專利名稱：花鱸白細胞介素8基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)中的基因領(lǐng)域，特別是關(guān)于花鱸白細胞介素8基因序列。
背景技術(shù)：
白介素8(interleukin 8 IL-8)基因又稱噬中性粒細胞激活因子或粒細胞趨化因子，屬C-X-C型趨化性因子，是最早發(fā)現(xiàn)的趨化性因子。它由單核—巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、上皮細胞和肥大細胞等多種細胞經(jīng)炎癥刺激后產(chǎn)生，具有趨化和激活嗜中性粒細胞的能力，包括吸引噬中性粒細胞向炎癥部位遷移，并誘導(dǎo)它們脫顆粒，釋放溶菌酶，啟動呼吸代謝爆發(fā)，增加細胞表面粘附分子的表達等多種功能，在炎癥發(fā)生和發(fā)展過程中有重要的作用，是一種重要的免疫抗病基因。目前隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害問題日趨嚴重，因此從魚體自身入手，提高魚體免疫力是當今病害防治的趨勢。至今對花鱸免疫基因的研究還較少，尤其對IL-8的研究還屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過以近源物種IL8基因的CDS序列的保守區(qū)設(shè)計的兼并引物，并用PCR法擴增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到花鱸白細胞介素8(IL-8)基因的全表達序列。其核苷酸如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)措施實現(xiàn)1、總RNA的提取解剖魚體取出脾臟，使用Trizol進行勻漿，按照使用說明提取花鱸總RNA。2、cDNA第一鏈的合成花鱸總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物(oligo-dT接頭引物)混合，進行反轉(zhuǎn)錄。
3、引物設(shè)計依據(jù)，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、虹鱒、牙鲆、鯉魚等)IL8同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計兼并引物，擴增片段大小約為180bp。引物設(shè)計后采用β-乙睛亞磷酰胺化學(xué)法進行DNA合成。
引物序列為F5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’R5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA 3’4、IL-8基因cDNA全序列的克隆以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，所擴增的PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)簡并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質(zhì)粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。
根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計特異性引物，利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對目的基因的3′和5′末端進行PCR擴增。
在3′RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側(cè)引物和接頭引物進行PCR反應(yīng)，所得產(chǎn)物利用內(nèi)側(cè)和接頭引物再進行PCR擴增。
在5′RACE中，利用末端轉(zhuǎn)移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作為模板，利用外側(cè)特異性引物和OligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物再利用內(nèi)側(cè)引物和OligodG進行第二次PCR擴增。
所得到的PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，用M13引物對質(zhì)粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼并引物擴增所得的序列利用Clustal W軟件進行拼接。
5、對花鱸白細胞介素8(IL-8)基因的測定所得到的PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，用3730測序儀對質(zhì)粒DNA進行測序。測序結(jié)果用BLAST軟件進行同源性測定，來確定為花鱸IL-8同源序列。比對結(jié)果Score ESequences producing significant alignments(Bits) Valuegi|74095881|ref|NP 001027759.1|interleukin-8[Takifugu rubri...1592e-38gi|62901686|gb|AAY18807.1|interleukin 8[Acanthopagrus schlege|1541e-36
gi|19911219|dbj|BAB86884.1|CXC chemokine [Paralichthys olivaceu1463e-34gi|15667642|gb|AAL05442.1|interleukine-8[Paralichthys olivaceu1448e-34gi|52547128|gb|AAU81660.1|interleukin-8[Gadus morhua]1419e-33gi|77621310|emb|CAD59734.2|interleukin-8[Gadus morhua]1387e-32gi|91701717|gb|ABE47600.1|interleukin-8[Cyprinus carpio]1302e-29gi|31087942|gb|AAP42829.1|interleukin 8X[Oncorhynchus mykis...1262e-28本發(fā)明的優(yōu)點隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害問題日趨嚴重，一般的抗生素藥物極易引起環(huán)境污染，因此從魚體自身入手，提高魚體免疫力是病害防治的趨勢。因此該基因的獲得，不僅為研究魚類IL-8在炎癥反應(yīng)中的作用，進一步探討魚類炎癥反應(yīng)的發(fā)生機理奠定基礎(chǔ)，而且通過氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫佐劑提供理論基礎(chǔ)。
具體實施例方式
1.總RNA的提取取鮮活健康花鱸(體重約400g)在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)2d后(水溫約24℃，氣泵充氣)，從胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖魚體取出脾臟約100mg，分別放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中進行勻漿，按照試劑盒使用說明提取總RNA。
2.cDNA第一鏈的合成取花鱸總RNA 5μg與反轉(zhuǎn)錄引物(oligo-dT接頭引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加熱5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為25μL。反應(yīng)過程為42℃ 60min，70℃ 15min，最后放入-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.引物設(shè)計依據(jù)，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、虹鱒、牙鲆、鯉魚等)IL8同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計兼并引物，擴增片段大小約為180bp。引物設(shè)計后采用β-乙睛亞磷酰胺化學(xué)法進行DNA合成。
引物序列為F5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’R5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA 3’4.IL-8基因cDNA全序列的克隆以近源物種IL8基因CDS序列的保守區(qū)設(shè)計的兼并引物，擴增片段大小約為180bp。
以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系為10xPCR反應(yīng)緩沖液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水將反應(yīng)體系補充至50μL。反應(yīng)條件為1個循環(huán)，94℃變性5min；35個循環(huán)94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1個循環(huán)，72℃延伸10min；4℃保溫。所擴增的PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)簡并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質(zhì)粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。
