專(zhuān)利名稱(chēng)：治療神經(jīng)病變的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及牽涉神經(jīng)元的疾病和病狀，更特別地涉及用于治療或預(yù)防神經(jīng)病變和其他牽涉神經(jīng)變性的疾病和病狀的方法和組合物。還包括鑒定用于治療或預(yù)防神經(jīng)病變的藥劑(agent)的方法。
背景技術(shù)：
軸突變性在多種神經(jīng)變性疾病例如帕金森病和阿爾茨海默病中以及在神經(jīng)元的創(chuàng)傷性、毒性或局部缺血性損傷時(shí)出現(xiàn)。這樣的疾病和病狀與包括軸突功能障礙在內(nèi)的軸突病變(axonopathy)相關(guān)。軸突病變的一個(gè)實(shí)例是沃勒變性(Waller，Philos Trans R.soc.Lond.140423-429，1850)，其在軸突的遠(yuǎn)端部分被從細(xì)胞體上切斷時(shí)發(fā)生。切斷的軸突迅速地趨向變性。因此，軸突病變可以是神經(jīng)病變性疾病和病狀的關(guān)鍵特征，和軸突缺陷可能是患者殘疾的重要成因。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明者成功地發(fā)現(xiàn)，軸突變性可以通過(guò)增加患病和/或受損的神經(jīng)元中的NAD活性而得到減少或預(yù)防。據(jù)信，增加的NAD活性可以增加sirtuin活性，后者然后產(chǎn)生受損的神經(jīng)元細(xì)胞的軸突變性的降低。因而，預(yù)防軸突變性的一個(gè)方法可以是通過(guò)在受損的哺乳動(dòng)物軸突中活化sirtuin分子即SIRT1。SIRT1的活化可以通過(guò)對(duì)SIRT1分子的直接作用或通過(guò)增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的供應(yīng)，所述的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸是SIRT1的組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰酶活性的底物。SIRT1的活化導(dǎo)致軸突變性嚴(yán)重程度的減少或防止軸突變性。還據(jù)信，NAD活性的增加可能能夠通過(guò)不牽涉sirtuin的其他機(jī)制起作用。因此，增加NAD活性可以減少或預(yù)防受損的哺乳動(dòng)物軸突中的軸突變性，所述增加NAD活性可能通過(guò)增加SIRT1活性或者通過(guò)一種或多種其他機(jī)制或者兩者起作用。
因此，在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明旨在在有此需要的哺乳動(dòng)物特別是人中治療或預(yù)防神經(jīng)病變的方法。該方法可包括施用有效量的藥劑，其可增加患病和/或受損的神經(jīng)元中的sirtuin活性，特別是SIRT1活性。
在多種實(shí)施方案中，所述藥劑可通過(guò)增加NAD活性來(lái)增加SIRT1活性。據(jù)信，增加NAD活性可以增加sirtuin活性，因?yàn)镹AD可作為SIRT1的底物。這樣的藥劑可包括NAD或NADH、NAD的前體、NAD補(bǔ)救途徑中的中間體或者產(chǎn)生NAD的物質(zhì)例如煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)或編碼煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的核酸。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶可以為NMNAT1蛋白。
在多種實(shí)施方案中，所述藥劑也可以直接增加SIRT1活性，同樣地，所述藥劑可以是sirtuin多肽或編碼sirtuin多肽的核酸或諸如芪、查兒酮、黃酮、異黃烷酮、黃烷酮或兒茶素的物質(zhì)。這樣的化合物可包括選自白藜蘆醇、piceatannol、脫氧土大黃苷、反式芪和土大黃苷的芪；選自紫鉚因、isoliquiritigen和3，4，2′，4′，6′-五羥基查兒酮的查兒酮；選自黃顏木素、5，7，3′，4′，5′-五羥基黃酮、木犀草素、3，6，3′，4′-四羥基黃酮、櫟精、7，3′，4′，5′-四羥基黃酮、山奈黃素、6-羥基芹黃素、芹黃素、3，6，2′，4′-四羥基黃酮、7，4′-二羥基黃酮、7，8，3′，4′-四羥基黃酮、3，6，2′，3′-四羥基黃酮、4′-羥基黃酮、5，4′-二羥基黃酮、5，7-二羥基黃酮、桑色素、黃酮和5-羥基黃酮的黃酮；選自大豆黃素和染料木黃酮的異黃酮；選自柚苷配基、3，5，7，3′，4′-五羥基黃烷酮和黃烷酮的黃烷酮；或者選自(-)-表兒茶素、(-)-兒茶素、(-)-兒茶素、(-)-沒(méi)食子兒茶素、(+)-兒茶素和(+)-表兒茶素的兒茶素。
在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及通過(guò)向哺乳動(dòng)物特別是人施用有效量的藥劑來(lái)治療神經(jīng)病變的方法，所述藥劑通過(guò)增加患病和/或受損的神經(jīng)元和/或支持細(xì)胞例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等中的核NAD活性而起作用。
這樣的藥劑可以為NAD或NADH、煙酰胺單核苷酸、煙酸單核苷酸或煙酰胺核糖核苷或其衍生物；或者產(chǎn)生NAD的酶例如煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，或編碼產(chǎn)生NAD的酶的核酸例如編碼煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的核酸；或者增加編碼NAD產(chǎn)生途徑中的酶的核酸表達(dá)的藥劑，或增加NAD產(chǎn)生途徑中的酶的活性和/或穩(wěn)定性的藥劑，或增加NAD活性的藥劑。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶可以為NMNAT1蛋白。
在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及在有此需要的哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防視神經(jīng)病變的方法。該方法可包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的藥劑，其通過(guò)增加患病和/或受損的神經(jīng)元中的NAD活性而起作用。向哺乳動(dòng)物施用可以包括向眼施用，特別是通過(guò)用持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)施用藥劑，或通過(guò)施用包含給予眼的藥劑的持續(xù)釋放小丸。
所述藥劑可以為NAD或NADH、煙酰胺單核苷酸、煙酸單核苷酸或煙酰胺核糖核苷；或者產(chǎn)生NAD的酶例如煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶；或者編碼產(chǎn)生NAD的酶的核酸例如編碼煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的核酸；或者增加NAD活性的藥劑。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶可以為NMNAT1蛋白或NMNAT3蛋白。
在本發(fā)明方法的多種實(shí)施方案中，與軸突降解相關(guān)的神經(jīng)病變可以為許多神經(jīng)病變中的一種，例如那些遺傳的或先天的或與帕金森病、阿爾茨海默病、皰疹感染、糖尿病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脫髓鞘病、局部缺血或中風(fēng)、化學(xué)損傷、熱損傷、AIDS等相關(guān)的神經(jīng)病變。另外，上面未提及的神經(jīng)變性疾病以及一亞類(lèi)的上述疾病可以用本發(fā)明的方法治療。這樣的亞類(lèi)的疾病可包括帕金森病或非帕金森病、阿爾茨海默病或非阿爾茨海默病等等。
在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明還旨在篩選用于在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)病變的藥劑的方法。該方法可包括，在體外或體內(nèi)給神經(jīng)元細(xì)胞施用候選藥劑，給所述神經(jīng)元細(xì)胞造成軸突損傷，和檢測(cè)受損的神經(jīng)元細(xì)胞的軸突變性的減少。在多種實(shí)施方案中，該方法可包括檢測(cè)在細(xì)胞中，特另是在神經(jīng)元細(xì)胞中由候選藥劑產(chǎn)生的NAD活性的增加。NAD活性的增加可以是核NAD活性的增加。
還提供了用于篩選增加神經(jīng)元中的sirtuin活性的藥劑的方法，以及用于篩選增加神經(jīng)元中的NAD生物合成活性的藥劑的方法。該方法可包括，在體外或體內(nèi)給哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞施用候選藥劑，給所述神經(jīng)元細(xì)胞造成軸突損傷，和檢測(cè)受損的神經(jīng)元細(xì)胞的軸突變性的減少。在一些實(shí)施方案中，這樣的方法可以是初步的篩選方法，其中第二次測(cè)定法進(jìn)一步將活性描繪為與sirtuin活性或者與NAD和NAD生物合成或補(bǔ)救途徑的酶或組分相關(guān)。
在本發(fā)明的篩選方法的多種實(shí)施方案中，軸突損傷可以由大量的方法來(lái)產(chǎn)生，包括化學(xué)損傷神經(jīng)元細(xì)胞、熱損傷神經(jīng)元細(xì)胞、使神經(jīng)元細(xì)胞缺氧和物理?yè)p傷神經(jīng)元細(xì)胞。
在多種實(shí)施方案中還提供了重組載體。所述載體可以包含與編碼哺乳動(dòng)物NMNAT1蛋白或NMNAT3蛋白的序列有效連接的啟動(dòng)子。在這樣的實(shí)施方案的多種方面，重組載體可以是慢病毒或腺伴隨病毒。
在多種實(shí)施方案中還提供了包含與編碼SIRT1蛋白的序列有效連接的啟動(dòng)子的重組載體。在這樣的實(shí)施方案的多種方面，重組載體可以是慢病毒或腺伴隨病毒。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖解說(shuō)明了Wlds融合蛋白的NMNAT1活性產(chǎn)生了受損神經(jīng)元的延遲的變性，其顯示A)表達(dá)Wlds蛋白或EGFP的被慢病毒感染的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元外植體培養(yǎng)物中的體外沃勒變性，其中顯示了在橫斷(transection)之前以及橫斷之后12、24、48和72小時(shí)的微管蛋白βIII-免疫反應(yīng)性神經(jīng)突(比例尺＝1mm，和“*”標(biāo)明了在去除之前細(xì)胞體的位置)；和B)被慢病毒感染的DRG神經(jīng)元中的體外沃勒變性，所述DRG神經(jīng)元僅表達(dá)EGFP、Wlds蛋白、與EGFP融合的Wlds蛋白的Ufd2a部分(70個(gè)殘基)(Ufd2a(1-70)-EGFP)、具有C-末端核定位信號(hào)的Ufd2a(1-70)-EGFP、與EGFP融合的Wlds蛋白的NMNAT1部分、顯性失活的Ufd2a(Ufd2a(P1140A))、或Ufd2a siRNA構(gòu)建體，其中顯示了使用每個(gè)構(gòu)建體在所示時(shí)間點(diǎn)上神經(jīng)突的代表性圖像和剩余的神經(jīng)突數(shù)目的定量分析數(shù)據(jù)(相對(duì)于橫斷前的剩余神經(jīng)突的百分?jǐn)?shù)±S.D.)(底部左側(cè))，和“*”表明用經(jīng)EGFP感染的神經(jīng)元具有顯著差異(p＜0.0001)；還顯示了用于確認(rèn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的橫斷前的EGFP信號(hào)(底部右側(cè)；比例尺＝50μm)，和用于確認(rèn)通過(guò)慢病毒基因轉(zhuǎn)移而得到的蛋白質(zhì)表達(dá)和Ufd2a蛋白的siRNA下調(diào)的免疫印跡分析(底部右圖)。
圖2圖解說(shuō)明了增加的NAD供應(yīng)保護(hù)軸突免于損傷后的變性，其顯示A)使用煙酰胺單核苷酸作為底物就NAD產(chǎn)生檢測(cè)了野生型和突變型Wlds和NMNAT1蛋白的酶活性，其中裂解物從表達(dá)所示蛋白質(zhì)的HEK293細(xì)胞中制備，和將在1小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生的NAD的數(shù)量轉(zhuǎn)化成NADH，通過(guò)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，并標(biāo)準(zhǔn)化至總蛋白質(zhì)濃度，顯示出兩種突變體均基本上不具有酶活性；和B)被慢病毒感染的DRG神經(jīng)元中的體外沃勒變性，所述DRG神經(jīng)元表達(dá)NMNAT1或Wlds蛋白、這些蛋白質(zhì)的缺乏NAD-合成活性的突變體NMNAT1(W170A)和Wlds(W258A)、或EGFP，其中條形圖顯示了對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體在所示時(shí)間點(diǎn)上剩余的神經(jīng)突數(shù)目的定量分析數(shù)據(jù)(相對(duì)于橫斷前的剩余神經(jīng)突的百分?jǐn)?shù)±S.D.)，和“*”表明用經(jīng)EGFP感染的神經(jīng)元具有顯著差異(p＜0.0001)；C)使用針對(duì)6XHis標(biāo)簽的抗體通過(guò)免疫印跡分析的在被慢病毒感染的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)；和D)用0.5μM長(zhǎng)春花新堿培養(yǎng)的表達(dá)NMNAT1或EGFP(對(duì)照)的DRG神經(jīng)元外植體，其中顯示了在所示的添加長(zhǎng)春花新堿之后的時(shí)間點(diǎn)上神經(jīng)突的代表性圖像(相差；小條＝1mm)，和以由神經(jīng)突所覆蓋的面積相對(duì)于治療前由神經(jīng)突所覆蓋的面積，將在所示時(shí)間點(diǎn)上的保護(hù)效果的定量進(jìn)行作圖。
圖3圖解說(shuō)明了軸突保護(hù)要求在損傷之前用NAD預(yù)處理神經(jīng)元，其顯示A)使用DRG外植體的體外沃勒變性，所述DRG外植體于在軸突橫斷之前24小時(shí)加入的各種濃度的NAD存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)；和B)在橫斷之前將DRG外植體與1mM NAD預(yù)溫育4、8、12、24或48小時(shí)，其中條形圖顯示了在每個(gè)所示時(shí)間點(diǎn)上在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的剩余神經(jīng)突數(shù)目(相對(duì)于橫斷前的剩余神經(jīng)突的百分?jǐn)?shù)±S.D.)，和“*”表明與對(duì)照相比的顯著的軸突保護(hù)(p＜0.0001)。
