YW211 (SEQ ID NO: 3): 5'- TCGCGTCG丌CGCCCGTCGTTCGGTA匿3' (26bp)YW212 (SEQ ID NO: 4): 5'- TCGTCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA -3' (27bp)YW213 (SEQ ID NO: 5): 5'- TCACGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA -3' (26bp)YW214 (SEQ ID NO: 6): 5'- TCGTCGTCGTTCGACCCGTCG丌CGGTA-3' (28bp)YW215 (SEQ ID NO: 7): 5'- TCGTTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3' (29bp)YW216 (SEQ ID NO: 8): 5'-TCGTCGTTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3'(32bp)YW311 (SEQ ID NO: 9): 5'-TCGCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTTCGCGTCGTTCGCTA-3' (40bp)YW3112 (SEQ ID NO: 10):5'- TCGCGTCGTTCGCTCCGTCGTTCGGTCGCGTCGTTCGCTCGGTCGTTCCGTA -3' (52bp)YW3113 (SEQ ID NO: 11):5'--3' (64bp)"化學修飾"與自然的DNA相比，本發(fā)明提供的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸可以經(jīng)各種化學修飾， 修飾的部位可發(fā)生在核苷之間的磷酸二酯鍵，核糖單位或/和有機堿基(A、 T、 C、 G)。在寡核苷酸的合 成期間或合成后都可以進行修飾。在合成期間的化學修飾可以在寡核苷酸的內(nèi)部或5'端進行修飾。合成后 的寡核苷酸可以但不限于在活性基團(如5'或3'端的磷酸或羥基)進行化學修飾。專業(yè)人員可以知道這些 化學修飾具體方式。本發(fā)明中的寡核苷酸可以有一個或多個化學修飾-和相同序列的自然形態(tài)的寡核苷酸 相比，本發(fā)明中的寡核苷酸的化學修飾可以位于局部的磷酸二酯鍵或/和局部的核糖單位或/和局部的核^ 堿基。本發(fā)明中的化學修飾包括寡核苷酸的骨架修飾。在這里，寡核苷酸的骨架修飾包括但不限于磷酸骨 架修飾。磷酸骨架修飾可以是在核苷酸分子的一個穩(wěn)定的磷酸骨架中，其中至少一個核苷酸間鍵合中的—lh 橋性磷酸氧原子被硫原子取代。在本發(fā)明中的寡核苷酸中，核苷酸間鍵合中的非橋性磷酸氧原子可以部分 或全部被硫原子取代。本發(fā)明中的寡核苷酸的骨架也可發(fā)生非離子DNA類似物，如烷基、芳香-碳磷酸鹽 化合物(帶電荷的碳磷酸鹽化合物氧原子被垸基、芳香基取代)修飾，再如磷酸二酯和烷基磷酸二酯中的 氧原子部分被烷基化修飾。本發(fā)明的寡核苷酸可以是磷硫酰和磷酸二酯的嵌合體。在本發(fā)明的寡核苷酸中， 化學修飾還包括堿基替代，如C-5丙炔嘧啶和7"deaza-7替代嘌呤替代。替代的嘌呤和嘧啶包括但不限干 腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、其它的自然的和非自然出現(xiàn)的堿基。在本發(fā)明的寡核苷酸中，化學 修飾還包括堿基修飾。修飾的堿基在化學上不同于典型的自然中的堿基(如A、 T、 C、 G。)，但具有它們 基本的化學結構。本發(fā)明中的寡核苷酸還可以用胞嘧啶衍生物或胸腺嘧啶核苷衍生物修飾。這里胞嘧啶衍 生物是指胞啼啶樣核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧樣核苷(不包括胸腺嘧啶)。另外， 本發(fā)明中的寡核苷酸的修飾可以是在寡核苷酸的兩個或一個末端連接連接一個二元醇，如四乙二醇或六乙 二醇。本發(fā)明中的含5，CGTCGTTCG3，寡核苷酸經(jīng)化學修飾可以產(chǎn)生出相應的含5'CGTCGTTCG3'寡核ff 酸的功能性類似物。"腫瘤"本發(fā)明中的"腫瘤"即現(xiàn)代醫(yī)學定義的腫瘤，可以分為非致癌性的良性腫瘤和致癌性的惡 性腫瘤。癌癥是惡性腫瘤。"免疫反應"免疫應答和免疫反應有相似的意義。免疫反應是免疫細胞如B細胞、T細胞、NK細胞、 樹突細胞和巨噬細胞等對抗原或其它刺激作出的反應。