專(zhuān)利名稱(chēng)：豬血血紅蛋白生物酶解制備低分子肽及氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肉制品加工副產(chǎn)物血液蛋白資源的綜合利用領(lǐng)域，具體是指豬血血紅蛋白生物酶解制備低分子肽及氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
來(lái)自于肉制品加工副產(chǎn)物的動(dòng)物血液含有19％左右的蛋白質(zhì)，與瘦肉中蛋白質(zhì)含量相當(dāng)，其中20％存在于血漿中，另外多達(dá)80％存在于血紅細(xì)胞中，而且其氨基酸組成平衡，尤其是賴氨酸、色氨酸含量高，是一種優(yōu)質(zhì)而廉價(jià)的蛋白質(zhì)資源。
近年來(lái)對(duì)血液蛋白主要是血漿蛋白的開(kāi)發(fā)利用取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)存在于血紅細(xì)胞中占血液總蛋白含量80％的血紅蛋白，由于其難以被消化吸收、生物利用率低且色澤易于褐變、腥味難以祛除，即使微量添加仍然會(huì)引起食品品質(zhì)的劣變，尚無(wú)較好的解決辦法，這就嚴(yán)重制約了大量血液資源的開(kāi)發(fā)利用。目前雖然有少部分血液用于生產(chǎn)附加值較低的產(chǎn)品，如血豆腐、血腸及飼用血粉，但其它大部分血液直接排放廢棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染(其化學(xué)需氧量高達(dá)500,000mg/L)。鑒此，在資源短缺和環(huán)境污染問(wèn)題日益突出的今天，采用現(xiàn)代食品加工技術(shù)和生物技術(shù)，進(jìn)行血液蛋白尤其是血紅蛋白資源的精深加工及其系列產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)，對(duì)解決目前血液資源精深加工的瓶頸問(wèn)題具有重要意義。
在上個(gè)世紀(jì)70年代開(kāi)始就有國(guó)外學(xué)者Tybor、Autio、Janaína、Kuppevelt、Hayakawa等采用有機(jī)溶劑法、羧甲基纖維素(CMC)法從血紅蛋白中提取珠蛋白。前者的蛋白質(zhì)回收率雖然可達(dá)81.4％，但是有溶劑殘留而不適合于在食品工業(yè)中使用；后者的營(yíng)養(yǎng)和功能特性都比較好，可是蛋白質(zhì)回收率最高只能達(dá)到60％，且成本高，尚未規(guī)?；a(chǎn)。Buckley K.、Jeng-Huh Yang和Wismer-Pedersen，J.等人分別采用過(guò)氧化物氧化法來(lái)脫去血紅蛋白的顏色，取得了一定的效果，但此類(lèi)方法殘留的過(guò)氧化氫會(huì)影響到食品的衛(wèi)生安全。后來(lái)亦有學(xué)者(Houlier、Synowiecki、Ockerman)采用Alcalase酶水解法來(lái)提取血紅蛋白中的珠蛋白，蛋白質(zhì)回收率可達(dá)到70-80％，但酶解產(chǎn)物具有較重的苦味，影響了這種方法的推廣和使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)豬血血紅蛋白在食品工業(yè)生產(chǎn)中不能規(guī)模化應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題，提供一種豬血血紅蛋白生物酶解制備低分子肽及氨基酸的方法，使蛋白質(zhì)回收率提高到90-95％，本發(fā)明無(wú)二次污染，幾乎達(dá)到零排放，而且產(chǎn)物沒(méi)有苦味，具有很高的溶解性和起泡性，兼具突出的保濕性能。
本發(fā)明的豬血血紅蛋白生物酶解制備低分子肽及氨基酸的方法，包括如下步驟(1)豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為11.4-16.5％重量，調(diào)節(jié)溶液pH值到7.2-7.7，溫度保持在50-55℃，加入胰酶和Protamex、Flavourzyme或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶，酶與蛋白濃度比為330-720U/g，反應(yīng)時(shí)間為12-17h，水解度控制在24-30％；(2)將步驟(1)得到的水解產(chǎn)物通過(guò)離心分離除去不溶解的沉淀部分。
步驟(1)中，所述的蛋白酶均為已在食品工業(yè)中廣泛使用并且安全的食品級(jí)用酶，其混合蛋白酶具體比例(U/U)如下胰酶∶Protamex＝1-2∶9；胰酶∶Flavourzyme＝1-2∶4；胰酶∶木瓜蛋白酶＝1-2∶8。
步驟(2)中，可以將步驟(1)得到的水解產(chǎn)物在20℃、3000g-4000g條件下離心10-20min，除去不溶解的沉淀部分。
步驟(2)的產(chǎn)物濃縮至濃度為25-30％，其蛋白質(zhì)回收率可達(dá)90-95％，而且產(chǎn)物沒(méi)有苦味。濃縮后噴霧干燥，得到粉狀豬血血紅蛋白酶解物。
