專利名稱：用于治療高脂血癥及相關(guān)疾病的雜環(huán)衍生物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35 U.S.C.§119(e)要求于2004年6月9日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/578,227的優(yōu)先權(quán)，其通過參考結(jié)合于此。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療高膽固醇血癥及關(guān)聯(lián)的心血管疾病和其他疾病的反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)的小分子介質(zhì)。
相關(guān)技術(shù)描述目前充分確定的是升高的血清膽固醇(“高膽固醇血癥”)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的起因，所述動(dòng)脈粥樣硬化是膽固醇在動(dòng)脈壁內(nèi)部的進(jìn)行性積累。高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的最主要原因，所述心血管疾病包括高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、心臟病發(fā)作和中風(fēng)。僅在美國，每年有約一百一十萬個(gè)體遭遇心臟病發(fā)作，估計(jì)費(fèi)用超過1170億美元。盡管有許多降低血液中膽固醇水平的藥物策略，但是它們中的許多具有不理想的副作用并且具有增加的安全問題。而且，商購的藥物療法都沒有充分地刺激反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，一種去除體內(nèi)膽固醇的重要代謝途徑。循環(huán)膽固醇是通過血漿脂蛋白-轉(zhuǎn)運(yùn)血液中脂質(zhì)的復(fù)合脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組合物的顆粒進(jìn)行。低密度脂蛋白(LDLs)，和高密度脂蛋白(HDLs)是主要的膽固醇載體。認(rèn)為LDLs負(fù)責(zé)將膽固醇從肝(合成或者從膳食來源獲得其的地方)中傳遞膽固醇到體內(nèi)的肝外組織中。術(shù)語“反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)”描述將膽固醇從肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝中，它在肝中被分解代謝和清除。認(rèn)為血漿HDL顆粒充當(dāng)組織膽固醇的清除劑而在反向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中具有主要作用。有說服力的證據(jù)支持沉積在動(dòng)脈粥樣硬化損傷處的脂質(zhì)主要來自血漿LDL的概念；因此，一般已將LDLs稱為“壞”膽固醇。相反，血漿HDL水平與冠狀心臟疾病呈反向相關(guān)-事實(shí)上，將高血漿水平的HDL視為陰性風(fēng)險(xiǎn)因素。推測(cè)高水平的血漿HDL不僅對(duì)于冠狀動(dòng)脈疾病是保護(hù)性的，而且可以實(shí)際上誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的退化(例如，見Badimon等1992，Circulation 86(Suppl.III)86-94)。因此，通常已將HDLs稱為“好”膽固醇。釋放自LDLs的胞內(nèi)膽固醇的量控制細(xì)胞膽固醇代謝。來自LDLs的細(xì)胞膽固醇的積累控制三個(gè)過程(1)其通過關(guān)閉HMGCoA還原酶的合成來減少細(xì)胞膽固醇合成，所述HMGCoA還原酶是一種在膽固醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶；(2)通過活化LCAT，進(jìn)入的LDL-來源的膽固醇促進(jìn)膽固醇的貯存，所述LCAT是將膽固醇轉(zhuǎn)變成沉積在儲(chǔ)藏液滴中的膽固醇酯的細(xì)胞酶；和(3)膽固醇在細(xì)胞中的累積促進(jìn)抑制新LDL受體的細(xì)胞合成的反饋機(jī)制。因此，細(xì)胞調(diào)節(jié)它們對(duì)LDL受體的補(bǔ)充從而帶來足夠的膽固醇以滿足它們的代謝需求，而不過載。(關(guān)于綜述，見Brown &Goldstein，InThe Pharmacological Basis Of Therapeutics，8th Ed.，Goodman& Gilman，Pergamon Press，NY，1990，Ch.36，pp.874-896)。反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)是一種途徑，通過所述途徑外周細(xì)胞膽固醇可以返回肝以再循環(huán)到肝外組織或作為膽汁分泌到腸。所述RCT途徑代表從大多數(shù)肝外組織中清除膽固醇的僅有方式。RCT主要由三個(gè)步驟組成(1)膽固醇流出，膽固醇從外周細(xì)胞中的最初去除；(2)通過卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LACT)作用的膽固醇酯化，其防止流出的膽固醇再入外周細(xì)胞；和(3)將HDL膽固醇酯吸收/傳遞到肝細(xì)胞。LCAT是RCT途徑的關(guān)鍵酶并且主要產(chǎn)自肝中，并在與HDL級(jí)分關(guān)聯(lián)的血漿中循環(huán)。LCAT將細(xì)胞來源的膽固醇轉(zhuǎn)變成膽固醇酯，所述膽固醇酯匯集(sequester)在將要被清除的HDL中。RCT途徑由HDLs所調(diào)節(jié)。HDL是特征在于它們的高密度的脂蛋白顆粒的專業(yè)術(shù)語。HDL復(fù)合體的主要的脂質(zhì)組分是各種磷脂，膽固醇(酯)和三酰甘油。最主要的載酯蛋白成分是決定HDL的功能特性的A-I和A-II。每種HDL顆粒包含載脂蛋白A-1(ApoA-I)的至少一個(gè)拷貝(通常兩個(gè)-四個(gè)拷貝)。ApoA-I由肝和小腸合成為前載脂蛋白原，所述前載脂蛋白原作為快速裂解以產(chǎn)生具有243個(gè)氨基酸殘基的成熟多肽的前體蛋白(proprotein)分泌。ApoA-I主要包括由通常是脯氨酸的接頭部分間隔的6-8個(gè)不同的22個(gè)氨基酸殘基重復(fù)，并且在一些情況中包括由一些殘基組成的一段序列。ApoA-I與脂質(zhì)形成三種類型的穩(wěn)定復(fù)合體被稱作pre-beta-1 HDL的小、少-脂質(zhì)的復(fù)合體；被稱作pre-beta-2 HDL的包含極性脂質(zhì)(磷脂和膽固醇)的展平鐵餅狀顆粒；和被稱作球形或成熟HDL(HDL3和HDL2)的包含極性和非極性脂質(zhì)二者的球形顆粒。盡管大多數(shù)在循環(huán)中的HDL包含ApoA-I和ApoA-II二者，僅包含ApoA-I(AI-HDL)的HDL的級(jí)分似乎在RCT中更為有效。流行病學(xué)研究支持AI-HDL是抗-致動(dòng)脈粥樣硬化的假說(Parra等，1992，Arterioscler.Thromb.12701-707；Decossin等，1997，Eur.J.Clin.Invest.27299-307)?；隗w內(nèi)獲得的數(shù)據(jù)的一些系列的證據(jù)暗示HDL及其主要蛋白組分ApoA-I，參與預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化損傷，和潛在地斑塊的退化-使這些成為治療干預(yù)的吸引人的目標(biāo)。首先在人血清ApoA-I(HDL)濃度和動(dòng)脈粥樣硬化形成之間存在逆相關(guān)(Gordon & Rifkind，1989，N.Eng.J.Med.3211311-1316；Gordon等，1989，Circulation 798-15)。事實(shí)上，HDL的特定亞群已經(jīng)與人中動(dòng)脈粥樣硬化的減少的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(Miller，1987，Amer.Heart 113589-597；Cheung等，1991，Lipid Res.32383-394)；Fruchart &Ailhaud，1992，Clin.Chem.3879)。第二，動(dòng)物研究支持ApoA-I(HDL)的保護(hù)性作用。用ApoA-I或HDL治療膽固醇喂養(yǎng)的兔減少了膽固醇-喂養(yǎng)兔的斑塊(脂條)的發(fā)展和進(jìn)展(Koizumi等，1988，J.Lipid Res.291405-1415；Badimon等，1989，Lab.Invest.60455-461；Badimon等，1990，J.Clin.Invest.851234-1241)。但是功效根據(jù)HDL的來源而變化(Beitz等，1992，Prostaglandins，Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47149-152；Mezdour等，1995，Atherosclerosis 113237-246)。第三，ApoA-I作用的直接證據(jù)由包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)獲得。轉(zhuǎn)移到小鼠中的人ApoA-I基因的表達(dá)保護(hù)所述小鼠免于主動(dòng)脈的損傷的發(fā)展，所述小鼠在遺傳上傾向飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化(Rubin等，1991，Nature 353265-267)。所述ApoA-I轉(zhuǎn)基因還顯示抑制在ApoE-缺陷小鼠中和在Apo(a)轉(zhuǎn)基因小鼠中的動(dòng)脈粥樣硬化(Paszty等，1994，J.Clin.Invest.94899-903；Plump等，1994，PNAS.USA 919607-9611；Liu等，1994，J.Lipid Res.352263-2266)。在表達(dá)人ApoA-I的轉(zhuǎn)基因兔(Duverger，1996，Circulation 94713-717；Duverger等，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.161424-1429)和在轉(zhuǎn)基因大鼠中，觀察到了相似的結(jié)果，在所述轉(zhuǎn)基因大鼠中升高水平的人ApoA-I保護(hù)大鼠免于動(dòng)脈粥樣硬化并且在氣囊血管成形術(shù)后抑制再狹窄(Burkey等，1992，Circulation，Supplement I，86I-472，Abstract No.1876；Burkey等，1995，J.Lipid Res.361463-1473)。
目前對(duì)于高膽固醇血癥和其它血脂異常的治療在過去的約二十年中，將cholesterolemic化合物分離成HDL和LDL調(diào)節(jié)劑并認(rèn)識(shí)到減少LDL血液水平的需求已導(dǎo)致了許多藥物的開發(fā)。然而，這些藥物中的許多具有不理想的副作用和/或在某些患者中是禁忌的，特別是當(dāng)與其它藥物結(jié)合施用時(shí)。這些藥物和治療策略包括(1)膽汁-酸-結(jié)合樹脂，其中斷膽汁酸從腸到肝的再循環(huán)[例如，考來烯胺(QUESTRAN LIGHT，Bristol-Myers Squibb)，和鹽酸考來替泊(COLESTID，Pharmacia & Upjohn Company)]。
(2)抑制素(statins)，其通過阻斷HMGCoA還原酶-膽固醇生物合成中涉及的關(guān)鍵酶，抑制膽固醇合成[例如，洛伐他汀(MEVACOR，Merck & Co.，Inc.)、來自曲霉屬(Aspergillus)菌株的天然產(chǎn)物，普伐他汀(PRAVACHOL，Bristol-Myers Squibb Co.)、和阿托伐他汀(LIPITOR，Warner Lambert)]；(3)煙酸是水溶性維生素B-復(fù)合物，其減少VLDL的產(chǎn)生并在降低LDL上是有效的；(4)貝特類(fibrates)通過減少VLDL級(jí)分用于降低血清的三酸甘油酯并且可以經(jīng)由相同的機(jī)理在一些患者群中產(chǎn)生適度的血漿膽固醇減少[例如，安妥明(ATROMID-S，Wyeth-Ayerst Laboratories)、和吉非貝齊(LOPID，Parke-Davis)]；(5)雌激素替代療法可降低更年期后婦女的膽固醇水平；(6)長鏈α，ω-二羧酸已被報(bào)道可降低血清三酸甘油酯和膽固醇(見，例如，Bisgaier等，1998，J.Lipid Res.3917-30；WO 98/30530；美國專利號(hào)4,689,344；WO 99/00116；美國專利號(hào)5,756,344；美國專利號(hào)3,773,946；美國專利號(hào)4,689,344；美國專利號(hào)4,689,344；美國專利號(hào)4,689,344；和美國專利號(hào)3,930,024)；(7)公開了降低血清三酸甘油酯和膽固醇水平的其它化合物，包括醚(見，例如，美國專利號(hào)4,711,896；美國專利號(hào)5,756,544；美國專利號(hào)6,506,799)，和多萜醇的磷酸酯(美國專利號(hào)4,613,593)，和azolidinedione衍生物(美國專利號(hào)4,287,200)。目前這些可獲得的用于降低膽固醇的藥物都沒有安全地升高HDL水平和刺激RCT。事實(shí)上，這些目前治療策略中的大部分似乎作用在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑上，調(diào)節(jié)飲食吸收，再循環(huán)，膽固醇的合成和VLDL數(shù)量。
治療高膽固醇血癥的ApoA-I激動(dòng)劑鑒于HDL的潛在作用，即ApoA-I及其相關(guān)磷脂在抗動(dòng)脈粥樣硬化疾病中的保護(hù)，UCB Belgium開始了、停止和似乎再次開始了利用重組產(chǎn)生的ApoA-I進(jìn)行的人臨床試驗(yàn)(Pharmaprojects，Oct.27，1995；IMSR & D Focus，Jun.30，1997；Drug Status Update，1997，Atherosclerosis2(6)261-265；還見M.Eriksson at Congress，″The Role of HDL in DiseasePrevention，″Nov.7-9，1996，F(xiàn)ort Worth；Lacko & Miller，1997，J.Lip.Res.381267-1273；和WO 94/13819)并由Bio-Tech開始和停止(Pharmaprojects，Apr.7，1989)。使用ApoA-I還嘗試進(jìn)行試驗(yàn)以治療敗血癥性休克(Opal，″Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis，″IBC′s 7thInternational Conference on Sepsis，Apr.28-30，1997，Washington，D.C.；Gouni等，1993，J.Lipid Res.94139-146；Levine，WO 96/04916)。然而，有許多與ApoA-I的生產(chǎn)和使用相關(guān)的缺陷，使其作為藥物不那么理想；例如ApoA-I是大的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)它是困難的和昂貴的；至于在貯存過程中的穩(wěn)定性，活性產(chǎn)品的傳遞和體內(nèi)的半衰期，必須克服明顯的生產(chǎn)和再現(xiàn)性問題。鑒于這些缺陷，已經(jīng)嘗試制備模擬ApoA-I的肽。由于ApoA-I的關(guān)鍵活性是由于在蛋白質(zhì)中的獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征中的多個(gè)重復(fù)的存在-類別A兩親性α-螺旋(Segrest，1974，F(xiàn)EBS Lett.38247-253；Segrest等，1990，PROTEINSStructure，F(xiàn)unction and Genetics 8103-117)，大多數(shù)設(shè)計(jì)模擬ApoA-I活性的肽的努力已集中于設(shè)計(jì)形成種類A-類型的兩親性α-螺旋的肽(見，例如，在美國專利號(hào)6,376,464和6,506,799中的背景討論；將其全文并入那里作為參考)。在一項(xiàng)研究中，F(xiàn)ukushima等合成了全部由周期排列的谷氨酸、賴氨酸和亮氨酸殘基組成的22個(gè)殘基的肽從而形成具有等-親水性和疏水性面的兩親性α-螺旋(″ELK肽″)(Fukushima等，1979，J.Amer.Chem.Soc.101(13)3703-3704；Fukushima等，1980，J.Biol.Chem.25510651-10657)。所述ELK肽與ApoA-I的198-219片段共享41％的序列同源性。顯示所述ELK肽與磷脂有效關(guān)聯(lián)并模仿ApoA-I的一些物理和化學(xué)特性(Kaiser等，1983，PNAS USA 801137-1140；Kaiser等，1984，Science 223249-255；Fukushima等，1980，上文；Nakagawa等，1985，J.Am.Chem.Soc.1077087-7092)。后來發(fā)現(xiàn)該22個(gè)殘基肽的二聚體比單體更接近地模仿ApoA-I；基于這些結(jié)果，提示被螺旋中斷者(breaker)(甘氨酸或脯氨酸)在中部打斷的44-mer表示ApoA-I中的最小功能域(Nakagawa等，1985，如上)。另一項(xiàng)研究包括被稱作″LAP肽″的模型兩親性肽(Pownall等，1980，PNAS USA 77(6)3154-3158；Sparrow等，1981，InPeptidesSynthesis-Structure-Function，Roch和Gross，Eds.，Pierce Chem.Co.，Rockford，IL，253-256)。基于用天然載脂蛋白的片段的脂質(zhì)結(jié)合研究，設(shè)計(jì)了一些名稱為LAP-16、LAP-20和LAP-24的LAP肽(分別包含16、20和24個(gè)氨基酸殘基)。