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用于檢測與嚴重的急性呼吸綜合征(sars)相關的冠狀病毒的肽及其混合物的制作方法

文檔序號:3555732閱讀:380來源:國知局
專利名稱:用于檢測與嚴重的急性呼吸綜合征(sars)相關的冠狀病毒的肽及其混合物的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及有效用于檢測人和動物的與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)感染的新肽及其混合物。
背景技術
SARS,一種未知病原學的非典型肺炎,在2003年2月末被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)認可。在2003年4月,世界范圍內(nèi)的科學家證實了以前未被認識的冠狀病毒(SARS-CoV)可能是SARS的起因(Drosten et al.,2003;Ksiazek et al,2003;Peiris et al,2003)。
迄今為止,已開發(fā)的對于SARS-CoV的血清學診斷測試極少(Drostenet al.,2003;Ksiazek et al,2003;Peiris et al,2003)。首選引入的是間接免疫熒光測定(IFA)(Drosten et al.,2003;Ksiazek et al,2003;Peiris et al,2003),緊隨其后的是ELISA(Ksiazek et al,2003;Peiris et al,2003)。所述IFAs都基于SARS-感染細胞的固定,隨后的人抗-SARS抗體的結(jié)合和用熒光抗-人抗體對它們進行的標記。開始的ELISA基于使用全病毒裂解物(WVL),即從組織培養(yǎng)物中富集的病毒的制備物。然而,如已在其它病毒中經(jīng)歷過的,全病毒裂解物純度的缺乏通常導致測定中的更高背景水平,因為直接針對全病毒裂解物的污染物的抗體也將被捕獲。這種純度的缺乏減少了測定的敏感性并將檢測不到許多顯示低抗-SARS-CoV抗體水平的患者。因為相同的原因,這些全病毒裂解物分析的特異性也是不能接受得低。將具有高抗體水平的患者檢測為SARS-陽性病例,所述抗體直接針對全病毒裂解物制備物的污染物。事實上,由于現(xiàn)存文獻的首先應用,大量公開物已經(jīng)報道了合成肽和重組蛋白質(zhì)對于抗-SARS-CoV抗體的特異性檢測的有效性(Ho et al.,2004;;Wang et al,2003;Wu et al.,2004)。
因此,存在對于開發(fā)診斷SARS-CoV感染的更敏感和更特異的測試的明確需要。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于開發(fā)SARS-CoV診斷方法和試劑盒的特異性SARS-CoV肽及其混合物。
更精確地,本發(fā)明的一個目標是提供一種分離的肽及其類似物,所述肽包括選自由SEQ ID NOS1-4,6-16,18-22,24-33,35-41,43-62,64-73,75-77,79-81,83-100,102-105,107-113,115-118,120-127和129-140組成的組中的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個目標是提供具有式a--X--c--Z--b的分離的肽及其類似物,其中X和Z具有的氨基酸序列與獨立地選自由下列組成的組中的氨基酸序列具有85%同一性SEQ ID NOS1-4,6-16,18-22,24-33,35-41,43-62,64-73,75-77,79-81,83-100,102-105,107-113,115-118,120-127和129-140,并且其中a是有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的氨基端,1-8個氨基酸或取代物;b是有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的羧基端,1-8個氨基酸或取代物;和c是有效促進串聯(lián)排列的兩個肽的偶聯(lián)或提高串聯(lián)的肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的一個或兩個氨基酸或取代物的接頭。
本發(fā)明的另一個目標涉及包括如上所述的至少兩種肽或其類似物的混合物。
另一個目標涉及特異性結(jié)合于本發(fā)明的肽或其類似物的抗體或特異性結(jié)合于肽的抗體的混合物或特異性結(jié)合于如上所述的肽的混合物的抗體的混合物。
本發(fā)明的另一個目標是提供檢測指示SARS-CoV的抗體的存在或缺乏的體外診斷方法,所述抗體結(jié)合于按照本發(fā)明的肽或其類似物以形成免疫復合物,所述方法包括如下步驟a)使按照本發(fā)明的肽或其類似物與生物樣品接觸一段時間并在足夠形成免疫復合物的條件下;和b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或缺乏。
本發(fā)明的另一個目標是提供一種用于檢測指示SARS-CoV的抗體的存在或缺乏的診斷試劑盒,所述試劑盒包括-按照本發(fā)明的肽或其類似物;和-檢測肽-抗體免疫復合物的試劑;其中所述肽或其類似物和試劑以足夠進行所述檢測的量存在。
本發(fā)明的另一個目標是提供檢測指示SARS-CoV的肽或蛋白質(zhì)的存在或缺乏的體外診斷方法,所述肽或蛋白質(zhì)結(jié)合于按照本發(fā)明的抗體以形成免疫復合物,所述方法包括如下步驟a)使按照本發(fā)明的抗體與生物樣品接觸一段時間并在足夠形成免疫復合物的條件下;和b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或缺乏。
本發(fā)明的另一個目標是提供一種用于檢測指示SARS-CoV的肽或蛋白質(zhì)的存在或缺乏的診斷試劑盒,所述試劑盒包括-按照本發(fā)明的抗體;和-檢測肽-抗體免疫復合物的試劑;其中所述抗體和試劑以足夠進行所述檢測的量存在。
本發(fā)明的肽及其混合物對于篩選SARS-CoV感染的血液和體液是有用的。例如,本文描述的肽及其混合物在用于檢測針對SARS-CoV的抗體的廣泛多種的特異性結(jié)合測定以及作為用于激發(fā)檢測SARS-CoV抗原的抗體的免疫原是有用的。
附圖簡述

圖1描述基于由BCCA基因組科學中心(BCCA Genome SciencesCenter)在2003年4月13日提供的序列(Protein ID NP_828858.1;422AA)的推定SARS-CoV的核殼體(N)蛋白質(zhì)的Kyle-Doolittle分析(親水性圖)和Jameson-Wolf(抗原指數(shù))和Emini(表面或然率)圖譜。
圖2顯示本發(fā)明預期的肽的氨基酸序列,并將其鑒定為SEQ ID NOS1-140。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供對應于SARS-CoV的推定的刺突(S),核殼體(N)和基質(zhì)(M)基因產(chǎn)物的免疫顯性區(qū)域的新肽及其類似物。本發(fā)明還提供這些肽和類似物的混合物和化學組合(串聯(lián)排列)。如將在下面的描述中所解釋的,這些肽、類似物、混合物和串聯(lián)排列在關于SARS-CoV及由其造成的感染的廣泛多種的診斷方法和試劑盒中是有用的。
本發(fā)明的肽優(yōu)選地在對SARS-CoV蛋白質(zhì)分析的基礎上進行選擇,如圖1所示以預測親水圖(Kyle-Doolittle),表面或然率圖(Emini)和抗原指數(shù)(Jameson-Wolf)的3個公式進行所述分析。對于這三個參數(shù)顯示陽性指數(shù)的氨基酸的區(qū)域具有作為免疫原并隨后形成可用于檢測抗-SARS-CoV抗體的線性表位的良好或然率。分析下列SARS-CoV蛋白質(zhì)S(刺突;NP_828851.1),N(核殼體;NP_828858.1),M(基質(zhì);NP_828855.1),E(小包膜;NP_828854.1),NSP1(非結(jié)構蛋白1;NP_828862.1)NSP2(NP_828863.1),NSP3(NP_828864.1),NSP4(NP_828865.1),NSP5(NP_828866.1),NSP6(NP_828867.1),NSP7(NP_828868.1),NSP9(NP_828869.1),NSP10(NP_828870.1),NSP11(NP_828871.1),NSP12(NP_828872.1)和NSP13(NP_828873.2)。
如上面提出,選擇在圖2中顯示的肽以進行另外的實驗。Seq ID no3的位置19,Seq ID no6的位置133,Seq ID no9的位置348,Seq ID no10的位置419,Seq ID no18的位置1064,Seq ID no26的位置158,Seq IDno38的位置119和128,Seq ID no43的位置550,Seq ID no57的位置2010,Seq ID no59的位置2178,Seq ID no61的位置2390和2391,SeqID no65的位置113,Seq ID no70的位置72,Seq ID no75的位置142,Seq ID no80的位置73,Seq ID no84的位置79和91,Seq ID no86的位置53和54,Seq ID no91的位置281,Seq ID no97的位置645和646,Seq ID no102的位置72和84,Seq ID no109的位置471,Seq ID no111的位置556,Seq ID no116的位置356,Seq ID no117的位置382和387,Seq ID no119的位置452,Seq ID no120的位置484,Seq ID no125的位置116,Seq ID no131的位置333和Seq ID no132的位置25的半胱氨酸殘基由絲氨酸殘基取代。關于Seq ID no039,84,103和118,起始的半胱氨酸殘基是保守的從而形成二硫鍵。