圖4圖解說(shuō)明了NAD依賴(lài)性軸突保護(hù)由SIRT1的活化而介導(dǎo)，其顯示A)使用DRG外植體培養(yǎng)物的體外沃勒變性，所述DRG外植體培養(yǎng)物單獨(dú)用NAD預(yù)溫育(對(duì)照)，或在100μM Sirtinol(Sir2抑制劑)或20mM 3-氨基苯甲酰亞胺(3AB，PARP抑制劑)存在的情況下用NAD預(yù)溫育；B)使用DRG外植體培養(yǎng)物的體外沃勒變性，所述DRG外植體培養(yǎng)物用白藜蘆醇(10、50或100μM)預(yù)溫育；和C)左側(cè)使用DRG外植體培養(yǎng)物的體外沃勒變性，所述DRG外植體培養(yǎng)物被表達(dá)特異于SIRT家族(SIRT1-7)的每一個(gè)成員的siRNA的慢病毒所感染，其中條形圖顯示了在每種條件下在所示時(shí)間點(diǎn)上的剩余神經(jīng)突數(shù)目的定量分析(相對(duì)于橫斷前的剩余神經(jīng)突的百分?jǐn)?shù)±S.D.)，和“*”表明與對(duì)照顯著不同的點(diǎn)(＜0.0001)；中間的表在被感染的NIH3T3細(xì)胞中用qRT-PCR測(cè)得的每種SIRT siRNA的有效性(表示為野生型mRNA水平的％)；和右側(cè)使用針對(duì)SIRT1的抗體的免疫印跡，顯示出SIRT1的表達(dá)在存在有效地阻斷NAD依賴(lài)性軸突保護(hù)的SIRT1 siRNA的情況下減少。
圖5圖解說(shuō)明了哺乳動(dòng)物NAD生物合成途徑，其中基于來(lái)自酵母和低級(jí)真核生物的酶表達(dá)分析和研究圖解說(shuō)明了預(yù)測(cè)的哺乳動(dòng)物NAD生物合成(所用的縮寫(xiě)QPRT，喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；NaPRT，煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；NmPRT，煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；Nrk，煙酰胺核糖核苷激酶；NMNAT，煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶；QNS，NAD合成酶)。
圖6圖解說(shuō)明了在哺乳動(dòng)物中的NAD生物合成相關(guān)酶的表達(dá)分析，其顯示(A)通過(guò)qRT-PCR測(cè)定了在大鼠DRG中在神經(jīng)橫斷之后1、3、7和14天后的NAD生物合成相關(guān)酶的mRNA水平，其中將表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化至在每個(gè)樣品中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)并標(biāo)明是相對(duì)于未施行軸突切斷術(shù)的DRG中的表達(dá)水平；(B)通過(guò)將DRG在1或0.1μM魚(yú)藤酮中溫育所示的時(shí)間而引起的神經(jīng)突變性，和如本文中所述通過(guò)qRT-PCR測(cè)定NAD合成相關(guān)酶的mRNA水平。
圖7圖解說(shuō)明了NMNAT酶的亞細(xì)胞定位和其保護(hù)軸突的能力，其顯示(A)使用被慢病毒感染的DRG神經(jīng)元外植體培養(yǎng)物的體外沃勒變性測(cè)定法，所述DRG神經(jīng)元外植體培養(yǎng)物表達(dá)NMNAT1、cytNMNAT1、NMNAT3或nucNMNAT3，其中顯示了在橫斷之后12和72小時(shí)獲取的代表性圖像；(B)NMNAT1、cytNMNAT1、NMNAT3或nucNMNAT3在HEK293T細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，其采用了使用抗6xHis標(biāo)簽的抗體的免疫組織化學(xué)以檢測(cè)每種蛋白質(zhì)，和用核標(biāo)記染料(雙苯甲酰亞胺(bisbenzimide))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色以便通過(guò)比較來(lái)確定每種蛋白質(zhì)的相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)定位的細(xì)胞核定位(比例尺＝25μm)；(C)野生型和突變型NMNAT1和NMNAT3的酶活性，其中從表達(dá)NMNAT1、cytNMNAT1、NMNAT3、nucNMNAT3的HEK293T細(xì)胞的裂解物中純化出具有6xHis標(biāo)簽的每種蛋白質(zhì)，其中將在37度于1小時(shí)后產(chǎn)生的NAD的數(shù)量轉(zhuǎn)化為NADH，進(jìn)行定量并標(biāo)準(zhǔn)化至蛋白質(zhì)濃度；(D)通過(guò)被每種病毒感染的HEK293T細(xì)胞的免疫印跡分析來(lái)確認(rèn)由慢病毒基因轉(zhuǎn)移所引起的NMNAT1、cytNMNAT1、NMNAT3和nucNMNAT3的蛋白質(zhì)表達(dá)；和(E)使用被慢病毒感染的DRG神經(jīng)元外植體培養(yǎng)物的體外沃勒變性測(cè)定法，所述DRG神經(jīng)元外植體培養(yǎng)物表達(dá)NMNAT1、cytNMNAT1、NMNAT3或nucNMNAT3，其中顯示了在軸突切斷術(shù)(axotomy)之后12、24、48和72小時(shí)的剩余神經(jīng)突數(shù)目的定量分析數(shù)據(jù)。
圖8圖解說(shuō)明了NAD生物合成底物的外源性施加和它們保護(hù)軸突的能力，其顯示了(A)在外源性施加NAD、NmR之后使用DRG神經(jīng)元外植體培養(yǎng)物的體外沃勒變性，在橫斷之后12、24、48和72小時(shí)獲取代表性圖像；(B)在外源性施加Na、Nam、NaMN、NMN、NaAD、NAD和NmR之后使用DRG神經(jīng)元外植體培養(yǎng)物的體外沃勒變性測(cè)定法，其中顯示了在軸突切斷術(shù)之后12、24、48和72小時(shí)的剩余神經(jīng)突數(shù)目的定量分析數(shù)據(jù)；(C)用表達(dá)慢病毒的NaPRT感染DRG神經(jīng)元外植體，并在軸突切斷術(shù)之前用或不用1mM Na溫育24小時(shí)，體外沃勒變性測(cè)定法顯示了在軸突切斷術(shù)之后12、24、48和72小時(shí)的剩余神經(jīng)突數(shù)目的定量分析數(shù)據(jù)。
圖9圖解說(shuō)明了在玻璃體內(nèi)注射N(xiāo)AD生物合成底物之后的視神經(jīng)橫斷，其中將NAD、NMN、NmR或Nam注射入大鼠左眼的玻璃體內(nèi)區(qū)室中并讓其整合視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞24小時(shí)，然后通過(guò)眼摘出術(shù)來(lái)橫斷左側(cè)視神經(jīng)，和在橫斷之后4天收集右側(cè)和左側(cè)視神經(jīng)并通過(guò)Western印跡法進(jìn)行分析，其中使用從在橫斷前未經(jīng)任何處理的小鼠中橫斷的視神經(jīng)作為負(fù)對(duì)照；在該圖中顯示了定量分析數(shù)據(jù)，即從經(jīng)橫斷的視神經(jīng)獲得的剩余神經(jīng)絲免疫反應(yīng)性相對(duì)于未經(jīng)橫斷的視神經(jīng)的百分?jǐn)?shù)±S.D.。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于治療神經(jīng)病變的方法和組合物。所述方法可以包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的增加患病和/或受損的神經(jīng)元中的NAD活性的物質(zhì)。據(jù)信，增加的NAD活性可以增加sirtuin活性，后者然后導(dǎo)致受損的神經(jīng)元細(xì)胞的軸突變性相對(duì)于在未用所述藥劑處理的受損的神經(jīng)元細(xì)胞中出現(xiàn)的軸突變性有所降低。這樣的軸突變性降低可以包括對(duì)于神經(jīng)元的損傷的完全或部分改善。還據(jù)信，NAD活性的增加可能能夠通過(guò)不牽涉sirtuin分子的其他機(jī)制起作用，從而產(chǎn)生軸突變性的降低或有助于產(chǎn)生軸突變性的降低。
七種已知的稱(chēng)為SIRT’s的sirtuin分子組成了哺乳動(dòng)物中的組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰酶的Sir2家族，所有這樣的sirtuin分子包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這七種人sirtuin，SIRT1-SIRT7，是NAD依賴(lài)性組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰酶，其分別以NCBI LocusLink ID Nos.23411、22933、23410、23409、23408、51548和51547進(jìn)行了更充分的描述(參見(jiàn)http://www.ncbi.nlm.hih.gov/LocusLink/)。特此引入所述NCBILocusLink參考站點(diǎn)作為參考。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可以增加任何一種或多種sirtuin的活性，特別地，本發(fā)明的多種方法增加SIRT1的活性。
關(guān)于物質(zhì)的活性，可參照特殊物質(zhì)的濃度或該物質(zhì)的功能有效性。物質(zhì)的濃度可以通過(guò)許多因素來(lái)增加，包括例如增加合成、減少分解、增加物質(zhì)的生物利用率或降低物質(zhì)的結(jié)合或者另外增加游離物質(zhì)的可利用數(shù)量。增加功能有效性可以是由于例如分子構(gòu)象的改變、物質(zhì)起作用的條件的改變、對(duì)物質(zhì)的靈敏度的改變等等而造成的。關(guān)于sirtuin分子，增加活性是希望表示增加NAD的濃度或增強(qiáng)NAD的功能有效性或增加NAD的利用率，或者增加經(jīng)過(guò)NAD的一個(gè)或多個(gè)生物合成途徑的通量，或者其任何的組合。
神經(jīng)病變可以包括牽涉神經(jīng)元和/或支持細(xì)胞例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的任何疾病或病狀，特別是那些牽涉軸突損害的疾病或病狀。通過(guò)創(chuàng)傷性損傷或通過(guò)由于疾病或病狀的非機(jī)械性損傷可以引起軸突損害，這樣的損害的結(jié)果可以是軸突的變性或功能障礙和功能性神經(jīng)元活性的喪失。產(chǎn)生這樣的軸突損害或與這樣的軸突損害相關(guān)的疾病和病狀處于大量的神經(jīng)病變性疾病和病狀中。這樣的神經(jīng)病變可以包括外周神經(jīng)病變、中樞神經(jīng)病變和其組合。此外，外周神經(jīng)病變的表現(xiàn)可以由主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的疾病而產(chǎn)生，和中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)可以基本上由外周或全身的疾病而產(chǎn)生。
外周神經(jīng)病變涉及對(duì)于外周神經(jīng)的損害，和可以是由于神經(jīng)的疾病而引起的或者是全身性疾病的結(jié)果。一些這樣的疾病可包括糖尿病，尿毒癥，傳染病如AIDs或麻風(fēng)病，營(yíng)養(yǎng)缺乏，血管或膠原病癥例如動(dòng)脈粥樣硬化，和自身免疫疾病例如全身性紅斑狼瘡、硬皮病、結(jié)節(jié)病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎。外周神經(jīng)變性還可以是由于對(duì)于神經(jīng)的創(chuàng)傷性即機(jī)械性損害以及對(duì)于神經(jīng)的化學(xué)或熱損害而造成的。損傷外周神經(jīng)的這樣的情形包括壓迫或擠壓損傷例如青光眼、腕管綜合征、直接創(chuàng)傷、穿透損傷、挫傷、骨折或脫位的骨；涉及淺神經(jīng)(尺骨、橈骨或腓骨)的壓力，其可以是由于延長(zhǎng)了拐杖的使用時(shí)間或在一個(gè)位置保持了太長(zhǎng)時(shí)間或者是由于腫瘤而造成的；神經(jīng)內(nèi)出血；局部缺血；暴露于冷或刺激或者某些藥物或毒性物質(zhì)例如除草劑(herbacides)或殺蟲(chóng)劑。特別地，神經(jīng)損害可以是由于細(xì)胞毒性抗癌劑例如長(zhǎng)春花生物堿如長(zhǎng)春花新堿所造成的化學(xué)損傷而引起的。這樣的外周神經(jīng)病變的典型癥狀包括虛弱、麻木、感覺(jué)異常(不正常的感覺(jué)例如灼燒感、搔癢感、刺痛感或麻刺感)和在臂、手、腿和/或腳中的疼痛。神經(jīng)病變還可以與線(xiàn)粒體功能障礙相關(guān)。這樣的神經(jīng)病變可以展現(xiàn)出降低的能量水平，即降低的NAD和ATP水平。
外周神經(jīng)病變還可以是代謝性和內(nèi)分泌性神經(jīng)病變，其包括廣泛的與代謝來(lái)源的全身性疾病相關(guān)的外周神經(jīng)病癥。其中的一些在前面已提及的這些疾病尤其包括糖尿病、低血糖癥、尿毒癥、甲狀腺功能減退癥、肝衰竭、紅細(xì)胞增多、淀粉樣變性、肢端肥大癥、卟啉病、脂質(zhì)/糖脂代謝的病癥、營(yíng)養(yǎng)/維生素缺乏和線(xiàn)粒體病癥。這些疾病的共同特點(diǎn)是由于代謝途徑失調(diào)而改變了髓鞘和軸突的結(jié)構(gòu)或功能，由此牽涉到外周神經(jīng)。
神經(jīng)病變還包括視神經(jīng)病變例如青光眼；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)變性例如與色素性視網(wǎng)膜炎和外視網(wǎng)膜神經(jīng)病變相關(guān)的那些；視神經(jīng)炎和/或變性，包括與多發(fā)性硬化相關(guān)的那些；對(duì)視神經(jīng)的創(chuàng)傷性損傷，可包括例如切除腫瘤期間的損傷；遺傳性視神經(jīng)病變，例如Kjer's病和Leber's遺傳性視神經(jīng)病變；局部缺血性視神經(jīng)病變，例如續(xù)發(fā)于巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎的那些；代謝性視神經(jīng)病變，例如神經(jīng)變性疾病，包括前面提及的Leber's神經(jīng)病變，營(yíng)養(yǎng)缺乏例如缺乏維生素B12或葉酸，和毒性例如由于乙胺丁醇或氰化物引起的毒性；由于不良藥物反應(yīng)引起的神經(jīng)病變；和由于維生素缺乏引起的神經(jīng)病變。局部缺血性視神經(jīng)病變還包括前動(dòng)脈缺血性視神經(jīng)病變。