這些模型兩親性肽與載脂蛋白沒有序列同源性并被設(shè)計(jì)以具有親水面，所述親水面以與和載脂蛋白關(guān)聯(lián)的類別A-類型兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域不同的方式構(gòu)成(Segrest等，1992，J.Lipid Res.33141-166)。從這些研究，作者得出結(jié)論20個(gè)殘基的最小長度是將脂質(zhì)結(jié)合特性賦予模型兩親性肽所必需的。用在序列的不同位置包含脯氨酸殘基的LAP20的突變體進(jìn)行的研究顯示在脂結(jié)合和LCAT活化之間存在直接關(guān)系，但是肽單獨(dú)的螺旋潛能沒有導(dǎo)致LCAT的活化(Ponsin等，1986，J.Biol.Chem.261(20)9202-9205)。而且，接近肽中部的螺旋中斷者(脯氨酸)的存在減少了其對(duì)于磷脂表面的親和性及其活化LCAT的能力。盡管某些LAP肽顯示結(jié)合磷脂(Sparrow等，如上)，存在關(guān)于在脂質(zhì)存在時(shí)LAP肽螺旋的程度的爭(zhēng)議(Buchko等，1996，J.Biol.Chem.271(6)3039-3045；Zhong等，1994，Peptide Research 7(2)99-106)。Segrest等已經(jīng)合成了由18-24個(gè)氨基酸殘基組成的肽，所述肽與ApoA-I的螺旋沒有序列同源性(Kannelis等，1980，J.Biol.Chem.255(3)11464-11472；Segrest等，1983，J.Biol.Chem.2582290-2295)。對(duì)該序列進(jìn)行具體設(shè)計(jì)以在疏水力矩(Eisenberg等，1982，Nature 299371-374)和電荷分布(Segrest等，1990，Proteins 8103-117；美國專利號(hào)4,643,988)方面模擬類A可交換的載脂蛋白的兩親性螺旋狀結(jié)構(gòu)域。將一個(gè)18個(gè)殘基的肽，“18A”肽設(shè)計(jì)為模型類別-Aα-螺旋(Segrest等，1990，如上)。用這些肽和其它具有反向電荷分布的肽，如“18R”肽進(jìn)行的研究已經(jīng)一致顯示電荷分布對(duì)于活性是關(guān)鍵的；具有反向電荷分布的肽顯示比18A類別A模擬物減少的脂質(zhì)親和性和在脂質(zhì)存在時(shí)更低的螺旋含量(Kanellis等，1980，J.Biol.Chem25511464-11472；Anantharamaiah等，1985，J.Biol.Chem.26010248-10255；Chung等，1985，J.Biol.Chem.26010256-10262；Epand等，1987，J.Biol.Chem.2629389-9396；Anantharamaiah等，1991，Adv.Exp.Med.Biol.285131-140)。還已經(jīng)設(shè)計(jì)了一種基于人ApoA-I的螺旋的序列的包含22個(gè)氨基酸殘基的“共有區(qū)”肽(Anantharamaiah等，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105；Venkatachalapathi等，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，Indian.Acad.Sci.B585-596)。通過鑒定在人ApoA-I的推定螺旋的每個(gè)位置上的最普遍的殘基來構(gòu)建該序列。如上述肽，由該肽形成的螺旋具有集簇于親水-疏水界面的正電荷氨基酸殘基，集簇于親水面中心的負(fù)電荷氨基酸殘基和少于180°的疏水角。盡管該肽的二聚體在活化LCAT中稍稍有效，單體顯示了較差的脂質(zhì)結(jié)合特性(Venkatachalapathi等，1991，如上)。主要基于關(guān)于上述肽的體外研究，已經(jīng)出現(xiàn)了一組設(shè)計(jì)模擬ApoA-I的功能的肽的“規(guī)則”。顯然，認(rèn)為對(duì)于脂質(zhì)親和性和LCAT的活化，需要具有集簇于親水-疏水界面的正電荷殘基和集簇于親水面中心的負(fù)電荷氨基酸殘基的兩親性α-螺旋(Venkatachalapathi等，1991，上文)。Anantharamaiah等還已經(jīng)指出在位于α-螺旋的疏水面中的共有區(qū)22-mer肽的13位置上的負(fù)電荷谷氨酸殘基在LCAT的活化中具有重要作用(Anantharamaiah等，1991，上文)。另外，Brasseur已經(jīng)指出少于180°的疏水角(pho角)是最佳脂質(zhì)-載脂蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性所需要的，并還解釋在脂雙層的邊緣周圍具有肽的餅狀顆粒的形成(Brasseur，1991，J.Biol.Chem.66(24)16120-16127)。Rosseneu等還強(qiáng)調(diào)少于180°的疏水角是LCAT活化所需要的(WO 93/25581)。然而，盡管在闡明設(shè)計(jì)ApoA-I激動(dòng)劑的“規(guī)則”中存在進(jìn)展，到目前為止，報(bào)道的最好的ApoA-I激動(dòng)劑具有少于40％的完整ApoA-I的活性。文獻(xiàn)中描述的肽激動(dòng)劑沒有被證實(shí)作為藥物是有用的。因此，需要開發(fā)模擬ApoA-I的活性并且相對(duì)簡(jiǎn)單和生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定分子。優(yōu)選地，候選分子將調(diào)節(jié)間接和直接的RCT。這些分子將比現(xiàn)存的肽激動(dòng)劑更小，并具有更寬的功能范圍。然而，尚沒有充分闡明設(shè)計(jì)RCT有效介質(zhì)的“規(guī)則”并且尚不知道設(shè)計(jì)具有ApoA-I功能的有機(jī)分子的原理。
發(fā)明概述公開了反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的介質(zhì)，其包含下列結(jié)構(gòu) 其中A、B、和C可以處于任何順序，并且其中A包含酸性部分，其包含酸性團(tuán)或其生物電子等排體(bioisostere)；B包含芳香族的或親脂的部分，其包含HMG CoA還原酶抑制劑或其類似物的至少一部分；和C包含堿性部分，其包含堿性基或其生物電子等排體。優(yōu)選地，已經(jīng)將α氨基或α羧基中的至少之一從它們各自的氨基或羧基末端部分上除去。如果不被除去，優(yōu)選所述α氨基用選自由下列各項(xiàng)組成的組的保護(hù)基加帽(capped)乙?；⒈揭阴；⒈郊柞；?、新戊酰基(pivolyl)、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸(2-napthylic acid)、煙酸、其中n為1至20的CH3-(CH2)n-CO-、二-叔-丁基-4-羥基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、聯(lián)苯基、取代的苯基、取代的雜環(huán)、烷基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、稠合環(huán)烷基、飽和雜芳基、和取代的飽和雜芳基。如果不被除去，優(yōu)選所述α羧基用選自由下列各項(xiàng)組成的組的保護(hù)基加帽胺如其中R＝H的RNH、二-叔-丁基-4-羥基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、聯(lián)苯基、取代的苯基、取代的雜環(huán)、烷基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、稠合環(huán)烷基、飽和雜芳基、和取代的飽和雜芳基。酸性團(tuán)的生物電子等排體可以選自由下列各項(xiàng)組成的組
堿性基的生物電子等排體可以選自由下列各項(xiàng)組成的組 根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案公開了下列介質(zhì)



其中n＝1-10
在優(yōu)選實(shí)施方案中，公開了下列化合物4-胍基丁胺-3-酰氨基GABA喹啉、4-(1-(4-氨基丁基氨基甲酰基)-2-(2-甲基-4-苯基喹啉-3-基)乙基氨基甲?；?丁酸、和4-(5-胍基戊氨基)喹啉-3-羧酸。上述優(yōu)選化合物列表中任何未衍生化的氨基和/或羧基末端的氨基酸殘基用保護(hù)基加帽。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述介質(zhì)具有下列結(jié)構(gòu) 優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中RCT的介質(zhì)模擬ApoA-I的功能和活性。在廣泛的方面中，這些介質(zhì)是包含三個(gè)域，酸性域、親脂(例如芳族的)域、和堿性域的分子。所述分子優(yōu)選含有帶正電荷的域、帶負(fù)電荷的域、和不帶電的親脂域。關(guān)于彼此域的位置可以在分子之間不同；因而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，不管每一個(gè)分子內(nèi)部三個(gè)域的相對(duì)位置，所述分子介導(dǎo)RCT。而在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，分子模板或模型包含“酸性”氨基酸來源的殘基、親脂部分、和堿性氨基酸來源的殘基，以任何順序連接而形成RCT的介質(zhì)，在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分子模型可以通過具有酸性、親脂的和堿性域的單個(gè)殘基來體現(xiàn)，例如，氨基酸，苯丙氨酸。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，RCT的分子介質(zhì)包含天然的L-或D-氨基酸、氨基酸類似物(合成的或半合成的)、和氨基酸衍生物。例如，所述介質(zhì)可以包括“酸性的”氨基酸殘基或其類似物、芳香族的或親脂的支架(scaffold)、和堿性氨基酸殘基或其類似物，所述殘基是由肽鍵或酰胺鍵、或任何其它鍵的連接而結(jié)合。所述RCT的分子介質(zhì)通過提高直接的和/或間接的RCT途徑(即，增加膽固醇的流出量)、活化LCAT的能力、和增加血清HDL濃度的能力而共享減少血清膽固醇的共同方面。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的介質(zhì)優(yōu)選包含酸性團(tuán)、親脂基和堿性基，并且包含序列X1-X2-X3、X1-X2-Y3、Y1-X2-X3、或Y1-X2-Y3其中X1是酸性氨基酸或其類似物；X2是HMG CoA還原酶抑制劑的芳族的或親脂的部分(例如，支架或藥效團(tuán))；X3是堿性氨基酸或其類似物；Y1是不含α氨基的酸性氨基酸類似物；和Y3是不含α羧基的堿性氨基酸類似物。當(dāng)所述氨基末端的α氨基存在時(shí)(例如，X1)，它還包含第一保護(hù)基，并且當(dāng)羧基末端的α羧基存在時(shí)(例如，X3)，它還包含第二保護(hù)基。優(yōu)選所述第一(氨基末端)保護(hù)基選自由乙?；?、苯乙?；?、新戊?；?、2-萘酸、煙酸、CH3-(CH2)n-CO-(其中n在從1至20的范圍內(nèi))、和乙?；?、苯乙酰基的酰胺，二-叔-丁基-4-羥基-苯基、萘基、取代的萘基、FMOC、聯(lián)苯基、取代的苯基、取代的雜環(huán)、烷基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、稠合環(huán)烷基、飽和雜芳基、和取代的飽和雜芳基等組成的組。優(yōu)選所述第二(羧基末端)保護(hù)基選自由胺例如RNH2(其中R＝二-叔-丁基-4-羥基-苯基)、萘基、取代的萘基、FMOC、聯(lián)苯基、取代的苯基、取代的雜環(huán)、烷基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、稠合環(huán)烷基、飽和雜芳基、和取代的飽和雜芳基等組成的組。酸性、親脂和堿性基團(tuán)的順序可以是以任何和全部可能方式聚集而提供保持所述分子模型的基本特征的化合物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，X1和X3的類似物可以包含所述酸和堿R基團(tuán)的生物電子等排體。在其它的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)X1、X2或X3是D或其它修飾的合成氨基酸殘基而提供代謝穩(wěn)定的分子。這也可以通過肽模擬(peptidomimetic)方法，即，將主鏈中的肽鍵或相似基團(tuán)反向來實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述介質(zhì)可被結(jié)合到更大的實(shí)體中，例如約1至10個(gè)氨基酸的肽、或分子。這里使用支架表示藥效團(tuán)，它是簡(jiǎn)化配體(候選藥物分子)和蛋白質(zhì)之間相互作用過程的模型。支架可擁有固定在所述蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)中的天然分子的某些特征。可以假設(shè)這些特征與一些互補(bǔ)的特征在所述蛋白質(zhì)的腔中相互作用。可以通過將官能團(tuán)附在所述支架上而得出變化。優(yōu)選地，我們通過下列啟發(fā)式方法定義支架支架是親脂的或芳族的HMGCoA還原酶抑制劑的至少一部分的模擬物。這里所用的術(shù)語“生物電子等排體”、“生物電子等排替換”、“生物電子等排性”及緊密相關(guān)的術(shù)語具有與本領(lǐng)域中一般公認(rèn)的那些相同的含義。生物電子等排體是原子、離子、或者分子，其中電子的周圍層可以被認(rèn)為是基本相似的。術(shù)語生物電子等排體通常用于表示全部分子的一部分，與全部分子自身相對(duì)。生物電子等排替換涉及使用一種生物電子等排體以替換另一種，預(yù)期維持或稍微修飾所述第一生物電子等排體的生物活性。因而，這種情況下的生物電子等排體是具有相似大小、形狀和電子密度的原子或原子群。由于合理的預(yù)期，即提出的生物電子等排替換將導(dǎo)致相似生物性質(zhì)的保持，而產(chǎn)生生物電子等排性。這樣的合理預(yù)期也可僅基于結(jié)構(gòu)相似性。關(guān)于受體等的特征域，在已知大量細(xì)節(jié)的那些情況下這是特別正確的，所述特征域涉及生物電子等排體以某種方式結(jié)合到那里或者其在所述生物電子等排體上起作用。酸基或堿性基的生物電子等排體的實(shí)例表示如下。
羧酸生物電子等排體(R＝H/烷基)
胍生物電子等排體(R＝H/烷基) 如這里所用，術(shù)語“氨基酸”也可以指的是通式NH2-CHR-COOH的分子或者在含有母體氨基酸(parent amino acid)的肽內(nèi)部的殘基，其中“R”是大量不同側(cè)鏈之一?！癛”可以指的是二十種遺傳編碼氨基酸之一的取代基?！癛”也可以指的是不屬于二十種遺傳編碼氨基酸之一的取代基。如這里所用，術(shù)語“氨基酸殘基”指的是當(dāng)它結(jié)合到另一種氨基酸時(shí)在失去水分子后保留的氨基酸部分。如這里所用，術(shù)語“氨基酸類似物”指的是氨基酸母體化合物的結(jié)構(gòu)衍生物，其區(qū)別于它至少一個(gè)元件(element)，例如，α氨基或酸性氨基酸，其中所述酸性R基用其生物電子等排體替代。因此，本發(fā)明的“半剝裸的”和“剝裸的(denuded)”實(shí)施方案包含氨基酸類似物，因?yàn)檫@些的型式不同于傳統(tǒng)的氨基酸結(jié)構(gòu)，失去至少一個(gè)元件，例如α氨基或羧基。術(shù)語“修飾的氨基酸”更特別地指的是含有“R”取代基的氨基酸，其不對(duì)應(yīng)于二十種遺傳編碼的氨基酸之一，因此修飾的氨基酸落入氨基酸類似物的更寬類別。如這里所用，術(shù)語“充分保護(hù)的”指的是氨基和羧基端都包含保護(hù)基的優(yōu)選實(shí)施方案。如這里所用，術(shù)語“半剝裸的”指的是α氨基或α羧基中之一從各自的氨基或羧基末端的氨基酸殘基或其類似物上失去的優(yōu)選實(shí)施方案。保留下的α氨基或α羧基用保護(hù)基加帽。如這里所用，術(shù)語“剝裸的”或“完全剝裸的”指的是已經(jīng)將α氨基或α羧基兩者都從各自的氨基或羧基末端的氨基酸殘基或其類似物上除去的優(yōu)選實(shí)施方案。某些化合物可以以互變異構(gòu)形式存在。通過實(shí)施方案包含所有這樣的包括非對(duì)映異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體的同分異構(gòu)體。假設(shè)某些化合物或者以同分異構(gòu)形式或其混合物形式存在。某些化合物可以以多晶型的形式存在。多晶型性是由于以至少兩種不同形式的化合物結(jié)晶而產(chǎn)生的。通過實(shí)施方案包含所有這樣的多晶形物。假設(shè)所述某些化合物以某種多晶形物或其混合物形式存在。
HMG CoA還原酶抑制如上所述，支架是HMG CoA還原酶抑制劑的一部分的模擬物，它是親脂的或芳族的。HMG CoA還原酶抑制劑共享連接到類HMG部分的剛性疏水基。HMG CoA還原酶抑制劑是HMGR關(guān)于結(jié)合底物HMG CoA的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。HMG CoA還原酶抑制劑的結(jié)構(gòu)上不同的剛性疏水基被容納在HMGR的淺的非極性溝中。HMGR的抑制是膽固醇降低療法中有效的和安全的方法。HMGCoA還原酶抑制劑除了降低膽固醇外還具有其它效果。這些包括氧化一氮介導(dǎo)的促進(jìn)新血管生長、刺激骨形成、保護(hù)低密度脂蛋白的氧化性修飾、消炎作用、和降低C-反應(yīng)性蛋白質(zhì)水平。