本發(fā)明的肽按照第一個目標,本發(fā)明涉及分離的肽及其類似物,所述肽包括選自由下列組成的組中的氨基酸序列SEQ ID NOS1-4,6-16,18-22,24-33,35-41,43-62,64-73,75-77,79-81,83-100,102-105,107-113,115-118,120-127和129-140。
按照另一個目標,本發(fā)明涉及串聯(lián)排列的肽。確實,本發(fā)明涉及具有式a--X--c--Z-b的分離的肽及其類似物,其中X和Z具有獨立地選自由下列組成的組中的氨基酸序列SEQ ID NOS1-4,6-16,18-22,24-33,35-41,43-62,64-73,75-77,79-81,83-100,102-105,107-113,115-118,120-127和129-140,并且其中a是有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的氨基端,1-8個氨基酸或取代物;b是有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的羧基端,1-8個氨基酸或取代物;和c是有效促進串聯(lián)排列的兩個肽的偶聯(lián)或提高串聯(lián)的肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的一個或兩個氨基酸或取代物的接頭。
按照本發(fā)明的另一個目標,本發(fā)明還意欲提供包括如上限定的至少兩個肽或其類似物的混合物。
優(yōu)選地,氨基酸序列選自由SEQ ID NOS3,19,22,28,31,37,136,137,138,139和140及其類似物組成的氨基酸序列的組中。最優(yōu)選地,氨基酸序列由SEQ ID NO3,19,22,28,31,37,136,137,138,139或140或其類似物的任一組成。
用于本文時,“類似物”指與如上限定的肽的氨基酸序列的全長有至少85%的同一性的氨基酸序列。更具體地,術語“類似物”表示在肽鏈中,在其由天然存在的SARS-CoV氨基酸序列的區(qū)段(block)組成的部分中,在一個或多個位點的氨基酸插入、缺失、取代和修飾。
本發(fā)明的肽的天然氨基酸序列的優(yōu)選修飾和取代是保守的那些(即,對肽的二級結(jié)構和親水性質(zhì)具有最小影響的那些)。這些包括取代諸如由Dayhoff在Atlas of Protein Sequence and Structure5,1978中和Argos在EMBO J,8,779-785,1989中所描述的那些。例如,屬于下組之一的氨基酸代表保守性變化丙氨酸,脯氨酸,甘氨酸,谷氨酸,天冬氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,絲氨酸,蘇氨酸;半胱氨酸,絲氨酸,酪氨酸,蘇氨酸;纈氨酸,異亮氨酸,亮氨酸,甲硫氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸;賴氨酸,精氨酸,組氨酸;和苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,組氨酸。
以相同的方式,一種易于氧化的氨基酸,甲硫氨酸(Met)可在本發(fā)明的肽中被正亮氨酸所取代。優(yōu)選的取代還包括D-同分異構體對相應的L-氨基酸的取代。
除了當指SARS-CoV的基因產(chǎn)物的天然氨基酸序列時,用于本說明書(例如,在a和b及類似物的定義中)的術語“氨基酸”包括所有的天然氨基酸,以它們的D-構型存在的那些氨基酸,和已知的非天然、合成性和修飾的氨基酸,諸如高半胱氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸和β-纈氨酸。
如上簡短提出的,修飾本發(fā)明的肽從而使被選擇的肽更有效用作免疫診斷試劑通常是有用并無疑在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些變化,例如包括--添加半胱氨酸殘基到一個或兩個末端從而用異雙官能交聯(lián)劑,諸如磺基琥珀酰亞胺基-4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯促進肽偶聯(lián)到合適的載體中。影響這些連接的優(yōu)選的試劑是磺基琥珀酰亞胺基-磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯和N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯;--將1-8個另外的氨基酸添加在肽的一個或兩個末端從而促進肽的彼此連接,用于將其偶聯(lián)到支持物或更大的肽或蛋白質(zhì)或用于修飾肽的物理或化學特性。這些變化的實例是N-或C-末端的酪氨酸的添加,通過酯化反應作為接頭的谷氨酸或天冬氨酸的添加和可通過席夫堿或酰胺形成被連接的賴氨酸的添加。如上所述,這些另外的氨基酸可包括任何天然氨基酸,以它們的D-構型存在的那些氨基酸和已知的非天然、合成性以及修飾的氨基酸;和--通過,例如?;蝓0坊瘜﹄牡囊粋€或兩個末端的衍生作用。這些修飾導致在肽上的凈電荷的變化并還可促進肽對支持基質(zhì)、載體或另外的肽的共價連接。有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進附著于支持基質(zhì)的取代物的實例是C2-C16?;鶊F,聚乙二醇,磷脂,人血清白蛋白(HSA)和聚賴氨酸(PLL)。
如上所反映,應用串聯(lián)排列的肽在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些肽可以是均聚物或共聚物。本發(fā)明的肽和串聯(lián)排列的肽的物理混合物也在其范圍內(nèi)。
為了制備本發(fā)明的新肽,可以使用任何常規(guī)的肽制備方法。這些包括合成、重組DNA技術及其組合。按照本發(fā)明,優(yōu)選固相合成。在該合成方法中,樹脂支持物可以是常規(guī)用在本領域中進行固相制備肽的任何合適的樹脂。優(yōu)選地,其是對-芐氧基-醇聚苯乙烯或?qū)?methylbenzyhydrylamine樹脂。將第一被保護氨基酸與樹脂支持物偶聯(lián)后,通過常規(guī)應用在本領域的方法來去除氨基保護基。在去除氨基保護基后,使剩余的被保護氨基酸和如果必要,側(cè)鏈被保護的氨基酸以所需的次序順序地進行偶聯(lián)以獲得被選擇的肽?;蛘?,使用在與樹脂支持的氨基酸序列偶聯(lián)之前的溶液方法(solution methodology)可以偶聯(lián)多個氨基酸基團。
合適的偶聯(lián)試劑的選擇按照已建立的技術。例如,合適的偶聯(lián)試劑是單獨地或優(yōu)選地在1-羥基苯并三唑存在下的N,N′-二異丙基碳二亞胺或N,N′-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)或優(yōu)選地,苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟-磷酸酯。另一個有用的偶聯(lián)方法應用被保護的氨基酸的預形成的對稱酐。
對于被引到延伸的多肽鏈上的每個氨基酸所應用的必需的α-氨基保護基優(yōu)選9-芴基甲基氧基羰基(FMOC),盡管可使用任何其它合適的保護基,只要其在偶聯(lián)條件下不降解并在已經(jīng)存在于延伸的肽鏈中的任何其它保護基存在時可容易地和選擇性地去除。
選擇側(cè)鏈氨基酸的保護基的標準是(a)在合成的每個步驟,在選擇用于去除α-氨基保護基的反應條件下,保護基對于各種試劑的穩(wěn)定性;(b)保護基的關鍵性質(zhì)的保持(即,在偶聯(lián)條件下沒有被分離)和(c)保護基在肽合成結(jié)束后并在沒有另外影響肽結(jié)構的條件下容易地可去除性。
在合適的清除劑諸如茴香醚、苯硫基甲烷、乙基甲基硫醚、1,2-乙二硫醇和相關試劑存在時,以50%-60%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液于室溫作用1-6小時將充分保護的樹脂支持的肽優(yōu)選地從對-芐氧基醇樹脂上裂解下來。同時,將大多數(shù)酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護基去除。典型地,通過HF處理將更多的酸抗性保護基去除。
使用的方法本發(fā)明的肽作為按照本領域眾所周知的方法檢測和量化SARS-CoV相關抗體的診斷試劑是有用的。這些方法包括ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、熒光測定、化學發(fā)光測定、放射性免疫測定血細胞凝集、比濁測定法、免疫層析法(快速檢驗),單斑點和多斑點測定方法。還可以使用諸如肽或蛋白質(zhì)微陣列或使用基于壓電現(xiàn)象的生物傳感器標記、表面等離振子共振(SPR)或懸臂法的新方法。
使用本發(fā)明的肽或肽的混合物確定針對SARS-CoV的抗體的優(yōu)選的便利和經(jīng)典技術是酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。在該測定中,例如,本發(fā)明的肽或混合物吸附于,或共價偶聯(lián)到微量滴定板的孔中。然后用待測定的血清或生物體液(fluid)處理所述孔。洗滌后,將用過氧化物酶標記的抗-人IgG或抗-人IgM或抗-人IgA加入孔中。用相應的底物,例如,3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺來進行過氧化物酶的確定。
在不背離該說明性的測定的有用性的前提下,過氧化物酶可被另一種標記,例如放射性、熒光、化學發(fā)光或紅外線發(fā)射標記所替代。
