專利名稱：一種重組蝎昆蟲(chóng)毒素及其可溶性表達(dá)和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組蝎昆蟲(chóng)毒素，具體屬于一種可溶性表達(dá)富含二硫鍵的重組蝎昆蟲(chóng)神經(jīng)毒素及其分離純化方法。
背景技術(shù)：
東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch)是我國(guó)的主要蝎種，廣泛分布于中國(guó)西北部、蒙古及韓國(guó)，毒性溫和，毒液中富含生物活性多肽物質(zhì)，有極大的藥用價(jià)值。幾千年前，蝎煎劑就被用來(lái)治療中風(fēng)等疾病，近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)其含有抗癌多肽、抗癲癇肽、抗菌肽等。蝎子的有效成分是具有生物活性的多肽，即蝎毒素。據(jù)估計(jì)，蝎毒素大約有100000種，已發(fā)現(xiàn)的只占0.02％，大多數(shù)屬離子通道阻滯劑，特異識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞膜上的Na+、K+、Cl-、Ca2+等離子通道，調(diào)節(jié)離子通道的啟閉或阻斷離子的通過(guò)。
目前，對(duì)離子通道疾病的深入研究發(fā)現(xiàn)除了很多遺傳疾病(如癲癇等)與離子通道相關(guān)外，惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等都與離子通道密切相關(guān)，如Cl-通道變異引起的腦膠質(zhì)瘤、L型鈣通道變異與結(jié)腸腫瘤相關(guān)等。因此，除了離子通道相關(guān)藥可用于治療神經(jīng)性疾病，進(jìn)一步深入研究其對(duì)細(xì)胞膜離子通道的作用、對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的影響及與腫瘤細(xì)胞的聯(lián)系等具有重要意義。為開(kāi)發(fā)以離子通道作為靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物提供一個(gè)新的研究方向。
同時(shí)，蝎毒素中有一類多肽具有對(duì)昆蟲(chóng)專一選擇性地神經(jīng)致死作用，而對(duì)于哺乳動(dòng)物無(wú)害或毒性很小，因此開(kāi)發(fā)此類毒素，作為一種高效生物殺蟲(chóng)劑用于害蟲(chóng)的生物防治，在農(nóng)業(yè)上有非常誘人的前景。
然而，目前從天然蝎毒中分離出單一蝎昆蟲(chóng)毒素組分，在質(zhì)和量上都非常困難，因此，克隆昆蟲(chóng)毒素基因，并通過(guò)基因工程的方式來(lái)表達(dá)該蛋白，成為首選方案。但是，由于蝎神經(jīng)毒素疏水性強(qiáng)，富含二硫鍵，在工程菌中易形成無(wú)活性的包涵體形式?，F(xiàn)在大多數(shù)重組毒素通過(guò)變復(fù)性來(lái)獲得，但該方法產(chǎn)率低。本發(fā)明采用融合表達(dá)方式獲得可溶性的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT，并建立了簡(jiǎn)單有效的純化方法。該表達(dá)純化方法也適用于其他重組蝎毒素等富含二硫鍵的神經(jīng)毒素的表達(dá)純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT及其可溶性融合表達(dá)方法，包括構(gòu)建一個(gè)可溶性融合表達(dá)質(zhì)粒，提供一種重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的分離純化方法。
本發(fā)明提供的一種重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT，其氨基酸序列為Gly Arg Ala Met Gly Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser GlyLys Val Ser Glu Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Cys Asn Asn Ile Cys ThrLys Val Tyr Tyr Ala Thr Ser Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys TyrCys Phe Gly Leu Asp Asp Asp Lys Ala Val Leu Lys Ile Lys Asp AlaThr Lys Ser Tyr Cys Asp Val Gln Ile Ile Gly His His His His His His***編碼所述的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的基因，其核苷酸序列為gga aga gcc atg ggc aag aag aat gga tac gct gtc gat agt agt ggtaaa gtt agt gaa tgt ttg tta aac aat tac tgc aac aac ata tgc acaaaa gta tat tat gct acg agc gga tat tgc tgc tta cta tca tgt tattgc ttc ggt cta gat gac gat aaa gca gtt ttg aag atc aag gac gcgacc aaa tct tat tgc gac gtc caa ata att ggt cat cat cat cat cat cat taa本發(fā)明重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的可溶性融合表達(dá)方法，包括PCR引物設(shè)計(jì)、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、融合蛋白的表達(dá)，具體包括如下步驟(1)本發(fā)明首先專門(mén)設(shè)計(jì)合成了PCR擴(kuò)增蝎昆蟲(chóng)毒素BmK IT cDNA的引物序列如下上游引物5’-CTGA GCC ATG GGC AAG AAG AAT GGA TAC GCT-3’，下游引物5’-CGCGCTG CAGTTAATG ATG ATG ATG ATG ATGACC AAT TAT TTG GACGTC-3’。