RCT介導(dǎo)至今，設(shè)計(jì)ApoA-I激動(dòng)劑的努力集中在22聚物單元結(jié)構(gòu)，例如Anantharamaiah等，1990，Arteriosclerosis 10(1)95-105；Venkatachalapathi等，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，IndianAcad.Sci.B585-596的“共有22聚物”，其能夠在脂質(zhì)存在下形成兩親性α-螺旋(參見例如美國專利號(hào)6,376,464涉及的從共有22聚物修飾得到的肽模擬物)。相比于較長的22聚物，利用這樣相對(duì)短的肽有一些優(yōu)勢(shì)。例如，較短的RCT介質(zhì)更容易并且更低成本地生產(chǎn)，它們?cè)诨瘜W(xué)上和構(gòu)象上更穩(wěn)定，優(yōu)選的構(gòu)象保持相對(duì)剛性，在所述肽鏈內(nèi)部有很少的或者沒有分子內(nèi)相互作用，并且越短的肽表現(xiàn)越高程度的口服可用性。這些較短肽的多拷貝可以結(jié)合到HDL或LDL，產(chǎn)生更受限制的大肽的相同效果。雖然ApoA-I多功能性可以基于它的多α-螺旋域的貢獻(xiàn)，但是即使ApoA-I的單功能，例如LCAT活化，可以通過多于一個(gè)α-螺旋域在重復(fù)方式中作為媒介也是可能的。這樣，在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，ApoA-I的多功能可以被指向單子域的公開的RCT介質(zhì)模擬。ApoA-I的三個(gè)功能性特征被廣泛接受為ApoA-I激動(dòng)劑設(shè)計(jì)用的主要標(biāo)準(zhǔn)(1)與磷脂締合的能力；(2)活化LCAT的能力；和(3)促進(jìn)膽固醇流出細(xì)胞的能力。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案的一些方式，RCT分子介質(zhì)可以僅表現(xiàn)所述最后的功能性特征-增加RCT的能力。然而，經(jīng)常被忽視的相當(dāng)多的ApoA-I其它性質(zhì)使ApoA-I成為特別有吸引力的用于治療介入的目標(biāo)。例如，ApoA-I經(jīng)由受體-介導(dǎo)的過程指導(dǎo)膽固醇流量進(jìn)入肝臟并且經(jīng)由PLTP驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)調(diào)整前-β-HDL(來自周圍組織膽固醇的主受體)的生產(chǎn)。然而，這些特征使ApoA-I模擬分子的潛在有用性拓寬。這個(gè)為了考察ApoA-I模擬功能的全新方法將使用這里所公開的肽或氨基酸來源的小分子，以促進(jìn)直接的RCT(經(jīng)由HDL途徑)，也促進(jìn)間接的RCT(即，通過更改它們到肝臟的流向，將LDLs從循環(huán)中截取或清除)。為了能夠提高間接的RCT，優(yōu)選實(shí)施方案的分子介質(zhì)將優(yōu)選能夠與磷脂締合并且結(jié)合到肝臟(即，充當(dāng)肝臟脂蛋白結(jié)合位點(diǎn)的配體)。因而，導(dǎo)致優(yōu)選實(shí)施方案的研究努力的目標(biāo)是識(shí)別、設(shè)計(jì)、和合成RCT的短的穩(wěn)定小分子介質(zhì)，其表現(xiàn)優(yōu)先的脂結(jié)合構(gòu)象、通過促進(jìn)直接的和/或間接的反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)增加膽固醇到肝臟的流量、改善血漿脂蛋白輪廓(profile)、并且隨后防止動(dòng)脈粥樣硬化損害的進(jìn)行或/和甚至促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化損害的消退。所述優(yōu)選實(shí)施方案的RCT介質(zhì)可以以穩(wěn)定的大批或單位劑量形式制備，例如，可以在體內(nèi)使用之前重建或者再形成的凍干產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括在高脂血癥、高膽固醇血癥、冠狀動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、早老性癡呆、多發(fā)性硬化、涉及高脂血癥的病癥例如炎癥、和其它病癥例如引起膿毒性休克的內(nèi)毒素血癥的治療中的藥物配方和這種制劑的使用。通過展示優(yōu)選實(shí)施方案的RCT介質(zhì)與血漿的HDL、和LDL組分締合并且能增加HDL和前-β-HDL顆粒濃度并且降低LDL血漿水平的工作實(shí)例，說明了優(yōu)選實(shí)施方案。這樣促進(jìn)了直接的和間接的RCT。在人的肝細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)中，所述RCT介質(zhì)增加了人LDL介導(dǎo)的膽固醇積累。RCT介質(zhì)在活化PLTP方面也是有效的并因而促進(jìn)前-β-HDL粒子的形成。HDL膽固醇的增加作為所述RCT中LCAT參與(未直接顯示LCAT活化(體外))的間接證據(jù)。在動(dòng)物模型中，優(yōu)選實(shí)施方案的RCT介質(zhì)的使用導(dǎo)致血清HDL濃度的增加。在下面的小節(jié)中，更詳細(xì)地陳述了優(yōu)選實(shí)施方案，它描述了RCT介質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，包括來源于HMG CoA還原酶抑制劑的親脂支架；包括被保護(hù)型、半剝裸型及其剝裸型；結(jié)構(gòu)和功能表征；大批和單位劑量配方的制備方法；和使用方法。
介質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能在優(yōu)選實(shí)施方案中，RCT介質(zhì)通常是肽或其類似物，其模擬ApoA-I的活性。在一些實(shí)施方案中，用取代的酰胺、酰胺的電子等排體或酰胺模擬物替代所述肽中的至少一個(gè)酰胺鍵。另外，一種或多種酰胺鍵可以用不顯著干涉所述肽的結(jié)構(gòu)或活性的肽模擬部分或酰胺模擬部分替代。例如，在Olson等，1993，J.Med.Chem.363039-3049中描述了適合的酰胺模擬部分。如這里所用，遺傳編碼的L-對(duì)映異構(gòu)的氨基酸的縮寫是常規(guī)的并且如下D-氨基酸是由小寫字母指明的，例如，D-丙氨酸＝a，等。
表1 在不顯著有害影響并且在許多情況下甚至提高所述肽活性的條件下，RCT介質(zhì)中的某些氨基酸殘基可以用其它氨基酸殘基替代。因而，通過優(yōu)選實(shí)施方案也預(yù)期RCT介質(zhì)的改變或突變形式，其中在所述結(jié)構(gòu)中至少一種定義的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基或其衍生物和/或類似物取代。將認(rèn)識(shí)到，在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸取代是保守的，即，替代的氨基酸殘基具有與被替代氨基酸殘基相似的物理和化學(xué)性質(zhì)。為了確定保守的氨基酸取代，所述氨基酸可以便利地分成兩個(gè)主要類別-親水的和疏水的-主要取決于所述氨基酸側(cè)鏈的物理-化學(xué)特征。這兩種主要類別還可以分成更清楚地定義氨基酸側(cè)鏈特征的亞類。例如，親水氨基酸類別還可以細(xì)分成酸性、堿性和極性氨基酸。疏水氨基酸類別還可以細(xì)分成非極性和芳族氨基酸。定義ApoA-I的不同氨基酸類別的定義如下根據(jù)Eisenberg等，1984，J.Mol.Biol.179125-142的正規(guī)化公認(rèn)的疏水性標(biāo)度，術(shù)語“親水氨基酸”指的是表現(xiàn)疏水性小于零的氨基酸。遺傳編碼的親水氨基酸包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。根據(jù)Eisenberg等，1984，J.Mol.Biol.179125-142的正規(guī)化公認(rèn)的疏水性標(biāo)度，術(shù)語“親水氨基酸”指的是表現(xiàn)疏水性大于零的氨基酸。遺傳編碼的親水氨基酸包括Pro(P)、Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)和Tyr(Y)。術(shù)語“酸性氨基酸”指的是具有側(cè)鏈pK值小于7的親水氨基酸。酸性氨基酸在生理pH下由于失去氫離子一般具有負(fù)電性的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括Glu(E)和Asp(D)。術(shù)語“堿性氨基酸”指的是具有側(cè)鏈pK值大于7的親水氨基酸。堿性氨基酸在生理pH下由于與水合氫離子的締合一般具有正電性的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包括His(H)、Arg(R)和Lys(K)。術(shù)語“極性氨基酸”指的是具有在生理pH下不帶電側(cè)鏈的親水氨基酸，但是其具有至少一個(gè)鍵，其中共同由兩個(gè)原子共享的電子對(duì)與所述原子的一個(gè)保持得更緊密。遺傳編碼的極性氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)Ser(S)和Thr(T)。術(shù)語“非極性氨基酸”指的是具有在生理pH下不帶電側(cè)鏈的疏水氨基酸，并且其具有其中共同由兩個(gè)原子共享的電子對(duì)通常被所述兩個(gè)原子的每一個(gè)相等保持的鍵(即，所述側(cè)鏈不是極性的)。遺傳編碼的非極性氨基酸包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。術(shù)語“芳族氨基酸”指的是具有含至少一個(gè)芳環(huán)或雜芳環(huán)的側(cè)鏈的疏水氨基酸。所述芳環(huán)或雜芳環(huán)可以含有一個(gè)或多個(gè)取代基例如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中每一個(gè)R獨(dú)立地是(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)鏈烯基、取代的(C1-C6)鏈烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20原子數(shù)的雜芳基、取代的5-20原子數(shù)的雜芳基、6-26原子數(shù)的烷雜芳基或取代的6-26原子數(shù)的烷雜芳基。遺傳編碼的芳族氨基酸包括Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。術(shù)語“脂族氨基酸”指的是含脂族烴側(cè)鏈的疏水氨基酸。遺傳編碼的脂族氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。氨基酸殘基Cys(C)是例外的，它可與其它Cys(C)殘基或其它含硫烷基氨基酸形成二硫鍵。Cys(C)殘基(和其它具有含-SH側(cè)鏈的氨基酸)在肽中或者以還原的游離-SH或者以氧化的二硫鍵形式存在的能力影響Cys(C)殘基是否對(duì)肽貢獻(xiàn)凈疏水的或親水的特征。盡管按照Eisenberg(Eisenberg，1984，上文)的正規(guī)化公認(rèn)的疏水性標(biāo)度，Cys(C)表現(xiàn)疏水性為0.29，但是應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案來說，不管上述定義的一般分類法，將Cys(C)分類為極性親水氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，上面定義的類別不是相互排除的。因而，可以將表現(xiàn)兩種或多種物理-化學(xué)性質(zhì)的含側(cè)鏈氨基酸包括在多個(gè)類別中。例如，具有進(jìn)一步用極性取代基取代的芳族部分的氨基酸側(cè)鏈，例如Tyr(Y)，可以既表現(xiàn)芳族疏水性質(zhì)又表現(xiàn)極性或親水性質(zhì)，并且可以因此被同時(shí)包括在芳族和極性類別內(nèi)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，任何氨基酸的適當(dāng)類別將是明顯的，特別是根據(jù)這里提供的詳細(xì)描述。雖然上面定義的類別已經(jīng)按照遺傳編碼的氨基酸進(jìn)行了例舉，但是所述氨基酸取代不必限制于遺傳編碼的氨基酸，并且在某些優(yōu)選實(shí)施方案中不限制于遺傳編碼的氨基酸。實(shí)際上，許多優(yōu)選的RCT介質(zhì)含有遺傳學(xué)非編碼氨基酸。因而，除了天然存在的遺傳編碼氨基酸，RCT介質(zhì)中的氨基酸殘基可以用天然存在的非編碼氨基酸和合成的氨基酸取代。某些通常遇到的為RCT介質(zhì)提供有用的取代的氨基酸包括，但是不限于，β-丙氨酸(β-Ala)和其它ω-氨基酸例如3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基異丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鳥氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔-丁基丙氨酸(t-BuA)；叔-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；4-苯基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亞砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙?；嚢彼?AcLys)；2，4-氨基丁酸(Dbu)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；對(duì)-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)和高絲氨酸(hSer)；羥基脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、N-甲基化氨基酸和肽(N-取代的甘氨酸類)。按照這里提供的定義，可以將這里沒有具體提及的其它氨基酸殘基基于它們的觀察到的物理和化學(xué)性質(zhì)容易地歸類。根據(jù)上面所定義類別的遺傳編碼和通常的非編碼氨基酸的分類總結(jié)在下面的表2中。應(yīng)當(dāng)理解，表2僅是為了說明目的，而不意味著可用于取代這里描述的RCT介質(zhì)的氨基酸殘基和衍生物的窮舉列表。
表2通常遇到的氨基酸的分類 按照這里提供的定義，可以將這里沒有具體提及的其它氨基酸殘基基于它們的觀察到的物理和化學(xué)性質(zhì)容易地歸類。雖然大多數(shù)情況下，將用D-對(duì)映異構(gòu)的氨基酸取代RCT介質(zhì)的氨基酸，所述取代不限于D-對(duì)映異構(gòu)的氨基酸。因而，也包括在“突變的”或“改變的”形式的定義中的是那些用相同的L-氨基酸(例如，D-Arg→L-Arg)或者用相同類別或亞類的L-氨基酸替代D-氨基酸(例如，D-Arg D-Lys)的情況，反之亦然。所述介質(zhì)可以有利地由至少一種D-對(duì)映異構(gòu)的氨基酸組成。認(rèn)為含有這樣的D-氨基酸的介質(zhì)比專門由L-氨基酸組成的肽在口腔、腸或血清中是更穩(wěn)定的。
連接體可以將RCT介質(zhì)以從頭至尾方式(即N-末端至C-末端)、從頭至頭方式(即N-末端至N-末端)、從尾至尾方式(即C-末端至C-末端)、或其組合結(jié)合(connect)或連接(link)。所述連接體可以是任何能夠?qū)蓚€(gè)肽相互共價(jià)連接的雙官能團(tuán)分子。因而，合適的連接體是雙官能團(tuán)分子，其中所述官能團(tuán)能夠共價(jià)地附到肽的N-和/或C-末端。合適用于附到肽的N-或C-末端的官能團(tuán)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，與實(shí)現(xiàn)這樣的共價(jià)鍵形成的合適的化學(xué)一樣。充分長度和柔性的連接體包括但不限于Pro(P)、Gly(G)、Cys-Cys、Gly-Gly、H2N-(CH2)n-COOH，其中n是1至12，優(yōu)選4至6；H2N-芳基-COOH和糖類。然而，在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)的連接體本身是完全不能使用的。作為替代，酸性、親脂的和堿性部分是單分子的所有部分。
HMG CoA還原酶抑制劑支架在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疏水的或芳族的支架是基于HMGCoA還原酶抑制劑。HMG CoA還原酶抑制劑的實(shí)例表示如下
HMG-CoA還原酶抑制劑HMG-CoA還原酶抑制劑 HMG-CoA還原酶抑制劑 HMG-CoA還原酶抑制劑貝特類降血脂劑活化PPARα 吉非貝齊(Lopid)安妥明(PPARα)于是，基于HMG CoA還原酶抑制劑的親脂的或芳族的支架與母體HMG CoA還原酶抑制劑一起表示如下

包含基于HMG CoA還原酶抑制劑的親脂支架的RCT介質(zhì)的實(shí)例，諸如尼伐他汀，表示如下。
如上所述，優(yōu)選地，支架是HMG CoA還原酶抑制劑的一部分的親脂或芳族的模擬物。HMG CoA還原酶抑制劑共享連接到類HMG部分的剛性、疏水基團(tuán)。HMG CoA還原酶抑制劑是HMGR關(guān)于結(jié)合底物HMG CoA的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。HMG CoA還原酶抑制劑的結(jié)構(gòu)上不同的剛性疏水基被容納在HMGR的淺的非極性溝中。HMG CoA還原酶抑制劑支架取代的丙氨酸衍生物是X1-X2-X3、X1-X2-Y3、Y1-X2-X3或Y1-X2-Y3分子模型中的中心氨基酸(X2)的替換；雖然所述分子可以以任何順序重新排列?？梢詮南鄳?yīng)的芳基醛類(J-CHO，其中J是任何一種stain支架)制備所述氨基酸衍生物，如下所示?？梢砸詫?duì)映異構(gòu)體純(D或L，取決于手性催化劑)的形式或者以外消旋的形式制備所述氨基酸衍生物。
方案statin支架束縛的丙氨酸衍生物的一般合成 上述芳基醛類(Jn-CHO，n＝1-4)可以根據(jù)下列方案制備。
方案氟伐他汀支架醛的合成 方案阿托伐他汀支架醛(其中R是烷基或烷基磺酰基)的合成
方案羅蘇伐他汀支架醛(其中X是氫或鹵素)的合成 方案尼伐他汀(Nisvastatin)支架醛(其中X是氫或鹵素并且R是烷基)的合成 然后可以將這些statin取代的丙氨酸衍生物與其他氨基酸衍生物(例如Glu或Arg)偶聯(lián)。而且，這些衍生物可以部分或完全剝裸，如EFR或efr的情況中所描述的。利用HMG CoA還原酶支架的RCT介質(zhì)的一個(gè)實(shí)施方案是基于阿托伐他汀。