與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)病變或軸突病變相關(guān)的神經(jīng)變性疾病包括多種疾病。這樣的疾病包括牽涉進(jìn)行性癡呆的疾病，例如阿爾茨海默病、老年性癡呆、皮克病和亨廷頓舞蹈??；影響肌肉功能的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如帕金森病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和進(jìn)行性共濟(jì)失調(diào)如肌萎縮性側(cè)索硬化癥；脫髓鞘病，例如多發(fā)性硬化；病毒性腦炎，例如由腸道病毒、蟲(chóng)媒病毒和單純皰疹病毒引起的那些；和朊病毒疾病。對(duì)頭部的機(jī)械性損傷例如青光眼或創(chuàng)傷性損傷還可以引起腦和脊髓中的神經(jīng)損傷和變性。另外，局部缺血和中風(fēng)以及諸如營(yíng)養(yǎng)缺乏和化學(xué)毒性(例如用化療劑時(shí))的情形可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)病變。
在此處使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“治療”是希望包括在神經(jīng)元損傷出現(xiàn)之前或之后的干涉。照此，治療可以通過(guò)在對(duì)于神經(jīng)元的首要侵害出現(xiàn)之前進(jìn)行施用來(lái)預(yù)防神經(jīng)元損傷，以及可以通過(guò)在對(duì)于神經(jīng)元的首要侵害出現(xiàn)之后進(jìn)行施用來(lái)改善神經(jīng)元損傷。這樣的對(duì)于神經(jīng)元的首要侵害可以包括任何與神經(jīng)病變相關(guān)的疾病或病狀，或由于這些疾病或病狀而產(chǎn)生?！爸委煛边€包括防止神經(jīng)元損傷的進(jìn)展。在此處使用時(shí)，“治療”可以包括施用藥物和/或合成的物質(zhì)，施用生物物質(zhì)例如蛋白質(zhì)、核酸、病毒載體等，以及施用諸如neutraceuticals、食品添加劑或功能性食品的物質(zhì)。
本發(fā)明的方法和組合物可用于治療哺乳動(dòng)物。這樣的哺乳動(dòng)物包括人以及非人哺乳動(dòng)物。非人哺乳動(dòng)物包括，例如，伴侶動(dòng)物例如狗和貓，農(nóng)業(yè)動(dòng)物例如牲畜(包括奶牛、馬等)，和外來(lái)動(dòng)物例如動(dòng)物園動(dòng)物。
能夠在哺乳動(dòng)物中增加sirtuin活性的物質(zhì)可以包括多酚，其中的一些已在早些時(shí)候進(jìn)行了描述(參見(jiàn)例如Howitz等人，Nature 425191-196，2003，和該文章所帶有的補(bǔ)充信息，在此引用所有這些文獻(xiàn)作為參考)。這樣的化合物可以包括芪，例如白藜蘆醇、piceatannol、脫氧土大黃苷、反式芪和土大黃苷；查兒酮，例如紫鉚因、isoliquiritigen和3，4，2′，4′，6′-五羥基查兒酮和查兒酮；黃酮，例如黃顏木素、5，7，3′，4′，5′-五羥基黃酮、木犀草素、3，6，3′，4′-四羥基黃酮、櫟精、7，3′，4′，5′-四羥基黃酮、山奈黃素、6-羥基芹黃素、芹黃素、3，6，2′，4′-四羥基黃酮、7，4′-二羥基黃酮、7，8，3′，4′-四羥基黃酮、3，6，2′，3′-四羥基黃酮、4′-羥基黃酮、5，4′-二羥基黃酮、5，7-二羥基黃酮、桑色素、黃酮和5-羥基黃酮；異黃酮，例如大豆黃素和染料木黃酮；黃烷酮，例如柚苷配基、3，5，7，3′，4′-五羥基黃烷酮和黃烷酮；或兒茶素，例如(-)-表兒茶素、(-)-兒茶素、(-)-兒茶素、(-)-沒(méi)食子兒茶素、(+)-兒茶素和(+)-表兒茶素。
另外的多酚或其他增加sirtuin脫乙酰酶活性的物質(zhì)可以使用此處所述的測(cè)定系統(tǒng)以及在商購(gòu)可得的測(cè)定系統(tǒng)例如發(fā)熒光性酶測(cè)定系統(tǒng)(Biomol International L.P.，Plymouth Meeting，Pennsylvania)中進(jìn)行鑒定。Sinclair等人還公開(kāi)了能夠增加sirtuin活性的物質(zhì)(Sinclair等人，WO2005/02672，該文獻(xiàn)在此以其整體進(jìn)行引用作為參考)。
在多種實(shí)施方案中，其他物質(zhì)能夠間接地通過(guò)增加NAD活性來(lái)增加sirtuin活性，因?yàn)樘厥獾膕irtuin起作用方式是通過(guò)NAD-依賴(lài)性組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰酶活性的。通過(guò)施用NAD或NADH以及通過(guò)合成NAD可以增加NAD活性。NAD可以通過(guò)三個(gè)主要途徑來(lái)合成，即從新合成途徑，其中從色氨酸合成NAD，NAD補(bǔ)救途徑，其中通過(guò)降解的NAD產(chǎn)物例如煙酰胺的再環(huán)化來(lái)產(chǎn)生NAD(Lin等人，Curent Opin.Cell Bool.15241-246，2003；Magni等人，Cell Mol.LifeSci.6119-34，2004)，和煙酰胺核糖核苷激酶途徑，其中通過(guò)煙酰胺核糖核苷激酶將煙酰胺核糖核苷轉(zhuǎn)化成煙酰胺單核苷酸(Bieganowski等人，Cell 117495-502，2004)。因此，向受損的神經(jīng)元施用下列物質(zhì)能夠有效地增加NAD活性在從新合成途徑中的NAD的前體例如色氨酸或煙酸鹽(nicotinate)，和/或在NAD補(bǔ)救途徑中的物質(zhì)例如煙酰胺、煙酸、煙酸單核苷酸或脫氨基-NAD，和/或在煙酰胺核糖核苷激酶途徑中的物質(zhì)例如煙酰胺核糖核苷或煙酰胺單核苷酸。如下所示，除了NAD之外，煙酰胺單核苷酸、煙酸單核苷酸或煙酰胺核糖核苷也具有和NAD類(lèi)似程度的抗軸突變性的保護(hù)能力，但是，煙酸和煙酰胺不能做到這樣。然后，增加的NAD活性可以增加受損的神經(jīng)元中sirtuin組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰酶活性，和減少或防止軸突變性。另外，據(jù)信，其他物質(zhì)可以通過(guò)增加酶活性，或通過(guò)增加NAD、煙酰胺單核苷酸、煙酸單核苷酸、煙酰胺核糖核苷或sirtuin酶的水平，或通過(guò)減少NAD、煙酰胺單核苷酸、煙酸單核苷酸、煙酰胺核糖核苷或sirtuin酶的降解來(lái)發(fā)揮作用。
在多種實(shí)施方案中，可以通過(guò)施用合成NAD的酶或包含合成NAD的酶的核酸來(lái)增加受損的神經(jīng)元中的NAD。這樣的酶可包括用于合成NAD的在從新合成途徑中的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶，或者編碼用于合成NAD的在從新合成途徑中的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶的核酸，特別是NAD補(bǔ)救途徑的酶，例如煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)如NMNAT1。因此，在一個(gè)非限定性實(shí)例中，施用NMNAT例如NMNAT1或NMNAT3或者施用包含編碼NMNAT例如NMNAT1或NMNAT3的序列的核酸可以減少或防止受損的神經(jīng)元中的軸突變性。
根據(jù)下列對(duì)于人NMNAT1基因和/或蛋白的GenBank登錄號(hào)描繪了人NMNAT1酶(E.C.2.7.7.18)NP_073624；NM_022787；AAL76934；AF459819；和NP_073624；AF314163。該基因的一個(gè)變體是NMNAT-2(KIAA0479)，其的人類(lèi)版本可以在GenBank登錄號(hào)NP_055854和NM_015039下找到。
在此處使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“以...的百分?jǐn)?shù)同一的”或“同一性百分?jǐn)?shù)”或“％同一性”是指兩個(gè)氨基酸序列之間或者兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性。每個(gè)同一性可以通過(guò)比較可為了比較目的而比對(duì)的每個(gè)序列中的位置來(lái)確定。當(dāng)在被比較的序列中的等價(jià)位置被相同堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，那么這些分子在該位置上就是同一的；當(dāng)?shù)葍r(jià)的位點(diǎn)被相同或類(lèi)似的氨基酸殘基(例如在空間和/或電子特性方面類(lèi)似)占據(jù)時(shí)，那么這些分子可以被稱(chēng)為在該位置上是同源的(類(lèi)似的)。作為同源性、類(lèi)似性或同一性的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行表示涉及在由被比較的序列所共享的位置處同一或類(lèi)似的氨基酸數(shù)目的函數(shù)。可以使用多種比對(duì)算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。可作為GCG序列分析軟件包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分而獲得FASTA和BLAST，和可以例如以默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行使用。ENTREZ可通過(guò)National Center for Biotechnology Information，NationalLibrary of Medicine，National Institutes of Health，Bethesda，Md.獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列的同一性百分?jǐn)?shù)可以通過(guò)GCG程序以1的缺口權(quán)重來(lái)測(cè)定，例如給每個(gè)氨基酸缺口加權(quán)重，就好像其是兩個(gè)序列之間的單個(gè)氨基酸或核苷酸錯(cuò)配。用于比對(duì)的其他技術(shù)描述于Methods in Enzymology，第266卷Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis(1996)，ed.Doolittle，AcademicPress，Inc.，Harcourt Brace&Co.的分部，San Diego，California，USA。優(yōu)選地，采用允許序列中的缺口的比對(duì)程序來(lái)比對(duì)序列。Smith-Waterman是一種類(lèi)型的允許序列中的缺口的算法。參見(jiàn)Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。還有，可以采用使用Needleman和Wunsch比對(duì)方法的GAP程序來(lái)比對(duì)序列。一種可選擇的搜索策略使用MPSRCH軟件，其在MASPAR計(jì)算機(jī)上運(yùn)行。MPSRCH使用Smith-Waterman算法以在極大并行的計(jì)算機(jī)(massively parallelcomputer)上對(duì)序列進(jìn)行評(píng)分，該方法增強(qiáng)了選取遠(yuǎn)距離相關(guān)的匹配的能力，和特別能夠耐受小的缺口和核苷酸序列錯(cuò)誤?？梢允褂煤怂峋幋a的氨基酸序列來(lái)搜索蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。具有單獨(dú)的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)描述于Methods in Enzymology，ed.Doolittle，同上。數(shù)據(jù)庫(kù)包括Genbank、EMBL、和日本的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)。
多肽的“變體”是指這樣的多肽，即該多肽具有在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處發(fā)生改變的多肽的氨基酸序列。變體可以具有“保守的”變化，其中被取代的氨基酸具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性(例如用異亮氨酸替代亮氨酸)。變體可以具有“非保守的”變化(例如用色氨酸替代甘氨酸)。類(lèi)似的次要變化還可以包括氨基酸缺失或插入或者兩者。關(guān)于確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而不會(huì)完全破壞生物學(xué)或免疫學(xué)活性的指導(dǎo)可以用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序來(lái)找到。例如LASERGENE軟件(DNASTAR)。
當(dāng)在多核苷酸序列的情況下使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“變體”可以包括與特殊的基因或其編碼序列的多核苷酸序列相關(guān)的多核苷酸序列。該定義可以包括例如“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)的”變體。剪接變體可以與參考分子具有顯著的同一性，但通常由于在mRNA加工期間的可選擇的外顯子剪接而具有或多或少數(shù)目的多肽。相應(yīng)的多肽可擁有附加的功能結(jié)構(gòu)域或不存在結(jié)構(gòu)域。物種變體是在從一個(gè)物種到另一個(gè)物種時(shí)發(fā)生變化的多核苷酸序列。所獲得的多肽通常會(huì)具有相互之間顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變化是在指定物種的個(gè)體之間在特殊基因的多核苷酸序列中的變化。多態(tài)變體還可以包括“單核苷酸多態(tài)性(SNPs)”，其中多核苷酸序列具有一個(gè)堿基的變化。SNPs的存在可能是某群體、疾病狀態(tài)或疾病狀態(tài)的傾向的指示。
根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物能夠用于治療或預(yù)防神經(jīng)病變的藥劑可以包括煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)或編碼NMNAT的多核苷酸。特別地，所述藥劑可以是這樣的酶，即其具有NMNAT活性，和具有與人NMNAT1的至少50％同一性或與人NMNAT3的至少50％同一性，與人NMNAT1的至少60％同一性或與人NMNAT3的至少60％同一性，與人NMNAT1的至少70％同一性或與人NMNAT3的至少70％同一性，與人NMNAT1的至少80％同一性或與人NMNAT3的至少80％同一性，與人NMNAT1的至少90％同一性或與人NMNAT3的至少90％同一性，與人NMNAT1的至少95％同一性或與人NMNAT3的至少95％同一性。此外，所述藥劑可以包括人NMNAT1、人NMNAT3或其經(jīng)保守取代的變體。
