專利名稱：達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種喹諾酮類抗生素的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用，尤其涉及一種達(dá)氟沙星(danofloxacin)的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用。屬抗生素藥免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的下列名稱適用于整個說明書和權(quán)利要求書BSA牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司產(chǎn)品PBS磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)Sephadex-675葡聚糖凝膠，Sigma公司產(chǎn)品cBSA經(jīng)乙二胺修飾的牛血清蛋白透析膜美國聯(lián)合炭化(United Carbide)公司產(chǎn)品達(dá)氟沙星中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所EDC乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺，簡稱EDC，Sigma公司產(chǎn)品達(dá)氟沙星(danofloxacin)屬于喹諾酮類抗生素。這類抗生素由于其抗菌譜廣，殺菌能力強(qiáng)，是繼土霉素之后在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用的藥物。這類藥物可以有效地預(yù)防和治療家禽細(xì)菌和霉形體疾病。達(dá)氟沙星是其中最常用最有效的藥物之一。但人們通過研究逐漸發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類抗生素在動物源食品中的殘留對人體有毒害。作為一種人畜共用藥，喹諾酮類抗生素在食品中的殘留通過食物鏈對人體健康危害很大。新英格蘭明尼蘇達(dá)州衛(wèi)生署的KIRKE SMITH為首的研究小組發(fā)現(xiàn)，家禽使用喹諾酮類藥物使彎曲桿菌產(chǎn)生了耐藥性。根據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心的調(diào)查，一種由食品引起疾病的彎曲桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性由1998年的13.6％上升到1999年的17.6％。而我國尚未頒布動物源食品中殘留的喹諾酮類藥物的檢測方法和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。美國由于考慮到這類藥物的交叉感染，已經(jīng)開始在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中禁用喹諾酮類抗生素。我國雖尚未在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中禁用喹諾酮類抗生素，但有嚴(yán)格的停藥期規(guī)定。隨著人民生活水平的提高及我國加入WTO，對動物源食品的品質(zhì)要求也越來越高，食品中藥物殘留的檢測必將法制化，常規(guī)化。因此，研究喹諾酮類藥物在食品中的殘留限量和檢測方法是非常必要的。
在抗生素藥物殘留的檢測中，儀器法如液相色譜和質(zhì)譜以及液相質(zhì)譜聯(lián)用是應(yīng)用最廣泛的方法。這些方法準(zhǔn)確，穩(wěn)定，可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法。但儀器法價格昂貴，費(fèi)時較長，且造成有機(jī)溶劑污染，需要大型儀器設(shè)備，需要專門的技術(shù)人員，所以難于用于現(xiàn)場操作。酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)提供了一種極好的掃描手段。該法具有快速，準(zhǔn)確，簡易，不需要專門人員操作等優(yōu)點(diǎn)，這使得ELISA法成為一種理想的，可用于常規(guī)掃描的檢測方法。酶聯(lián)免疫檢測法的核心是需要高質(zhì)量的抗體。大多數(shù)抗生素包括喹諾酮類藥物都是小分子有機(jī)化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以，必須把這些化合物轉(zhuǎn)變成能引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。經(jīng)檢索，現(xiàn)在世界上尚未有關(guān)于達(dá)氟沙星的免疫原的合成及抗體制備的報道，而且目前國內(nèi)檢測達(dá)氟沙星藥物殘留的ELISA試劑盒大都購于國外，保存期限短，價格高，遠(yuǎn)不能滿足檢測需要，因此研究達(dá)氟沙星的免疫原的合成及抗體制備就顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種能引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對達(dá)氟沙星有特異反應(yīng)的抗體的免疫原，即達(dá)氟沙星(danofloxacin)的偶聯(lián)物及其制備方法。同時，本發(fā)明還提供了所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物作為免疫原在制備達(dá)氟沙星特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
本發(fā)明的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物，由達(dá)氟沙星半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。
其中上述產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)優(yōu)選是牛血清蛋白。
本發(fā)明所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的達(dá)氟沙星的分子個數(shù)，所述n為整數(shù)1～20，BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9Kda；上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜281nm，323nm，334nm。
上述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物，其中n優(yōu)選為整數(shù)5～15，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
上述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法是將達(dá)氟沙星與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