用本發(fā)明的肽和混合物確定在測試樣品或血清中針對SARS-CoV的抗體的存在的另一種方法是按照所謂的“雙-抗原-夾層法-測定”的酶免疫學測定。此方法基于如Immunological Methods,20,25-34,1978中所述Maiolini的工作。按照此方法,利用配體的偶聯(lián)諸如生物素-抗生物素蛋白、His6-Ni-NTA、FITC-抗-FITC或其它,使待測定的血清或其它分析物與已經(jīng)涂布本發(fā)明的肽的固相(捕獲層)以及與已被過氧化物酶或其它信號標記的本發(fā)明的肽(檢測層)接觸。
可以一個或兩個步驟來進行免疫反應。如果免疫反應以兩個步驟來進行,那么洗滌步驟典型地在兩次溫育之間進行。免疫反應或反應后,也通常進行洗滌步驟。其后,例如,使用過氧化物酶的鄰苯二胺確定過氧化物酶或其它信號。還可將包括那些已描述的其它的酶和色原用在本測定中。
應用在上述測定和測定方法中的合適的支持基質(zhì)或固相包括,但不限于,有機和無機聚合物,例如淀粉酶、葡聚糖、天然或改性的纖維素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、磁鐵礦、多孔玻璃粉末、聚乙烯雙烯氟化物(kynar)和膠乳、測試容器(即玻璃或人工材料的測試試管、滴定板或比色杯)的內(nèi)壁以及固體(即,玻璃和人工材料的棒條,具有末端增厚的棒條,具有末端裂片(lobes)或薄片(lamellae)的棒條)的表面。玻璃和人工材料的球體特別適合作為固相的載體。
本發(fā)明的肽及其混合物不僅在確定和量化針對SARS-CoV的抗體中是有用的。它們還在確定和量化SARS-CoV抗原本身中是有用的,因為游離、聚合或綴合于合適的載體的本發(fā)明的肽,在激發(fā)抗體,特別和優(yōu)選地激發(fā)在免疫學上與SARS-CoV的抗原具有交叉反應性的單克隆抗體是有用的。例如,可通過用足夠量的肽注射哺乳動物或禽類動物從而激發(fā)所需的免疫應答并從所述動物的血清中回收所述抗體來制備這些抗體。因此,本發(fā)明的另一個目標是提供特異性結(jié)合于按照本發(fā)明的肽或其類似物,或肽的混合物的抗體。
關于本發(fā)明的抗體,術語“特異性結(jié)合于”指以相對高的親和性結(jié)合于一個或多個目標蛋白的表位,諸如本發(fā)明的肽,而基本不識別和結(jié)合除目標之外的分子的抗體。用于本文時,術語“相對高的親和性”意為抗體和目標肽或蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和性為至少106M-1,優(yōu)選地至少約107M- 1和甚至更優(yōu)選地108M-1-1010M-1。對這些親和性的確定優(yōu)選地在作為本領域技術人員公知常識的標準競爭性結(jié)合免疫測定條件下進行。
激發(fā)抗體的合適的宿主動物包括,例如,兔、馬、山羊、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、綿羊和母雞。優(yōu)選地,使用本發(fā)明的肽和常規(guī)技術來制備產(chǎn)生所需單克隆抗體的雜交瘤。
例如,可使用眾所周知的產(chǎn)生單克隆抗體的Kohler和Milstein技術。為了辨別針對相同抗原,但針對不同表位的單克隆抗體,可使用Stahli et al.的方法(J.of Immunological Methods,32,297-304,1980)。
使用上述抗體,可將公知的各種方法用在確定或量化SARS-CoV或其部分中。在一種這樣的方法中,將已知量的待檢驗的血清樣品或任何其它生物體液,本發(fā)明的放射性標記的肽或混合物和本發(fā)明的未標記的肽或混合物混和在一起,加入給定量的本發(fā)明的肽的抗體,優(yōu)選單克隆抗體,并使所述混合物靜止。然后,通過本領域已知方法諸如用硫酸銨、聚乙二醇、過量或結(jié)合于不溶支持物的二抗,或葡聚糖包被的炭進行處理從未結(jié)合的試劑中分離得到的抗體/抗原復合物。
然后,以結(jié)合或未結(jié)合的相來確定標記的肽的濃度并通過以本身已知的方式比較標記成分的水平和標準曲線來確定樣品的SARS-CoV抗原含量。
另一種將這些抗體使用在測定中的合適方法是“雙-抗體-夾層法-測定”。按照此測定,用兩種不同的抗體,對待測樣品進行處理,所述抗體例如,通過用本發(fā)明的肽或其混合物或組合免疫不同的動物,例如山羊和兔來激發(fā)(raise)。所述抗體之一被標記而另一個被涂布于固相上。優(yōu)選的固相是塑料珠,并且優(yōu)選的標記是辣根過氧化物酶。
典型地,在“雙-抗體-夾層法-測定”中,將所述樣品與固相抗體和標記的抗體一起溫育。然而,還可能的是使樣品首先與固相抗體接觸,然后在任選地洗滌后使所述樣品與標記的抗體接觸。然而,優(yōu)選地,將樣品與固相和標記的抗體一起進行處理。免疫反應后,洗滌所述混合物并按照本領域已知的方法來測定標記。在過氧化酶被用作標記的情形中,可使用例如具有鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺的底物來進行測定。被標記的組分的量與存在于分析物或血清樣品中的抗原的量成比例。
因此,在另一個目標中,本發(fā)明因而提供了檢測指示SARS-CoV的抗體的存在或缺乏的體外診斷方法,所述抗體與按照本發(fā)明的肽或其類似物結(jié)合從而形成免疫復合物,所述方法包括如下步驟a)使按照本發(fā)明的肽或其類似物與生物樣品接觸一段時間并在足以形成免疫復合物的條件下;和b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或缺乏。
本發(fā)明還在另一個目標中提供了檢測指示SARS-CoV的肽或蛋白質(zhì)的存在或缺乏的體外診斷方法,所述肽或蛋白質(zhì)與按照本發(fā)明的抗體結(jié)合從而形成免疫復合物,所述方法包括如下步驟a)使按照本發(fā)明的抗體與生物樣品接觸一段時間并在足以形成免疫復合物的條件下;和
b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或缺乏。
“生物樣品”包括從個體(動物或人)中獲得的各種樣品類型,并可將其用在本發(fā)明的診斷方法中。所述定義包括生物起源的血液和其它液體樣品、固體組織樣品諸如來自那里的活組織檢查樣品或組織培養(yǎng)物或細胞,及其后代。
所述定義還包括在獲得后以任何方式諸如用試劑處理、溶解、或富集某些成分諸如蛋白質(zhì)或多肽,進行處理的樣品。術語“生物樣品”包括臨床樣品,并還包括培養(yǎng)的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物體液和組織樣品。
如上所述,還可在合適的檢驗試劑盒中進行測定和量化SARS-CoV抗原或針對該病毒的抗體的方法和測定,所述試劑盒的特征在于本發(fā)明的肽或混合物,或由那些肽和混合物激發(fā)的針對SARS-CoV的抗體。這些試劑盒典型地包括兩個或更多進行診斷測定所必需的組分。組分可以是化合物、試劑、容器和/或裝置。例如,在試劑盒中的一個容器可包含特異性結(jié)合于本發(fā)明的肽的單克隆抗體或其片段。這些抗體或片段可被提供連接于本領域技術人員已知的支持材料。一個或多個另外的容器可裝入將在測定中使用的元素,諸如試劑或緩沖劑。
關于這一點,在另一個目標中,本發(fā)明提供檢測指示SARS-CoV的抗體的存在或缺乏的診斷試劑盒,所述試劑盒包括-按照本發(fā)明的肽或其類似物和-檢測肽-抗體免疫復合物的試劑,其中所述肽或其類似物以及試劑以足夠進行所述檢測的量存在。
在一個優(yōu)選的實施方案中,所述試劑盒還包括缺乏與所述肽免疫性結(jié)合的抗體的生物參比樣品以及包括可特異性結(jié)合于所述肽或其類似物的抗體的比較樣品,其中所述生物參比樣品和比較樣品以足夠進行所述檢測的量存在。
在另一個目標中,提供檢測指示SARS-CoV的肽或蛋白質(zhì)的存在或缺乏的診斷試劑盒,所述試劑盒包括-按照本發(fā)明的抗體和-檢測肽-抗體免疫復合物的試劑;
其中所述抗體和試劑以足夠進行所述檢測的量存在。
在一個優(yōu)選的實施方案中,所述試劑盒還包括缺乏與所述抗體免疫性結(jié)合的肽的生物參比樣品以及包括可特異性結(jié)合于所述抗體的肽的比較樣品,其中所述生物參比樣品和比較樣品以足夠進行所述檢測的量存在。
在下面提供本發(fā)明肽的合成和利用的優(yōu)選的方案。
方案1制備攜帶N-FMOC保護的氨基酸殘基的樹脂將所需的在二氯甲烷(CH2Cl2)和二甲基甲酰胺(DMF)的混合物(4∶1)中的N-FMOC保護的氨基酸殘基于0℃加入對-芐氧基醇樹脂在CH2Cl2∶DMF(4∶1)的混懸液中。將所述混合物手動攪拌數(shù)秒,然后用N,N′-二環(huán)己基-碳二亞胺(DCC)進行處理,隨后用催化量的4-(二甲基氨基)吡啶進行處理。將所述混合物于0℃再攪拌30分鐘,然后于室溫攪拌過夜。將過濾的樹脂用CH2Cl2、DMF和異丙醇(每個洗滌3次),最后用CH2Cl2連續(xù)洗滌。將樹脂懸浮于CH2Cl2,并在冰浴中冷卻,然后將重蒸餾的吡啶加入攪拌的混懸液中,隨后加入苯甲酰氯。攪拌于0℃持續(xù)30分鐘然后于室溫持續(xù)60分鐘。過濾后,在于高真空下被干燥到恒重之前,用CH2Cl2、DMF和異丙醇(每個洗滌3次),最后用石油醚(兩次)對樹脂進行連續(xù)洗滌。按照Meienhofer et al.(Int.J.Peptide Protein Res.,13,35,1979)對取代進行的分光光度測定說明在樹脂上的取代程度。
方案2后來的氨基酸的偶聯(lián)將攜帶N-FMOC保護的第一氨基酸殘基的樹脂置于Biosearch 9600肽合成儀的反應容器中并如下處理1)用DMF洗滌(4次,每次20秒)2)用30%的哌啶的DMF溶液預洗(3分鐘)3)用30%的哌啶的DMF溶液去保護(7分鐘)4)用DMF洗滌(8次,每次20秒)5)檢驗游離氨基基團--Kaiser檢驗(必須是陽性的)
6)然后將肽樹脂與都溶解于包含16當量的4-甲基嗎啉的無水重蒸餾的DMF中的8當量的所需FMOC-保護的氨基酸和1-羥基苯并三唑和苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基-氨基)磷鎓六氟磷酸酯一起輕輕搖動1或2小時。
7)用DMF洗滌(6次,每次20秒)步驟7后,取出等分試樣進行水合茚三酮試驗。如果所述試驗是陰性的,從步驟1開始重復所述方案以偶聯(lián)下一個氨基酸。如果所述試驗是陽性或弱陽性,重復步驟6和7。