所述藥劑還可以包括與編碼人NMNAT1的核酸具有至少50％同一性的多核苷酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少50％同一性的多核苷酸，與編碼人NMNAT1的核酸具有至少60％同一性的多核苷酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少60％同一性的多核苷酸，與編碼人NMNAT1的核酸具有至少70％同一性的多核苷酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少70％同一性的多核苷酸，與編碼人NMNAT1的核酸具有至少80％同一性的多核苷酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少80％同一性的多核苷酸，與編碼人NMNAT1的核酸具有至少90％同一性的多核苷酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少90％同一性的多核苷酸，與編碼人NMNAT1的核酸具有至少95％同一性的多核苷酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少95％同一性的多核苷酸。所述藥劑還可以是編碼人NMNAT1、人NMNAT3或其變體的多核苷酸。
所述藥劑還可以包括sirtuin多肽或編碼sirtuin多肽的核酸。特別地，所述藥劑可以包括這樣的酶，即其具有SIRT活性，和具有與人SIRT1的至少50％同一性，與人SIRT1的至少60％同一性，與人SIRT1的至少70％同一性，與人SIRT1的至少80％同一性，與人SIRT1的至少90％同一性，或與人SIRT1的至少95％同一性。此外，所述藥劑可以包括人SIRT1或其經(jīng)保守取代的變體。所述藥劑還可以包括與編碼人SIRT1的核酸具有至少50％同一性的多核苷酸，與編碼人SIRT1的核酸具有至少60％同一性的多核苷酸，與編碼人SIRT1的核酸具有至少70％同一性的多核苷酸，與編碼人SIRT1的核酸具有至少80％同一性的多核苷酸，與編碼人SIRT1的核酸具有至少90％同一性的多核苷酸，或與編碼人SIRT1的核酸具有至少95％同一性的多核苷酸。此外，所述藥劑可以包括編碼人SIRT1或其變體的多核苷酸。
施用可以是通過(guò)任何合適的施用途徑，包括頰、牙、子宮頸內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、顱內(nèi)、淋巴管內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、鞘內(nèi)、氣管內(nèi)、子宮內(nèi)、血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、膀胱內(nèi)、鼻內(nèi)、眼、口、耳、膽灌注、心灌注、小顎(priodontal)、直腸、脊髓、皮下、舌下、局部、陰道內(nèi)、transermal、輸尿管或尿道。劑型可以是包括計(jì)量氣霧劑的氣霧劑、咀嚼棒、膠囊、含有經(jīng)包衣的小丸的膠囊、含有延遲釋放小丸的膠囊、含有延長(zhǎng)釋放小丸的膠囊、濃縮物、霜?jiǎng)?、增?qiáng)的(augmented)霜?jiǎng)?、栓劑型霜?jiǎng)?、圓盤(pán)(disc)、敷料、酏劑、乳劑、灌腸劑、延長(zhǎng)釋放纖維、延長(zhǎng)釋放薄膜、氣體、凝膠、計(jì)量凝膠、顆粒劑、延遲釋放顆粒劑、泡騰顆粒劑、咀嚼用樹(shù)膠、植入物、吸入物、可注射的、可注射的脂質(zhì)復(fù)合物、可注射的脂質(zhì)體、插入物、延長(zhǎng)釋放插入物、子宮內(nèi)裝置、膠凍劑、液體、延長(zhǎng)釋放液體、洗液、增強(qiáng)的洗液、香波洗液、油、軟膏劑、增強(qiáng)的軟膏劑、糊劑、軟錠劑、小丸、粉劑、延長(zhǎng)釋放粉劑、計(jì)量粉劑、環(huán)、香波、皂液、濺濕用溶液劑(solution for slush)、溶液劑/滴劑、濃縮溶液劑、成凝膠溶液劑/滴劑、海綿、噴霧劑、計(jì)量噴霧劑、栓劑、混懸劑、混懸劑/滴劑、延長(zhǎng)釋放混懸劑、藥簽、糖漿劑、片劑、咀嚼片劑、含有經(jīng)包衣的顆粒的片劑、延遲釋放片劑、可分散的片劑、泡騰片劑、延長(zhǎng)釋放片劑、口中崩解片劑、棉塞、帶(tape)或藥片/糖錠劑。
眼內(nèi)施用可包括通過(guò)注射(包括玻璃體內(nèi)注射)、通過(guò)滴眼劑和通過(guò)透鞏膜遞送的施用。
施用還可以為夾雜在哺乳動(dòng)物的飲食中，例如夾雜在人或伴侶動(dòng)物的功能性食品中。
還考慮到，某些含有增加sirtuin活性的組合物的制劑將要口服施用。這樣的制劑優(yōu)選地用合適的載體包封和配制成固體劑型。合適的載體、賦形劑和稀釋劑的一些實(shí)例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯樹(shù)膠、磷酸鈣、藻酸鹽、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、明膠、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、硬脂酸鎂、水、礦物油等等。所述制劑另外還可以包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和懸浮劑、防腐劑、增甜劑或矯味劑。通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的規(guī)程配制所述組合物，以便在施用給患者之后提供活性成分的快速、持續(xù)或延遲的釋放。所述制劑還可以包含減少蛋白水解性降解和促進(jìn)吸收的物質(zhì)，例如表面活性劑。
可以根據(jù)患者的大概體重或身體表面積或者將要占據(jù)的身體空間的體積來(lái)計(jì)算具體的劑量。該劑量還會(huì)依賴(lài)于所選擇的特定施用途徑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可常規(guī)地進(jìn)行對(duì)于確定合適的治療劑量所必需的計(jì)算的進(jìn)一步精確。按照在檢定制劑中的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行這樣的計(jì)算而不需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)，對(duì)于某些化合物的所述在檢定制劑中的活性例如已經(jīng)在別處進(jìn)行了描述(參見(jiàn)例如Howitz等人，Nature 425191-196，2003和該文章所附的補(bǔ)充信息)。可以結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的劑量-響應(yīng)研究來(lái)確定準(zhǔn)確的劑量。將會(huì)理解，實(shí)際施用的組合物的量將會(huì)由開(kāi)業(yè)醫(yī)生考慮相關(guān)情況來(lái)確定，所述相關(guān)情況包括待治療的病狀，待施用的組合物的選擇，個(gè)體患者的年齡、體重和響應(yīng)，患者癥狀的嚴(yán)重程度，和所選擇的施用途徑。
在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了篩選候選藥劑的方法。在一個(gè)這樣的測(cè)定方法中，就于減少或防止受損的神經(jīng)元細(xì)胞的軸突變性方面的有效性對(duì)藥劑進(jìn)行測(cè)試。因此，將候選藥劑施用給經(jīng)歷了損傷的神經(jīng)元細(xì)胞，并檢測(cè)受損的神經(jīng)元細(xì)胞的軸突變性的減少。通常，在產(chǎn)生損傷之前加入藥劑，可是，在一些情況下，可以在添加候選化合物之前產(chǎn)生損傷。該方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。體外測(cè)試可以使用許多種哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中的任一種在多種引起損傷的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行?？墒褂玫牟溉閯?dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型的一個(gè)實(shí)例是原代背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其通過(guò)橫斷并去除神經(jīng)元細(xì)胞體或者通過(guò)生長(zhǎng)在含有長(zhǎng)春花新堿的培養(yǎng)基中而受到損傷，如下所述。體內(nèi)測(cè)試可以在完整的動(dòng)物中進(jìn)行，例如外周神經(jīng)再生的小鼠模型(Pan等人，J.Neurosci.2311479-11488，2003)或進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變的小鼠模型(Schmalbruch等人，J.Neuropathol.Exp.Neurol.50192-204，1991；Ferri等人，Current Biol.13669-673，2003)。
因?yàn)闇p少或防止神經(jīng)元損傷的機(jī)制是由于sirtuin分子的NAD-依賴(lài)性組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰酶活性的增加，所以所述測(cè)定方法還可以用作對(duì)于直接或通過(guò)增加NAD活性來(lái)增加sirtuin活性的物質(zhì)的初步篩選。因此，上述方法可以用于篩選增加NAD生物合成活性的藥劑或者增加神經(jīng)元中sirtuin活性的藥劑。
重組載體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述重組載體用作編碼sirtuin分子或NAD生物合成的酶的核酸的承載物。這樣的重組載體可以包含與編碼哺乳動(dòng)物NMNAT1蛋白或哺乳動(dòng)物sirtuin蛋白例如SIRT1蛋白的序列有效連接的啟動(dòng)子。這樣的重組載體可以是任何合適的載體，例如慢病毒或腺伴隨病毒。還可以使用任何合適的啟動(dòng)子，例如遍在蛋白啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子或β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
本發(fā)明可以通過(guò)參考下列的實(shí)施例而得到進(jìn)一步的理解。
實(shí)施例1該實(shí)施例證明，從用表達(dá)Wlds蛋白的載體轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元上橫斷的軸突與對(duì)照神經(jīng)元相比顯示出延遲的變性。
在wlds小鼠中，響應(yīng)于軸突損傷的沃勒變性已顯示出延遲(Gillingwater等人，J Physiol，534627-639，2001)?；蚍治鲲@示，wlds突變包含85kb的串聯(lián)三次重復(fù)，其導(dǎo)致嵌合的核分子(Wlds蛋白)的過(guò)表達(dá)。該蛋白質(zhì)由下列部分組成Ufd(遍在蛋白融合降解蛋白)2a的N-末端70AAs、與煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶1(NMNAT1)的全序列融合的遍在蛋白鏈裝配因子、在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生NAD的NAD補(bǔ)救途徑中的酶。Wlds蛋白具有NMNAT活性，但缺乏遍在蛋白連接酶功能，這暗示了軸突保護(hù)源自增加的NMNAT1活性或者Ufd2a功能的‘顯性失活的’抑制。
為了鑒定由Wlds蛋白介導(dǎo)的延遲的軸突變性的機(jī)制，我們使用了體外沃勒變性模型。將原代DRG外植體神經(jīng)元用表達(dá)合適的蛋白質(zhì)的慢病毒感染，并通過(guò)去除神經(jīng)元細(xì)胞體(橫斷)或在長(zhǎng)春花新堿中生長(zhǎng)(毒性)來(lái)?yè)p傷軸突。
慢病毒表達(dá)構(gòu)建體由D.Baltimore友情提供(Lois等人，Science295868-72，2002)。我們修飾了FUGW載體以產(chǎn)生普通表達(dá)穿梭FUIV(遍在蛋白啟動(dòng)子-目的基因-IRES-增強(qiáng)的YFP(Venus))載體，其使得能夠增強(qiáng)在表達(dá)目的基因的細(xì)胞中的YFP表達(dá)。下列蛋白質(zhì)的每一個(gè)在C-末端具有六組氨酸標(biāo)簽，將它們克隆入FUIV載體中Wlds嵌合突變蛋白；含有點(diǎn)突變(P1140A)的Ufd2a，其先前已顯示作為“顯性失活”(Ufd2a(P1140))抑制野生型Ufd2a功能。將下列基因克隆入FUGW載體中1)Ufd2a的第一個(gè)70AAs(包含在Wlds蛋白中的部分)，其與EGFP的N-末端融合(Ufd2a(1-70)-EGFP)或與在C-末端具有核定位信號(hào)的EGFP的N-末端融合(Ufd2a(1-70)-nucEGFP)；2)Wlds蛋白的NMNAT1部分，其與EGFP的C-末端融合(EGFP-NMNAT1)。
對(duì)于Ufd2a/Ube4b的鼠cDNA(mKIAA0684)由Kazusa DNAResearch Institute提供。對(duì)于NMNAT1的鼠cDNA(登錄號(hào)BC038133)從ATCC購(gòu)買(mǎi)。使用PCR介導(dǎo)的誘變來(lái)在Ufd2a、NMNAT1和Wlds中產(chǎn)生點(diǎn)突變。
我們?cè)贔SP-si載體中產(chǎn)生了siRNA構(gòu)建體，所述FSP-si載體是通過(guò)用人U6啟動(dòng)子和Pol I終止信號(hào)以及隨后的SV40啟動(dòng)子-嘌呤霉素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因替代遍在蛋白啟動(dòng)子和GFP cDNA而從FUGW骨架產(chǎn)生的。如前所述進(jìn)行siRNA構(gòu)建體的克隆，從而從U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出siRNA(Castanotto等人，RNA，81454-60，2002)。用于蛋白質(zhì)表達(dá)的siRNA下調(diào)的序列為SIRT1的1692～1710、SIRT2的1032～1050、SIRT3的538～556、SIRT4的1231～1249、SIRT5的37～55、SIRT6的1390～1408、和SIRT7的450～468。每個(gè)慢病毒表達(dá)和siRNA構(gòu)建體的完整性通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)確認(rèn)。
將來(lái)自E12.5胚胎的小鼠DRG外植體在存在1nM神經(jīng)生長(zhǎng)因子的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)向培養(yǎng)基中加入5-氟尿嘧啶而從培養(yǎng)物中去除非神經(jīng)元細(xì)胞。在10-20DIV進(jìn)行神經(jīng)突的橫斷，使用18號(hào)針頭以去除神經(jīng)元細(xì)胞體。使用在文中或在附圖中所示的條件，用β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Sigma)或Sirtinol(Calbiochem)進(jìn)行溫育。