免疫應答包括天然免疫應答和獲得性(特異性)免 疫應答。獲得性性免疫應答括細胞免疫應答和體液免疫應答。"治療腫瘤"這里的治療是指對發(fā)生腫瘤的個體采取的治療性措施，用來控制疾病的進展，延長發(fā)生腫瘤個體的生存期，改善發(fā)生腫瘤個體的生存質(zhì)量，減輕的疾病的癥狀，使癌腫縮小甚至消除。"個體"個體是指應用本發(fā)明寡核苷酸的人類個體和非人類脊椎動物個體。非人類脊椎動物包括非人 類靈長類動物，畜牧動物和寵物動物。本發(fā)明提供的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可在應用于個體后治療腫瘤。"藥物學可接受的載體"藥物學可接受的載體是指一種或多種固體或液體的填充劑、稀釋劑或包封 物質(zhì)，此載體適合將本發(fā)明中的寡核苷酸應用于個體。該載體可以是有機的、無機的、天然的或合成的。 該載體包括各種溶液、稀釋劑、溶劑、分散劑、脂質(zhì)體、乳劑、糖衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲的和延緩 吸收的試劑、和其他的適合本發(fā)明中的寡核苷酸應用的載體。藥物學可接受的載體的選擇決定于本發(fā)明中 含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物的應用方式?？勺⑸溆玫妮d體包括水、生理鹽水、平衡鹽溶液、 葡萄糖溶液、甘油等。對于固體混合物(如粉末、丸、片劑、膠囊形式)而言，常用的非毒性固體載體包 括具有藥理學純度的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸鎂等。另外，作為生物學上中性的載體，應用的藥理 學組分中可以含有非毒性的輔助物質(zhì)，包括濕化或乳化劑、防腐劑、PH緩沖試劑，醋酸鈉和單月桂酸酯等。"治療有效劑量"為了治療腫瘤，給個體應用劑量是治療有效劑量。該治療有效劑量是指在治療腫 瘤的過程中，給予個體后可產(chǎn)生理想的預防或治療效果的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物的劑 量。本發(fā)明中的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以直接或放到藥物學上可接受的載體中應 用。這個"劑量"的多少決定于本領域技術熟練人員應知的標準技術，還要參考其他因素，包括并不限于 個體的大小和健康情況和疾病的嚴重程度。本發(fā)明中的寡核苷酸可以用作單次治療或多次治療。本發(fā)明中 的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物每次應用到個體的劑量范圍從1嗎到100 mg。為了達到理 想的治療效果，本領域技術熟練人員可以對應用的劑量作調(diào)整，如主治醫(yī)師在可靠的醫(yī)療判斷的基礎上， 做出的劑量調(diào)整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍。"給藥途徑"在應用時，本發(fā)明中的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以單獨應用或按 配方制作成藥物組合物應用，經(jīng)由各種合適的途徑來達到理想的治療效果。本發(fā)明中的含5'CGTCGTTCG3' 寡核苷酸或其功能類似物的給藥途徑可以是腸內(nèi)、腸外、外用或吸入途徑。腸內(nèi)給要途徑包括經(jīng)口、胃、 結腸或直腸給藥；腸外給藥途徑包括經(jīng)靜脈、腹膜、鞘內(nèi)、肌肉、皮下、局部注射，經(jīng)陰道、外用、鼻粘膜和肺吸入等。外用給藥途徑包括經(jīng)皮膚、口腔、眼睛、耳和鼻子。"藥物組合物"藥物組合物指的是本發(fā)明中治療有效劑量的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物與藥物學上可接受的載體組成的混合物。藥物組合物分可以包含一個或多個本發(fā)明中的含 5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物。藥物組合物可以但不限于是水溶液、鹽溶液、顆粒、氣溶膠、 片劑、粉劑、糖衣片劑、膠囊劑、栓劑、糖漿劑、乳劑、懸膠液、乳膏、滴劑和其它合適的物質(zhì)。藥物組 合物的應用方式可以是經(jīng)腸外、經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、經(jīng)腹膜內(nèi)、經(jīng)局部(粉劑、軟膏劑、凝膠劑、 滴劑、透辟貼劑)、含服或口腔和鼻腔噴霧等。