可將上述方案用于偶聯(lián)本發(fā)明描述的肽的每個氨基酸。還可在整個合成中將用FMOC進行的N-保護與任何余下的氨基酸一起使用。
可通過使用上述偶聯(lián)方案結(jié)合氚化的氨基酸來制備放射性標記的肽。
添加最后一個氨基酸后,通過返回上述方案的步驟1-7來去除N-末端殘基的N-FMOC。用CH2Cl2洗滌所述的肽樹脂并在真空中干燥從而得到粗的被保護的肽。
方案3去保護并將肽從樹脂上裂解下來將被保護的肽-樹脂懸浮于包含2.5%的乙二硫醇和2.5%茴香醚的55%的三氟乙酸(TFA)的CH2Cl2溶液。用N2沖洗所述混合物并于室溫攪拌1.5小時。過濾所述混合物并將所述樹脂用CH2Cl2洗滌。于室溫用20%的在CH2Cl2中的TFA再次處理所述樹脂5分鐘。過濾所述混合物并用20%的在CH2Cl2中的TFA洗滌所述樹脂,然后用CH2Cl2洗滌它。低于35℃下,將合并的過濾物在真空下蒸發(fā)并用無水二甲醚洗滌殘余物數(shù)次。將所述固體溶解在10%的乙酸水溶液中并將其凍干以得到粗產(chǎn)物。
通過在茴香醚和二甲硫存在時于0℃以HF處理1小時,將包含精氨酸和半胱氨酸殘基的肽進一步去保護。用10%的乙酸水溶液抽提所述肽,用二甲醚洗滌并將其凍干以得到粗肽。
方案4肽的純化通過在以梯度的移動相填充的C18或C4反相的Vydac柱(2.5×25mm)上的制備HPLC來純化粗肽。在220nm處監(jiān)測流出液,并隨后用分析HPLC監(jiān)測。將有關級分合并、蒸發(fā)并凍干。通過分析反相層析法和氨基酸分析來證實對合成肽的鑒定。
方案5肽與牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍蛋白(KLH)的綴合將肽與先前用磺基琥珀酰亞胺基4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)或磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)衍生化的BSA或KLH進行綴合。
將sulfo-SMPB或sulfo-SMCC(Pierce Chemicals)的水溶液加入在0.02M的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中的BSA或KLH溶液。將所述混合物于室溫搖動45分鐘并將活化的載體于4℃立即應用于用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱。
將對應于活化載體的第一個峰吸收值(280nm)的級分合并在一個圓底燒瓶中,并在所述圓底燒瓶中加入在0.05M的磷酸鈉緩沖液(pH6.2)中的肽的溶液。用N2徹底沖洗所述混合物并將其于室溫過夜溫育。使用3H標記的肽并通過綴合物的氨基酸分析來監(jiān)測偶聯(lián)效率。
方案6通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來檢測針對SARS-CoV的抗體用包含肽或肽的混合物(5μg/ml)的100μl溶液(過濾的0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液,pH9.4±0.2)來飽和微量滴定板的每個孔并留置過夜。優(yōu)選地,發(fā)明人使用OsterBayVersafill分配系統(tǒng)來填充該孔。將每個孔騰空(優(yōu)選地通過抽吸)并用洗滌緩沖液(NaCl,0.15M;NaH2PO4,0.060M;乙基汞硫代水楊酸鈉,0.01%和Tween 20,0.05%;pH7.4(0.3mL/孔))洗滌兩次。然后,將所述孔用0.35ml的洗滌緩沖液于37℃飽和1小時并用無Tween 20的相同緩沖液洗滌1次。于37℃再次干燥1小時后,將所述孔備用。用樣品緩沖液(包含磷酸鈉,6mM;NaCl,0.15M和BSA,2%,終pH等于7.2)來稀釋待分析的血清樣品。在添加稀釋的血清樣品(0.1ml)之前用洗滌緩沖液漂洗所述孔。這些在室溫溫育30分鐘。然后,將所述孔騰空,用洗滌緩沖液迅速洗滌兩次,然后洗滌1次,2分鐘。將用1%w/v的在包含Tris,0.05M;NaCl,0.5M;Tween 20,0.05%;乙基汞硫代水楊酸鈉,0.01%的溶液(pH7.2)中的牛血清白蛋白稀釋的綴合溶液(過氧化物酶標記的親和性純化的針對人IgG的山羊抗體,在5ml 50%甘油中的0.5mg)加入每個孔中(0.1ml)并于室溫溫育30分鐘。然后將所述孔騰空,用洗滌緩沖液洗滌5次。用100體積的包含0.1%v/v的30%H2O2的0.1M檸檬酸鹽-乙酸鹽緩沖液(pH5.6)來稀釋底物溶液(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)(每ml的DMSO中8mg)并將其加入每個孔中(0.1ml/孔)。10分鐘后,用0.1ml的2N H2SO4處理每個孔的內(nèi)容物并在450nm讀出光密度。所有的測定以兩次重復進行。
實施例隨后的實施例是對本發(fā)明應用性的廣泛范圍的舉例說明而不傾向于限制其范圍。在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下可對其作出修改和變化。盡管可將與本文描述的那些相似或相等的任何方法和材料用在檢驗本發(fā)明的實踐中,還是描述了優(yōu)選的方法和材料。
實施例1本發(fā)明的肽檢測抗-SARS-CoV抗體的效率將對應于序列Seq ID nos3,17,22,23,31,34,37,101,136和137的SARS-CoV肽進行化學合成,并按照方案6描述的方案用在微量滴定板EIA(酶免疫測定)中以檢測抗-SARS CoV IgG抗體。
為了檢驗這些肽的敏感性,制備一組收集自SARS-陽性患者的55個血清樣品。通過IFA(間接熒光測定),所有這些樣品的血清學狀態(tài)被確認為SARS-陽性。為了檢驗這些肽的特異性,從收集自在2000年和2001年,SARS報道出現(xiàn)前的至少兩年,被其它呼吸疾病侵襲的患者的血清庫制備一組22個血清樣品。
結(jié)果顯示于表1中。對于每個肽,基于用22個SARS-陰性樣品獲得的結(jié)果的平均值加3標準偏差(平均值+3SD)來選擇截止(cutoff)水平。將超過或低于截止值的任何值分別認為是陽性或陰性。10個肽顯示良好特異性(95.5%或100%)因為用肽Seq ID nos23,37和137沒有獲得假陽性結(jié)果,而用對應于Seq ID nos3,17,22,31,34,101,和136的肽僅獲得1個假陽性結(jié)果。就敏感性而言,對應于Seq ID nos37,136和137的肽分別顯示與SARS-陽性樣品的顯著反應性(分別為63.6%,50.9%和69.1%反應性)。Seq ID nos3,22,31,和34的肽也顯示分別與在55個中檢測的4,5,5和3樣品具有一定反應性。
此外,當將對應于Seq ID nos;37,136和137的肽的混合物用于試驗時,獲得了91.3%的敏感性和100%的特異性(見表2,混和37-136-137)。這些結(jié)果顯示三個合成肽的組合提高了測定的檢測效率,因為得到的敏感性比3個單獨的肽更好而特異性仍是相同的(與肽Seq ID nos37和136相對)或甚至比肽Seq ID no137的更高。
實施例2本發(fā)明的肽檢測SARS-CoV蛋白質(zhì)的效率用Seq ID no37或Seq ID no136的肽(都與KLH偶聯(lián))免疫兔。3個月后,從這些兔中收集血清并接下來按照方案6描述的方案以用Seq ID nos37,136和137的肽包被的微量培養(yǎng)板來對其進行檢驗。山羊抗-IgG-過氧化物酶綴合物的添加揭示特異性抗-肽抗體在所有被測試的抗血清中的存在,但是當用以肽Seq ID nos 136或137包被的微量培養(yǎng)板試驗Seq ID no37的抗血清時和當用以肽Seq ID nos 37或137包被的微量培養(yǎng)板測定SeqID no 136的抗血清時,沒有顯著的反應。
在下一組實驗中,將1微克(μg)的重組核殼體(N)蛋白質(zhì)(氨基酸1-49;Biodesign International,Saco,Maine,USA)與兔抗血清一起加入微孔中。結(jié)果顯示加入的SARS N蛋白質(zhì)與被吸附的肽Seq ID no136競爭抗體,因為如表2所示,當存在蛋白質(zhì)時,信號減少。用另一個肽(Seq ID no37)免疫的血清進行的對照實驗沒有顯示信號的減少,說明這種減少是特異性的。
實施例3本發(fā)明的肽檢測SARS-CoV抗原的效率用在實施例2中描述的重組N蛋白質(zhì)包被微量培養(yǎng)板(1μg/mL;100μL/孔)。接下來,將在實施例2中描述的抗血清加入所述板中并按照方案6中描述的方案檢測與包被的抗原結(jié)合的IgG。獲得的結(jié)果可見于表3。它們顯示可將針對SARS-CoV N肽激發(fā)的抗血清用于檢測SARS-CoV的N蛋白質(zhì)。
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表1 SARS-CoV肽的敏感性和特異性OD 450nm(-空白)混和37-136-
表2
表3
序列表<110>亞特斯公司<120>用于檢測與嚴重的急性呼吸綜合征(SARS)相關的冠狀病毒的肽及其混合物<130>010349-0004<140>
<141>
<150>CA 2.441.677<151>2003-09-23<150>CA 2.428.443<151>2003-05-09<160>140<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>1Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn5 10 15Ser Val Leu Leu Phe20<210>2<211>27<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>2Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn5 10 15Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val20 25<210>3<211>27<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>3Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Ser Thr Thr Phe Asp Asp5 10 15Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser20 25