如上所述，使用HEK293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒表達(dá)載體。為了確認(rèn)源自慢病毒的蛋白表達(dá)，用慢病毒感染HEK293T細(xì)胞并在感染后3天裂解細(xì)胞。將這些裂解物通過(guò)使用抗-His標(biāo)簽單克隆抗體(Qiagen)的免疫印跡法進(jìn)行分析，以檢測(cè)各自的具有六組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的表達(dá)。在軸突橫斷之前剛開(kāi)始的3-7天，通過(guò)將～106-107pfu/ml的病毒與DRG外植體溫育24小時(shí)來(lái)進(jìn)行DRG神經(jīng)元的慢病毒感染。在倒置熒光顯微鏡下檢查被感染的神經(jīng)元以確保在＞95％的神經(jīng)元中可檢測(cè)到慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
如以前所述進(jìn)行軸突變性的定量分析(Zhai等人，Neuron 39217-25，2003)。簡(jiǎn)而言之，在所示的時(shí)間使用相差顯微術(shù)檢查培養(yǎng)物。將具有成碎片的、無(wú)折射的外觀(guān)的軸突標(biāo)示為“變性的”。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，從幾張隨機(jī)獲取的每一培養(yǎng)物的圖像中對(duì)至少200個(gè)可單獨(dú)區(qū)分的軸突進(jìn)行盲評(píng)分。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在一式三份的外植體中測(cè)試每一個(gè)條件。從每個(gè)條件的2-4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得結(jié)果。通過(guò)Student’sT檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。為了計(jì)算神經(jīng)突所覆蓋的面積，使用analysis 3.1軟件(Soft Imaging System，Lakewood，CO)對(duì)從兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一式四份樣品中得到的數(shù)字捕獲的圖像進(jìn)行分析。
我們發(fā)現(xiàn)，從表達(dá)Wlds蛋白的神經(jīng)元上橫斷下來(lái)的軸突以這樣的方式變性，即其具有源自wlds小鼠的神經(jīng)元的延遲動(dòng)力學(xué)特征(Buckmaster等人，Eur J Neurosci 71596-602，1995)，如圖1A中所示。
接著，我們比較了在過(guò)表達(dá)Wlds蛋白的神經(jīng)元中與在表達(dá)Ufd2a或NMNAT1蛋白(其構(gòu)成了與EGFP相連的Wlds蛋白)的神經(jīng)元中橫斷后的軸突變性。結(jié)果顯示在圖1B中。
我們發(fā)現(xiàn)，與Wlds蛋白本身相比，EGFP-NMNAT1的表達(dá)延遲了軸突變性，而靶向細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的Ufd2a的N-末端70AA(融合至EGFP)不影響軸突變性。通過(guò)在去除神經(jīng)元細(xì)胞體之后的各個(gè)時(shí)間處計(jì)數(shù)剩余神經(jīng)突的百分?jǐn)?shù)來(lái)進(jìn)行這些影響的定量。該分析顯示，EGFP-NMNAT1像Wlds蛋白本身一樣，在損傷后72小時(shí)導(dǎo)致完整的神經(jīng)突有＞10倍的增加。為了進(jìn)一步排除UPS直接參與Wlds蛋白介導(dǎo)的軸突保護(hù)的可能，我們使用顯性失活Ufd2a突變體或Ufd2asiRNA構(gòu)建體檢查了Ufd2a抑制的影響。但是，這些方法都沒(méi)有導(dǎo)致延遲響應(yīng)于軸突切斷術(shù)的軸突降解?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)證明，Wlds蛋白的NMNAT1部分是在wlds小鼠中觀(guān)察到的延遲的軸突變性的原因。
實(shí)施例2該實(shí)施例顯示，在全長(zhǎng)NMNAT1中和在Wlds蛋白中的突變消除了這些蛋白質(zhì)的軸突保護(hù)效應(yīng)。
NMNAT1是在核NAD補(bǔ)救途徑中的酶，其分別催化煙酰胺單核苷酸(NMN)和煙酸鹽單核苷酸(NaMN)轉(zhuǎn)化成NAD和煙酸鹽腺嘌呤單核苷酸(NaAD)。在過(guò)表達(dá)NMNAT1的神經(jīng)元中觀(guān)察到的軸突保護(hù)可能是通過(guò)其合成NAD的能力(即其酶活性)介導(dǎo)的，或者也許是通過(guò)其他未知的該蛋白質(zhì)的功能介導(dǎo)的。為了澄清該問(wèn)題，我們使用NMNAT1晶體結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定幾個(gè)預(yù)測(cè)參與底物結(jié)合的殘基。在這些殘基中的一個(gè)處的突變(W170A)經(jīng)工程改造而引入全長(zhǎng)NMNAT1和Wlds蛋白中。體外酶測(cè)定法確認(rèn)，這兩個(gè)突變型蛋白質(zhì)都在其合成NAD的能力方面受到了嚴(yán)重的限制(圖2A)。將這些突變體中的每一個(gè)和其各自的野生型配對(duì)物引入神經(jīng)元中以評(píng)測(cè)它們保護(hù)軸突免于降解的能力。我們發(fā)現(xiàn)，表達(dá)這些無(wú)酶活性的突變體的神經(jīng)元沒(méi)有軸突保護(hù)作用(圖2A)，這表明NAD/NaAD-產(chǎn)生是NMNAT1防止軸突降解的能力的原因。
實(shí)施例3該實(shí)施例舉例說(shuō)明了，在用長(zhǎng)春花新堿損傷的神經(jīng)元中的增加的NMNAT活性也顯示出延遲的軸突降解。
除了機(jī)械橫斷之外，在wlds小鼠中還觀(guān)察到抗其他損害性因子例如局部缺血和毒素的軸突保護(hù)(Coleman等人，Trends Neurosci25532-37，2002；Gillingwater等人，J Cereb Blood Flow Metab2462-66，2004)。我們尋求確定增加的NMNAT活性是否也會(huì)延遲響應(yīng)于其他類(lèi)型的軸突損傷的軸突降解，所述其他類(lèi)型的軸突損傷例如為長(zhǎng)春花新堿、具有經(jīng)充分表征的軸突毒性的癌癥化療試劑。讓表達(dá)NMNAT1或EGFP(對(duì)照)的神經(jīng)元在0.5μM長(zhǎng)春花新堿中生長(zhǎng)直至9天。我們發(fā)現(xiàn)，表達(dá)NMNAT1的神經(jīng)元的軸突維持著它們?cè)嫉拈L(zhǎng)度和反射性(refractility)，而從表達(dá)EGFP的神經(jīng)元發(fā)散出的軸突逐漸地縮回并在第9天前大部分發(fā)生變性(圖2B)。這些結(jié)果表明，NMNAT活性自身能夠保護(hù)軸突免受許多侵害的影響和介導(dǎo)在wlds小鼠中觀(guān)察到的保護(hù)作用。
實(shí)施例4該實(shí)施例顯示，外源性地施用的NAD能夠保護(hù)受損的神經(jīng)元免于軸突變性。
以前的實(shí)驗(yàn)已顯示，神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)能夠結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外NAD進(jìn)入細(xì)胞的膜蛋白(Bruzzone等人，F(xiàn)aseb J 1510-12，2001)。這鼓勵(lì)我們探究外源性地施用的NAD是否能夠防止軸突變性。我們?cè)谳S突橫斷之前向神經(jīng)元培養(yǎng)物中加入各種濃度的NAD，并檢查了軸突降解的程度。我們發(fā)現(xiàn)，在軸突切斷術(shù)之前24小時(shí)加入的0.1-1mM的NAD顯著地延遲了軸突變性，雖然外源性地施加的NAD在保護(hù)軸突的有效性方面比慢病毒介導(dǎo)的NMNAT1表達(dá)要稍低一些(圖3A)。這些結(jié)果提供了對(duì)于這樣的想法的直接支持，即增力NAD供應(yīng)可以防止軸突降解。
實(shí)施例5該實(shí)施例舉例說(shuō)明了，在去除神經(jīng)元細(xì)胞體之前需要NAD來(lái)保護(hù)受損的神經(jīng)元免于軸突變性。
為了獲得對(duì)于NAD-依賴(lài)性軸突保護(hù)(NDAP)的機(jī)制的了解。我們檢查了在去除神經(jīng)元細(xì)胞體之前是否需要NAD，或者將切斷的軸突直接暴露于高水平的NAD是否足以提供保護(hù)(圖3B)。制備了神經(jīng)元培養(yǎng)物，并在軸突橫斷的時(shí)候或者在損傷之前的各個(gè)時(shí)間(4至48小時(shí))處向培養(yǎng)基中加入1mM NAD。
我們發(fā)現(xiàn)，在軸突橫斷的時(shí)候施用NAD或者在損傷之前施用NAD直至8小時(shí)對(duì)于軸突沒(méi)有保護(hù)作用。但是，當(dāng)在損傷之前將神經(jīng)元與NAD溫育更長(zhǎng)的一段時(shí)間的時(shí)候，觀(guān)察到了顯著的軸突保留，最大的效用出現(xiàn)在至少24小時(shí)的NAD預(yù)處理之后。這些結(jié)果表明，NAD依賴(lài)性軸突保護(hù)不是由軸突本身中的快速的翻譯后修飾介導(dǎo)的。
對(duì)于延長(zhǎng)完整的神經(jīng)元暴露于NAD的時(shí)間以防止響應(yīng)于損傷的軸突降解的要求暗示，保護(hù)過(guò)程要求從新的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯事件。有趣地，Wlds蛋白和NMNAT1都位于細(xì)胞核內(nèi)(數(shù)據(jù)未顯示)。類(lèi)似地，大多數(shù)構(gòu)成酵母中的NAD補(bǔ)救途徑的酶也區(qū)室化于細(xì)胞核中。我們使用靈敏的微小規(guī)模酶測(cè)定法(Szabo等人，Proc Natl Acad Sci USA，931753-58，1996)比較了在野生型和表達(dá)NMNAT1的DRG神經(jīng)元中的NAD水平，但是發(fā)現(xiàn)總的細(xì)胞NAD水平?jīng)]有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。這類(lèi)似于在酵母中的觀(guān)察結(jié)果，在酵母中這一細(xì)胞核途徑的活化不改變總的NAD水平(Anderson等人，J Biol Chem，27718881-90，2002；Huh等人，Nature，425686-91，2003)。此外，在野生型和wlds小鼠的腦中的組織NAD水平是類(lèi)似的，盡管在wlds小鼠中NMNAT活性水平增加(Mack等人，Nat Neurosci，41199-206，2001)。這些數(shù)據(jù)暗示了，與細(xì)胞質(zhì)的NAD-依賴(lài)性過(guò)程相反，在細(xì)胞核中的NAD-依賴(lài)性酶活性可能介導(dǎo)了響應(yīng)于增加的NMNAT活性而觀(guān)察到的軸突保護(hù)。
實(shí)施例6該實(shí)施例顯示了，Sir2的抑制參與了NAD-依賴(lài)性軸突保護(hù)。
蛋白質(zhì)脫乙酰酶和poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的Sir2家族是主要的NAD-依賴(lài)性細(xì)胞核酶活性。Sir2是組蛋白和其他蛋白質(zhì)的NAD-依賴(lài)性脫乙酰酶，它的活化對(duì)于在酵母和美麗線(xiàn)蟲(chóng)(C. elegans)中促進(jìn)壽命的增加來(lái)說(shuō)是重要的(Bitterman等人，Microbiol Mol BiolRev，67376-99，2003；Hekimi等人，Science 2991351-54，2003)。PARP通過(guò)DNA損傷而活化，并參與DNA修復(fù)(S.D.Skaper，Ann NY AcadSci，993217-28和287-88，2003)。這些酶，特別是Sir2蛋白，在近些年已經(jīng)產(chǎn)生了極大的關(guān)注，因?yàn)樗鼈兲峁┝藷崃肯拗坪推鋵?duì)于衰老過(guò)程的影響之間的有力聯(lián)系。這些NAD-依賴(lài)性酶在調(diào)節(jié)基因活性中的重要性提示我們?nèi)ヌ骄克鼈冊(cè)谳S突降解的自破壞過(guò)程中的作用。因此，我們測(cè)試了Sir2的抑制劑(Sirtinol)和PARP的抑制劑(3-氨基苯甲酰胺(3AB))是否能夠影響NAD-依賴(lài)性軸突保護(hù)(NDAP)(圖4A)。在存在1mM NAD和Sirtinol(100μM)或3AB(20mM)的情況下培養(yǎng)神經(jīng)元。通過(guò)去除神經(jīng)元細(xì)胞體來(lái)進(jìn)行軸突的橫斷，并在12至72小時(shí)后評(píng)測(cè)軸突降解的程度。我們發(fā)現(xiàn)，Sirtinol有效地阻斷了NDAP，表明Sir2蛋白可能是該過(guò)程的效應(yīng)物。相反地，3AB對(duì)于NDAP沒(méi)有影響，表明PARP在軸突保護(hù)中不起作用。為了進(jìn)一步檢查Sir2蛋白在NDAP中的作用，我們測(cè)試了白藜蘆醇(10～100μM)的效用，白藜蘆醇是一種增強(qiáng)Sir2活性的多酚化合物(Howitz等人，Nature，425191-96，2003)。我們發(fā)現(xiàn)，在軸突切斷術(shù)之前用白藜蘆醇處理的神經(jīng)元顯示出軸突降解的減少，該減少與使用NAD而獲得的相當(dāng)(圖4A)，這為這樣的想法提供了進(jìn)一步的支持，即Sir2蛋白是由NMNAT活性增加介導(dǎo)的軸突保護(hù)的效應(yīng)物。
實(shí)施例7該實(shí)施例顯示了，SIRT1參與了NAD-依賴(lài)性軸突保護(hù)。
在人和嚙齒動(dòng)物中，已經(jīng)鑒定了共享Sir2保守結(jié)構(gòu)域的七個(gè)分子(sirtuin(SIRT)1至7)，雖然這些蛋白質(zhì)中的一些并不表現(xiàn)出具有組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰酶活性(Buck等人，J Leukoc Biol，S0741-5400，2004)。SIRT1位于細(xì)胞核中，并參與了染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄因子例如p53的調(diào)節(jié)(J.Smith，Trends Cell Biol，12404-406，2002)。其他SIRT蛋白的細(xì)胞定位較不清楚，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些在細(xì)胞質(zhì)中和在線(xiàn)粒體中。為了確定哪種或那些SIRT蛋白參與了NAD-依賴(lài)性軸突保護(hù)，我們使用siRNA構(gòu)建體進(jìn)行了基因壓制(knockdown)實(shí)驗(yàn)以特異地靶向SIRT家族的每一個(gè)成員。用表達(dá)特異的SIRT siRNA構(gòu)建體的慢病毒感染神經(jīng)元，所述SIRT siRNA構(gòu)建體有效地抑制它們的所希望的靶標(biāo)的表達(dá)(圖4B)。將經(jīng)感染的神經(jīng)元培養(yǎng)在1mM NAD中，并通過(guò)去除細(xì)胞體來(lái)進(jìn)行軸突的橫斷。我們發(fā)現(xiàn)，SIRT1 siRNA構(gòu)建體在阻斷NAD的軸突保護(hù)作用時(shí)就如同Sirtinol抑制劑一樣有效。相反地，其他SIRT蛋白的抑制對(duì)于NDAP不具有顯著的影響(圖4B)。這些結(jié)果表明，SIRT1是NAD供應(yīng)增加的主要效應(yīng)物，所述的NAD供應(yīng)增加有效地防止軸突的自破壞。雖然SIRT1可以使直接參與軸突穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)脫乙?；?，但是其主要在細(xì)胞核中的定位，以及為了獲得有效保護(hù)而在損傷前～24小時(shí)對(duì)于NAD的需要，一起暗示了SIRT1調(diào)節(jié)了導(dǎo)致軸突保護(hù)的基因程序。