在各種情況下，藥物組合物必須是無菌和穩(wěn)定的。本發(fā)明 的注射劑藥物組合物包括藥學上可接受的水溶液、非水溶液、分散劑、懸濁劑、乳劑或粉劑，注射前用無 菌的注射用水或分散劑溶解。本發(fā)明中的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以用水相載體溶解， 比如用pH 3. 0到pH 8. 0的等滲的緩沖液，沐值范圍也可為pH3. 5-pH 7. 4， pH 3. 5-pH 6. 0， pH 3. 5-pH 5. 0。 緩沖液包括檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液?？诜乃幬锝M合物可以和可食用的載體按 配方制成粉劑、片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖槳、膏劑或懸濁劑等。常規(guī)的非毒性固體載 體作為固體組分可以是藥物學級別的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸鎂等?？谇缓o藥法的藥學藥學藥物組合物可以是傳統(tǒng)方式的片劑和錠劑。作為吸入法的藥學藥學藥物組合物是噴霧劑，相關領域技術熟練人 員可以選擇使用壓力囊、噴霧器或干粉。在一些情況下，為了延長本發(fā)明中含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或 其功能類似物的作用效果，藥物組合物可被處理于合適的持續(xù)釋放系統(tǒng)后應用。發(fā)明中的含5'CGTCGTTCG3' 寡核苷酸或其功能類似物或藥物組合物可以被處理成帶有結晶的懸膠液或水分較少的非結晶物質(zhì)，來穩(wěn)定 地延緩釋放。注射用的本發(fā)明中含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物的延緩釋放可以通過用疏水物 質(zhì)(如，可接受的油性載體)溶解來實現(xiàn)。用于注射形式的藥物組合物，可以是脂質(zhì)體包裹的寡核苷酸成 乳粒，或可生物降解的半透性聚合物，如多乳酸化合物、多正酯類或聚酐。"抗腫瘤制劑"抗腫瘤制劑是指在個體用于治療腫瘤的制劑，包括化療藥物，非特異性免疫增強劑， 表皮細胞生長因子受體(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制劑，腫瘤細胞突變蛋白酪氨酸激酶抑制劑，腫 瘤血管抑制劑，抗腫瘤抗體和腫瘤疫苗等。本發(fā)明中的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以單 獨應用，或幾種聯(lián)合應用，或應用藥物可接受的載體，或和一種或幾種其它的抗腫瘤制劑聯(lián)合應用。本發(fā) 明提供的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以和其它的抗腫瘤制劑同時應用，或按先后次序應 用。"化療藥物"；化療藥物是指用于腫瘤治療的化學藥物。本發(fā)明提供的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以和一種或多種化學藥物聯(lián)合應用治療腫瘤?；熕幬锇ǖ幌抻诘妗h(huán)磷酰胺、消瘤芥、鹽酸氮芥，卡氮芥、環(huán)乙亞硝脲、噻替派、馬利蘭、順鉑，亞硝脲類，5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、甲氨喋呤、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤，羥基脲，阿霉素，表阿霉素，柔紅霉素，米托蒽醌，絲裂霉素，博采霉素，自力霉素，放線菌素D，長春新堿，長春花堿，長春花堿酰胺，三尖杉脂堿，喜樹堿，鬼臼乙叉甙,美登素，欖香烯乳，三苯氧胺，腎上腺皮質(zhì)激素，甲基芐肼，羥基甲基芐肼，左旋門冬酰胺酶，鉑類(順鉑，& 鉑，草酸鉑)，氮烯咪胺，六甲嘧胺，泰索帝或培美曲賽(Alimta)，諾維本，希羅達，伊立替康，拓撲替康，草酸鉑，多烯紫杉醇(Docetaxel),聯(lián)合應用的化療藥物如泰素(紫杉醇)+順鉑，泰素+卡鉑、健 擇(鹽酸吉西他濱)+順鉑，泰索帝(多西紫杉醇)+順鉑，泰素D、健擇+順鉑，順鉑(Ci印latin)+長春 瑞賓(vinorelbine),吉西他濱(gemcitabine)+卡鉑(Carboplatin),紫杉醇(paclitaxel)+卡鉑。