<210>4<211>23<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>4Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile5 10 15Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu20<210>5<211>24<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>5Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe5 10 15Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln20<210>6<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>6Phe Glu Leu Ser Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met5 10 15Gly Thr Gln Thr His20<210>7<211>29<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>7Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys5 10 15His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu20 25<210>8<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>8Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn5 10 15
Gly Thr Ile Thr Asp Ala20<210>9<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>9Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys5 10 15Ile Ser Asn Ser Val Ala20<210>10<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>10Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp5 10 15Asp Phe Met Gly Ser Val20<210>11<211>25<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>11Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly5 10 15Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg20 25<210>12<211>33<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>12Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln5 10 15Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro20 25 30Lys Thr Ser<210>13<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>13
Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile5 10 15Val Ala Tyr Thr Met Ser20<210>14<211>28<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>14Ser Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe5 10 15Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys20 25<210>15<211>29<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>15Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe5 10 15Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys20 25<210>16<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>16Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala5 10 15Asn Gln Phe Asn Lys Ala20<210>17<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>17Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln5 10 15Ile Gln Glu Ser Leu20<210>18<211>31<212>PRT
<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>18Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr5 10 15Ala Pro Ala Ile Ser His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu20 25 30Gly<210>19<211>33<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>19Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu5 10 15Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His20 25 30Thr Ser Pro<210>20<211>23<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>20Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn5 10 15Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu20<210>21<211>30<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>21Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr5 10 15Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile20 25 30<210>22<211>30<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>22Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr5 10 15
Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile20 25 30<210>23<211>18<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>23Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile5 10 15Ile Lys Leu<210>24<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>24Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu5 10 15Thr Asn Ile Leu Leu20<210>25<211>14<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>25Ile Val Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly5 10<210>26<211>18<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>26Gly His Ser Leu Gly Arg Ser Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu5 10 15Ile Thr Val<210>27<211>22<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>27Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp5 10 15