在上游和下游引物的引導(dǎo)下，以含蝎昆蟲(chóng)毒素基因的載體為模板[含蝎昆蟲(chóng)毒素基因的載體由本課題組構(gòu)建，發(fā)表于高技術(shù)通訊(梁愛(ài)華，李曉玲，蘇智廣Cloning andSequencing of an Excitatory Insect-Selective Neurotox in BmKIT cDNA from Buthusmartensii Karsch.高技術(shù)通訊，1999，9(6)12-15)，蝎昆蟲(chóng)毒素基因登錄號(hào)Y17050]，利用PCR技術(shù)合成目的基因片段。在合成的BmK IT基因片段的3’端含六個(gè)編碼組氨酸密碼子，它可以在不改變產(chǎn)物BmK IT的氨基酸排列順序和生物活性的基礎(chǔ)上，大大提高BmK IT純化產(chǎn)率。
(2)將上述擴(kuò)增得到的BmK IT cDNA與一種含有蛋白自剪接元件(內(nèi)含肽intein)基因的原核表達(dá)載體pTWIN1連接(表達(dá)載體pTWIN 1購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)有限公司)，構(gòu)建成高效表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1-IThis6。
(3)將重組表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1-IThis6轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)，工程菌pTWIN1-IThis6/BL21培養(yǎng)在LB液體培養(yǎng)基中，在誘導(dǎo)溫度為20℃，IPTG濃度為0.4mM，誘導(dǎo)10個(gè)小時(shí)時(shí)，目的蛋白以可溶的形式存在，且經(jīng)許多次傳代后表達(dá)量仍很穩(wěn)定。
本發(fā)明在上述重組蝎昆蟲(chóng)毒素可溶性融合表達(dá)的基礎(chǔ)上又建立了分離純化的方法，包括將工程菌的發(fā)酵液經(jīng)菌體的破碎、蛋白抽提、融合蛋白自剪切與親和層析、樣品濃縮以及高溫處理和凝膠過(guò)濾層析精制等，獲得電泳純的重組蝎昆蟲(chóng)毒素BmK IT。所建立的方法穩(wěn)定、步驟簡(jiǎn)單、回收率高。具體分離純化步驟包括(1)用冷凍離心機(jī)將工程菌的發(fā)酵液于4℃下以8000rpm的速度離心離心收集菌體，用0.1M pH8.5的磷酸鹽緩沖液(10-30％的甘油，pH8.5)重新懸浮，用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，細(xì)胞破碎液12000rpm離心后，將澄清的細(xì)胞粗提物注入Ni-NTA柱(Ni-NTAagarose購(gòu)自QIAGEN公司)，與柱材料充分結(jié)合，用10倍柱床體積的洗滌緩沖液(含200mM咪唑，10-30％的甘油，pH6.5)洗滌柱材料，然后室溫放置過(guò)夜，在pH6.5條件下，誘導(dǎo)內(nèi)含肽的自我裂解活性。次日用10倍柱床體積的洗滌緩沖液繼續(xù)洗滌Ni-NTA柱，然后用3倍柱床體積的洗脫緩沖液(100mM EDTA，10-30％的甘油，pH6.5)將目的蛋白洗脫收集。
(2)將上述洗脫液用超濾方法進(jìn)行濃縮，并將濃縮液置于80℃-100℃水浴10-30min，離心取上清，以去除內(nèi)含肽和未正確折疊的重組毒素等其它雜蛋白。將該上清加入到superdex 75H/R凝膠層析柱中，用流速為0.5-1.0mL/min的磷酸鹽緩沖液洗滌至出峰完畢，收集目的峰。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下特點(diǎn)①由于蝎毒素疏水性強(qiáng)，在水溶液中容易聚合形成沉淀，通過(guò)對(duì)緩沖液各成分進(jìn)行優(yōu)化，本發(fā)明實(shí)施中，在緩沖液中添加20％的甘油使重組蝎毒素穩(wěn)定，對(duì)后續(xù)的進(jìn)一步純化非常有利；②為了提高蝎昆蟲(chóng)毒素BmK IT的可溶性，本發(fā)明將目的蛋白與一種蛋白自剪接元件(內(nèi)含肽)Ssp DnaB intein融合表達(dá)。同時(shí)，由于重組蛋白C端融合有6個(gè)組氨酸，可以在Ni-NTA親和層析柱利用內(nèi)含肽的可誘導(dǎo)自我裂解活性將目的蛋白釋放出來(lái)，而不需要引入昂貴的蛋白酶去切除融合蛋白。③由于蝎昆蟲(chóng)毒素BmK IT含有4對(duì)二硫鍵，具有穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，本發(fā)明通過(guò)80℃水浴10分鐘使未切割的融合蛋白、融合子-內(nèi)含肽以及沒(méi)有正確折疊的BmK IT變性沉淀，使目的蛋白快速純化。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的可溶性融合表達(dá)1、PCR引物設(shè)計(jì)及BmK IT基因擴(kuò)增根據(jù)蝎昆蟲(chóng)毒素BmK IT的cDNA序列，同時(shí)為了便于蛋白純化，本發(fā)明在下游引物中設(shè)計(jì)了編碼6個(gè)組氨酸的核苷酸序列，具體引物設(shè)計(jì)如下上游5’-CTGA GCC ATG GGC AAG AAG AAT GGA TAC GCT-3’，其中CC ATG G為Nco I酶切位點(diǎn)；下游5’-CGCGCTG CAGTTAATG ATG ATG ATG ATG ATGACC AAT TAT TTGGAC GTC-3’，其中CTG CAG為PstI酶切位點(diǎn)，ATG ATG ATG ATG ATG ATG為編碼6個(gè)組氨酸(6×his)的核苷酸序列。