本發(fā)明 提供的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以和一種或兩種或兩種以上的化療藥物聯(lián)合應用。"非特異性免疫增強劑"是指能非特異增強個體抗腫瘤免疫反應的制劑，這些制劑包括單但不限于卡 介苗(BCG) 、 a型干擾素(IFN-a)和白細胞間介素(IL-2)。"表皮細胞生長因子受體(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制劑"腫瘤細胞如肺癌細胞表達的表 皮細胞生長因子是受體酪氨酸激酶，抑制此激酶活性的制劑可以抑制包括肺癌細胞的生長。此類制劑包括 但不限于吉非替尼或易瑞沙(Gefitinib, Iressa)和埃羅替尼(Erlotinib, Tarceva) (Bezjak， A., et al. J Clin Oncol 24: 3831-3837 2006)。"腫瘤細胞突變蛋白酪氨酸激酶抑制劑"是指抑制腫瘤細胞突變蛋白酪氨酸激酶活性的制劑。此類制 劑包括但不限于甲磺酸伊馬替尼(Gleevec或STI—571或Imatinib mesylate)。甲磺酸伊馬替尼是突變 蛋白質(zhì)(Bcr-—Abl)酪氨酸激酶磷酸化抑制劑(Rubin BP, DuensingA. Mechanisms of resistance to small molecule kinase inhibition in the treatment of solid tumors. Lab Invest. 2006 Aug 21)。"腫瘤血管抑制劑"是指通過抑制腫瘤血管形成而發(fā)揮抗腫瘤作用的制劑。這類制劑包括但不限于阿 瓦斯丁 (Avastin)和恩度(END0STAK)。阿瓦斯丁是結合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的基因工程單克隆抗 體(Gridelli C, et al. New antiangiogenetic agents and non-small cell lung cancer. Crit Rev Oncol Hematol. 2006 Jul 12)。恩度是重組人血管內(nèi)皮抑制素。"抗腫瘤抗體"是指包括但不限于HERCEPTIN (Johnson BE, Janne PA. Rationale for a phase [I trial of pertuzumab， a HER-2 dimerization inhibitor, in patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jul 15:12(14 Pt 2) :4436s-4440s)等對肺癌細胞生長有治療作用的抗體類藥物。"腫瘤疫苗"是指能誘生個體產(chǎn)生抗腫瘤特異性免疫應答的制劑。腫瘤疫苗中的腫瘤抗原是誘生腫瘤 特異性免疫應答的核心物質(zhì)，這些腫瘤抗原包括但不限于MUCl。"遞送載體"本發(fā)明中的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以用遞送載體遞送應用。 遞送載體包括但不限于類固醇(如膽固醇)、絡和物、乳化物、免疫刺激復合物(ISC0Ms)、脂質(zhì)(如 陽離子脂質(zhì)和陰離子脂質(zhì))、脂質(zhì)體、活的細菌載體(如沙門氏菌、大腸桿菌、分枝桿菌志賀(氏)桿菌、 乳酸桿菌)和活的病毒載體(如牛痘苗、腺病毒、單純皰疹病毒)、病毒小體、病毒樣顆粒、微球、核酸 疫苗、高分子材料(如羧甲基纖維素、脫乙酰殼多糖)、環(huán)狀多聚物。遞送載體也可以通過特異性受體識 別靶細胞的靶向性配體分子。
具體實施方式
技術熟練人員可以了解到本發(fā)明提供的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸或其功能類似物可以通過抑制肺癌 細胞的生長而發(fā)揮治療肺癌的作用，也可以通過刺激人的免疫細胞增殖和產(chǎn)生細胞因子而發(fā)揮抗腫瘤的作 用。下面的非限定性的實施例將對本發(fā)明作出例證說明。在實施例中，以人外周血分離人外周血單個核細胞作為免疫細胞的來源，其中的免疫細胞有T細胞、 B細胞、天然殺傷細胞、樹突狀細胞、粒細胞和單核細胞等。實施例中的含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸由上海生工生物技術有限公司合成，并經(jīng)無熱源處理。寡核苷 酸中的內(nèi)毒素應用鱟變形細胞溶解法檢測(AssociatesofCapeCo(Unc)。