His Ala Gly Ser Asn Asp Asn20<210>28<21l>34<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>28Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg5 10 15Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn20 25 30Gly Gly Arg Asn<210>29<211>31<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>29Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn5 10 15Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly20 25 30Leu<210>30<211>31<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>30Ile Asn Thr Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg5 10 15Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu20 25 30Leu<210>31<211>28<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>31Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr5 10 15
Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu20 25<210>32<211>28<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>32Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn5 10 15Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg20 25<210>33<211>38<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>33Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser5 10 15Ala Ala 3lu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr20 25 30Lys Gln Tyr Asn Val Thr Gln Ala35<210>34<211>19<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>34Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn5 10 15Val Thr Gln Ala<210>35<211>27<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>35Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp5 10 15Gln Asp Ieu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His20 25<210>36
<211>13<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>36Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val5 10<210>37<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>37Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro5 10 15Gln Arg Gln Lys Lys Gln20<210>38<211>31<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>38Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Ala Glu Ser Glu Glu Glu Glu Ile5 10 15Asp Glu Thr Ser Glu His Glu Tyr Gly Thr Glu Asp Asp Tyr Gln20 25 30Gly<210>39<211>31<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>39Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Ala Glu Cys Glu Glu Glu Glu Ile5 10 15Asp Glu Thr Cys Glu His Glu Tyr Gly Thr Glu Asp Asp Tyr Gln20 25 30Gly<210>40<211>33<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>40Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Trp Leu Asp Asp Thr Thr Glu5 10 15
Gln Ser Glu Ile Glu Pro Glu Pro Glu Pro Thr Pro Glu Glu Pro20 25 30Val Asn Gln<210>41<211>16<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>41Asn Gly Ala Met Gln Lys Glu Ser Asp Asp Tyr Ile Lys Leu Asn5 10 15Gly<210>42<211>23<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>42Ala Pro Lys Gln Glu Glu Pro Pro Asn Thr Glu Asp Ser Lys Thr5 10 15Glu Glu Lys Ser Val Val Gln Lys20<210>43<211>25<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>43Glu Glu Thr Arg Lys Leu Met Pro Ile Ser Met Asp Val Arg Ala5 10 15Ile Met Ala Thr Ile Gln Arg Lys Tyr Lys20 25<210>44<211>32<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>44Ser Ser Lys Thr Ser Glu Glu His Phe Val Glu Thr Val Ser Leu5 10 15Ala Gly Ser Tyr Arg Asp Trp Ser Tyr Ser Gly Gln Arg Thr Glu20 25 30Leu Gly
<210>45<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>45Thr Lys Lys Trp Lys Phe Pro Gln Val Gly Gly Leu Thr Ser Ile5 10 15Lys Trp Ala Asp Asn Asn20<210>46<211>23<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>46Glu Ile Glu Pro Lys Leu Asp Gly Tyr Tyr Lys Lys Asp Asn Ala5 10 15Tyr Tyr Thr Glu Gln Pro Ile Asp20<210>47<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>47Glu Ser Gln Gln Pro Thr Ser Glu Glu Val Val Glu Asn Pro Thr5 10 15Ile Gln Lys Glu Val20<210>48<211>18<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>48Glu Asn Thr Ser Ile Thr Ile Lys Lys Pro Asn Glu Leu Ser Leu5 10 15Ala Leu Gly<210>49<211>12<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>49Ala Lys Arg Leu Ala Gln Arg Val Phe Asn Asn Tyr5 10
<210>50<211>29<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>50Thr Phe Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ile Arg Ala Ser Leu Pro5 10 15Thr Thr Ile Ala Lys Asn Ser Val Lys Ser Val Ala Lys Leu20 25<210>51<211>11<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>51Asn Tyr Val Lys Ser Pro Lys Phe Ser Lys Leu5 10<210>52<211>10<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>52Tyr Lys Arg Asn Arg Ala Thr Arg Val Glu5 10<210>53<211>28<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>53Arg Asp Leu Ser Leu Gln Phe Lys Arg Pro Ile Asn Pro Thr Asp5 10 15Gln Ser Ser Tyr Ile Val Asp Ser Val Ala Val Lys Asn20 25<210>54<211>17<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>54Leu Tyr Phe Asp Lys Ala Gly Gln Lys Thr Tyr Glu Arg His Pro5 10 15Leu Ser<210>55