上述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法，由如下步驟完成(1)溶液A的制備將達(dá)氟沙星，羥基琥珀酰亞胺，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(EDC)，以摩爾比1∶2～8∶5～15溶解在二甲基甲酰胺中，反應(yīng)生成達(dá)氟沙星與乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺溶于pH為7.38～7.56，濃度為0.01M～0.02M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7.38～7.56；以乙二胺∶BSA∶EDC的摩爾比為15～25∶1∶15～25的量稱取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃±5℃條件下攪拌反應(yīng)2～4小時；將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.38～7.56，濃度為0.01M～0.02M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，備用；(4)按達(dá)氟沙星與cBSA的摩爾比為15～50∶1量分別取溶液A和溶液B，在20℃±5℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應(yīng)4～6小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析70～80小時，再改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物。
在上述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法中步驟(1)所述達(dá)氟沙星與羥基琥珀酰亞胺、EDC的摩爾比優(yōu)選為1∶5∶10。
在上述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法中步驟(2)所述乙二胺與牛血清蛋白、EDC的摩爾比優(yōu)選為20∶1∶20。
在上述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法中步驟(2)(3)所述的磷酸緩沖液pH優(yōu)選為7.40，濃度優(yōu)選為0.01M。
在上述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法中步驟(4)所述的達(dá)氟沙星與牛血清蛋白的摩爾數(shù)比優(yōu)選為30∶1。
本發(fā)明所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物作為免疫原在制備達(dá)氟沙星特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
利用本發(fā)明的技術(shù)方案可以成功地把半抗原達(dá)氟沙星與載體蛋白特別是牛血清蛋白BSA偶聯(lián)起來，從而合成了能夠在動物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的完全免疫原——達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物。
利用本發(fā)明所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物作為免疫原免疫新西蘭大白兔，成功地獲得了對半抗原達(dá)氟沙星有特異反應(yīng)的抗體。經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定，利用本發(fā)明所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物作為免疫原制備的達(dá)氟沙星特異反應(yīng)抗體，其抗血清效價達(dá)到1∶256,000，其最低檢測限為0.01ppb。
上述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物以及高效價的達(dá)氟沙星特異反應(yīng)抗體的制備成功，為制備達(dá)氟沙星的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒提供了基礎(chǔ)。在實(shí)際應(yīng)用中，把所述制備的達(dá)氟沙星特異反應(yīng)抗體鍍在微孔盤內(nèi)，就可以用來檢驗(yàn)動物源食品中達(dá)氟沙星的殘留。由于本發(fā)明所述方法具有簡易，快速，特異，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，所以可以用于食品檢驗(yàn)檢疫中的初步掃描檢測之用。這樣不但可以節(jié)省大量的檢驗(yàn)時間，還可以用于現(xiàn)場操作，從而彌補(bǔ)了儀器法費(fèi)時較長，需要大型儀器設(shè)備支持，需要專門的技術(shù)人員操作，難用于現(xiàn)場的不足。所以，半抗原達(dá)氟沙星與載體蛋白特別是牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物的合成及抗血清的成功制備為這種快速檢驗(yàn)法奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)液A的制備稱取達(dá)氟沙星10.00mg，羥基琥珀酰亞胺10.13mg，EDC 21.09mg，溶解在3ml二甲基甲酰胺中，反應(yīng)生成達(dá)氟沙星與EDC的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺18.03mg溶于20ml pH為7.40，濃度為0.01M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7.40；分別稱取1000.00mg BSA(分子量68，000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃條件下攪拌反應(yīng)2小時；將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析70小時，然后改用蒸餾水透析24小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.40，濃度為0.01M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，備用；(4)按達(dá)氟沙星與cBSA的摩爾比為20∶1量分別取溶液A和溶液B，在20℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應(yīng)6小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析70小時，再改用蒸餾水透析24小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物。
實(shí)施例2(1)A的制備稱取達(dá)氟沙星10.00mg，羥基琥珀酰亞胺12.66mg，EDC 42.17mg，溶解在4.6ml二甲基甲酰胺中，反應(yīng)生成達(dá)氟沙星與EDC的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺18.03mg溶于20ml pH為7.40，濃度為0.01M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7.40；分別稱取1000.00mg BSA(分子量68,000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在25℃條件下攪拌反應(yīng)4小時；將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析72小時，然后改用蒸餾水透析30小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.40，濃度為0.01M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，備用；