以下顯示的是在實施例中應用的含 5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸序列和名稱YW111 (SEQIDN0:1): 5'-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3'(21bp)YW112 (SEQIDNO:2): 5,-TCGTCGTCGTTCGAT-3, (15bp)YW211 (SEQ ID NO: 3): 5'- TCGCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA-3' (26bp)YW212 (SEQ ID NO: 4): 5'-TCGTCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA-3' (27bp)YW213 (SEQ ID NO: 5): 5'- TCACGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA -3' (26bp)YW214 (SEQ ID NO: 6): 5'- TCGTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA -3' (28bp)YW215 (SEQ ID NO: 7): 5'- TCGTTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA -3' (29bp)YW216 (SEQ ID NO: 8 ): 5'-TCGTCGTTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3' (32bp)YW311 (SEQ ID NO: 9): 5'-TCGCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGG丌CGCGTCGTTCGCTA-3' (40bp)YW3"2 (SEQ ID NO: 10):5'- TCGCGTCGTTCGCTCCGTCGTTCGGTCGCGTCGTTCGCTCGGTCGTTCCGTA -3' (52bp)YW3113 (SEQ ID NO: 11):5'--3' (64bp)實施例l、含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸刺激人外周血單個核細胞(PBMCs)增殖的作用用Ficoll-Hyp叫ue密度梯度離心法從人外周血分離正常人外周血單個核細胞(Ficoll試劑購0 Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。用臺酚蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為 95%-99%。用^H]胸腺瞎啶摻入法檢測人外周血單個核細胞的增殖情況。簡而述之，人外周血單個核細胞 以6x()S/孔的密度接種到U型底96孔板，與各種含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸(3 ng/ml)在37°C、5%C02 的細胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)48小時，之后加入卩H]腺嘧啶(New England Nuclear, Boston, MA)繼續(xù)培養(yǎng)16小時。在 玻璃纖維濾器上收獲細胞，用閃爍計數(shù)器檢測結果。用平均cpm± SD表示細胞增殖情況。每個樣品設3 復孔。如圖1的結果所示，含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸可顯著刺激人外周血單個核細胞增殖。這證明含 5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸可以刺激免疫細胞增生，增強免疫功能，從而增強對腫瘤的免疫監(jiān)視作用。