軸突變性是一種主動(dòng)的、自破壞性的現(xiàn)象，其不僅在損傷之后和在對(duì)化療作出響應(yīng)時(shí)被觀(guān)察到，而且在與衰老、代謝疾病例如糖尿病性神經(jīng)病變、和神經(jīng)變性疾病相關(guān)時(shí)被觀(guān)察到。我們的結(jié)果表明，在wlds小鼠中的軸突保護(hù)的分子機(jī)制是由于NAD的供應(yīng)增加和隨之發(fā)生的組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙酰酶SIRT1的活化，所述的NAD的供應(yīng)增加是由于NAD補(bǔ)救途徑的活性增加而造成的。
實(shí)施例8-11下面的材料和方法用于實(shí)施例8-11。
表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和誘變。使用Herculase(Stratagene)PCR擴(kuò)增出NAD生物合成相關(guān)酶的編碼區(qū)，對(duì)于鼠NMNAT1從EST克隆BC038133中擴(kuò)增，和對(duì)于鼠煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶3(NMNAT3)從克隆BC005737中擴(kuò)增。人NAD合成酶(QNS)的具有六組氨酸標(biāo)簽的cDNA由Dr.N.Hara(Shimane University，Shimane，Japan)友情提供。六組氨酸標(biāo)簽加在每個(gè)cDNA的3′-末端。通過(guò)PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變產(chǎn)生NMNAT1胞質(zhì)突變體(cytNMNAT1)。通過(guò)在NMNAT3的C-末端加上核定位信號(hào)而產(chǎn)生NMNAT3的細(xì)胞核形式(nucNMNAT3)。如前所述，將每一個(gè)PCR擴(kuò)增出的NAD合成相關(guān)酶的片段克隆入FCIV慢病毒穿梭載體中。對(duì)所有構(gòu)建體的完整性進(jìn)行測(cè)序，使用Taq DyeDeoxy Terminator循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems)和Applied Biosystems 373 DNA測(cè)序儀。
NAD生物合成底物。NAD生物合成相關(guān)酶的所有底物從Sigma購(gòu)買(mǎi)(Na、Nam、NMN、NaMN、煙酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)和NAD)。NmR從NMN合成。通過(guò)使用反相柱LC-18T(Supelco)的HPLC(Waters)來(lái)確認(rèn)NMN向NmR的轉(zhuǎn)化。在1ml/分鐘的緩沖液流速下，NmR在260±10秒被洗脫和NMN在150±10秒被洗脫，所述緩沖液含有50mM K2HPO4和50mM KH2PO4(pH7.0)。如前所述，使用由Dr.Charles Brenner(Dartmouth Medical School，NewHampshire，USA)友情提供的酵母菌株來(lái)評(píng)測(cè)NmR的生物活性。
實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-PCR分析。根據(jù)對(duì)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的照料和使用的National Institute of Health指導(dǎo)方針，在Washington University進(jìn)行所有的手術(shù)程序。對(duì)于神經(jīng)損傷之后的表達(dá)分析，橫斷C57BL/6小鼠的坐骨神經(jīng)，和在所示時(shí)間點(diǎn)上收集L4至L5.DRGs并匯集在一起以提取RNA。根據(jù)所述的方法將來(lái)自E14.5胚胎的大鼠DRG外植體培養(yǎng)14天，和用含有10nM長(zhǎng)春花新堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)所示的一段時(shí)間，并提取RNA。從匯集的組織來(lái)源或DRG外植體培養(yǎng)物中制備總RNAs。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，從1μg的每種RNA中制備第一鏈cDNA模板。對(duì)于每個(gè)RNA樣品進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的cDNA合成。通過(guò)在TaqMan7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems)上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SYBR-GREEN染料的熒光增加來(lái)進(jìn)行定量反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR。
細(xì)胞培養(yǎng)、體外軸突切斷術(shù)和軸突變性的定量。將來(lái)自E12.5胚胎的小鼠DRG外植體培養(yǎng)在含有10％FCS和1nM神經(jīng)生長(zhǎng)因子的DMEM中。通過(guò)向培養(yǎng)基中加入5-氟尿嘧啶而從培養(yǎng)物中去除非神經(jīng)元細(xì)胞。在14-21DIV進(jìn)行神經(jīng)突的橫斷，使用18號(hào)針頭以去除神經(jīng)元細(xì)胞體。產(chǎn)生慢病毒表達(dá)載體。在軸突橫斷之前3-7天進(jìn)行慢病毒感染24小時(shí)。進(jìn)行神經(jīng)突變性的定量分析。
蛋白質(zhì)表達(dá)和定位的確定。為了確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)，用表達(dá)每一種NAD生物合成相關(guān)酶的病毒感染HEK293T細(xì)胞。在感染后5天裂解細(xì)胞以便通過(guò)免疫印跡進(jìn)行分析，從而通過(guò)抗-6xHis標(biāo)簽單克隆抗體(R&D Systems)來(lái)檢測(cè)每種具有六組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的表達(dá)。使用被對(duì)于每一種NAD生物合成相關(guān)酶的病毒穿梭載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞來(lái)分析每種蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。將細(xì)胞于在含有0.1％吐溫-20的PBS(PBS-T)中的4％低聚甲醛中固定，并與含有5％BSA的PBS-T溫育1小時(shí)，然后用在含有1％BSA的PBS-T中的1∶1000稀釋的抗-6xHis標(biāo)簽抗體(R&D Systems)覆蓋并在4℃保持16小時(shí)。用PBS-T洗滌細(xì)胞，并用在TBS-T中的綴合有Alexa Fluor594的二抗(Molecular Probes)溫育1小時(shí)，和通過(guò)熒光顯微術(shù)(Nikon)進(jìn)行檢查。
NMNAT蛋白過(guò)表達(dá)、親和純化和酶測(cè)定。通過(guò)使用磷酸鈣沉淀法，用對(duì)于每種酶的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。三天后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后懸浮在含有50mM磷酸鈉(pH8.0)和300mMNaCl的緩沖液(緩沖液A)中。然后通過(guò)SONIFIRE 450(BRANSON)將細(xì)胞勻漿，并通過(guò)在10,000g離心10分鐘來(lái)收集上清液。用緩沖液A洗滌His-選擇鎳親和凝膠(Sigma)，和向1ml上清液中加入0.1ml的50％凝膠懸浮液，并在4℃溫育10分鐘，然后用緩沖液A充分地洗滌結(jié)合具有六組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的小珠。通過(guò)加入100μl含有50mM磷酸鈉(pH8.0)、300mM NaCl和250mM咪唑的溶液來(lái)洗脫蛋白質(zhì)。通過(guò)使用如前所述經(jīng)親和純化的蛋白質(zhì)來(lái)測(cè)量相對(duì)的NMNAT酶活性，減去從用模擬品轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中獲得的值，并通過(guò)由光密度測(cè)定法測(cè)定的重組蛋白質(zhì)的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
NAD生物合成底物的施用和視神經(jīng)橫斷。將Nam、NMN、NmR或NAD以100mM或1M的濃度溶解在PBS中。在麻醉狀態(tài)下，以每秒0.5μl ml的速度將各自5μl溶液注射入左側(cè)玻璃體內(nèi)component中。在玻璃體內(nèi)注射后24小時(shí)橫斷左側(cè)視神經(jīng)，并在所示時(shí)間處回收視神經(jīng)。將視神經(jīng)組織在100μl含有100mM tris-HCl(pH6.8)、1％SDS和1mM DTT的緩沖液中進(jìn)行勻漿。對(duì)于每個(gè)樣品取50μg蛋白質(zhì)通過(guò)Western印跡法進(jìn)行分析，使用抗-神經(jīng)絲抗體2H3(Developmental Studies Hybridoma Center)和綴合有過(guò)氧化物酶的二抗(Jackson ImmunoResearch)。從橫斷的神經(jīng)對(duì)對(duì)側(cè)的神經(jīng)的神經(jīng)絲免疫反應(yīng)性的比例計(jì)算變性率。
實(shí)施例8該實(shí)施例舉例說(shuō)明了NAD生物合成途徑和哺乳動(dòng)物NAD生物合成相關(guān)酶的表達(dá)分析。
在原核生物和真核生物中，NAD均通過(guò)三個(gè)主要途徑合成。在從新合成途徑中，NAD從色氨酸合成(圖5)。在補(bǔ)救途徑中，NAD從維生素(包括煙酸和煙酰胺)產(chǎn)生。最近已發(fā)現(xiàn)了從煙酰胺核糖核苷開(kāi)始的第三條途徑，稱(chēng)為不依賴(lài)于Preiss-Handler的途徑。從新合成途徑的最后的酶促反應(yīng)涉及通過(guò)QPRT(EC 2.4.2.19)將喹啉酸鹽(quinolinate)轉(zhuǎn)化為NaMN。在這一點(diǎn)上，從新合成途徑和補(bǔ)救途徑會(huì)聚在一起。NaPRT(EC 2.4.2.11)將Na轉(zhuǎn)化為NaMN，NaMN然后被NMNAT(EC 2.7.7.1)轉(zhuǎn)化為NaAD。QNS1(EC 6.3.5.1)將NaAD轉(zhuǎn)化為NAD。NmPRT(EC 2.4.2.12；也稱(chēng)為visfatin)將Nam轉(zhuǎn)化為NMN。NMN還被NMNAT轉(zhuǎn)化為NAD。在哺乳動(dòng)物中還未鑒定出煙酰胺酶(PNC，EC 3.5.1.19)，其在酵母和細(xì)菌補(bǔ)救途徑中中將Nam轉(zhuǎn)化為Na。在不依賴(lài)于Preiss-Handler的途徑中，Nrk(EC2.7.1.22)將NmR轉(zhuǎn)化為NMN，并與補(bǔ)救途徑會(huì)聚。以前已經(jīng)克隆和表征了這些哺乳動(dòng)物酶中的大多數(shù)，包括QPRT、NmPRT、QNS1、Nrk1/2和NMNAT1/2/3。還將NaPRT的哺乳動(dòng)物同源物鑒定為注釋為細(xì)菌NaPRT的哺乳動(dòng)物同源物的EST。
為了探究在神經(jīng)系統(tǒng)中哺乳動(dòng)物NAD生物合成相關(guān)酶的表達(dá)，我們進(jìn)行了定量RT-PCR，其使用來(lái)自在E14、P0、P7、P14和P21期的小鼠腦、視網(wǎng)膜、脊髓和DRG的RNA。在整個(gè)發(fā)育階段和在成年期，所有的酶普遍地在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，除了Nrk2，它的表達(dá)在所有經(jīng)檢查的組織中非常低(數(shù)據(jù)未顯示)。為了鑒定合成NAD的酶響應(yīng)于神經(jīng)元侵害的可誘導(dǎo)性，我們比較了在坐骨神經(jīng)橫斷之后1、3、7和14天的DRG中相對(duì)于在未損傷的DRG中的每種酶的RNA表達(dá)。如圖6A中所示，大多數(shù)的酶在損傷之后上調(diào)了2至8倍。在這些之中，Nrk2表達(dá)在軸突切斷術(shù)之后14天被異常高度地誘導(dǎo)(超過(guò)20倍)。我們還分析了在由位于培養(yǎng)的大鼠DRG神經(jīng)元中的神經(jīng)毒素所引起的軸突變性期間NAD合成相關(guān)酶的表達(dá)。用0.1μM和1μM魚(yú)藤酮處理DRG神經(jīng)元以引起軸突變性，并在添加魚(yú)藤酮之后24小時(shí)收集RNA。在魚(yú)藤酮處理之后，Nrk2的表達(dá)增加超過(guò)6倍(圖6B)。這些結(jié)果提示，盡管在NAD合成途徑中的所有酶活性是普遍存在的，但是Nrk2可能負(fù)責(zé)在神經(jīng)元侵害之后提供NAD合成底物。
實(shí)施例9該實(shí)施例舉例說(shuō)明了，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)Nmat酶均拯救軸突免于變性。
為了確定NMNAT1的核定位對(duì)于提供軸突保護(hù)是否是必需的，我們?cè)隗w外沃勒變性測(cè)定法中分析了NMNAT酶的亞細(xì)胞分布的影響，并比較了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核NMNAT的過(guò)表達(dá)之間的軸突保護(hù)的程度。NMNAT1在NMNAT1蛋白的211-217氨基酸中具有推定的核定位信號(hào)PGRKRKW。我們產(chǎn)生了標(biāo)示為cytNMNAT1的突變型NMNAT1，其中將該核定位信號(hào)改變?yōu)镻GAAAAW，并檢查了亞細(xì)胞分布。如圖7B中所示，大部分的cytNMNAT1位于胞質(zhì)溶膠中，和我們預(yù)期的一樣。