PCR擴(kuò)增的模板來(lái)自我們利用RT-PCR方法已從東亞蝎毒尾腺總mRNA中擴(kuò)增出的攣縮型昆蟲(chóng)毒素BmK IT成熟蛋白的cDNA的重組分泌型表達(dá)載體pExSecI-BmKIT。
PCR反應(yīng)體系10×PCR緩沖液 5μLdNTP(10mmol/L) 5μL5’和3’兩側(cè)引物(10pmol/μL)各5μL模板1μLTaq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL雙蒸水 28.5μL上述混合物置于PCR儀中，94℃，5min后，94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。取反應(yīng)物進(jìn)行電泳鑒定觀察到300bp的單一條帶，與BmKIT基因長(zhǎng)度一致。
2、重組融合表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1-IThis6的構(gòu)建上述引物擴(kuò)增得到的BmK IT cDNA與一種含有蛋白自剪接元件基因的原核表達(dá)載體pTWIN1進(jìn)行連接，用限制性內(nèi)切酶Nco I和Pst I雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pTWIN1，經(jīng)核酸膠電泳分離，分別回收目的基因和載體DNA片段，兩片段1∶3混合，T4連接酶16℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)中，經(jīng)氨芐青霉素篩選培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒，用PCR和限制性內(nèi)切酶鑒定，并經(jīng)DNA測(cè)序分析，所克隆的基因序列正確。取結(jié)果陽(yáng)性者并命名為pTWIN1-IThis6。
3、BmK IT基因在大腸桿菌中的表達(dá)將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中得到工程菌pTWIN1-IThis6/BL21。工程菌經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，按5％比例的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)到OD600為0.6時(shí)，加入終濃度為0.4mM的IPTG，20℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)10個(gè)小時(shí)。SDS-PAGE蛋白電泳表明在25kD左右多出一條蛋白條帶。并且該蛋白條帶能與his單克隆抗體呈顯特異反應(yīng)。Bio-Profile凝膠呈像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果分析表明，目的蛋白占菌體總蛋白含量的20％左右。
實(shí)施例2、重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的純化
1、重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的Ni-NTA親和層析用冷凍離心機(jī)將工程菌的發(fā)酵液于4℃下以8000rpm的速度離心離心15min收集菌體，用0.1MpH8.5的磷酸鹽緩沖液(含20％的甘油，pH8.5)重新懸浮，用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，細(xì)胞破碎液12000rpm離心后，將澄清的細(xì)胞粗提物注入Ni-NTA柱，與柱材料充分結(jié)合，用10倍柱床體積的洗滌緩沖液(含200mM咪唑，20％的甘油，pH6.5)洗滌柱材料，然后室溫放置過(guò)夜，在pH6.5條件下，誘導(dǎo)內(nèi)含肽的自我裂解活性。次日用10倍柱床體積的洗滌緩沖液繼續(xù)洗滌Ni-NTA柱，然后用3倍柱床體積的洗脫緩沖液(100mM EDTA，20％的甘油，pH6.5)將目的蛋白洗脫收集。
2、重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的精制將上述洗脫液用3kD的超濾膜濃縮，并將濃縮液置于80℃水浴10min，15000rpm離心取上清，以去除內(nèi)含肽等其它雜蛋白。將該上清加入到superdex 75H/R凝膠層析柱中，用流速為0.5mL/min的磷酸鹽緩沖液洗滌至出峰完畢，收集目的峰，冷凍干燥后保存。
洗脫得到的樣品作Tricine-PAGE，呈現(xiàn)一條帶，分子量約8.5kD。
權(quán)利要求