阿托伐他汀(Lipitor)可以合成基于阿托伐他汀的D-和L-氨基酸衍生物。還可以將這些衍生物部分或完全剝裸?？梢栽谒霭被釟埢囊粋€(gè)或兩個(gè)一起進(jìn)行生物電子等排替換?？梢詫⑽於岵糠诌M(jìn)行替換，例如，用3-氨基苯甲酸或PABA。這些衍生物表示在下列圖和方案中。
A從3-氨基-吡咯-2-羧酸 B從2-氨基-吡咯-3-羧酸 C從4-氨基-吡咯-3-羧酸
D從4-氨基-吡唑-3-羧酸 E從3-氨基-吡咯-2-羧酸(吡啶環(huán)對(duì)苯基) F從3-氨基-吡咯-2-羧酸(生物電子等排體) G從2-氨基-吡咯-3-羧酸(生物電子等排體)
H從4-氨基-吡咯-3-羧酸(生物電子等排體) I從4-氨基-吡唑-3-羧酸(生物電子等排體) J備選實(shí)施方案
K包含生物電子等排體的備選實(shí)施方案 方案-1用于溶液相合成的一般路線 溶液相肽合成中的N-Boc保護(hù)的氨基酸的一般路線表示在方案1中。首先，將所述酸與胺在標(biāo)準(zhǔn)條件下反應(yīng)(例如，EDCI、HOBt、Et3N)并且將得到的產(chǎn)物去保護(hù)(TFA)至相應(yīng)的胺。將后者用另一種適當(dāng)保護(hù)的氨基酸在標(biāo)準(zhǔn)條件下偶聯(lián)。所述N-Boc被除去(TFA)并用酰基氯(例如AcCl)加帽，并且將其它保護(hù)基去除獲得所需的產(chǎn)物。
方案-2固相中合成的一般路線 固相肽合成中的N-Boc保護(hù)的氨基酸的一般路線表示在方案2中。首先，將樹脂(Rink)的N-Fmoc去保護(hù)(哌啶，DMF)，然后與N-Fmoc保護(hù)的氨基酸在標(biāo)準(zhǔn)條件(例如，DIC、HOBt、Et3N)下偶聯(lián)，并且如上將得到的產(chǎn)物去保護(hù)為所述樹脂-結(jié)合的酰氨基胺。將后者用另一種適當(dāng)保護(hù)的氨基酸在標(biāo)準(zhǔn)條件下偶聯(lián)并重復(fù)一次。將N-Fmoc除去(哌啶，DMF)并用?；?例如AcCl)加帽，并且將其它保護(hù)基去除以獲得所需的產(chǎn)物。
支架中間體 (其中Ar＝芳基、雜芳基；R＝烷基、芳基、雜芳基)所述支架替換如上所示。雖然未顯示N-Fmoc & N-Cbz衍生物，但是也進(jìn)行了制備。后面的中間體的合成法未在方案中描述，但是以和它們的N-Boc衍生物類似的方式(利用FmocCl)制備。下面的方案描述這些有價(jià)值中間體的合成。2-氨基-吡咯-3-羧酸衍生物的合成表示在方案3中。將苯偶姻與SOCl2反應(yīng)到相應(yīng)的氯化物，然后與胺反應(yīng)得到α-酮胺。備選地，在醇溶劑中，當(dāng)在更弱的酸(例如，AcOH)存在下加熱所述胺，直接從苯偶姻制備后者。所述胺不是單體，而事實(shí)上是寡聚的(來自Mass和質(zhì)子NMR)。將α-酮胺與乙炔二羧酸二甲酯(DMAD)在MeOH中反應(yīng)得到良好收率的吡咯產(chǎn)物。將2-位的酯與1當(dāng)量的含水NaOH在MeOH中選擇性水解并且用稀HCl酸化。將得到的酸提供在Curtius重排下[二苯基磷?；?prosphoryl)疊氮化物(DPPA)、叔-BuOH、加熱)。將N-Boc保護(hù)的酯水解(NaOH水溶液、加熱、然后是稀釋的HCl)成相應(yīng)的酸。備選地，將α-酮胺與氰基乙酸乙酯反應(yīng)成2-氨基-吡咯(方案3)并且在標(biāo)準(zhǔn)條件下將后者水解并且N-Boc保護(hù)。
方案32-氨基-吡咯-3-羧酸衍生物的合成 3-氨基-吡咯-2-羧酸衍生物的合成表示在方案4和方案5。將所述胺與α-溴-苯基乙酸反應(yīng)，接著是用?；忍幚?。得到的酰氨基酸用乙酸酐中的親偶極的(芳基乙炔)處理成所述吡咯。接著將后者硝化(HNO3或硝鎓鹽)、還原(阮內(nèi)鎳、H2、EtOH/THF)、水解(NaOH水溶液、加熱)并N-保護(hù)(Boc2O、二噁烷)成所需的產(chǎn)物(方案4)。
方案43-氨基-吡咯-2-羧酸衍生物的合成 方案5顯示了雜芳基束縛的吡咯核。如前所示(方案4)類似地制備酰氨基酸。將吡咯核硝化(硝鎓鹽的HNO3)。然后將后者還原、水解、N-Boc保護(hù)，如方案5所給出。
方案-54-(2-吡啶基)-3-氨基-吡咯-2-羧酸衍生物的合成
對(duì)于4-氨基-吡咯-3-羧酸衍生物的合成，存在兩條路線，如方案5和方案6中所示。將α-氨基酸與?；仍谶拎ぶ蟹磻?yīng)成N-?；衔?，將其與乙炔二羧酸二甲酯(DMAD)在乙酸酐中加熱成期望的對(duì)稱的吡咯。將二酸選擇性地水解成一元酸(1.0當(dāng)量的NaOH水溶液；稀HCl)。將后者用二苯基磷酰基(phosproryl)疊氮化物(DPPA)[苯、叔-丁醇、加熱]和NaOH水溶液[加熱；稀釋的HCl)處理成所需的化合物(方案6)。備選地，將所述酰氨基酸與炔丙基酯在乙酸酐中反應(yīng)，接著經(jīng)硝化成硝基酸(方案6)。然后根據(jù)方案4，將所述硝基還原(阮內(nèi)鎳、H2、EtOH/THF)成胺，將所述酯水解(NaOH水溶液(aq.NaOH))并將所述胺保護(hù)(Boc2O、二噁烷)。
方案64-氨基-吡咯-3-羧酸衍生物的合成 在方案7中勾畫了4-氨基-吡咯-3-羧酸衍生物合成的完全不同的方法。首先，將β-酮酸酯在α位烷基化并且用胺將得到的二酮酸酯處理成吡咯-3-羧酸酯。將后者轉(zhuǎn)變成如方案6中表示的所需產(chǎn)物。
方案74-氨基-吡咯-3-羧酸衍生物的合成(繼續(xù)的) R＝烷基、芳基；R’＝烷基、芳基方案8中描述了吡唑核的合成。在堿存在下，將芳基酮與草酸酯反應(yīng)，接著是酸化成1，3-二酮基化合物。將后者與取代的肼反應(yīng)成吡唑-3-羧酸酯衍生物。后來的硝化(HNO3或硝鎓鹽)、還原(阮內(nèi)鎳、H2)、酯水解(NaOH水溶液)、和胺保護(hù)(Boc2O)產(chǎn)生所需化合物。
方案84-氨基-吡唑-3-羧酸衍生物的合成 另一個(gè)利用HMG CoA還原酶支架的RCT介質(zhì)的實(shí)施方案是基于尼伐他汀(nisvastatin)，如下所示。也表示了這些化合物合成的一般方案。

RCT介質(zhì)的結(jié)構(gòu)內(nèi)使用的生物電子等排體將可以在優(yōu)選的RCT介質(zhì)內(nèi)使用的優(yōu)選生物電子等排體的實(shí)例表示在下面。含胍鎓鹽(guanidium)或脒基的生物電子等排體用來取代氨基酸，例如精氨酸。含羧酸的生物電子等排體用來取代氨基酸，例如谷氨酸。用來取代堿性氨基酸，精氨酸、賴氨酸、或組氨酸，和酸性氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸的任何其它的生物電子等排體是預(yù)期的。圓環(huán)表示環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括非芳族的和芳族的結(jié)構(gòu)。
下面的合成方案顯示了可以用于合成包含生物電子等排體的RCT介質(zhì)的方法實(shí)例。術(shù)語“AA”可以表示方案中的親脂支架。
方案9 方案10
方案11 方案12 羧酸和胍基團(tuán)的生物電子等排體的實(shí)例在下面表示。
羧酸生物電子等排體(R＝H/烷基)
胍的生物電子等排體(R＝H/烷基) 優(yōu)選的介質(zhì)在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述介質(zhì)可以選自由4-胍基丁胺-3-酰氨基GABA喹啉、4-(1-(4-氨基丁基氨基甲?；?-2-(2-甲基-4-苯基喹啉-3-基)乙基氨基甲?；?丁酸、和4-(5-胍基戊氨基)喹啉-3-羧酸組成的組。上述優(yōu)選化合物列表中的任何未衍生化的氨基和/或羧基末端的氨基酸殘基用保護(hù)基封端。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述介質(zhì)具有下列結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)和功能的分析優(yōu)選實(shí)施方案的RCT介質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，包括上述的多聚體形式，可被測(cè)定以選擇活性化合物。例如，可以測(cè)定介質(zhì)它們形成α-螺旋、結(jié)合脂質(zhì)、與脂質(zhì)形成復(fù)合物、活化LCAT和促進(jìn)膽固醇流出等的能力。用于分析所述介質(zhì)的結(jié)構(gòu)和/或功能的方法和測(cè)定在本領(lǐng)域中是眾所周知的。以工作實(shí)例形式提供了優(yōu)選的方法，如下。例如，如下描述的圓二色性(CD)和核磁共振(NMR)測(cè)定法可以用于分析所述介質(zhì)的結(jié)構(gòu)-特別是在脂質(zhì)存在下螺旋的程度。結(jié)合脂質(zhì)的能力可以利用如下描述的熒光光譜測(cè)定法確定。所述介質(zhì)活化LCAT的能力可以容易地利用如下描述的LCAT活化作用確定。如下描述的體外和體內(nèi)測(cè)定可以用于評(píng)價(jià)半衰期、分布、膽固醇流出量和對(duì)RCT的影響。
合成方法優(yōu)選實(shí)施方案可以利用實(shí)際上任何本領(lǐng)域已知的制備化合物的技術(shù)而制備。例如，可以利用常規(guī)的分步溶解或固相肽合成而制備所述化合物?？梢岳贸Ｒ?guī)的分步溶解或固相合成而制備所述RCT介質(zhì)(參見，例如Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins，Williams等，Eds.，1997，CRC Press，Boca Raton Fla.，和其中引用的參考文獻(xiàn)；Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach，Atherton & Sheppard，Eds.，1989，IRL Press，Oxford，England，和其中引用的參考文獻(xiàn))。在常規(guī)的固相合成中，第一氨基酸或其類似物的附著要求將它的羧基末端(C-末端)與衍生化樹脂化學(xué)地反應(yīng)而形成低聚肽的羧基末端。氨基酸的α-氨基末端一般用叔-丁氧基-碳基(Boc)或者用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)封閉而防止可以另外反應(yīng)的氨基參與偶聯(lián)反應(yīng)。氨基酸或類似物的側(cè)鏈基團(tuán)，如果是反應(yīng)性的，也通過多種芐基衍生的保護(hù)基以醚、硫醚、酯、和氨基甲酸酯的形式封閉(或保護(hù))。下一步和后來的重復(fù)循環(huán)涉及將所述氨基-末端的(N-末端)樹脂結(jié)合的氨基酸(或末端的肽鏈殘基)解封而除去所述α-氨基保護(hù)基團(tuán)，接著是下一個(gè)封閉的氨基酸的化學(xué)加成(偶聯(lián))。然而，需要將這個(gè)過程重復(fù)許多循環(huán)而合成所關(guān)心的整個(gè)分子。在每一個(gè)偶聯(lián)和解封步驟之后，將所述樹脂結(jié)合的分子徹底清洗以便在進(jìn)行下一步之前除去任何殘留的反應(yīng)物。所述固體載體粒子促進(jìn)任何特定步驟的反應(yīng)物的去除，因?yàn)楫?dāng)所述樹脂和樹脂結(jié)合的肽被保持在具有多孔開口的柱或裝置中時(shí)可以容易地被過濾和清洗。可以將合成的分子通過酸催化從所述樹脂釋放(一般用氫氟酸或三氟乙酸)，所述酸催化將所述分子從樹脂裂解而在它的C-末端上留下酰胺或羧基。也將酸解裂解用來從合成的肽中的氨基酸側(cè)鏈上除去保護(hù)基。然后可以將完成的肽通過多種色譜方法的任何一種純化。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，通過固相合成法用Na-Fmoc化學(xué)合成所述肽和肽衍生的RCT介質(zhì)。Na-Fmoc保護(hù)的氨基酸和Rink酰胺MBHA樹脂和Wang樹脂是從Novabiochem(San Diego，CA)或Chem-Impex Intl(WoodDale，IL)購買的。其它化合物和溶劑購自下列來源三氟乙酸(TFA)、茴香醚、1，2-乙二硫醇、茴香硫醚、哌啶、乙酸酐、2-萘酸和新戊酸(Pivaloic acid)(Aldrich，Milwaukee，WI)，HOBt和NMP(Chem-Impex Intl，Wood Dale，IL)，來自Fischer Scientific，Pittsburgh，PA的二氯甲烷、甲醇和HPLC級(jí)溶劑。所述肽的純度用LC/MS檢驗(yàn)。利用制備型HPLC系統(tǒng)(Agilent technologies，1100 Series)在C18-結(jié)合的二氧化硅柱(Tosoh Biospec制備柱，ODS-80TM，Dim21.5mm×30cm)上實(shí)現(xiàn)所述肽的純化。用梯度體系[50％至90％的B溶劑(乙腈∶水為60∶40，含0.1％TFA)]洗脫所述肽。利用Rink酰胺MBHA樹脂(0.5-0.66mmol/g)或wang樹脂(1.2mmol/g)以分步方式經(jīng)由固相法合成全部肽及其類似物。所述側(cè)鏈的保護(hù)基是Arg(Pbf)、Glu(OtBu)和Asp(OtBu)。利用1.5至3倍過量的保護(hù)的氨基酸將每一個(gè)Fmoc-保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)到這個(gè)樹脂。所述偶聯(lián)劑是N-羥基苯并三唑(HOBt)和二異丙基碳二亞胺(DIC)，并且通過水合茚三酮檢驗(yàn)法監(jiān)控所述偶聯(lián)。通過30-60分鐘的處理用NMP中20％的哌啶除去Fmoc基團(tuán)，然后是用CH2Cl2、CH2Cl2中10％的TEA、甲醇和CH2Cl2的相繼清洗。偶聯(lián)步驟之后接著是乙?；蛘咴谛枰臅r(shí)候用其它封端基團(tuán)。使用TFA、茴香硫醚、乙二硫醇和茴香醚(90∶5∶3∶2，v/v)的混合物(室溫下4-5小時(shí))而將所述肽從肽-樹脂裂解并除去全部側(cè)鏈保護(hù)基。從燒結(jié)漏斗過濾粗制肽混合物，用TFA清洗(2-3次)。將濾液濃縮成濃漿并加入到冷醚中。在制冷器中過夜保存并離心之后，所述肽沉淀為白色固體。倒出所述溶液并用乙醚徹底清洗所述固體。將得到的粗制肽溶解在緩沖液(乙腈∶水為60∶40，含0.1％TFA)中并干燥。通過HPLC利用制備C-18柱(反相)用40分鐘內(nèi)的梯度體系50-90％B純化所述粗制肽[緩沖液A含0.1％(v/v)TFA的水，緩沖液B含0.1％(v/v)TFA的乙腈∶水(60∶40)]。將純級(jí)分通過Speedvac濃縮。收率在5％至20％之間變化。備選地，優(yōu)選實(shí)施方案的肽可以通過片段縮合來制備，即，將小的組成肽鏈連接在一起而形成較大的肽鏈，例如在Liu et al.，1996，Tetrahedron Lett.37(7)933-936；Baca，et al.，1995，J.Am.Chem.Soc.1171881-1887；Tam et al.，1995，Int.J.Peptide Protein Res.45209-216；Schnolzer和Kent，1992，Science 256221-225；Liu和Tam，1994，J.Am.Chem.Soc.116(10)4149-4153；Liu和Tam，1994，PNAS.USA 916584-6588；Yamashiro和Li，1988，Int.J.Peptide Protein Res.31322-334；Nakagawa etal.，1985，J.Am Chem.Soc.1077087-7083；Nokihara et al.，1989，Peptides1988166-168；Kneib-Cordonnier et al.，1990，Int.J.Pept.Protein Res.35527-538中所述；通過參考將其內(nèi)容整體地結(jié)合到這里。在Nakagawa et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.1077087-7092中描述了其它用于合成優(yōu)選實(shí)施方案的肽的方法。對(duì)于通過片段縮合產(chǎn)生的肽，通過增加偶聯(lián)時(shí)間可以顯著增加縮合步驟的偶聯(lián)效率。一般地，增加偶聯(lián)時(shí)間導(dǎo)致產(chǎn)物外消旋增加(Sieberet al.，1970，Helv.Chim.Acta 532135-2150)?？梢岳糜袡C(jī)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備含N-和/或C-末端保護(hù)基的RCT介質(zhì)。例如，肽的N-末端的?；椒ɑ蛘唠牡腃-末端的酰胺化或酯化方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在N-和/或C-末端進(jìn)行其它修飾的方法，如附著末端保護(hù)基所必需的任何側(cè)鏈官能度的保護(hù)方法一樣，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。同樣地，例如，對(duì)于肽的N-末端或肽的C-末端上的保護(hù)基去保護(hù)的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在N-和/或C-末端進(jìn)行其它修飾的方法，如除去末端保護(hù)基所必需的任何側(cè)鏈官能度的去保護(hù)方法一樣，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。制藥上可接受的鹽(抗衡離子)可以通過離子交換色譜或其它本領(lǐng)域眾所周知的方法常規(guī)地制備。