在步驟(1)，可以用2M NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.7。
步驟(1)水解反應(yīng)結(jié)束后，可在95-100℃條件下加熱5-10min進(jìn)行滅菌，將酶解產(chǎn)物冷卻到25℃。
所述豬血血紅蛋白可以采用現(xiàn)有技術(shù)得到，本發(fā)明采用下述方法制備得到檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33％檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng)過(guò)3000-4000g、5-10℃離心10-20min，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.0-1.5倍體積的水再經(jīng)50-60Mpa均質(zhì)或超聲波功率為1000-1500W超聲處理2-3min破胞得到豬血血紅蛋白。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)不同的蛋白酶和水解條件對(duì)血紅蛋白的降解、產(chǎn)物的風(fēng)味和功能特性以及蛋白質(zhì)回收率都有重要影響，本發(fā)明通過(guò)高壓均質(zhì)或超聲處理破碎血紅細(xì)胞結(jié)合篩選優(yōu)化出的蛋白酶最佳組合，采用可控酶解技術(shù)降解血紅蛋白制備符合食品工業(yè)應(yīng)用要求的低分子肽及氨基酸。該方法反應(yīng)條件溫和，無(wú)二次污染，蛋白質(zhì)回收率較其它方法有顯著提高，最高可達(dá)95％，比目前文獻(xiàn)報(bào)道的最好水平提高了15-20％。產(chǎn)物無(wú)不良風(fēng)味，具有很高的溶解性和起泡性，兼具突出的保濕性能。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33％檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng)過(guò)3000g、5℃離心20分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.0倍體積的水再經(jīng)50Mpa均質(zhì)破胞得到豬血血紅蛋白，取豬血血紅蛋白500g。
第二步500g豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為14.5％，混合均勻后用2MNaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.5，加熱并保持溫度在55℃時(shí)，加入胰酶和Protamex，比例為胰酶∶Protamex＝1.8∶9(U/U)，[酶/蛋白]濃度＝710U/g，恒溫狀態(tài)下酶解13h，水解度為25％，反應(yīng)結(jié)束后在100℃條件下加熱5min，將酶解產(chǎn)物冷卻到25℃。
第三步將冷卻后水解產(chǎn)物在20℃、3000g條件下離心20min，除去不溶解的沉淀部分，將清液濃縮，樣品濃度為25-30％。
第四步濃縮后的樣品噴霧干燥得到產(chǎn)物。經(jīng)檢驗(yàn)，其主要成分是分子量為10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白質(zhì)計(jì)為93.7％，蛋白回收率為94.5％。
實(shí)施例2第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33％檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng)過(guò)4000g、10℃離心10分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.4倍體積的水再經(jīng)60Mpa均質(zhì)破胞得到豬血血紅蛋白，取豬血血紅蛋白500g。
第二步500g豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為11.6％，混合均勻后用2MNaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.2，加熱并保持溫度在51℃時(shí)，加入胰酶和Protamex，比例為胰酶∶Protamex＝1.1∶9(U/U)，[酶/蛋白]濃度＝670U/g，恒溫狀態(tài)下酶解16h，水解度為28％，反應(yīng)結(jié)束后在100℃條件下加熱5min，將酶解產(chǎn)物冷卻到25℃。
第三步將冷卻后水解產(chǎn)物在20℃、4000g條件下離心10min，除去不溶解的沉淀部分，將清液濃縮，樣品濃度為26-30％。
第四步濃縮后的樣品噴霧干燥得到產(chǎn)物。經(jīng)檢驗(yàn)，其主要成分是分子量為10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白質(zhì)計(jì)為92.9％，蛋白回收率為93.7％。