(4)按達(dá)氟沙星與cBSA的摩爾比為30∶1量分別取溶液A和溶液B，在25℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應(yīng)4小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析72小時，再改用蒸餾水透析30小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物。
實(shí)施例3(1)液A的制備稱取達(dá)氟沙星10.00mg，羥基琥珀酰亞胺20.26mg，EDC 63.26mg，溶解在10ml二甲基甲酰胺中，反應(yīng)生成達(dá)氟沙星與EDC的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺18.52mg溶于20ml pH為7.56，濃度為0.02M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7.56；分別稱取1000.00mg BSA(分子量67,000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在22℃條件下攪拌反應(yīng)3小時；將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析80小時，然后改用蒸餾水透析20小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.56，濃度為0.02M的磷酸緩沖溶液中，配成12.0mg/ml的溶液，備用；(4)按達(dá)氟沙星與cBSA的摩爾比為50∶1量分別取溶液A和溶液B，在22℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應(yīng)5小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析80小時，再改用蒸餾水透析20小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物。
(7)用Sephadex-G75(Sigma)進(jìn)行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.40)為洗脫液。收集達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物純品。凍干得到達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物即達(dá)氟沙星免疫原固體粉末。
實(shí)施例4抗體的制備純化及檢測1.抗體的制備選擇上述實(shí)施例2所制備的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物作為免疫原進(jìn)行動物免疫實(shí)驗(yàn)以制備抗體。
取1mg/ml的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的溶液1ml，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射給四只體重2kg的雄性健康新西蘭大白兔，1ml/只，15天后以同量抗原與弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行二免，二免以后，每隔15天加強(qiáng)免疫一次，抗原量減半，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心臟采血，室溫靜置1小時，0-4℃過夜，13000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集血清，-20℃保存，備用。
2.抗體的純化攪拌狀態(tài)下向上述制備的抗血清中加入飽和硫酸銨至硫酸銨溶液的終濃度為體積百分比是50％，0-4℃放置過夜，有沉淀物析出；以13000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH7.4的PBS至沉淀溶解，然后加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨溶液的終濃度為體積百分比是33％，0-4℃放置過夜，有沉淀物析出；以13000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH7.4的PBS至沉淀溶解。將上述純化物用0.01M、pH7.4的PBS，0-4℃透析，換透析液3次，然后加入質(zhì)量體積百分比為0.02％的疊氮化鈉，-20℃保存，備用。
3.抗體的酶聯(lián)免疫檢測(1)效價測定方法采用常規(guī)的間接酶聯(lián)免疫吸附檢測法在96孔的酶標(biāo)板上，用100μl/孔的達(dá)氟沙星與卵清蛋白的偶聯(lián)物(10μg/ml)包被，0-4℃放置過夜，然后用PBST(1000mlpH7.4、濃度0.01M的PBS+體積百分比是0.05％Tween20)洗板四次；用250μl/孔封閉液(1000mlPBST+質(zhì)量體積百分比是1％卵清蛋白)封閉，室溫放置3小時，洗板；在洗去封閉液后，加100ul/孔的抗血清，室溫放置2小時，洗板；在洗去抗血清以后，每孔加入1∶1000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 100ul，室溫放置1小時，洗板；加入底物鄰苯二胺顯色，室溫放置10min，再加入2MHCl終止。酶標(biāo)儀A492nm檢測。
經(jīng)測定本發(fā)明所述達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物抗體效價達(dá)1∶256,000。
效價的判定以P/N大于2∶1的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗體的酶聯(lián)免疫檢測效價。
其中上述P為代測血清在某一稀釋倍數(shù)測定的吸光度值，上述N為陰性對照在相應(yīng)稀釋倍數(shù)測定的吸光度值。
(2)特異性測定測定步驟與效價測定類似，在上述最佳的包被抗原與抗體濃度條件下，加抗體的同時加入達(dá)氟沙星溶液(從100ppm-1ppt)，與包被抗原競爭結(jié)合有限的抗體，達(dá)氟沙星藥的濃度越高，抗體與包被抗原就結(jié)合得越少，從而顯色越淺，吸光度值越低。再與空白對照(只加抗體，未加達(dá)氟沙星藥的吸光度值)相比較，以確定抗體特異性。
通過測定抗體特異性較好，其最低檢測限可達(dá)到0.01ppb，檢測靈敏度較高，并且與喹諾酮類其它藥物的交叉反應(yīng)較小。