<211>15<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>55Val Asn Leu Asp Asn Leu Arg Ala Asn Asn Thr Lys Gly Ser Leu5 10 15<210>56<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>56Leu Ser Glu Gln Leu Arg Lys Gln Ile Arg Ser Ala Ala Lys Lys5 10 15Asn Asn Ile Pro Phe Arg20<210>57<211>14<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>57Arg Gly Gly Ser Tyr Lys Asn Asp Lys Ser Ser Pro Val Val5 10<210>58<211>16<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>58Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Glu Leu Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val5 10 15Leu<210>59<211>18<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>59Leu Asn Asn Glu His Tyr Arg Ala Leu Ser Gly Val Phe Ser Gly5 10 15Val Asp Ala<210>60<211>10<212>PRT
<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>60Phe Phe Asn Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Val5 10<210>61<211>42<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>61Asp Thr Thr Ser Tyr Arg Glu Ala Ala Ser Ser His Leu Ala Lys5 10 15Ala Leu Asn Asp Phe Ser Asn Ser Gly Ala Asp Val Leu Tyr Gln20 25 30Pro Pro Gln Thr Ser Ile Thr Ser Ala Val Leu Gln35 40<210>62<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>62Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His5 10 15Ser Phe Leu Val Gln Ala20<210>63<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>63Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val5 10 15Arg Ile Gln Pro Gly Gln20<210>64<211>21<212>PRT<211>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>64Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu Pro Leu Thr Gln Asp5 10 15His Val Asp Ile Leu Gly20
<210>65<211>14<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>65Ala Asp Thr Ser Leu Ser Gly Tyr Arg Leu Lys Asp Ser Val5 10<210>66<211>11<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>66Arg Thr Val Tyr Asp Asp Ala Ala Arg Arg Val5 10<210>67<211>18<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>67Asp Tyr Leu Val Ser Thr Gln Glu Phe Arg Tyr Met Asn Ser Gln5 10 15Gly Leu Leu<210>68<211>14<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>68Gln Gln Leu Arg Val Glu Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln5 10<210>69<211>9<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>69Lys Asp Thr Thr Glu Ala Phe Glu Lys5<210>70<211>17<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>70Asp Ile Asn Arg Leu Ser Glu Glu Met Leu Asp Asn Arg Ala Thr5 10 15
Leu Gln<210>71<211>26<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>71Tyr Ala Thr Ala Gln Glu Ala Tyr Glu Gln Ala Val Ala Asn Gly5 10 15Asp Ser Glu Val Val Leu Lys Lys Leu Lys Lys20 25<210>72<211>17<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>72Ala Lys Ser Glu Phe Asp Arg Asp Ala Ala Met Gln Arg Lys Leu5 10 15Glu Lys<210>73<211>16<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>73Tyr Lys Gln Ala Arg Ser Glu Asp Lys Arg Ala Lys Val Thr Ser5 10 15Ala<210>74<211>19<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>74Leu Arg Lys Leu Asp Asn Asp Ala Leu Asn Asn Ile Ile Asn Asn5 10 15Ala Arg Asp Gly<210>75<211>17<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>75Asp Tyr Gly Thr Tyr Lys Asn Thr Ser Asp Gly Asn Thr Phe Thr
5 1015Tyr Ala<210>76<211>26<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>76Glu Ile Gln Gln Val Val Asp Ala Asp Ser Lys Ile Val Gln Leu5 10 15Ser Glu Ile Asn Met Asp Asn Ser Pro Asn Leu20 25<210>77<211>11<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>77Asn Asn Glu Leu Ser Pro Val Ala Leu Arg Gln5 10<210>79<211>17<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>78Asp Asp Asn Ala Leu Ala Tyr Tyr Asn Asn Ser Lys Gly Gly Arg5 10 15Phe Val<210>79<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>79Leu Ser Asp His Gln Asp Leu Lys Trp Ala Arg Phe Pro Lys Ser5 10 15Asp Gly Thr Gly Thr20<210>80<211>24<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>80Tyr Thr Glu Leu Glu Pro Pro Ser Arg Phe Val Thr Asp Thr Pro