實(shí)施例3第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33％檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng)過(guò)3500g、5℃離心15分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.2倍體積的水再經(jīng)超聲波功率為1300W超聲3min破胞得到豬血血紅蛋白，取豬血血紅蛋白5kg。
第二步5kg豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為12.5％，然后用2M NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.5，加熱并保持溫度在53℃時(shí)，加入胰酶和木瓜蛋白酶，比例為胰酶∶木瓜蛋白酶＝1.9∶8(U/U)，[酶/蛋白]濃度＝650U/g，恒溫狀態(tài)下酶解12h，水解度為24％，反應(yīng)結(jié)束后在100℃條件下加熱10min，將酶解產(chǎn)物冷卻到25℃。
第三步將冷卻后水解產(chǎn)物在20℃、3500g條件下離心15min，除去不溶解的沉淀部分，將上清液濃縮(最終濃度為26％)。
第四步濃縮后的樣品噴霧干燥得到產(chǎn)物。經(jīng)檢驗(yàn)，其主要成分是分子量為10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白質(zhì)計(jì)為93.1％，蛋白回收率為92.9％。
實(shí)施例4第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33％檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng)過(guò)3800g、7℃離心12分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.5倍體積的水再經(jīng)超聲波功率為1000W超聲3min破胞得到豬血血紅蛋白，取豬血血紅蛋白5kg。
第二步5kg豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為11.5％，然后用2MNaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.5，加熱并保持溫度在51℃時(shí)，加入胰酶和木瓜蛋白酶，比例為胰酶∶木瓜蛋白酶＝1.2∶8(U/U)，[酶/蛋白]濃度＝610U/g，恒溫狀態(tài)下酶解16h，水解度為29％，反應(yīng)結(jié)束后在95℃條件下加熱10min，將酶解產(chǎn)物冷卻到25℃。
第三步將冷卻后水解產(chǎn)物在20℃、3500g條件下離心15min，除去不溶解的沉淀部分，將上清液濃縮(最終濃度為29％)。
第四步濃縮后的樣品噴霧干燥得到產(chǎn)物。經(jīng)檢驗(yàn)，其主要成分是分子量為10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白質(zhì)計(jì)為91.4％，蛋白回收率為93.0％。
實(shí)施例5第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33％檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng)過(guò)4000g、10℃離心10分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.5倍體積的水再經(jīng)60Mpa均質(zhì)破胞得到豬血血紅蛋白，取豬血血紅蛋白30kg。
第二步30kg豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為11.4％，混合均勻后用2MNaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.6，加熱并保持溫度在50℃時(shí)，加入胰酶和Flavourzyme，比例為胰酶∶Flavourzyme＝1.8∶4(U/U)，[酶/蛋白]濃度＝380U/g，恒溫下酶解13h，水解度為25％，反應(yīng)結(jié)束后在100℃條件下加熱8min，將酶解產(chǎn)物冷卻到25℃。
第三步將冷卻后水解產(chǎn)物20℃、4000g條件下離心10min，除去不溶解的沉淀部分，將上清液濃縮到27％。
第四步濃縮后的樣品噴霧干燥得到產(chǎn)物。經(jīng)檢驗(yàn)，其主要成分是分子量為10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白質(zhì)計(jì)為94.0％，蛋白回收率為90.6％。
實(shí)施例6第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33％檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng)過(guò)3000g、5℃離心20分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.0倍體積的水再經(jīng)超聲波功率為1300W超聲2.5min破胞得到豬血血紅蛋白，取豬血血紅蛋白30kg。