實(shí)施例5制備達(dá)氟沙星與卵清蛋白的偶聯(lián)物(1)A的制備稱取達(dá)氟沙星10.00mg，羥基琥珀酰亞胺12.75mg，EDC 42.17mg，溶解在4.6ml二甲基甲酰胺中，反應(yīng)生成達(dá)氟沙星與EDC的活性中間體，備用；(2)溶液B的配制把卵清蛋白溶于pH為7.40，濃度為0.01M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，備用；(3)按達(dá)氟沙星與卵清蛋白的摩爾比為30∶1量分別取溶液A和溶液B，在25℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應(yīng)4小時，得到溶液C；(4)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析72小時，再改用蒸餾水透析24小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(5)凍干上清液，得到白色達(dá)氟沙星與卵清蛋白的偶聯(lián)物。
權(quán)利要求
1.一種達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物，由達(dá)氟沙星半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物，其中所述產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)是牛血清蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的達(dá)氟沙星的分子個數(shù)，所述n為整數(shù)1～20，BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9Kda；上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜281nm，323nm，334nm。
4.如權(quán)利要求3所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物，其特征是所述n為整數(shù)5～15，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是將達(dá)氟沙星與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
6.如權(quán)利要求5所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法，由如下步驟完成(1)溶液A的制備將達(dá)氟沙星，羥基琥珀酰亞胺，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(EDC)，以摩爾比1∶2～8∶5～15溶解在二甲基甲酰胺中，反應(yīng)生成達(dá)氟沙星與乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)cBSA的制備在0～4℃條件下，先將乙二胺溶于pH為7.38～7.56，濃度為0.01M～0.02M磷酸緩沖溶液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7.38～7.56；以乙二胺∶BSA∶EDC的摩爾比為15～25∶1∶15～25的量稱取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃±5℃條件下攪拌反應(yīng)2～4小時；將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在0～4℃條件下，用上述磷酸緩沖液攪拌透析70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；在0～4℃，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；凍干上清液，得到白色粉末固體cBSA，備用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH為7.38～7.56，濃度為0.01M～0.02M的磷酸緩沖溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，備用；(4)按達(dá)氟沙星與cBSA的摩爾比為15～50∶1量分別取溶液A和溶液B，在20℃±5℃溫度下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應(yīng)4～6小時，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸緩沖液攪拌透析70～80小時，再改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；然后在0～4℃下，以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心上述透析后的溶液15分鐘，取上清液；(6)凍干上清液，得到白色達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物。
7.如權(quán)利要求6所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是步驟(1)所述達(dá)氟沙星與羥基琥珀酰亞胺、EDC摩爾比為1∶5∶10。
8.如權(quán)利要求6所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是步驟(2)所述乙二胺與牛血清蛋白、EDC的摩爾比為20∶1∶20。
9.如權(quán)利要求6所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是步驟(4)所述的達(dá)氟沙星與牛血清蛋白的摩爾數(shù)比為30∶1。
10.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物作為免疫原在制備達(dá)氟沙星特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通式(I)的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物，由達(dá)氟沙星半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。其中n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的達(dá)氟沙星的分子數(shù)，所述n為整數(shù)1～20，BSA為牛血清蛋白，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa。本發(fā)明還公開了所述的偶聯(lián)物的制備方法，即將達(dá)氟沙星與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明的達(dá)氟沙星的偶聯(lián)物通過免疫新西蘭大白兔，制備了效價達(dá)1∶256,000的抗血清，其最低檢測限為0.01ppb。本發(fā)明具有方法簡便，快速，特異，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為制備達(dá)氟沙星的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒提供了基礎(chǔ)。
文檔編號C07K1/00GK1827643SQ20061004320
公開日2006年9月6日 申請日期2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月14日
發(fā)明者郗日沫, 盧圣欣, 張玉蘭 申請人:山東大學(xué)