根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計特異性引物。利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對目的基因的3′和5′末端進行PCR擴增。
在3′RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側(cè)引物和接頭引物進行PCR反應(yīng)，所得產(chǎn)物稀釋50倍后，取1μL作為模板，利用內(nèi)側(cè)和接頭引物再進行PCR擴增。
在5′RACE中，利用末端轉(zhuǎn)移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作為模板，利用外側(cè)特異性引物和OligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物取1μL作為模板，再利用內(nèi)側(cè)引物和OligodG進行第二次PCR擴增。
所得到的PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，用M13引物對質(zhì)粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼并引物擴增所得的序列利用Clustal W軟件進行拼接。
5.對花鱸白細胞介素8(IL-8)基因的測定所得到的PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，用3730測序儀對質(zhì)粒DNA進行測序。測序結(jié)果用BLAST軟件進行同源性測定，來確定為花鱸IL-8同源序列。比對結(jié)果Score ESequences producing significant alignments (Bits)Valuegi|74095881|ref|NP 001027759.1|interleukin-8[Takifugu rubri...1592e-38gi|62901686|gb|AAY18807.1|interleukin 8[Acanthopagrus schlegel1541e-36gi|19911219|dbj|BAB86884.1|CXC chemokine[Paralichthys olivaceu1463e-34gi|15667642|gb|AAL05442.1|interleukine-8[Paralichthys olivaceu1448e-34gi|52547128|gb|AAU81660.1|interleukin-8[Gadus morhua]1419e-33gi|77621310|emb|CAD59734.2|interleukin 8[Gadus morhua]1387e-32gi|91701717|gb|ABE47600.1|interleukin 8[Cypr inus carpio]1302e-29gi|31087942|gb|AAP42829.1|interleukin 8X[Oncorhynchus mykis...1262e-28
序列表<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所<120>花鱸白細胞介素8基因序列<160>2<210>1<211>803<212>RNA<213>花鱸(Lateolabrax Japonicus)<220>
<221>3’UTP<222>(460)…(803)<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(159)<220>
<221>CDS<222>(160)...(459)<220>
<221>PolyA site<222>(788)...(803)<400>1ccaagaaaag gaaaagtaga gagagtgaac tcagtgaaag aataaggaat acagaagaat60aaaaaacttc tttactttta tacaggcttc atcagacggc tttctgaagg gcattcatat120ccttagtgat aatttgttgc aaaatttgta aaaggcaaa atg aag agc agc aga 174Met Lys Ser Ser Arg1 5gtg att gtc acc tct act gtg gtg ctc ctg gct ttc ttg gcc atc act 222Val Ile Val Thr Ser Thr Val Val Leu Leu Ala Phe Leu Ala Ile Thr6 12 18gaa ggg atg agt ctg aga agc ctt gga gtg gag ctg cac tgc cgc tgc 270Glu Gly Met Ser Leu Arg Ser Leu Gly Val Glu Leu His Cys Arg Cys22 28 34att gag acg gag agc aaa ccc atc ggc cgc cac att gag aag gtg gag 318Ile Glu Thr Glu Ser Lys Pro Ile Gly Arg His Ile Glu Lys Val Glu38 44 50ctg att cct gcc aac tcc cac tgc gag gag act gag ctc att gcc act 366Leu Ile Pro Ala Asn Ser His Cys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Ala Thr54 60 66ctg aag aag aca ggc caa gaa gtt tgc ctg gac ccg gag gct ccc tgg 414Leu Lys Lys Thr Gly Gln Glu Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp70 76 82gtc aag aaa gtc atg aac aag ttc ctg tcc aac aga aca ccc tga 459Val Lys Lys Val Met Asn Lys Phe Leu Ser Asn Arg Thr Pro86 92 98
acagatcggg agagatgtgt ttcatgagtc tgaacaattt caaagtacta aaaagtattt519atttgatagt catcacactc aatttaatac aatcaactgt caatttgatc aactgttgaa579aatgacaaca gaatttacca agtaaggtta tgtttgtatc aaacatgtgt gttaacaagc639ctgtgcttgt ttgtatgtca cttgtgtgtg ttactgtgta ttcttatcta taacttattt699gcttaaaata tttattgata tatttatgat gtaaatgtca attgtttagc tctgctgaca759accaattgat ttattaaaaa agtttaccta aaaaaaaaaaa aaa 803<210>2<211>99<212>PRT<213>花鱸(Lateolabrax Japonicus)<400>2Met Lys Ser Ser Arg Val Ile Val Thr Ser Thr Val Val Leu Leu1 7 13Ala Phe Leu Ala Ile Thr Glu Gly Met Ser Leu Arg Ser Leu Gly16 22 28Val Glu Leu His Cys Arg Cys Ile Glu Thr Glu Ser Lys Pro Ile31 37 43Gly Art His Ile Glu Lys Val Glu Leu Ile Pro Ala Asn Ser His46 52 58Cys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Lys Thr Gly Gln61 67 73Glu Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Val Lys Lys Val Met76 82 88Asn Lys Phe Leu Ser Asn Arg Tht Pro91 9權(quán)利要求
1.一種花鱸白細胞介素8基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQID NO.1所述。
2.一種花鱸白細胞介素8基因，它的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.2所述。
全文摘要
本發(fā)明以近源物種IL8基因的CDS序列的保守區(qū)設(shè)計兼并引物，從花鱸魚的脾臟中提取總RNA，用PCR法擴增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到花鱸白細胞介素8(IL－8)基因的全表達序列。該基因不僅為研究魚類IL－8在炎癥反應(yīng)中的作用，進一步探討魚類炎癥反應(yīng)的發(fā)生機理奠定基礎(chǔ)，而且通過氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫佐劑提供理論基礎(chǔ)。
文檔編號C07K14/54GK1869229SQ200610035460
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月15日
發(fā)明者江世貴, 邱麗華, 張漢華, 黃桂菊 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所