藥物劑型和治療方法優(yōu)選實(shí)施方案的RCT介質(zhì)可以用于治療動(dòng)物特別是包括人類的哺乳動(dòng)物中的任何失調(diào)，對(duì)于所述失調(diào)降低血清膽固醇是有益的，非限制性地包括其中增加血清HDL濃度、活化LCAT、并且促進(jìn)膽固醇流出和RCT是有益的病癥。這樣的病癥包括但不限于高脂血癥并且特別是高膽固醇血癥，以及心血管疾病例如動(dòng)脈粥樣硬化(包括動(dòng)脈粥樣硬化的治療和預(yù)防)和冠心??；再狹窄(例如預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化斑，其作為醫(yī)學(xué)操作例如球囊血管成形術(shù)的結(jié)果而發(fā)展)；和其它失調(diào)，例如局部缺血、和經(jīng)常導(dǎo)致膿毒性休克的內(nèi)毒素血癥。RCT介質(zhì)可以單獨(dú)或者與用于治療上述病癥的其它藥物的療法組合使用。這樣的療法包括但不限于所涉及藥物的同時(shí)或順序給藥。例如，在高膽固醇血癥或動(dòng)脈粥樣硬化的治療中，可以用目前使用的膽固醇降低療法任何一種或多種施用RCT分子介質(zhì)的制劑；例如，膽汁酸樹脂、煙酸、和/或statin。這樣的組合治療計(jì)劃可以產(chǎn)生特別有益的治療效果，因?yàn)槊恳环N藥物作用在膽固醇合成和轉(zhuǎn)運(yùn)中的不同目標(biāo)上；即，膽汁酸樹脂影響膽固醇循環(huán)、乳糜微粒和LDL群；煙酸主要影響VLDL和LDL群；statin抑制膽固醇合成、減少LDL群(并且可能增加LDL受體表達(dá))；而所述RCT介質(zhì)影響RCT、增加HDL、增加LCAT活性并且促進(jìn)膽固醇流出。所述RCT介質(zhì)可以與貝特類(fibrates)聯(lián)合使用而治療高脂血癥、高膽固醇血癥和/或心血管疾病例如動(dòng)脈粥樣硬化。RCT介質(zhì)可以與目前用于治療由內(nèi)毒素引起的膿毒性休克的抗微生物和抗炎癥藥組合使用。RCT介質(zhì)可以配制為分子-基的組合物或者分子-脂質(zhì)復(fù)合體，它可以以多種方式對(duì)受試者給藥，優(yōu)選經(jīng)由口服給藥，而將RCT介質(zhì)傳遞到循環(huán)。下面描述例舉的制劑和治療方案。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了用于改善和/或防止高膽固醇血癥和/或動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的方法。所述方法優(yōu)選涉及將優(yōu)選實(shí)施方案的化合物(或這種化合物的模擬物)的一種或多種給藥到生物體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。如這里所述，根據(jù)大量標(biāo)準(zhǔn)方法包括但不限于注射劑、栓劑、鼻腔噴霧劑、定時(shí)釋放植入物、透皮貼片等中任何一種，可以將所述化合物給藥。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述化合物口服給藥(例如糖漿劑、膠囊、或片劑)。所述方法涉及優(yōu)選實(shí)施方案的單一化合物的給藥或者兩種或多種不同化合物的給藥?？梢砸詥误w或者二聚的、寡聚的或聚合的形式提供所述化合物。在某些實(shí)施方案中，多聚形式可以包含締合的單體(例如離子或疏水連接的)而某些其它多聚形式包含共價(jià)連接的單體(直接連接或通過連接體連接)。雖然根據(jù)在人中的使用描述了優(yōu)選實(shí)施方案，但是它也適合于動(dòng)物，例如獸醫(yī)的使用。因而優(yōu)選生物體包括但不限于人類、非人類的靈長類、犬科、馬科、貓科、豬、有蹄類、largomorphs、等。優(yōu)選實(shí)施方案的方法不限于表現(xiàn)一種或多種高膽固醇血癥和/或動(dòng)脈粥樣硬化癥狀(例如，高血壓，斑的形成和破裂，臨床事件例如心臟病發(fā)作的減少、絞痛或中風(fēng)，高水平的低密度脂蛋白，高水平的極低密度脂蛋白，或者炎性蛋白質(zhì)等)的人類或非人類的動(dòng)物，而且在預(yù)防的范圍內(nèi)也是有用的。因而，優(yōu)選實(shí)施方案的化合物(或其模擬物)可以給藥到生物體以預(yù)防高膽固醇血癥和/或動(dòng)脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的發(fā)作/發(fā)展。關(guān)于這點(diǎn)特別優(yōu)選的受試者是表現(xiàn)一種或多種動(dòng)脈硬化風(fēng)險(xiǎn)因子(例如，家族病史，高血壓，肥胖癥，高酒精消費(fèi)，吸煙，高血液膽固醇，高血液甘油三酸酯，升高的血液LDL、VLDL、IDL、或低HDL，糖尿病或糖尿病的家族病史，高血脂，心臟病發(fā)作、絞痛或中風(fēng)，等)的受試者。優(yōu)選的實(shí)施方案包括藥物配方和這種制劑在高脂血癥、高膽固醇血癥、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、早老性癡呆、多發(fā)性硬化、涉及高脂血癥的病癥例如炎癥、和其他病癥例如引起感染性休克的內(nèi)毒素血癥的治療中的使用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以利用先前部分中描述的與RCT介質(zhì)的合成和純化有關(guān)的任何技術(shù)合成或制造所述RCT的分子介質(zhì)。具有長貯藏期限的穩(wěn)定制劑可以通過冷凍干燥所述介質(zhì)而制造-或者制備用于再形成的大批，或者制備可以在給藥到受試者之前通過用滅菌水或合適的滅菌緩沖溶液通過再次水合而重構(gòu)的個(gè)體等分試樣或劑量單位。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RCT介質(zhì)可以以分子-脂質(zhì)復(fù)合體形式配制和給藥。這個(gè)方法具有一些優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鰪?fù)合體應(yīng)當(dāng)在循環(huán)中具有增加的半衰期，特別是當(dāng)所述復(fù)合體具有與HDL并且特別是前-β-1或前-β-2 HDL群相似的大小和密度時(shí)。所述分子-脂質(zhì)復(fù)合體可以通過下面描述的大量方法的任一種而方便地制備。具有長貯藏期限的穩(wěn)定制劑可以通過下面作為優(yōu)選方法描述的冷凍干燥-共冷凍干燥程序制造。冷凍干燥的分子-脂質(zhì)復(fù)合體可以用于制備藥物再形成的大批，或用于制備可以通過在施用給受試者前用滅菌水或合適的緩沖溶液通過再次水合而重構(gòu)的個(gè)體等分試樣或劑量單位?？梢詫⒈绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的多種方法用于制備分子-脂質(zhì)小泡或復(fù)合物。為此目的，可以使用許多可用于制備脂質(zhì)體或脂蛋白體的技術(shù)。例如，所述化合物可以與適當(dāng)?shù)闹|(zhì)共超聲波處理(利用浴槽或探頭聲波處理器)而形成復(fù)合體。備選地，所述化合物可以與預(yù)先形成的脂質(zhì)小泡結(jié)合，導(dǎo)致分子-脂質(zhì)復(fù)合物的自發(fā)形成。在另一個(gè)備選方法中，可以通過去污劑透析方法形成肽-脂質(zhì)復(fù)合物；例如，將化合物、脂質(zhì)和去污劑的混合物進(jìn)行透析從而去除去污劑并重構(gòu)或形成肽-脂質(zhì)復(fù)合物(例如，見Jonas et al.，1986，Methods in Enzymol.128553-582)。雖然前面的方法是可行的，但是每一種方法存在它自身特有的在成本、收率、再現(xiàn)性和安全性方面的生產(chǎn)問題。根據(jù)一種優(yōu)選方法，所述化合物和脂質(zhì)結(jié)合在能共溶解每一種成分并能通過冷凍干燥完全除去的溶劑體系中。為此，應(yīng)當(dāng)仔細(xì)地選擇溶劑對(duì)而確保兩親性化合物和脂質(zhì)二者的共溶解性。在一個(gè)實(shí)施方案中，要結(jié)合到粒子中的化合物或其衍生物/類似物可以溶解在水或有機(jī)溶劑或溶劑的混合物(溶劑1)中。將(二氧磷基)脂質(zhì)成分溶解在水性或有機(jī)溶劑或溶劑的混合物(溶劑2)中，所述溶劑2與溶劑1可互溶，并且將兩種溶液混合。備選地，所述化合物和脂質(zhì)可以結(jié)合到共溶劑體系中；即，可互溶的溶劑混合物?；衔锱c脂質(zhì)的適合比例首先經(jīng)驗(yàn)確定以便得到的復(fù)合體擁有適當(dāng)?shù)奈锢砗突瘜W(xué)性質(zhì)；即，通常(但是不必)在大小上類似于HDL。將得到的混合物冷凍并冷凍干燥至干。有時(shí)必須將另外的溶劑加入到所述混合物而促進(jìn)冷凍干燥。這個(gè)冷凍干燥的產(chǎn)品可以長期貯存并將保持穩(wěn)定。可以將所述冷凍干燥的產(chǎn)物重構(gòu)以便獲得分子-脂質(zhì)復(fù)合體的溶液或懸浮液。為此，所述冷凍干燥粉末可以用水溶液再水化到適合的體積(通常是方便靜脈注射的5mg化合物/ml)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述冷凍干燥粉末用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水溶液再水化。必須將所述混合物攪拌或渦旋以促進(jìn)再水化，并且在大多數(shù)情況下，應(yīng)當(dāng)在等于或大于復(fù)合體脂質(zhì)組分的相變溫度進(jìn)行所述重構(gòu)步驟。重構(gòu)的脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合體的清澈制劑在幾分鐘之內(nèi)產(chǎn)生?？梢詫⑺弥貥?gòu)制劑的等分部分進(jìn)行表征而確定所述制劑中的復(fù)合體具有所需的大小分布；例如，HDL的大小分布。為此可以使用凝膠過濾色譜法。例如，可以使用Pharmacia Superose 6 FPLC凝膠過濾色譜系統(tǒng)。使用的緩沖液在50mM磷酸鹽緩沖液中含有150mM NaCl，pH 7.4。典型的樣品體積是20至200毫升含有5mg化合物/ml的復(fù)合體。柱流速是0.5ml/min。一系列已知分子量和斯托克斯直徑的蛋白質(zhì)以及HDL優(yōu)選用作標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定所述柱。通過波長254至280nm的光的吸光度或者散射監(jiān)控所述蛋白質(zhì)和脂蛋白復(fù)合體。優(yōu)選實(shí)施方案的RCT介質(zhì)可以和多種脂質(zhì)復(fù)合，包括飽和的、不飽和的、天然的和合成的脂質(zhì)和/或磷脂。合適的脂質(zhì)包括，但不限于，小烷基鏈磷脂，例如，卵磷脂酰膽堿，大豆磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿，1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿，1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿，1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿，二油酰磷脂酰膽堿 二油酰磷脂酰乙醇胺，二月桂酰磷脂酰甘油 磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，神經(jīng)鞘磷脂，神經(jīng)鞘脂類，磷脂酰甘油，二磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，二棕櫚酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酸，二棕櫚酰磷脂酸，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸，二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸，腦磷脂酰絲氨酸，腦神經(jīng)鞘磷脂，二棕櫚酰神經(jīng)鞘磷脂，二硬脂酰神經(jīng)鞘磷脂，磷脂酸，半乳糖腦苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，腦苷脂，二月桂基磷脂酰膽堿，(1，3)-D-mannosyl-(1，3)甘油二酯，氨基苯基糖苷，3-膽甾烯基-6′-(糖基硫代)己基醚糖脂，和膽固醇及其衍生物。優(yōu)選實(shí)施方案的藥物制劑含有RCT分子介質(zhì)或者分子-脂質(zhì)復(fù)合體作為適合于在體內(nèi)給藥和傳遞的制藥可接受的載體中的活性成分。因?yàn)樗龌衔锟梢院兴嵝院?或堿性末端和/或側(cè)鏈，可以將所述化合物或者以游離酸或堿的形式、或者以制藥可接受的鹽的形式包括在制劑中。可注射的制劑包括所述活性成分在水性或油性賦形劑中的無菌懸浮液、溶液或乳化液。所述組合物也可含有配制劑(formulatingagents)，例如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑。注射用劑型可以以單位劑量形式存在，例如，在安瓿中或者在多劑量容器中，并且可以含有附加的防腐劑。備選地，可注射的制劑可以以在使用前用合適的賦形劑進(jìn)行重構(gòu)的粉末形式進(jìn)行提供，所述賦形劑包括，但不限于無菌的無熱原的水，緩沖液，葡萄糖溶液等。為此目的，可以凍干RCT的介質(zhì)，或可以制備共-凍干的分子-脂質(zhì)復(fù)合物?？梢砸詥挝粍┬偷男问教峁┵A存的制劑并在體內(nèi)使用前進(jìn)行重構(gòu)。對(duì)于延長的傳遞，可以將活性組分配制為通過植入進(jìn)行施用的長效制劑；例如，皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)注射。因此，例如，可以將活性組分與合適的聚合或疏水性材料一起進(jìn)行配制(例如，作為在可接受的油中的乳狀液)或與離子交換樹脂一起進(jìn)行配制，或配制為少量可溶的衍生物；例如。作為RCT的介質(zhì)的少量可溶的鹽形式。備選地，可以使用被生產(chǎn)為緩慢釋放活性組分以進(jìn)行經(jīng)皮吸收的粘著盤或貼片的透皮傳遞系統(tǒng)。為此目的，可以使用滲透增強(qiáng)物以促進(jìn)活性組分的透皮滲透?？梢酝ㄟ^將優(yōu)選實(shí)施方案的RCT的介質(zhì)或分子-脂質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到硝化甘油貼片中以使用在患有局部缺血性心臟疾病和高膽固醇血癥的患者中以獲得特別的益處。對(duì)于口服施用，藥物組合物可以采取通過常規(guī)方式用藥用賦形劑諸如粘合劑(例如，預(yù)凝膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或濕潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉)進(jìn)行制備的片劑或膠囊形式。所述片劑可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行包被。進(jìn)行口服施用的液體制劑可以采用，例如溶液、糖漿或混懸液的形式，或它們可作為在使用前用水或其它合適的賦形劑構(gòu)成的干燥產(chǎn)品存在。這些液體制劑可以通過常規(guī)方法用藥用添加劑諸如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化的可食脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性賦形劑(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分級(jí)分離的植物油)；和防腐劑(例如，甲基或丙基-對(duì)-羥基苯甲酸酯或山梨酸)進(jìn)行制備。所述制劑還可包含合適的緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。可以將口服施用的制劑合適地配制以獲得活性化合物的控釋。對(duì)于頰含施用，所述組合物可以采取以常規(guī)方法配制的片劑或錠劑的形式。對(duì)于直腸和陰道施用路徑，可以將活性組分配制為溶液(對(duì)于滯留型灌腸劑)栓劑或軟膏劑。對(duì)于通過吸入進(jìn)行施用，使用合適的推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體，以來自壓縮包裝或噴霧器的氣溶膠噴霧劑形式來方便地傳遞活性組分。在壓縮的氣溶膠情形中，可以通過提供閥以傳遞計(jì)量來確定劑量單位?？梢耘渲朴迷谖鼩馄骰蛭肫髦械睦?，明膠的膠囊和藥筒，其包含化合物的粉末混合物和合適的粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉。如果需要，所述組合物可以存在于包裝或分配器裝置中，其可以包含一個(gè)或多個(gè)單位劑型，所述劑型包含活性組分。所述包裝可以例如，包含金屬或塑料箔，諸如泡眼包裝。所述包裝或分配器可配有施用的說明書。優(yōu)選實(shí)施方案的RCT的分子介質(zhì)和/或肽-脂質(zhì)復(fù)合體可以通過確保在循環(huán)中的生物利用度的任何合適的路徑來施用。這可以通過包括靜脈內(nèi)(IV)、肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)、皮下(SC)和腹膜內(nèi)(IP)注射的施用的腸胃外路徑來完成。然而，可以使用其它施用途徑。例如，如果將合適的制劑(例如，腸溶包衣)用于避免或最小化活性組分在，例如口腔粘膜、胃和/或小腸的苛刻環(huán)境中的降解，經(jīng)過胃腸道的吸收可以通過施用的口服路徑(包括但不限于攝取、頰含和舌下路徑)來完成?？诜┯镁哂幸子趹?yīng)用和因此提高順應(yīng)性的優(yōu)勢(shì)?；蛘?，可以將經(jīng)過粘膜組織的施用諸如陰道和直腸施用方式用于避免或最小化在胃腸道中的降解。在另一個(gè)備選方法中，可以將本發(fā)明的制劑經(jīng)過皮膚地(例如，透皮地)，或通過吸入進(jìn)行施用。將理解的是優(yōu)選的路徑可以隨受者的疾病、年齡和順應(yīng)性而變化。使用的RCT分子介質(zhì)或分子-脂質(zhì)復(fù)合體的實(shí)際劑量可以隨著給藥路線而改變，并且應(yīng)當(dāng)被調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)1.0mg/l至2g/l的循環(huán)血漿濃度。這里描述的動(dòng)物模型體系中獲得的數(shù)據(jù)顯示優(yōu)選實(shí)施方案的ApoA-I激動(dòng)劑與HDL組分締合，并在人中具有約5天的預(yù)計(jì)的半衰期。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，RCT介質(zhì)可以通過每星期一次的以0.5mg/kg至100mg/kg之間劑量的注射進(jìn)行給藥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，理想的血清水平可通過持續(xù)的輸注或通過提供約0.1mg/kg/小時(shí)-100mg/kg/小時(shí)的間歇輸注來維持。不同的RCT介質(zhì)的毒性和治療功效可以利用細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中用于確定LD50(致死群體的50％的劑量)和ED50(在群體的50％中治療有效的劑量)的標(biāo)準(zhǔn)制藥程序而確定。毒性和治療效應(yīng)之間的劑量比率是治療指數(shù)并且可將其表示為比率LD50/ED50。優(yōu)選顯示大的治療指數(shù)的ApoA-I分子激動(dòng)劑。