第二步30kg豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為16.4％，混合均勻后用2MNaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.2，加熱并保持溫度在54℃時(shí)，加入胰酶和Flavourzyme，比例為胰酶∶Flavourzyme＝1.0∶4(U/U)，[酶/蛋白]濃度＝330U/g，恒溫狀態(tài)下酶解17h，水解度為30％，反應(yīng)結(jié)束后在100℃條件下加熱10min，將酶解產(chǎn)物冷卻到25℃。
第三步將冷卻后水解產(chǎn)物20℃、3000g條件下離心20min，除去不溶解的沉淀部分，將上清液濃縮到26％。
第四步濃縮后的樣品噴霧干燥得到產(chǎn)物。經(jīng)檢驗(yàn)，其主要成分是分子量為10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白質(zhì)計(jì)為92.6％，蛋白回收率為91.1％。
權(quán)利要求
1.一種豬血血紅蛋白生物酶解制備低分子肽及氨基酸的方法，其特征在于包括如下步驟(1)豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為11.4-16.5％重量，調(diào)節(jié)溶液pH值到7.2-7.7，溫度保持在50-55℃，加入胰酶和Protamex、Flavourzyme或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶，酶與蛋白濃度比為330-720U/g，反應(yīng)時(shí)間為12-17h，水解度控制在24-30％；(2)將步驟(1)得到的水解產(chǎn)物通過(guò)離心分離除去不溶解的沉淀部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的混合蛋白酶用量比例(U/U)如下胰酶∶Protamex＝1-2∶9；胰酶∶Flavourzyme＝1-2∶4；胰酶∶木瓜蛋白酶＝1-2∶8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(1)中，用2MNaOH調(diào)節(jié)溶液pH。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)中水解反應(yīng)結(jié)束后，在95-100℃條件下加熱5-10min，將酶解產(chǎn)物冷卻到25℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(2)中，將步驟(1)得到的水解產(chǎn)物在20℃、3000g-4000g條件下離心10-20min，除去不溶解的沉淀部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述豬血血紅蛋白采用下述方法制備得到檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33％檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng)過(guò)3000-4000g、5-10℃離心10-20min，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.0-1.5倍體積的水再經(jīng)50-60Mpa均質(zhì)或超聲波功率為1000-1500W超聲處理2-3min破胞得到豬血血紅蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬血血紅蛋白生物酶解制備低分子肽及氨基酸的方法，包括豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為11.4－16.5％重量，調(diào)節(jié)溶液pH值到7.2－7.7，溫度保持在50－55℃，加入胰酶和Protamex、Flavourzyme或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶，酶與蛋白濃度比為330－720U/g，反應(yīng)時(shí)間為12－17h，水解度控制在24－30％；得到的水解產(chǎn)物通過(guò)離心分離除去不溶解的沉淀部分。本發(fā)明采用細(xì)胞破碎技術(shù)并結(jié)合篩選出的復(fù)合蛋白酶的最佳組合，優(yōu)化了反應(yīng)條件，使蛋白質(zhì)回收率提高到90－95％，產(chǎn)物無(wú)不良風(fēng)味，具有很高的溶解性和起泡性，兼具突出的保濕性能，可廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。
文檔編號(hào)C07K14/795GK1858228SQ20061003469
公開(kāi)日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月28日
發(fā)明者趙謀明, 郭善廣, 崔春, 趙強(qiáng)忠 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)