接著，我們確認(rèn)了cytNMNAT1的酶活性，NMNAT1和其突變體cytNMNAT1通過(guò)使用親和凝膠從表達(dá)任一種蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物中純化出來(lái)。如上所述測(cè)量經(jīng)親和純化的蛋白質(zhì)的酶活性，我們發(fā)現(xiàn)，cytNMNAT1的活性沒(méi)有因其的突變而改變(圖7C)。在DRG神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)cytNMNAT1之后，我們觀(guān)察到與細(xì)胞核野生型NMNAT1一樣的強(qiáng)神經(jīng)突保護(hù)(圖7A、E)。我們通過(guò)使用缺乏核定位信號(hào)的NMNAT1進(jìn)一步確認(rèn)了這一結(jié)果。在兩種NMNAT同工酶中，以前報(bào)道NMNAT3位于細(xì)胞核和線(xiàn)粒體之外，并具有與NMNAT1相當(dāng)?shù)拿富钚?。我們向NMNAT3的C-末端加入了人拓?fù)洚悩?gòu)酶I的核定位信號(hào)KPKKIKTED，從而產(chǎn)生細(xì)胞核NMNAT3。我們?cè)贖EK293T細(xì)胞中表達(dá)了具有六組氨酸標(biāo)簽的NMNAT3或nucNMNAT3，并分析了亞細(xì)胞定位及其酶活性。如以前報(bào)道的，NMNAT3分布在細(xì)胞核之外，包括明亮的點(diǎn)狀染色(punctuate staining)，和nucNMNAT3主要位于細(xì)胞核中，在胞質(zhì)溶膠中具有一些點(diǎn)狀染色(圖7B)。測(cè)量了NMNAT3和nucNMNAT3的酶活性，與NMNAT1相比，這兩種蛋白質(zhì)均具有與之相當(dāng)?shù)拿富钚?圖7C)。然后，在過(guò)表達(dá)這兩種NMNAT3酶之后進(jìn)行了體外沃勒變性測(cè)定法，我們發(fā)現(xiàn)，NMNAT3和nucNMNAT3的過(guò)表達(dá)均顯示出與NMNAT1同樣程度的神經(jīng)突變性的延遲(圖7A、E)。通過(guò)Western印跡法確認(rèn)了慢病毒介導(dǎo)的每種酶的表達(dá)(圖7D)。這些實(shí)驗(yàn)確證了，靶向細(xì)胞核或者胞質(zhì)溶膠的NMNAT都保護(hù)神經(jīng)突免于變性。
實(shí)施例10該實(shí)施例舉例說(shuō)明了，外源性地施加NAD生物合成相關(guān)酶的底物可保護(hù)軸突免于變性。
前面我們已經(jīng)顯示了，在培養(yǎng)基中外源性地施加的NAD顯示出體外軸突拯救效用。在此。我們顯示了，NmPRT的表達(dá)還顯示出軸突保護(hù)作用，這暗示了Nam用作神經(jīng)元中NAD合成的底物。為了確定圖5中所顯示的哪種底物用于神經(jīng)元中的NAD合成，和為了鑒定任何一種NAD前體是否可以能夠類(lèi)似于NAD或比NAD更好地拯救軸突，我們?cè)谂囵B(yǎng)基中施加了Na、Nam、NmR、NaMN、NMN或NaAD，并進(jìn)行了體外沃勒變性測(cè)定法。在神經(jīng)突橫斷之前施加1mMNMN 24小時(shí)成功地拯救神經(jīng)突免于變性。定量分析揭示出，NMN處理導(dǎo)致具有與通過(guò)外源性地施加NAD而獲得的神經(jīng)突保護(hù)程度類(lèi)似的程度的神經(jīng)突保護(hù)(圖8B)。這些結(jié)果進(jìn)一步暗示了這樣的可能性，即增加其他NAD生物合成底物的供應(yīng)能夠拯救神經(jīng)突免于變性。然后，我們向DRG神經(jīng)元外源性地施加1mM的NAD生物合成底物(包括Na、Nam、NaMN、NaAD和NmR)24小時(shí)，并進(jìn)行神經(jīng)突橫斷。如圖8A和B中所示，NaMN或NmR處理也和NAD一樣可拯救神經(jīng)突。NaAD顯示出輕微的保護(hù)，但Na不能拯救神經(jīng)突，而Na和Nam沒(méi)有作用。定量分析揭示出，在橫斷之后48小時(shí)外源性地施加1mM的NaMN、NMN、NmR或NAD引起相當(dāng)?shù)耐暾窠?jīng)突的增力(圖8B)。因?yàn)镹aMN的保護(hù)作用等同于NMN，所以在增加NaAD的供應(yīng)的情況下，通過(guò)QNS從NaAD合成NAD的步驟足以發(fā)揮拯救神經(jīng)突的作用。然而，與NAD相比，外源性地施加NaAD在48小時(shí)顯示出較少的完整神經(jīng)突的增加(圖8B)。這表明，在我們的測(cè)定條件下，NaAD沒(méi)有足量地?fù)饺爰?xì)胞中或者不穩(wěn)定。這些實(shí)驗(yàn)暗示，存在幾種不同的方式來(lái)拯救神經(jīng)突，包括外源性地施加NMN、NaMN、和NmR。所有這些處理似乎引起了NAD供應(yīng)的增加，這與表明NAD施加或NMNAT1過(guò)表達(dá)可拯救神經(jīng)突免于變性的先前實(shí)驗(yàn)一致。
實(shí)施例11該實(shí)施例證明，玻璃體內(nèi)施加NAD生物合成底物可延遲視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突變性。
視神經(jīng)的橫斷是能夠用于研究導(dǎo)致如下情況的機(jī)制的體內(nèi)模型在人類(lèi)疾病例如青光眼中觀(guān)察到的沃勒變性和隨后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)死亡。在C57BL/Wlds小鼠品系中，在軸突切斷術(shù)之后的沃勒變性期間的視神經(jīng)變性顯著放慢。另外，玻璃體內(nèi)注射用于篩選在體內(nèi)保護(hù)RGC軸突免于變性的化合物，因此，我們可以通過(guò)眼內(nèi)注射化合物(包括NAD、NMN、NmR和Nam)來(lái)評(píng)測(cè)每種NAD生物合成底物的體內(nèi)軸突保護(hù)作用。從體外沃勒變性測(cè)定法中，培養(yǎng)基中1mM的NAD、NMN和NmR足以保護(hù)軸突免于變性。我們開(kāi)始時(shí)向左側(cè)玻璃體內(nèi)區(qū)室中注射入5μl的100mM或1M NAD溶液。24小時(shí)溫育之后，橫斷左側(cè)視神經(jīng)，并在橫斷之后3、4和5天收集對(duì)照視神經(jīng)(右側(cè))和經(jīng)軸突切斷術(shù)的視神經(jīng)(左側(cè))。測(cè)量來(lái)自經(jīng)軸突切斷術(shù)的視神經(jīng)的神經(jīng)絲免疫反應(yīng)性，并將其對(duì)于從視神經(jīng)的右側(cè)獲得的值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。我們發(fā)現(xiàn)，在注射了1M和100mM NAD的大鼠中，在橫斷之后4天的免疫反應(yīng)性分別是未經(jīng)軸突切斷術(shù)的視神經(jīng)的77±27％和78±22％，而對(duì)照動(dòng)物只顯示7±16％(圖9)。
然后，我們向左側(cè)玻璃體內(nèi)區(qū)室中注射入5μl的100mM NMN、NmR和Nam，并在左側(cè)視神經(jīng)橫斷之后4天收集視神經(jīng)。從注射了NMN和NmR的視神經(jīng)中獲得的免疫反應(yīng)性是未經(jīng)軸突切斷術(shù)的神經(jīng)的60±25和72±19％。注射了Nam的動(dòng)物沒(méi)有顯示出任何與對(duì)照動(dòng)物的差異。這些結(jié)果與顯示了NAD、NMN和NmR具有軸突拯救活性但Nam沒(méi)有此活性的體外研究相一致。我們的體內(nèi)研究揭示了，這些參與NAD生物合成途徑的小分子是用于拯救軸突免于變性的有用工具。
特此引入在本申請(qǐng)中所引用的所有參考文獻(xiàn)作為參考。在此引用的參考文獻(xiàn)的任何討論只是想要概括其他作者所作的論斷，而不是承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)或其部分構(gòu)成了相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。申請(qǐng)人保留挑戰(zhàn)所引用的參考文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和相關(guān)性的權(quán)利。
權(quán)利要求
1.在有此需要的哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防神經(jīng)病變或軸突病變的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的通過(guò)增加患病和/或受損的神經(jīng)元和支持細(xì)胞中的sirtuin活性而起作用的藥劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑通過(guò)增加SIRT1的活性而起作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑是NAD、NADH、用于合成NAD的從新合成途徑的中間體、NAD補(bǔ)救途徑的中間體、煙酰胺核糖核苷激酶途徑的中間體或其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑是NAD、煙酰胺單核苷酸、煙酸單核苷酸或煙酰胺核糖核苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑包括用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶；編碼用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶的核酸；增加用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶表達(dá)的藥劑；或增加用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶的催化活性和/或穩(wěn)定性的藥劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述藥劑包括煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)或編碼NMNAT的核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述藥劑包括具有NMNAT活性并與人NMNAT1具有至少50％同一性或與人NMNAT3具有至少50％同一性的酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述藥劑與人NMNAT1具有至少70％同一性或與人NMNAT3具有至少70％同一性。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述藥劑選自人NMNAT1、人NMNAT3和其經(jīng)保守取代的變體。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述藥劑包括與編碼人NMNAT1的核酸具有至少50％同一性的核酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少50％同一性的核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述藥劑包括與編碼人NMNAT1的核酸具有至少70％同一性的核酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少70％同一性的核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述藥劑包括編碼人NMNAT1或人NMNAT3的核酸或其核酸變體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑包括sirtuin多肽或編碼sirtuin多肽的核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述藥劑包括具有SIRT活性并與人SIRT1具有至少50％同一性的酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述藥劑與人SIRT1具有至少70％同一性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述藥劑選自人SIRT1和其經(jīng)保守取代的變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述藥劑包括與編碼人SIRT1的核酸具有至少50％同一性的核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述藥劑包括與編碼人SIRT1的核酸具有至少70％同一性的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述藥劑包括編碼人SIRT1的核酸或其核酸變體。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑是氐、查兒酮、黃酮、異黃烷酮、黃烷酮或兒茶素。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述藥劑是選自白藜蘆醇、piceatannol、脫氧土大黃苷、反式氐和土大黃苷的氐；選自紫鉚因、isoliquiritigen和3，4，2′，4′，6′-五羥基查兒酮的查兒酮；選自黃顏木素、5，7，3′，4′，5′-五羥基黃酮、木犀草素、3，6，3′，4′-四羥基黃酮、櫟精、7，3′，4′，5′-四羥基黃酮、山奈黃素、6-羥基芹黃素、芹黃素、3，6，2′，4′-四羥基黃酮、7，4′-二羥基黃酮、7，8，3′，4′-四羥基黃酮、3，6，2′，3′-四羥基黃酮、4′-羥基黃酮、5，4′-二羥基黃酮、5，7-二羥基黃酮、桑色素、黃酮和5-羥基黃酮的黃酮；選自大豆黃素和染料木黃酮的異黃酮；選自柚苷配基、3，5，7，3′，4′-五羥基黃烷酮和黃烷酮的黃烷酮；或者選自(-)-表兒茶素、(-)-兒茶素、(-)-兒茶素、(-)-沒(méi)食子兒茶素、(+)-兒茶素和(+)-表兒茶素的兒茶素。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)病變或軸突病變是遺傳的或先天的，或者與神經(jīng)變性疾病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、腫瘤形成、內(nèi)分泌紊亂、代謝疾病、營(yíng)養(yǎng)缺乏、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫疾病、機(jī)械損傷、化學(xué)的或藥物誘導(dǎo)的損傷、熱損傷、輻射損傷、神經(jīng)壓迫、視網(wǎng)膜或視神經(jīng)病癥、線(xiàn)粒體功能障礙、進(jìn)行性癡呆、脫髓鞘病、局部缺血和/或中風(fēng)、傳染病或者炎性疾病有關(guān)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述神經(jīng)病變或軸突病變是由細(xì)胞毒性抗癌劑誘導(dǎo)的。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述視神經(jīng)病變是青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)變性、視神經(jīng)炎和/或變性、黃斑變性、局部缺血性視神經(jīng)病變、對(duì)視神經(jīng)的創(chuàng)傷性損傷、遺傳性視神經(jīng)病變、代謝性視神經(jīng)病變、由于毒性劑引起的神經(jīng)病變、或者由不良藥物反應(yīng)或維生素缺乏引起的神經(jīng)病變。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述與線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)的神經(jīng)病變是由于氧化損害、在線(xiàn)粒體基因組或核基因組中編碼的線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)的突變、暴露于毒素或者衰老的過(guò)程而造成的。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