實施例2含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸刺激人外周血單個核細胞(PBMCs)產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)的作用用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從正常人外周血分離人外周血單個核細胞(Ficoll試劑購6 Pharmacia公司，血液樣品由吉林省血液中心提供)。由臺酚蘭染色法確定人外周血單個核細胞的成活率為 95%^990/0。VeroE6細胞(非洲綠猴腎細胞系，源自Type Culture Collection,美國)用含10% (v/v)熱滅活的胎 牛血清和抗生素(100 IU of penicillin/ml and 100IU of streptomycin/ml)的IMDM培養(yǎng)液在37°C、 5%C02的 細胞醉箱內(nèi)培養(yǎng)。采用Vera E6細胞病變法檢測經(jīng)CpG ODN處理人外周血單個核細胞培養(yǎng)上清的抗病毒 活性。人外周血單個核細胞以6><105/孔的密度接種到U型底％孔板，與各種含5'CGTCGTTCG3'寡核貸 酸(3pg/ml)共孵育48小時，收集上清。將VeroE6細胞(3X10"孔)接種到平底96孔板，設3個復孔， 培養(yǎng)24小時。之后，和100^1上述收集的上清(1: 80稀釋)培養(yǎng)16小時，再加入10X TCID50 (TCID50， 半數(shù)組織感染劑量)的VSV病毒(水泡性口炎病毒)繼續(xù)培養(yǎng)36小時。培養(yǎng)結束后，用0.5%的結晶紫染 色。用多孔微量滴定板檢測儀測定0D值(A578nm)，以0D值來表示病毒的細胞病變效應。如圖2所示，含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸可以刺激人外周血單個核細胞產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)。這證明 含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸可以剌激以產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)特征的天然免疫反應。天然免疫反應可發(fā)揮抗腫 瘤作用。這些抗病毒物質(zhì)主要由細胞因子組成。實施3含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸抑制人肺癌細胞系細胞生長的作用A549細胞(人肺癌細胞系細胞，源自Type Culture Collection,美國)用含10°/。 (v/v)熱滅活的胎牛 血清和抗生素(100 IU of penicillin/ml and 100 IU of streptomycin/ml)的IMDM培養(yǎng)液在37°C、 5% C02的細 胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)。將A549細胞接種于％孔培養(yǎng)板，5000個/孔，設3個復孔，加入各種含5'CGTCGTTCG3' 寡核苷酸(終濃度為6 Hg/m)，在37QC、 5% C02的細胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)共賻育168小時。收集細胞，在顯微 鏡下用計數(shù)板計數(shù)。用3復孔計數(shù)的平均值表示結果。如圖3所示，含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸抑制人肺癌細胞的生長。序列表<110>長春華普生物技術有限公司<120>含5'CGTCGTTCG3'寡核苷酸及其用途<160> 11<210> 1<211> 21<212> DNA<213>人I:合成<400> 1TCGTCGACGT CGTTCGTTCT C 21<210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> 人工合成 <400> 2TCGTCGTCGT TCGAT 15<210> 3 <211> 26 <212> DNA<2i3>人:i:合成<400> 3TCGCGTCGTT CGCCCGTCGT TCGGTA 26<210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> 人工合成 <400> 4TCGTCGTCGT TCGCCCGTCG TTCGGTA 27<210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> 人工合成 <400> 5TCACGTCGTT CGCCCGTCGT TCGGTA 26<210> 6 <211> 28 <212> DNA<2i3> 人工合成<400> 6TCGTCGTCGT TCGACCCGTC GTTCGGTA 28<210> 7 <211> 29 <212> DNA <213>人工合成 <400> 7TCGTTCGTCG TTCGACCCGT CGTTCGGTA 29<210> 8 <211> 32