1.一種重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmKIT，特征在于其氨基酸序列為Gly Arg Ala Met Gly Lys Lys Asn Gly Tyr Ala Val Asp Ser Ser GlyLys Val Ser Glu Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Cys Asn Asn Ile Cys ThrLys Val Tyr Tyr Ala Thr Ser Gly Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Cys TyrCys Phe Gly Leu Asp Asp Asp Lys Ala Val Leu Lys Ile Lys Asp AlaThr Lys Ser Tyr Cys Asp Val Gln Ile Ile Gly His His His His His His ***
2.編碼權(quán)利要求1所述的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的基因，其核苷酸序列為gga aga gcc atg ggc aag aag aat gga tac gct gtc gat agt agt ggtaaa gtt agt gaa tgt ttg tta aac aat tac tgc aac aac ata tgc acaaaa gta tat tat gct acg agc gga tat tgc tgc tta cta tca tgt tattgc ttc ggt cta gat gac gat aaa gca gtt ttg aag atc aag gac gcgacc aaa tct tat tgc gac gtc caa ata att ggt cat cat cat cat cat cat taa
3.權(quán)利要求1的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的制備方法，特征在于其步驟包括可溶性融合表達(dá)和純化。
4.權(quán)利要求3的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的制備方法，其特征在于所述的可溶性融合表達(dá)包括如下步驟(1)合成PCR擴(kuò)增蝎昆蟲(chóng)毒素BmK IT cDNA的引物，其序列如下上游引物5’-CTGA GCC ATG GGC AAG AAG AAT GGA TAC GCT-3’，下游引物5’-CGCGCTG CAGTTAATG ATG ATG ATG ATG ATGACC AAT TATTTG GAC GTC-3’；(2)上述引物擴(kuò)增得到的BmK IT cDNA與一種含有蛋白自剪接元件基因的原核表達(dá)載體pTWIN1連接，構(gòu)建成高效表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1-IThis6；(3)pTWIN1-IThis6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用IPTG誘導(dǎo)基因的表達(dá)，產(chǎn)物以可溶性的融合蛋白形式存在于工程菌中。
5.權(quán)利要求3的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的制備方法，其特征在于所述的純化包括如下步驟(1)將表達(dá)有重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT細(xì)胞粗提物上清與Ni-NTA柱進(jìn)行親和層析，用洗滌緩沖液洗滌Ni-NTA柱，在pH6.5條件下，誘導(dǎo)內(nèi)含肽的自我裂解；然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗脫收集；(2)將上述洗脫液濃縮，并將濃縮液高溫水浴去除內(nèi)含肽等其它雜蛋白；將上清經(jīng)凝膠過(guò)濾層析，收集目的蛋白。
6.權(quán)利要求5的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的洗滌緩沖液為含有200mM咪唑、10-30％甘油的pH6.5的磷酸鹽緩沖液。
7.權(quán)利要求5的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的洗脫緩沖液為含有100mM EDTA、10-30％甘油的pH6.5的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmK IT及其可溶性表達(dá)和純化方法。將BmK ITcDNA與一種蛋白自剪接元件(內(nèi)含肽intein)基因融合表達(dá)，并在BmK IT cDNA的3’端融合了編碼6個(gè)組氨酸的核苷酸序列。誘導(dǎo)表達(dá)出的融合蛋白intein－rBmKIT在大腸桿菌中以可溶的形式存在，表達(dá)量占菌體總蛋白的20－25％。將工程菌的發(fā)酵液經(jīng)菌體的破碎、蛋白抽提、融合蛋白自剪切與親和層析、樣品濃縮以及高溫處理和凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化。獲得電泳純的重組蝎昆蟲(chóng)毒素rBmKIT。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是，重組目的蛋白以可溶的形式存在，避免了繁瑣且回收率低的包涵體變復(fù)性的方法，簡(jiǎn)化了純化步驟。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1817902SQ20061001248
公開(kāi)日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2006年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月7日
發(fā)明者梁愛(ài)華, 許成鋼, 范曉軍, 王偉, 柴寶峰, 崔大偉 申請(qǐng)人:山西大學(xué)