其它使用優(yōu)選實(shí)施方案的RCT激動(dòng)劑的介質(zhì)可以用在體外檢驗(yàn)以測(cè)定血清HDL，例如，用于診斷目的。因?yàn)镽CT介質(zhì)與血清的HDL和LDL組分締合，所以所述激動(dòng)劑可以用作HDL和LDL群的“標(biāo)記”。而且，所述激動(dòng)劑可以用作在RCT中有效的HDL亞群的標(biāo)記。為此，可以將所述激動(dòng)劑加入到患者血清樣品或者與患者血清樣品混合；在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)時(shí)間后，可以通過檢測(cè)結(jié)合的RCT介質(zhì)檢驗(yàn)HDL組分。這可以利用標(biāo)記的激動(dòng)劑(例如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、染料、等)、或者通過利用對(duì)于激動(dòng)劑特異的抗體(或抗體片段)的免疫測(cè)定實(shí)現(xiàn)。備選地，可以將標(biāo)記的激動(dòng)劑用在成像方法(例如，CAT掃描，MRI掃描)中以顯現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)，或監(jiān)測(cè)RCT，或顯現(xiàn)HDL在脂條、動(dòng)脈粥樣硬化損傷等中的聚集。(其中HDL應(yīng)在膽固醇流出中是有活性的)。
用于反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的介質(zhì)分析的檢測(cè)LCAT活化檢測(cè)可通過各種體外測(cè)定，例如，通過它們?cè)隗w外活化LCAT的能力來評(píng)價(jià)按照優(yōu)選實(shí)施方案的RCT的介質(zhì)的潛在臨床功效。在LCAT測(cè)定中，用等量的化合物或ApoA-I(分離自人血漿)對(duì)由卵磷脂酰膽堿(EPC)或1-棕櫚酰-2-油基-磷脂酰-膽堿(POPC)與放射性標(biāo)記的膽固醇組成的底物小泡(小的單層小泡或“SUVs”)進(jìn)行預(yù)溫育。通過添加LCAT(純化自人血漿)來起始反應(yīng)。被用作陽性對(duì)照的天然ApoA-I，表現(xiàn)了100％的活化活性。可將分子介質(zhì)的“比活”(即活性的單位(LCAT活化)/質(zhì)量單位)計(jì)算為獲得最大LCAT活化的介質(zhì)的濃度。例如，可對(duì)一系列濃度的肽(例如，有限稀釋)進(jìn)行測(cè)定以確定化合物的“比活”--分析中在特定時(shí)間點(diǎn)(例如1小時(shí))獲得最大LCAT活化(即，膽固醇向膽固醇酯的轉(zhuǎn)變百分比)的濃度。當(dāng)在例如1hr.繪制相對(duì)于所用化合物濃度的膽固醇轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)時(shí)，可以將“比活”確定為在繪制的曲線上達(dá)到穩(wěn)定水平的化合物濃度。
底物囊的制備用在LCAT測(cè)定中的小泡是由摩爾比為20∶1的卵磷脂(EPC)或1-棕櫚酰-2-油基-磷脂酰膽堿(POPC)與膽固醇組成的SUVs。為了制備足夠40次測(cè)定的小泡貯存溶液，將7.7mg EPC(或7.6mg POPC；10μmol)，78μg(0.2μmol)4-14C-膽固醇，116μg膽固醇(0.3μmol)溶解于5ml的二甲苯中并進(jìn)行凍干。其后，將4ml的測(cè)定緩沖液加入干燥粉末中并在氮?dú)夥障掠?℃超聲處理。超聲處理?xiàng)l件Branson 250超聲波儀，10mm探頭(tip)，6×5分鐘；測(cè)定緩沖液10mM Tris，0.14M NaCl，1mM EDTA，pH 7.4。將超聲處理的混合物在14,000rpm(16,000×g)離心6次，每次5分鐘以去除鈦顆粒。將得到的澄清溶液用于酶測(cè)定LCAT的純化對(duì)于LCAT的純化，將葡聚糖硫酸酯/Mg2+處理的人血漿用于獲得缺乏脂蛋白的血清(LPDS)，將其在Phenylsepharose、Affigelblue、ConcanavalinA sepharose和抗-ApoA-I親和層析法上順序進(jìn)行色譜分析。
LPDS的制備為了制備LPDS，將500ml血漿加入到50ml葡聚糖硫酸酯(MW＝500,000)溶液。攪拌20分鐘。在3000rpm(16,000×g)、4℃離心30分鐘。利用上清液(LPDS)用于進(jìn)一步純化(約500ml)。
苯基瓊脂糖凝膠色譜使用下列材料和條件用于苯基瓊脂糖凝膠色譜。固相高流動(dòng)性苯基瓊脂糖凝膠，高堅(jiān)固等級(jí)(subst.grade)，Pharmacia柱XK26/40，凝膠床層高度33cm，V＝約175ml，流速200ml/hr(樣品)，沖洗200ml/hr(緩沖液)，洗脫80ml/hr(蒸餾水)，緩沖液10mM Tris，140mMNaCl，1mM EDTA，pH 7.4，0.01％疊氮化鈉。將所述柱在Tris-緩沖液中平衡，向500ml LPDS加入29g NaCl并施加到所述柱。用若干體積的Tris緩沖液沖洗直到在280nm波長的吸光度近似在基線，然后用蒸餾水開始洗脫。將含有蛋白質(zhì)的級(jí)分匯合(匯合大小180ml)并用于Affigelblue色譜。
Affigelblue色譜將苯基瓊脂糖凝膠合并物對(duì)著20mM Tris-HCl、pH 7.4、0.01％疊氮化鈉在4℃過夜透析。將合并的體積通過超濾(Amicon YM30)減少到50-60ml并裝載到Affigelblue柱上。固相Affigelblue，Biorad，153-7301柱，XK26/20，凝膠床層高度約13cm；柱體積約70ml。流速裝載15ml/h沖洗50ml/h。在Tris-緩沖液中平衡柱。將苯基瓊脂糖凝膠合并物加樣到柱上。并行地開始收集級(jí)分。用Tris-緩沖液沖洗。將合并的級(jí)分(170ml)用于ConA色譜。
ConA色譜經(jīng)由Amicon(YM30)將Affigelblue合并物減少到30-40ml并用ConA起始緩沖液(1mM Tris HCl pH7.4；1mM MgCl2，1mM MnCl2，1mMCaCl2，0.01％疊氮化鈉)在4℃透析過夜。固相ConA瓊脂糖凝膠(Pharmacia)柱XK26/20，凝膠床層高度14cm(75ml)。流速裝載40ml/h沖洗(用起始緩沖液)90ml/h洗脫50ml/h，1mM Tris中的0.2M甲基-α-D-甘露糖苷，pH 7.4。收集甘露糖苷洗脫的蛋白質(zhì)級(jí)分(110ml)，并且通過超濾(YM30)將體積減少到44ml。將ConA合并物分成貯存于-20℃的2ml的等分試樣。
抗-ApoA-I親和色譜在已經(jīng)與抗-ApoA-I abs共價(jià)偶聯(lián)的Affigel-Hz材料(Biorad)上進(jìn)行抗-ApoA-I親和層析法。柱XK16/20，V＝16ml。用pH 7.4的PBS平衡柱。在裝載到柱上之前，將2ml的ConA合并物向著PBS進(jìn)行透析2小時(shí)。流動(dòng)速度裝載15ml/小時(shí)洗滌(PBS)40ml/小時(shí)。將合并的蛋白質(zhì)級(jí)分(V＝14ml)用于LCAT測(cè)定。用0.1M的檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)再生柱以洗脫結(jié)合的A-I(100ml)，并在該方法后立即用PBS再次平衡。
RCT介質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)下列實(shí)驗(yàn)方案可以用于證明所述RCT介質(zhì)在循環(huán)中是穩(wěn)定的并且與血漿的HDL組分締合。
化合物激動(dòng)劑的合成和/或放射性標(biāo)記將125I-標(biāo)記的LDL通過一氯化碘方法制備成比活為500-900cpm/ng(Goldstein和Brown 1974 J.Biol.Chem.2495153-5162)。如所述，通過培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞在最終比活為500-900cpm/ng下測(cè)定低密度脂蛋白的結(jié)合和降解(Goldstein和Brown 1974 J.Biol.Chem.2495153-5162)。在每個(gè)情況中，通過所述脂蛋白與10％(重量/體積)三氯乙酸(TCA)在4℃下的溫育，＞99％的放射性是可沉淀的。將酪氨酸殘基附著在每一個(gè)化合物的N-末端而實(shí)現(xiàn)放射性碘標(biāo)記。利用礦珠(Iodo-Beads)(Pierce Chemicals)和遵循制造商的方案，將所述化合物用Na125I(ICN)放射性碘標(biāo)記成比活為800-1000cpm/ng。透析之后，所述化合物的可沉淀的放射性(10％TCA)一直是＞97％。備選地，可以通過偶聯(lián)14C-標(biāo)記的Fmoc-Pro作為N-末端的氨基酸合成放射性標(biāo)記的化合物。L-[U-14C]X，比活為9.25GBq/mmol，可以用于含X的標(biāo)記激動(dòng)劑的合成?？梢愿鶕?jù)Lapatsanis，Synthesis，1983，671-173進(jìn)行所述合成。簡(jiǎn)言之，將250μM(29.6mg)的未標(biāo)記的L-X溶解在225μl的9％Na2CO3溶液中并且加入到9.25MBq(250μM)14C-標(biāo)記的L-X溶液(9％Na2CO3)。將所述液體冷卻降到0℃，與0.75ml DMF中的600μM(202mg)9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯(9-fluorenylmethyl-N-succinimidylcarbonate(Fmoc-OSu))混合并在室溫下振蕩4小時(shí)。此后，用二乙醚(2×5ml)和氯仿(1×5ml)萃取所述混合物，用30％HCl將剩余的水相酸化并用氯仿(5×8ml)萃取。將有機(jī)相通過Na2SO41濾出干燥并且在氮?dú)饬飨聦Ⅲw積減少到5ml。用UV檢測(cè)通過TLC(CHCl3∶MeOH∶Hac為9∶1∶0.1體積比，固定相HPTLC硅膠60，Merck，Germany)估計(jì)純度，例如，放射化學(xué)純度線性分析儀，Berthold，Germany；反應(yīng)收率可以約為90％(通過LSC測(cè)定)。將包含14C-化合物X的氯仿溶液直接用于合成。如上所述，可以自動(dòng)合成包含氨基酸2-22的樹脂并將其用于合成。通過Edman降解來確定肽的序列。偶聯(lián)的進(jìn)行如前面所述，除了優(yōu)選使用替代TBTU的HATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(uroniumhexafluorophosphate))以外。手動(dòng)進(jìn)行用未標(biāo)記的Fmoc-L-X進(jìn)行的第二次偶聯(lián)。
小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，可將300-500μg/kg(0.3-0.5mg/kg)[或更多諸如2.5mg/kg]放射性標(biāo)記的化合物腹膜內(nèi)注射到小鼠中，用正常小鼠食物(Chow)或?qū)е聞?dòng)脈粥樣硬化的Thomas-Harcroft改進(jìn)的食物(導(dǎo)致VLDL和IDL膽固醇的劇烈升高)對(duì)所述小鼠進(jìn)行喂養(yǎng)。在多個(gè)時(shí)間間隔取血液樣品以進(jìn)行血漿中放射性的評(píng)價(jià)。
人血清中的穩(wěn)定性可將100μg標(biāo)記的化合物可與2ml新鮮人血漿(于37℃)混和，并被立即去脂質(zhì)化(delipidated)(對(duì)照樣品)或在于37℃溫育8天后被去脂質(zhì)化(測(cè)試樣品)。通過用等體積的2∶1(v/v)氯仿甲醇抽提脂質(zhì)來進(jìn)行去脂質(zhì)化。將樣品裝載到反相C18HPLC柱上并用線性梯度(在33分鐘內(nèi)25-58％)的乙腈(包含0.1％w的TFA)進(jìn)行洗脫。洗脫圖譜根據(jù)吸光度(220nm)和放射性繪制。
前-β樣顆粒的形成可通過在密度d＝1.21g/ml處的KBr密度超離心來分離人HDL以獲得上層級(jí)分，隨后通過Superose 6凝膠過濾層析法來從其它脂蛋白中分離HDL?；贐radford蛋白測(cè)定所確定的蛋白質(zhì)含量，用生理鹽水將分離的HDL調(diào)整為1.0mg/ml的終濃度。從分離的HDL制備物中移出300μl的等分試樣，并用100μl標(biāo)記的化合物(0.2-1.0μg/μl)于37℃溫育2小時(shí)。分析多個(gè)單獨(dú)的溫育物，包括包含100μl的生理鹽水的空白和四個(gè)稀釋度的標(biāo)記的介質(zhì)。例如(i)0.20μg/μl的化合物∶HDL比率＝1∶15；(ii)0.30μg/μl化合物∶HDL比率＝1∶10；(iii)0.60μg/μl化合物∶HDL比率＝1∶5；和(iv)1.00μg/μl化合物∶HDL比率＝1∶3。2小時(shí)溫育后，將200μl的樣品的等分試樣(總體積＝400μl)裝載到Superose 6凝膠過濾柱上以進(jìn)行脂蛋白分離和分析并將100μl用于確定總的裝載的放射性。
介質(zhì)與人脂蛋白的締合可通過與每個(gè)脂蛋白類別(HDL、LDL和VLDL)和不同脂蛋白類別的混合物一起溫育標(biāo)記的介質(zhì)來確定分子介質(zhì)與人脂蛋白級(jí)分之間的締合。通過在d＝1.21g/ml的KBr密度梯度超離心來分離HDL、LDL和VLDL，并通過在Superose 6B柱大小排阻柱上的FPLC進(jìn)行純化(用0.7ml/min的流速和1mM Tris(pH 8)，115mM NaCl，2mM EDTA和0.0％NaN3的運(yùn)行緩沖液進(jìn)行層析法)。標(biāo)記的化合物與HDL，LDL和VLDL一起在1∶5的化合物∶磷脂比率(質(zhì)量比率)下于37℃溫育2小時(shí)。所需量的脂蛋白(基于產(chǎn)生1000μg所需的量的體積)與0.2ml的化合物貯存液(1mg/ml)混和并使用0.9％NaCl使溶液達(dá)到2.2ml。在37℃溫育2小時(shí)后，將等分試樣(0.1ml)取出用于總放射性的測(cè)定(例如，通過液體閃爍計(jì)數(shù)或伽馬計(jì)數(shù)，取決于標(biāo)記同位素)，將殘留的溫育混合物的密度用KBr調(diào)整到1.21g/ml，并且利用Beckman臺(tái)式超速離心機(jī)在TLA 100.3轉(zhuǎn)子中將樣品在4℃以100,000rpm(300,000g)離心24小時(shí)。通過從每一個(gè)樣品的頂部移出0.3ml而將得到的上清液分級(jí)為總共5個(gè)級(jí)分，并且將每個(gè)級(jí)分的0.05ml用于計(jì)數(shù)。頂部的兩個(gè)級(jí)分含有漂浮的脂蛋白，其它級(jí)分(3-5)對(duì)應(yīng)于溶液中的化合物。
選擇性結(jié)合到HDL脂質(zhì)用20、40、60、80、和100μg標(biāo)記的化合物將人血漿(2ml)在37℃溫育2小時(shí)。通過將密度調(diào)整到1.21g/ml并在TLA 100.3轉(zhuǎn)子中在4℃以100,000rpm(300,000g)離心36小時(shí)分離所述脂蛋白。取出頂部的900μl(在300μl級(jí)分中)用于分析。將來自每一個(gè)300μl級(jí)分的50μl對(duì)于放射性計(jì)數(shù)并且通過FPLC(Superose 6/Superose 12聯(lián)合柱)分析來自每一個(gè)級(jí)分的200μl。
動(dòng)物模型體系中反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)的使用優(yōu)選實(shí)施方案的RCT介質(zhì)的功效可以在兔或其它合適的動(dòng)物模型中證明。
磷脂/化合物復(fù)合體的制備遵循膽酸鹽透析法制備由磷脂(DPPC)和化合物組成的小的盤狀粒子。將所述磷脂溶解在氯仿中并且在氮?dú)饬飨赂稍铩⑺龌衔镆?-2mg/ml的濃度溶解在緩沖液(鹽水)中。將所述脂膜再溶解在含膽酸鹽的緩沖液(43℃)中并且以3∶1的磷脂/化合物的重量比加入所述化合物溶液。將混合物在43℃過夜溫育并在43℃(24hr)、室溫(24hr)和4℃(24hr)透析，在溫度點(diǎn)有三次緩沖液(大體積)的改變?？梢詫⑺鰪?fù)合體無菌過濾(0.22μm)用于注射并且在4℃保存。
化合物/磷脂粒子的分離和表征可以在凝膠過濾柱(Superose 6 HR)上分離所述粒子。通過測(cè)定每一個(gè)級(jí)分中的磷脂濃度確定含有所述粒子的峰位置。從洗脫體積，可以確定斯托克斯半徑。通過測(cè)定在16小時(shí)酸水解后的苯丙氨酸含量(用HPLC)而確定復(fù)合體中的化合物濃度。
兔中的注射用一劑量的磷脂/化合物復(fù)合體(5或10mg/kg體重，表示為化合物)以不超過10-15ml的單一推注形式靜脈注射雄性新西蘭白兔(2.5-3kg)。在操作之前使所述動(dòng)物稍微鎮(zhèn)靜。在注射前和注射后5、15、30、60、240和1440分鐘取血樣(在EDTA上收集)。對(duì)于每一個(gè)樣品，測(cè)定血細(xì)胞比容(Hct)。將樣品等分并在分析之前保存在-20℃。
兔血清的分析利用商購的檢驗(yàn)法酶促測(cè)定總血漿膽固醇、血漿甘油三酸酯和血漿磷脂，例如按照生產(chǎn)商的手冊(cè)(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany and Biomerieux，69280，Marcy-L′etoile，F(xiàn)rance)。在將所述血漿分離成它的脂蛋白級(jí)分后獲得的級(jí)分血漿脂蛋白輪廓可以通過在蔗糖密度梯度中的旋轉(zhuǎn)而確定。例如，收集級(jí)分并且可以通過常規(guī)的酶分析法測(cè)定對(duì)應(yīng)于VLDL、ILDL、LDL和HDL脂蛋白密度的級(jí)分中磷脂和膽固醇的水平。