<212> DNA <213>人工合成 <400> 8TCGTCGTTCG TCGTTCGACC CGTCGTTCGG TA 32<210> 9 <211> 40 <212> DNA <213>人工合成 <400> 9TCGCGTCGTT CGCCCGTCGT TCGGTTCGCG TCGTTCGCTA 40<210> 10 <211> 52 <212> DNA <213>人工合成 <400> 1052<210> 11<211> 64<212> DNA<2i3>人工.合成<400> 11TCGCGTCGTT CGCTCCGTCG TTCGGTCGCG TCGTTCGCTC GGTCGTTCCG TCGGTCGTTC CGTA 6權利要求
1、含5’CGTCGTTCG3’特定序列的寡核苷酸或其功能類似物。
2、 權力要求1所述的寡核苷酸或其功能類似物可含有一個或多個5' CGTCGTTCG3'特定序列。
3、 如權力要求1或2所述寡核苷酸或其功能類似物，其特定序列5' CGTCGTTCG3'的兩個末端或兩個特 定序列5' CGTCGTTCG3'中間可以添加其他任意的由4種核苷酸(A、 T、 C、 G)組成的核苷酸序列。
4、 如權力要求1-3中任一所述的寡核苷酸或其功能類似物包括但不限于如下寡核苷酸序列，即序列 表中SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11所代表的序列。
5、 權力要求1-4任一所述的寡核苷酸或其功能類似物可以經(jīng)化學修飾，化學修飾的部位可以是核苷間 的磷酸二酯鍵和/或核糖和/或堿基。經(jīng)化學修飾的權力要求l-4中任一所述的寡核苷酸被界定為相應寡核 苷酸的功能性類似物。
6、 權力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能類似物通過刺激免疫細胞增殖而使免疫功能增強的方法。
7、 權力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能類似物通過刺激免疫細胞分泌細胞因子而使免疫功能 增強的方法。
8、 如權力要求6和權力要求7任一所述的方法，其中的免疫功能增強的作用可以抑制腫瘤生長。
9、 權力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能類似物用于制備用于治療腫瘤的制劑的用途。
10、 權力要求1-5中任 -所述的寡核苷酸或其功能類似物抑制肺癌細胞生長的方法。
11、 權力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能類似物用于制備用f治療肺癌的制劑的用途。
12、 如權力要求8、 10任一所述的方法或權力要求9、 U任一所述的用途中，其中寡核ff酸或其功能類 似物在給予荷瘤個體時可以單獨應用或與藥物學可接受的載體一起應用的方法。
13、 如權力要求12中所述的方法，其中的寡核苷酸或其功能類似物可以作為藥物組合物中的有效成 分進行應用。
14、如權力要求12、 13任一所述的方法，其中的寡核苷酸或其功能類似物在應用于個體時可經(jīng)腸內(nèi)、 腸外、外用和吸入等給藥途徑施行。
15、 如權力要求12、 13、 14任一所述的方法，其屮的寡核苷酸或其功能類似物在給予個體時可以單獨 應用，或自身聯(lián)合應用，或與一種或幾種其它的抗腫瘤制劑聯(lián)合應用。
16、 權力要求15中所述的抗腫瘤制劑包括化療藥物、非特異性免疫增強劑、表皮細胞生長閃于受體 (EGFR)-酪氨酸激酶(-TK〉激活抑制劑、腫瘤細胞突變蛋白酪氨酸激酶抑制劑、腫瘤血管抑制劑、抗腫瘤抗體、腫瘤疫苗和其它的免疫治療制劑。
17、 如權力要求12、 13、 14、 i5任一所述的方法,其中的寡核苷酸或其功能類似物在給予個體時可以 和放射治療聯(lián)合應ffl。
18、 如權力要求12、 13、 14、 15、 17任一所述的方法中，其中的寡核苷或其功能類似物在給予個體時 可以單獨應用或和遞送載體聯(lián)合應用。
19、 如權力要求12、 13、 14、 15、 17、 18任一所述的方法中，其中的寡核苷酸或其功能類似物的應 用劑量為治療有效劑量。
全文摘要
本發(fā)明涉及5’CGTCGTTCG3’的寡核苷酸及其功能性類似物及應用該寡核苷酸或其功能性類似物治療肺癌的用途。
文檔編號C07H21/00GK101148467SQ20061015292
公開日2008年3月26日 申請日期2006年9月20日 優(yōu)先權日2006年9月20日
發(fā)明者于永利, 亮 楊, 楊風雷, 王麗穎 申請人:長春華普生物技術有限公司