27.在有此需要的哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防神經(jīng)病變或軸突病變的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的通過(guò)增加患病和/或受損的神經(jīng)元和/或支持細(xì)胞中的NAD活性而起作用的藥劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述藥劑是NAD、NADH、用于合成NAD的從新合成途徑的中間體、NAD補(bǔ)救途徑的中間體、煙酰胺核糖核苷激酶途徑的中間體或其組合。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述藥劑是NAD、煙酰胺單核苷酸、煙酸單核苷酸或煙酰胺核糖核苷。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述藥劑包括用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶；編碼用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶的核酸；增加用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶表達(dá)的藥劑；或增加用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶的催化活性和/或穩(wěn)定性的藥劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述藥劑包括煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)或編碼NMNAT的核酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述藥劑包括具有NMNAT活性并與人NMNAT1具有至少50％同一性或與人NMNAT3具有至少50％同一性的酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述藥劑與人NMNAT1具有至少70％同一性或與人NMNAT3具有至少70％同一性。
34.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述藥劑選自人NMNAT1、人NMNAT3和其經(jīng)保守取代的變體。
35.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述藥劑包括與編碼人NMNAT1的核酸具有至少50％同一性的核酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少50％同一性的核酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述藥劑包括與編碼人NMNAT1的核酸具有至少70％同一性的核酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少70％同一性的核酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述藥劑包括編碼人NMNAT1或人NMNAT3的核酸或其核酸變體。
38.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述神經(jīng)病變或軸突病變是遺傳的或先天的，或者與神經(jīng)變性疾病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、腫瘤形成、內(nèi)分泌紊亂、代謝疾病、營(yíng)養(yǎng)缺乏、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫疾病、機(jī)械損傷、化學(xué)的或藥物誘導(dǎo)的損傷、熱損傷、輻射損傷、神經(jīng)壓迫、視網(wǎng)膜或視神經(jīng)病癥、線(xiàn)粒體功能障礙、進(jìn)行性癡呆、脫髓鞘病、局部缺血和/或中風(fēng)、傳染病或者炎性疾病有關(guān)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述神經(jīng)病變或軸突病變是由細(xì)胞毒性抗癌劑誘導(dǎo)的。
40.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述視神經(jīng)病變是青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)變性、視神經(jīng)炎和/或變性、黃斑變性、局部缺血性視神經(jīng)病變、對(duì)視神經(jīng)的創(chuàng)傷性損傷、遺傳性視神經(jīng)病變、代謝性視神經(jīng)病變、由于毒性劑引起的神經(jīng)病變、或者由不良藥物反應(yīng)或維生素缺乏引起的神經(jīng)病變。
41.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述與線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)的神經(jīng)病變是由于氧化損害、在線(xiàn)粒體基因組或核基因組中編碼的線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)的突變、暴露于毒素或者衰老的過(guò)程而造成的。
42.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
43.篩選用于在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)病變的藥劑的方法，所述方法包括在體外或體內(nèi)向哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞施用候選藥劑；給所述神經(jīng)元細(xì)胞造成軸突損傷；和檢測(cè)在受損的神經(jīng)元細(xì)胞中軸突變性的減少。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中給所述神經(jīng)元細(xì)胞造成軸突損傷包括化學(xué)損傷神經(jīng)元細(xì)胞、熱損傷神經(jīng)元細(xì)胞、使神經(jīng)元細(xì)胞缺氧、物理?yè)p傷神經(jīng)元細(xì)胞、抑制能量代謝或其組合。
45.篩選用于在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)病變的藥劑的方法，所述方法包括檢測(cè)細(xì)胞中由候選藥劑引起的NAD活性的增加。
46.篩選增加神經(jīng)元中的sirtuin活性的藥劑的方法，所述方法包括在體外或體內(nèi)向哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞施用候選藥劑；給所述神經(jīng)元細(xì)胞造成軸突損傷；和檢測(cè)在受損的神經(jīng)元細(xì)胞中軸突變性的減少。
47.篩選增加神經(jīng)元中的NAD活性的藥劑的方法，所述方法包括在體外或體內(nèi)向哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞施用候選藥劑；給所述神經(jīng)元細(xì)胞造成軸突損傷；和檢測(cè)在受損的神經(jīng)元細(xì)胞中軸突變性的減少。
48.重組載體，其包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子有效連接至與編碼人NMNAT1的核酸具有至少50％同一性的多核苷酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少50％同一性的多核苷酸。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的重組載體，其包含與編碼人NMNAT1的核酸具有至少70％同一性的多核苷酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少70％同一性的多核苷酸。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的重組載體，其包含編碼人NMNAT1或人NMNAT3的多核苷酸或者其多核苷酸變體。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的重組載體，其包含慢病毒或腺伴隨病毒。
52.重組載體，其包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子有效連接至與編碼人SIRT1的核酸具有至少50％同一性的多核苷酸。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的重組載體，其包含與編碼人SIRT1的核酸具有至少70％同一性的多核苷酸。
54.根據(jù)權(quán)利要求54的重組載體，其包含編碼人SIRT1的多核苷酸或其多核苷酸變體。
55.根據(jù)權(quán)利要求52的重組載體，其包含慢病毒或腺伴隨病毒。
56.在有此需要的哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防視神經(jīng)病變的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的通過(guò)增加患病和/或受損的神經(jīng)元中的NAD活性而起作用的藥劑。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中向哺乳動(dòng)物的施用包括眼內(nèi)施用。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中眼內(nèi)施用包括持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)的眼內(nèi)施用。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中眼內(nèi)施用包括玻璃體內(nèi)注射、通過(guò)滴眼液的施用或通過(guò)透鞏膜遞送的施用。
60.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述藥劑是NAD、NADH、用于合成NAD的從新合成途徑的中間體、NAD補(bǔ)救途徑的中間體、煙酰胺核糖核苷激酶途徑的中間體或其組合。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述藥劑是NAD、煙酰胺單核苷酸、煙酸單核苷酸或煙酰胺核糖核苷。
62.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述藥劑包括用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶；編碼用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶的核酸；增加用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶表達(dá)的藥劑；或增加用于合成NAD的從新合成途徑的酶、NAD補(bǔ)救途徑的酶或煙酰胺核糖核苷激酶途徑的酶的催化活性和/或穩(wěn)定性的藥劑。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述藥劑包括煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)或編碼NMNAT的核酸。
64.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述藥劑包括與編碼人NMNAT1的核酸具有至少50％同一性的核酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少50％同一性的核酸。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述藥劑包括與編碼人NMNAT1的核酸具有至少70％同一性的核酸或與編碼人NMNAT3的核酸具有至少70％同一性的核酸。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述藥劑包括編碼人NMNAT1或人NMNAT3的核酸或其核酸變體。
67.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述視神經(jīng)病變是青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)變性、視神經(jīng)炎和/或變性、黃斑變性、局部缺血性視神經(jīng)病變、對(duì)視神經(jīng)的創(chuàng)傷性損傷、遺傳性視神經(jīng)病變、代謝性視神經(jīng)病變、由于毒性劑引起的神經(jīng)病變、或者由不良藥物反應(yīng)或維生素缺乏引起的神經(jīng)病變。
68.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了在哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防在神經(jīng)病變性疾病中的軸突降解的方法。所述方法可包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的通過(guò)增加患病和/或受損的神經(jīng)元中的sirtuin活性而發(fā)揮作用的藥劑。所述方法還可包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的通過(guò)增加患病和/或受損的神經(jīng)元中的NAD活性而發(fā)揮作用的藥劑。本發(fā)明還公開(kāi)了篩選用于治療神經(jīng)病變的藥劑的方法以及用于治療或預(yù)防神經(jīng)病變的重組載體。
文檔編號(hào)C07H19/22GK1964627SQ200580018114
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月4日
發(fā)明者J·米爾布蘭特, 荒木敏之, 佐佐木洋 申請(qǐng)人:華盛頓大學(xué)