含修飾氨基酸或者分子團(tuán)生物電子等排體或官能團(tuán)生物電子等排體的RCT介質(zhì)的合成基于阿托伐他汀的親脂基修飾的肽序列的合成一般分析方法全部試劑屬于商業(yè)品質(zhì)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法干燥和純化溶劑。從商業(yè)來源獲得氨基酸衍生物。分析的TLC在涂覆有0.2mm層的硅膠60 F254，Merck的鋁板上進(jìn)行，以及制備的TLC在涂覆有2mm層的硅膠PF254，Merck的20cm×20cm玻璃板上進(jìn)行。硅膠60(230-400目)，Merck用于快速色譜(flash chromatography)。在微型高溫臺(tái)(micro-hot-stage)設(shè)備上獲得熔點(diǎn)并且是未修正的。用Brucker 400分光計(jì)記錄1H NMR光譜，在400MHz下操作，利用TMS或溶劑作為參比。在NuMega ResonanceLaboratories，San Diego上進(jìn)行元素分析。終產(chǎn)物的制備反相HPLC(Glison)在Phenomenex Luna 5μC18(2)(60mm×21.2mm)柱上進(jìn)行，流速為15mL/min，利用可調(diào)的設(shè)定在254nm的UV檢測(cè)器。CH3CN和H2O的混合物用作梯度方式中的流動(dòng)相(CH3CN＝5％-95％)。LC/UV/ELSD/MS的分析利用獲自PE Sciex的API 150 EX儀器進(jìn)行。以正模式進(jìn)行ESI-MS實(shí)驗(yàn)。
方案12 2-(異丙基氨基)-1，2-二苯基乙酮(2)向苯偶姻(8.0g，37.7mmol)在EtOH的溶液(150mL)中加入異丙胺(2.45g，41.5mmol)，接著是冰AcOH(數(shù)滴)。將所述反應(yīng)在45℃加熱5天。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去揮發(fā)性原料并且真空干燥。在下列反應(yīng)中使用所述粗原料。
1-異丙基-4，5-二苯基-1H-吡咯-2，3-二羧酸二甲酯(3)將乙炔二羧酸二甲酯(DMAD，7.0g，57mmol)加入到上述胺2(8.0g，32mmol)在MeOH(100mL)中的溶液并且將所述反應(yīng)在氬氣下回流加熱過夜。在冰浴中冷卻所述反應(yīng)混合物并過濾。用冷MeOH(20mL)清洗所述固體并干燥而提供作為白色粉末的吡咯3(9.8g，82％)。
3-(甲酯基)-1-異丙基-4，5-二苯基-1H-吡咯-2-羧酸(4)向所述二酯2(6.12g，16.1mmol)加入MeOH(100mL)和1MNaOH(含水的，17.05mL)。將所述混合物回流加熱18h。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去揮發(fā)物。將殘留物置入到水(100mL)中并用乙醚(2×50mL)萃取并保持在旁邊而獲得未反應(yīng)的原材料。用4M HCl將水相酸化到pH～3并用乙醚萃取(3×60mL)，用水(50mL)清洗并干燥(Na2SO4)。在蒸發(fā)和干燥后，獲得作為白色固體的一元酸4(5.02g，85％)。
3-(甲酯基)-1-異丙基-4，5-二苯基-1H-吡咯-2-基氨基甲酸芐酯(5)向上面的一元酸4(0.1g，0.27mmol)在苯中的溶液(3mL)加入三乙胺(45μL，0.33mmol)和二苯基磷?；?phosproryl)疊氮化物(DPPA，0.091g，0.33mmol)，在室溫下攪拌4小時(shí)。然后加入芐基醇(35μL，33mmol)，并將所述反應(yīng)混合物回流加熱15h。將所述反應(yīng)進(jìn)行冷卻到室溫，加入5％NaHCO3(5mL)并用乙醚(2×10mL)萃取。在濃縮后，它給出氨基甲酸酯5。
2-(4-(N，N′-二(Boc)胍基)丁基氨基甲?；?-1-異丙基-4，5-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(6)向所述酸4(0.1g，0.27mmol)在CH2Cl2中的溶液(3mL)以如下順序加入EDCI(0.053g，0.27mmol)、HOBt(0.037g，0.27mmol)、Et3N(38μL，0.27mmol)和胺11(0.086g，0.26mol)并在室溫?cái)嚢柽^夜。用CH2Cl2(10ml)將所述反應(yīng)稀釋并用飽和的NaHCO3(5mL)、鹽水(5mL)清洗并干燥(Na2SO4)而獲得作為白色固體的酰胺6(0.165g，88.8％)。
2-(4-(N(Boc)胍基)丁基氨基甲?；?-1-異丙基-4，5-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸(7)向所述酯6(0.16g，0.237mmol)加入MeOH(10mL)和1MNaOH(含水的，1.0mL)。將所述混合物回流加熱18h。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去揮發(fā)物。將殘留物置入到用4M HCl酸化到pH～3的水(10mL)中并用乙醚(3×10mL)萃取，用水(10mL)清洗并干燥(Na2SO4)。在蒸發(fā)和干燥后，獲得酸7(0.121g，91％)。
2-(4-(胍基)丁基氨基甲酰基)-1-異丙基-4，5-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸.TFA(8)向上面Boc-保護(hù)的化合物7(0.10g，0.178mmol)在CH2Cl2的溶液(3mL)中的溶液加入三氟乙酸(3mL)并在室溫?cái)嚢?h。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去揮發(fā)物。粗原料的反相色譜法(CH3CN-H2O/0.1％TFA)給出作為三氟乙酸鹽的所需產(chǎn)物8(0.075g，91％)。
(S)-(4-(N3-(1-氨基甲?；?3-芐氧羰基丙基)-1-異丙基-4，5-二苯基-1H-吡咯-2，3-二羧酰氨基)丁基)-N-(Boc)胍(9)向所述酸7(0.132g，0.23mmol)在CH2Cl2中的溶液(10mL)以如下順序加入EDC)(0.051g，0.23mmol)、HOBt(0.032g，0.23mmol)、Et3N(65μL，0.23mmol)和胺12(0.061g，0.22mol)并在室溫?cái)嚢柽^夜。用CH2Cl2(10ml)將所述反應(yīng)稀釋并用飽和的NaHCO3(5mL)、鹽水(5mL)清洗并干燥(Na2SO4)而獲得白色固體的酰胺6(0.127g，69％)。
(S)-(4-(N3-(1-氨基甲?；?3-羧基丙基)-1-異丙基-4，5-二苯基-1H-吡咯-2，3-二羧酰氨基)丁基)-N-(Boc)胍.TFA(10)向芐酯9(0.02g，0.025mmol)在EtOH中的溶液(10mL)加入乙酸(0.1mL)和10％Pd(OH)2/C(0.01g)并且在氫氣(氣球)下在室溫?cái)嚢琛＿^夜攪拌之后，過濾所述反應(yīng)，用EtOH清洗并蒸發(fā)而獲得粗原料，將其吸收在TFA(2mL)中并在室溫?cái)嚢?h。在蒸發(fā)和用反相色譜法(CH3CN-H2O/0.1％TFA)純化時(shí)，獲得作為三氟乙酸鹽的所需產(chǎn)物。
基于尼伐他汀的親脂基修飾的肽序列的合成方案A 方案A4-羥基喹啉-3-羧酸乙酯(A1)將苯胺(2.15g，23mmol)和乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(5g，23mmol)凈混合并在110℃加熱2h，然后冷卻在室溫下進(jìn)行放置15h。在此期間所述反應(yīng)混合物結(jié)晶。將道氏熱載體(Dowtherm)A(70mL)加熱到255℃并將熔融的晶體加入，將混合物在255℃加熱20min。然后將所述混合物傾倒入用冰浴冷卻到0℃的不銹鋼容器。將己烷加入到冷溶液使產(chǎn)物沉淀，通過過濾收集產(chǎn)物并用另一部分的己烷漂洗。將所述產(chǎn)物從EtOH再結(jié)晶而給出作為白色固體的產(chǎn)物(1.6g，7.3mmol，32％，M.P.309C)，在下一步中不用進(jìn)一步純化而使用所述產(chǎn)物。
4-氯喹啉-3-羧酸乙酯(A2)向固體4-羥基喹啉-3-羧酸乙酯(A1)(1.5g，7mmol)加入POCl3(2.2g，1.3mL，14mmol)并且將所述混合物在110℃加熱20分鐘。將混合物倒入NH3(含水的，28-30％)和冰并且然后攪拌直到粒狀。用乙醚(3×40mL)萃取所述熔化的冰混合物并將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)、過濾、并濃縮而給出作為油的產(chǎn)物，其經(jīng)靜置結(jié)晶(1.44g，6mmol，87％)，它不用進(jìn)一步純化即可使用。
4-(4-氨基丁基氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(A3)向4-氯喹啉-3-羧酸乙酯(A2)(0.5g，2.1mmol)在甲苯中的溶液(10mL)加入二氨基丁烷(10×，1.85g，21mmol)并將混合物在110℃加熱1.5h。在此期間形成鹽，當(dāng)熱的時(shí)候通過過濾除去，并且在減壓下濃縮濾液而給出一種油。加入水并用DCM(2×25mL)萃取所述混合物。將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)、過濾、并濃縮而給出一種油，其經(jīng)靜置結(jié)晶(476mg，1.66mmol，79％)，它不用進(jìn)一步純化即可用在后面的步驟中。
4-(3-(乙氧羰基)喹啉-4-基氨基)丁基氨基甲酸叔-丁酯(A4)向4-(4-氨基丁基氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(A3)在DCM中的溶液(60mL)中加入二碳酸二-叔-丁酯并且將所述混合物在室溫?cái)嚢?h。所述混合物用2M Na2CO3(20mL)、水(20mL)、飽和NaCl(20mL)清洗，干燥(MgSO4)，過濾，并濃縮而給出作為黃色油的產(chǎn)物(4g)，它在后面的步驟中使用。
4-(4-叔-丁氧羰基胺-丁基氨基)-喹啉-3-羧酸(A5)將4-(3-(乙氧羰基)喹啉-4-基氨基)丁基氨基甲酸叔-丁酯(A4)在乙醇KOH中的溶液(5％，100mL)回流2h，并且然后在減壓下濃縮。將殘留物溶解在水(25mL)中并用HCl(20％)調(diào)節(jié)得到的混合物到pH-8。出現(xiàn)固體并用過濾收集，并且將得到的濾餅用水清洗并在真空下干燥給出作為白色粉末的產(chǎn)物(2.763g)，它用在下一步驟中。
4-{[4-(4-氨基丁基氨基)-喹啉-3-羰基]-氨基}-4-氨基甲?；?丁酸(A6)將結(jié)合到rink酰胺MBHA樹脂的D-戊二酸叔丁酯(2g，1.32mmol)、4-(4-叔-丁氧羰基胺-丁基氨基)-喹啉-3-羧酸(A5)(2eq，950mg，2.64mmol)、和PyBop(1.4g，2.64mmol)加入到火焰干燥的50mL圓底燒瓶。加入NMP(25mL)并且在室溫下攪拌所述溶液18h。過濾所述混合物并接著用DCM、MeOH各自交替3×漂洗并風(fēng)干。將得到的小球懸浮在TFA(10mL)中并加入茴香醚(0.2mL)并在室溫下攪拌1h。過濾除去所述固體并在減壓下將濾液濃縮而給出一種油。利用反相HPLC，使用ACN/H2O/0.1％TFA(從5％至95％CAN的梯度)的純化在冷凍干燥后給出作為白色固體的產(chǎn)品(127mg，0.33mmol，13％)。MP 108℃，1H NMR(400MHz)δ8.96(d，J＝7.6Hz，1H)，8.72(br s，1H)，8.58(d，J＝8.4Hz，1H)，7.94(m，2H)，7.71(m，4H)，7.63(s，1H)，7.18(s，1H)，4.35(m，1H)，2.81(br s，2H)，2.37(m，2H)，2.07-2.00(一系列的m，2H)，1.75(m，2H)，1.60(m，2H)EIMSm/z M+1388.7。分析結(jié)果C19H25N5O4+2TFA+2H2O方案B
方案B4-(4-雙-boc-胍基-丁胺)-喹啉-3-羧酸乙酯(B2)向1，3-二-boc-2-(三氟甲磺酰)胍(391mg，1mmol)在無水DCM中的溶液(4mL)凈加入4-(4-氨基丁基氨基)喹啉-3-羧酸乙酯(A3)(0.3g，1.05mmol)并且在室溫下將所述混合物攪拌15h。用DCM將混合物稀釋并用2M NaHSO4(20mL)、飽和NaHCO3(20mL)、飽和NaCl(20mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并濃縮給出作為白色泡沫的產(chǎn)物(225mg)，它用在后面的步驟中。
4-(4-胍基-丁胺)-喹啉-3-羧酸(B3)向4-(4-雙-boc-胍基-丁胺)-喹啉-3-羧酸乙酯(B2)(255mg，0.43mmol)在DME中的溶液(2mL)加入1M NaOH(2mL)，并且將溶液在室溫下攪拌6h。向這個(gè)溶液加入2滴20％KOH溶液并連續(xù)攪拌15h。將所述溶液濃縮到1/3體積并用1M HCl將pH調(diào)節(jié)到pH-6，并且將得到的白色沉淀物用過濾收集并干燥給出作為白色固體的粉末(0.132g，0.26mmol，61％)。向所述白色固體(152mg，0.27mmol)在DCM中的溶液(2mL)加入TFA(2mL)并且在室溫下將所述混合物攪拌2h。在減壓下濃縮所述混合物并用反相HPLC、H2O/ACN/0.1％TFA(5％-95％ACN)純化，將得到的級(jí)分通過冷凍干燥濃縮而給出作為白色固體的產(chǎn)物(43mg，0.1mmol，34％)。MP-98℃，1H NMR(400MHz)δ8.82(s，1H)，8.49(d，J＝8.4Hz，1H)，8.08(s，1H)，7.86(m，2H)，7.56(t，J＝7.6，7.2Hz，4H)，7.31(br s，4H)，3.98(s，2H)，3.20(d，J＝5.6Hz，3H)，1.75(dd，J＝6.4，36.4Hz，EIMS m/z M+1302.3。分析結(jié)果C15H19N5O2+1TFA+2H2O
方案C 方案C4-{[4-(4-叔丁氧羰基氨基-丁基氨基)-喹啉-3-羰基]-氨基}-丁酸芐基酯(C3)向4-(4-叔-丁氧羰基胺-丁基氨基)-喹啉-3-羧酸(A5)(0.5g，1.4mmol)在DCM中的懸浮液(20mL)加入TBTU(1.1eq，1.53mmol，482mg)并攪拌所述溶液，并且在8h后加入DMF(20mL)。在28h的連續(xù)攪拌后所述溶液變清澈，并且加入TEA(155mg，0.213mL，1.53mmol)接著是4-氨基丁酸芐酯(C2)(1.1eq，0.559g，1.53mmol)并將混合物攪拌15h。在減壓下除去DCM并用水稀釋殘余物。將這個(gè)水溶液用乙醚(3×50mL)然后用DCM(3×50mL)萃取。將有機(jī)層合并、干燥(MgSO4)、過濾、并濃縮。用硅膠快速色譜法(flash chromatography)利用DCM/MeOH(9∶1)純化殘余物而給出作為一種油的產(chǎn)物(0.484g)，它具有足夠的純度用在下面步驟中。
4-{[4-(4-氨基-丁基氨基)-喹啉-3-羰基]-氨基}-丁酸芐酯(C4)向4-([4-(4-叔丁氧羰基氨基-丁基氨基)-喹啉-3-羰基]-氨基)-丁酸芐酯(C3)(0.454mg，0.9mmol)在DCM中的溶液(10mL)加入TFA(4mL)并將所述混合物攪拌1h。濃縮所述溶液，用飽和NaHCO3中和，并用DCM萃取。將有機(jī)層合并、干燥(MgSO4)、過濾、并在減壓下濃縮而給出作為清澈油的產(chǎn)物(227mg，0.52mmol)。
4-{[4-(4-雙-Boc-胍基-丁基氨基)-喹啉-3-羰基]-氨基}-丁酸芐酯(C5)向4-{[4-(4-氨基-丁基氨基)-喹啉-3-羰基]-氨基}-丁酸芐酯(C4)(227mg，0.52mmol)在DCM中的溶液(7mL)加入TEA(53mg，0.72mL)，接著是1，3-二-boc-2-(三氟甲磺酰)胍(204mg，0.52mmol)并且將所述混合物在室溫下攪拌5h。用更多的DCM稀釋所述有機(jī)溶液，用2M NaHSO4(25mL)、NaHCO3(25mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并減壓濃縮而給出作為白色泡沫的產(chǎn)物(305mg)，照原樣使用。
4-{[4-(4-胍基-丁基氨基)-喹啉-3-羰基]-氨基}-丁酸(C6)向4-{[4-(4-雙-Boc-胍基-丁基氨基)-喹啉-3-羰基]-氨基}-丁酸芐酯(C5)(305mg)在MeOH中的溶液(10mL)加入Pd/C(10重量％，10％重量/重量，30mg)并且用H2將所述混合物真空吹掃5×并在H2下攪拌18h。用通過celite的過濾除去Pd/C并且在減壓下濃縮濾液而給出白色泡沫殘余物。將上述殘余物溶解在DCM(5mL)中并且加入TFA(5mL)，在室溫下將所述混合物攪拌4h。減壓除去所述溶劑并用乙醚研制所述殘余物。通過反相HPLC，利用ACN/H2O/TFA(0.1％)作為洗脫液(梯度從5％-95％ACN)純化得到的油而給出作為白色吸濕固體的產(chǎn)物(70mg，0.018mmol)。MP-未測(cè)定，1H NMR(400MHz)δ9.86(br s，1H)，8.92(t，J＝5.2，5.6Hz，1H)，8.56(d，J＝8.8Hz，1H)，7.91(m，2H)，7.76(t，J＝5.6，5.6Hz，1H)，7.68(m，1H)，7.37-7.06(br m，4H)，3.29(m，6H)，3.12(q，J＝6.4，12.8Hz)，2.33(t，J＝7.2，7.2Hz，2H)，1.76(m，4H)，1.54(m，2).EIMS m/z M+1387.5。分析結(jié)果未確定。
方案D
方案D2-甲基-4-苯基喹啉-3-羧酸乙酯(D1)向2-氨基二苯酮(10g，51mmol)和乙酰乙酸乙酯(5.3g，63.8mmol，8mL)在甲苯中的溶液(100mL)加入PTSA(0.3g)并且將所述反應(yīng)混合物利用Dean Stark裝置回流加熱1.5h，當(dāng)沒有更多水存在時(shí)。減壓下除去溶劑并將殘余物從EtOH再結(jié)晶而給出作為淺黃色晶體的產(chǎn)物(8.14g，28mmol)。
(2-甲基-4-苯基喹啉-3-基)甲醇(D2)向2-甲基-4-苯基喹啉-3-羧酸乙酯(D1)(5g，17.2mmol)在DCM中的-78℃溶液(50mL)逐滴加入在DCM中的1M Dibal-H(2.5eq，43mmol，43mL)并在此溫度下連續(xù)攪拌1.5h。在-78℃下小心地加入Na2SO4(6.1g，43mmol)在水中的溶液(10mL)并且將所述混合物升溫到室溫并攪拌1h。過濾除去所述固體并用熱EtOAc漂洗。合并濾液并在減壓下濃縮而給出作為黃色固體殘余物的產(chǎn)物(3.62g，14.5mmol)。
3-(氯甲基)-2-甲基-4-苯基喹啉(D3)向(2-甲基-4-苯基喹啉-3-基)甲醇(D2)在DCM中的溶液(50mL)加入SOCl2(10.4mL，17g，140mmol)并且將所述混合物室溫?cái)嚢?h。在減壓下濃縮所述混合物而給出作為黃色固體的氯化物的HCl鹽(2.266g)。以HCl鹽形式保存所述產(chǎn)物并且通過用飽和NaHCO3處理并用乙醚萃取而將其轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x堿。
1，1-二(乙氧羰基)-2-(2-甲基-4-苯基喹啉-3-基)乙基氨基甲酸叔丁酯(D4)向作為游離堿的3-(氯甲基)-2-甲基-4-苯基喹啉(D3)(0.958g，3.6mmol)在DMF中的溶液(12mL)加入已經(jīng)通過用NaH(4.32mmol，104mg)處理15min而去質(zhì)子化的二(乙氧羰基)甲基氨基甲酸叔丁酯(4.32mmol，1.19g)的DMF溶液(40mL)。將這個(gè)混合物攪拌過夜，然后在減壓下濃縮，溶解在H2O中，并且用乙醚(3×50mL)萃取所述溶液。將萃取液合并、干燥(MgSO4)、過濾、在減壓下濃縮而給出作為棕色油的產(chǎn)物，它照原樣使用。
2-叔-丁氧羰基氨基-3-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-丙酸(D5)向1，1-二(乙氧羰基)-2-(2-甲基-4-苯基喹啉-3-基)乙基氨基甲酸叔丁酯(D4)(0.85g，1.7mmol)在MeOH中的溶液(10mL)中加入2M NaOH(2.1eq，1.8mL)并且將所述混合物在90℃下加熱7h。在減壓下除去所述溶劑并用水稀釋殘余物。用20％的HCl水溶液將得到的混合物調(diào)節(jié)到pH-5.5并將所述乳白色溶液用EtOAc(3×50mL)萃取、干燥(MgSO4)、過濾、和濃縮而給出作為棕色泡沫固體的產(chǎn)物(0.404g，1mmol)，它照原樣使用。
(3-[2-叔-丁氧羰基氨基-3-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-丙酰基氨基]-丙基)-氨基甲酸苯基酯(D6)向2-叔-丁氧羰基氨基-3-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-丙酸(D5)(200mg，0.5mmol)在DCM中的溶液(15mL)加入TBTU(1.1eq，174mg，0.54mmol)和TEA(2eq，1.08mmol，110mg，150uL)，并且將所述混合物在室溫進(jìn)行攪拌10min。向這個(gè)混合物加入4-氨基丁基氨基甲酸苯酯(1.1eq，0.54mmol，140mg)并且將所述混合物在室溫?cái)嚢?h。加入水并且分離有機(jī)層、干燥(MgSO4)、過濾、和濃縮而給出黃色殘余物。在硅膠上首先利用2％DCM/MeOH、然后4％DCM/MeOH、然后8％DCM/MeOH，每次(ea.)250mL，純化所述殘余物而給出作為黃色油的產(chǎn)物(228mg)。
{3-[-氨基3-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-丙酰(proionyl)氨基]-丁基}-氨基甲酸苯基酯(D7)向(3-[2-叔-丁氧羰基氨基-3-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-丙酰基氨基]-丙基)-氨基甲酸苯基酯(D6)(220mg，0.36mmol)在DCM中的溶液(5mL)加入TFA/DCM(3.5mL/5mL)的混合物，并且在室溫下攪拌所述混合物2h。在減壓下除去所述溶劑并將殘余物置入在EtOAc(50mL)中并用飽和NaHCO3(35mL)、水(2×25mL)洗滌，干燥(MgSO4)、過濾、并濃縮而給出作為清澈黃色油的產(chǎn)物(161mg，0.32mmol，88％)。
4-[2-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-1-(4-苯氧基羰基氨基-丁基氨基甲?；?-乙基氨基甲酰基]-丁酸(D8)向{3-[-氨基3-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-丙酰(proionyl)氨基]-丁基}-氨基甲酸苯基酯(D7)(161mg，0.32mmol)在THF中的溶液加入戊二酸酐(1.5eq，0.5mmol，57mg)并將所述溶液在室溫下攪拌2h。在減壓下除去所述溶劑并將殘余物置入在EtOAc(25mL)中并且用水洗滌、干燥(MgSO4)、過濾、并濃縮而給出作為緩慢凝固的清澈橙色油的產(chǎn)物(213mg)，不需要進(jìn)一步表征而照原樣使用它。
4-[1-(4-氨基-丁基氨基甲?；?-2-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-乙基氨基甲?；鵠-丁酸(D9)向4-[2-(2-甲基-4-苯基-喹啉-3-基)-1-(4-苯氧基羰基氨基-丁基氨基甲酰基)-乙基氨基甲?；鵠-丁酸(D8)(213mg，0.34mmol)在MeOH(10mL)和THF(5mL)中的溶液加入Pd/C，并且在80 psi H2氣的Parr振蕩器上放置5h。過濾通過celite除去Pd/C并濃縮。利用反相HPLC使用H2O/ACN(5-95％ACN)純化得到的殘余物而在冷凍干燥后給出作為白色固體的產(chǎn)物(13.3mg)。MP 129℃，1H NMR(400MHz)δ7.91(m，2H)，7.64(m，2H)，7.54(m，4H)，7.36(m，2H)，7.26(d，J＝6.4Hz，1H)，7.08(d，J＝8Hz，1H)，4.352(m，1H)，3.1-2.6(一系列m，8H)，2.03(m，4H)，1.55(m，2H)，1.22(m，4H).EIMS m/z M+1491.7。分析結(jié)果C28H34N4O4+3H2O
方案E 提議的合成修飾 R＝堿性基或酸性團(tuán)、其生物電子等排體，胺類或酰胺類n＝0，1，2，3，4...等m＝0，1，2，3，4...等方案E4-(5-芐氧基羰基氨基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸乙酯(E2，n＝4)向4-氯喹啉-3-羧酸乙酯(A2)(1g，4.26mmol)在DMA中的溶液(20mL)加入N-CBz-二氨基戊烷(1.4g，5.1mmol)和DABCO(1.4g，13mmol)并且將所述溶液在115℃下加熱2.5h。在減壓下除去DMA并將殘余物懸浮在水中并用乙醚(3×25mL)萃取、干燥(MgSO4)、過濾并濃縮而給出作為棕色油的產(chǎn)物(1.88g，4.3mmol)，它照原樣使用。
提議的合成修飾 R＝堿性基或酸性團(tuán)、其生物電子等排體，胺類或酰胺類n＝0，1，2，3，4...等m＝0，1，2，3，4...等4-(5-氨基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸乙酯(E3，n＝4)向4-(5-芐氧基羰基氨基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸乙酯(E2，n＝4)(1.88g，4.3mmol)在EtOH中的溶液(30mL)加入Pd/C(180mg，10％wwPd)，并將所述混合物在H2氣下攪拌3d，必要時(shí)將氣球再充填。通過celite用過濾除去催化劑并濃縮而給出作為蜂蜜有色油的產(chǎn)物(1.3g，4.2mmol)，它在不進(jìn)一步純化的情況下使用。
4-(5-雙-Boc-胍基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸乙酯(E4，n＝4)向4-(5-氨基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸乙酯(E3，n＝4)(0.64g，2.1mmol)在無水DCM中的溶液(10mL)加入TEA(322ul，233mg)和1，3-二-boc-2-(三氟甲磺?；?胍(1.1eq，0.9g，2.31mmol)并且將所述混合物在室溫下攪拌2.5h。將所述溶液用更多DCM稀釋并且用2M NaHSO3(20mL)、飽和NaHCO3(20mL)、飽和NaCl洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮而給出與白色泡沫一樣的產(chǎn)物(1.2g，2.1mmol)，它照原樣使用。
4-(5-胍基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸(E5，n＝4)向4-(5-雙-Boc-胍基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸乙酯(E4，n＝4)(1.2g，2.1mmol)在DME中的溶液(20mL)加入1M NaOH(15mL)并且將所述混合物在室溫下攪拌2d。將所述混合物濃縮而除去DME，將剩余水性混合物用HCl(20％水溶液)調(diào)節(jié)到pH～5-6。得到的固體用過濾收集并風(fēng)干。將粗制固體懸浮在DCM(15mL)中并加入TFA(3.5mL)并且將所述混合物在室溫下2.5h。加入更多的TFA并將所述溶液攪拌3.5h，然后濃縮。將殘余物懸浮在水中，加入2M Na2CO3調(diào)節(jié)pH～7-8并且通過過濾收集得到的固體并在真空下干燥。用反相HPLC在C18上利用H2O/ACN/0.5％TFA純化所述粗制物而在冷凍干燥后給出白色固體樣的化合物(40mg，0.09mmol)，為單TFA鹽。MP 72℃，1H NMR(400MHz)δ8.79(s，1H)，8.48(d，J＝8.8Hz，1H)，7.86(m，2H)，7.78(m，1H)，7.55(m，1H)，7.24(brs，4H)，3.94(m，3H)，3.14(d，J＝6.4，6.8Hz，2H)，1.77(m，2H)，1.55(m，4H)EIMS m/z M+1316.3。分析結(jié)果C16H21N5O2+2H2O+1TFA4-(3-胍基-丙基氨基)-喹啉-3-羧酸(E5，n＝2)以類似于4-(5-胍基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸(E5，n＝4)的方法，利用正-(3-氨基丙基)-氨基甲酸叔丁酯并用TFA去保護(hù)來制造這個(gè)化合物。MP 231℃，1H NMR(400MHz)δ10.48(m，1H)，9.52(br s，1H)，9.00(s，1H)，8.20(d，J＝8.4Hz，1H)，7.75(d，J＝8.4Hz，1H)，7.60(t，J＝6.8，8.4Hz，2H)，7.35(t，J＝7.6，8Hz，2H)，3.75(m，3H)，3.22(t，J＝7.2，7.2Hz，2H)，1.90(m，2H)EIMS m/z M+1288.4.分析結(jié)果C14H17N5O2+2H2O4-(2-胍基-乙基氨基)-喹啉-3-羧酸(E5，n＝1)以類似于4-(5-胍基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸(E5，n＝4)的方法，利用正-Boc-乙二胺并用TFA去保護(hù)來制造這個(gè)化合物。MP 267℃，1HNMR(400MHz)δ8.77(s，1H)，8.42(d，J＝8.4Hz，1H)，7.84(m，3H)，7.57(t，J＝8.4Hz，7.2Hz 1H)，7.28(br s，3H)，4.08(br s，2H)。EIMS m/z M+1274.5。分析結(jié)果C13H15N5O2+2H2O+1TFA嘧啶類4-[3-(嘧啶-2-基-氨基)-丙基氨基]-喹啉-3-羧酸(E6，n＝2，R＝H)向4-(3-氨基-丙基氨基)-喹啉-3-羧酸乙酯(E3，n＝2，177mg，0.65mmol)在EtOH中的溶液(35mL)加入DIPEA(1mmol，129mg，173uL)和2-氯嘧啶(90mg，0.78mmol)并且將所述混合物回流加熱15h。將所述溶液濃縮并置入EtOH(15mL)中，加入1M NaOH(5mL)并將所述溶液攪拌15h。將所述混合物濃縮并利用20％HCl將殘余物調(diào)節(jié)到pH～5。收集得到的固體并在反相HPLC、ACN/H2O 5-95％，C18上純化而在冷凍干燥后給出作為白色固體的產(chǎn)物(135mg)。MP 269℃。1H NMR(400MHz)δ8.47(d，J＝8.8Hz，1H)，8.19(d，J＝4.8Hz，2H)，7.80(m，2H)，7.50(m，1H)，7.26(m，1H)，6.52(t，J＝4.4，5.2Hz，1H)，3.99(m，2H)2.00(m，2H)。EIMS m/z M+1324.5。分析結(jié)果C17H17N5O2+1H2O+1TFA4-[5-(嘧啶-2-基氨基)-戊基氨基]-喹啉-3-羧酸乙酯(E6，n＝4，R＝CH2CH3)向4-(5-氨基-戊基氨基)-喹啉-3-羧酸乙酯(E3，n＝4，505mg，1.7mmol)在EtOH中的溶液(20mL)加入DIPEA(323mg，2.5mmol，435uL)和2-氯嘧啶(231mg，2mmol)，并將所述混合物回流加熱15h。將所述混合物濃縮并用反相HPLC，C18，ACN/H2O，5-95％純化而給出作為灰白色帶黃色固體的產(chǎn)物(135mg，0.36mmol，21％)。MP 108℃1H NMR(400MHz)δ8.92(m，1H)，8.83(s，1H)，8.34(d，J＝8.4Hz，1H)，8.19(d，J＝4.8Hz，2H)，7.8(m，1H)，7.71(m，1H)，7.44(m，1H)，7.09(t，J＝6，5.6Hz，1H)，6.50(t，J＝4.8，4.8Hz，1H)，3.68(m，2H)，3.22(q，J＝6.8，12.8Hz，2H)，1.68(m，2H)，1.52(m，2H)，1.41(m，2H)。EIMS m/z M+1380.5。分析結(jié)果C21H25N5O2
方案F 方案F4-氨基-喹啉-3-羧酸乙酯(F2)向4-氯喹啉-3-羧酸乙酯(A2，1.44g，0.6mmol)在甲苯中的溶液(10mL)加入濃NH3，并且將所述混合物密封在鋼彈中并且在125℃下加熱4h。冷卻所述鋼彈并且通過真空過濾收集得到的白色固體，干燥而給出產(chǎn)物(1.5g)。
4-氨基-喹啉-3-羧酸(F3)向4-氨基-喹啉-3-羧酸乙酯(F2)(250mg，1.2mmol)在EtOH中的溶液(5mL)加入20％KOH(10mL)并且將所述混合物在回流下加熱1h。在減壓下除去EtOH并且利用20％HCl將所述水溶液調(diào)節(jié)到pH～6.5-7。收集白色固體并且干燥而給出產(chǎn)物(161mg)。將所述產(chǎn)物從EtOH中結(jié)晶并干燥。MP 305℃。1H NMR(400MHz)δ8.89(s，1H)，8.42(d，J＝8.4Hz，1H)，7.83(m，2H)，7.60(m，1H)。EIMS m/z M+1189.4。分析結(jié)果C10H8N2O2+0.5H2O在不背離所述范圍的情況下，可以對(duì)這里描述的實(shí)施方案進(jìn)行許多修改和變更，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。這里描述的特定實(shí)施方案僅是通過實(shí)例的方式提供。
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1.一種反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的介質(zhì)，其包含下列結(jié)構(gòu) 其中A、B、和C可以處于任何順序，其中A包含酸性部分，其包含酸性團(tuán)或其生物電子等排體；B包含芳香族或親脂性的部分，其包含HMG CoA還原酶抑制劑或其類似物的至少一部分；并且C包含堿性部分，其包含堿性基或其生物電子等排體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的介質(zhì)，其中已經(jīng)將α氨基或α羧基中的至少之一從它們各自的氨基或羧基末端部分上除去。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的介質(zhì)，其中如果不被除去，所述α氨基用選自由下列各項(xiàng)組成的組的保護(hù)基加帽甲?；?、乙酰基、苯乙酰基、苯甲?；⑿挛祯；?pivolyl)、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸(2-napthylic acid)、煙酸、其中n為1至20的CH3-(CH2)n-CO-、二-叔-丁基-4-羥基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、聯(lián)苯基、取代的苯基、取代的雜環(huán)、烷基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、稠合環(huán)烷基、飽和雜芳基、和取代的飽和雜芳基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的介質(zhì)，其中如果不被除去，所述α羧基用選自由下列各項(xiàng)組成的組的保護(hù)基加帽胺如其中R＝H的RNH2、二-叔-丁基-4-羥基-苯基、萘基、取代的萘基、Fmoc、聯(lián)苯基、取代的苯基、取代的雜環(huán)、烷基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、稠合環(huán)烷基、飽和雜芳基、和取代的飽和雜芳基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的介質(zhì)，其中所述酸性團(tuán)的生物電子等排體選自下列各項(xiàng)組成的組
6.根據(jù)權(quán)利要求1的介質(zhì)，其中所述堿性基的生物電子等排體選自下列各項(xiàng)組成的組
7.根據(jù)權(quán)利要求1的介質(zhì)，其中所述介質(zhì)選自下列各項(xiàng)組成的組
8.化合物4-胍基丁胺-3-酰氨基GABA喹啉。
9.化合物4-(1-(4-氨基丁基氨基甲?；?-2-(2-甲基-4-苯基喹啉-3-基)乙基氨基甲酰基)丁酸。
10.化合物
11.化合物4-(5-胍基戊基氨基)喹啉-3-羧酸。
全文摘要
本發(fā)明提供適合于增加哺乳動(dòng)物中反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的組合物。所述組合物適合于口服遞送，并且在治療和/或預(yù)防高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)心血管疾病中是有用的。
文檔編號(hào)C07D231/14GK1968928SQ200580019171
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月9日
發(fā)明者J·C·索卡, R·J·托馬斯, H·卡圖亞, I·尼庫林 申請(qǐng)人:阿文尼爾藥品公司