5 10 15Lys Gly Pro Lys Val Lys Tyr Leu Tyr20<210>81<211>23<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>81Ala Phe Ala Val Asp Pro Ala Lys Ala Tyr Lys Asp Tyr Leu Ala5 10 15Ser Gly Gly Gln Pro Ile Thr Asn20<210>82<211>17<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>82Thr Val Thr Pro Glu Ala Asn Met Asp Gln Glu Ser Phe Gly Gly5 10 15Ala Ser<210>83<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>83Arg Ser His Ile Asp His Pro Asn Pro Lys Gly Phe Ser Asp Leu5 10 15Lys Gly Lys Tyr Val20<210>84<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>84Arg Cys His Ile Asp His Pro Asn Pro Lys Gly Phe Cys Asp Leu5 10 15Lys Gly Lys Tyr Val20<210>85<211>9<212>PRT
<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>85Asp Gln Leu Arg Glu Pro Leu Met Gln5<210>86<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>86Lys Thr Asn Ser Ser Arg Phe Gln Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn5 10 15Leu Leu Asp Ser Tyr20<210>87<211>22<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>87Val Val Lys Arg His Thr Met Ser Asn Tyr Gln His Glu Glu Thr5 10 15Ile Tyr Asn Leu Val Lys Asp20<210>88<211>13<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>88Val Pro His Ile Ser Arg Gln Arg Leu Thr Lys Tyr Thr5 10<210>89<21>)25<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>89Asp Asp Asp Tyr Phe Asn Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Phe Val Glu5 10 15Asn Pro Asp Ile Leu Arg Val Tyr Ala Asn20 25<210>90<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)
<400>90Thr Leu Asp Asn Gln Asp Leu Asn Gly Asn Trp Tyr Asp Phe Gly5 10 15Asp Phe Val Gln Val20<210>91<211>26<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>91Lys Tyr Asp Phe Thr Glu Glu Arg Leu Ser Leu Phe Asp Arg Tyr5 10 15Phe Lys Tyr Trp Asp Gln Thr Tyr His Pro Asn20 25<210>92<211>25<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>92Asn Asn Val Ala Phe Gln Thr Val Lys Pro Gly Asn Phe Asn Lys5 10 15Asp Phe Tyr Asp Phe Ala Val Ser Lys Gly20 25<210>93<211>18<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>93Asp Gly Asn Ala Ala Ile Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Arg Tyr Asn5 10 15Leu Pro Thr<210>94<211>27<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>94Tyr Tyr Asp Ser Met Ser Tyr Glu Asp Gln Asp Ala Leu Phe Ala5 10 15Tyr Thr Lys Arg Asn Val Ile Pro Thr Ile Thr Gln20 25
<210>95<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>95Asn Leu Lys Tyr Ala Ile Ser Ala Lys Asn Arg Ala Arg Thr Val5 10 15Ala Gly Val Ser Ile20<210>96<211>17<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>96Thr Asn Arg Gln Phe His Gln Lys Leu Leu Lys Ser Ile Ala Ala5 10 15Thr Arg<210>97<211>22<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>97Val Leu Ala Arg Lys His Asn Thr Ser Ser Asn Leu Ser His Arg5 10 15Phe Tyr Arg Leu Ala Asn Glu20<210>98<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>98Leu Tyr Arg Asn Arg Asp Val Asp His Glu Phe Val Asp Glu Phe5 10 15Tyr Ala Tyr Leu Arg Lys20<210>99<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>99Lys Gln Gly Asp Asp Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Pro Ser5 10 15
Arg Ile Leu Gly Ala Gly20<210>100<211>26<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>100Asp Ala Tyr Pro Leu Thr Lys His Pro Asn Gln Glu Tyr Ala Asp5 10 15Val Phe His Leu Tyr Leu Gln Tyr Ile Arg Lys20 25<210>101<211>17<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>101Leu Thr Asn Asp Asn Thr Ser Arg Tyr Trp Glu Pro Glu Phe Tyr5 10 15Glu Ala<210>102<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>102Tyr Ser Lys Ser His Lys Pro Pro Ile Ser Phe Pro Leu Ser Ala5 10 15Asn Gly Gln Val Phe Gly20<210>103<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>103Tyr Cys Lys Ser His Lys Pro Pro Ile Ser Phe Pro Leu Cys Ala5 10 15Asn Gly Gln Val Phe Gly20<210>104<211>20<212>PRT
<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>104Lys Leu Phe Ala Ala Glu Thr Leu Lys Ala Thr Glu Glu Thr Phe5 10 15Lys Leu Ser Tyr Gly20<210>105<211>21<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>105Ile Ala Thr Val Arg Glu Val Leu Ser Asp Arg Glu Leu His Leu5 10 15Ser Trp Glu Val Gly Lys20<210>106<211>32<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>106Lys Pro Arg Pro Pro Leu Asn Arg Asn Tyr Val Phe Thr Gly Tyr5 10 15Arg Val Thr Lys Asn Ser Lys Val Gln Ile Gly Glu Tyr Thr Phe20 25 30Glu Lys<210>107<211>18<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>107Gly Glu Tyr Thr Phe Glu Lys Gly Asp Tyr Gly Asp Ala Val Val5 10 15Tyr Arg Gly<210>108<211>25<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>108Leu Asn Ile Ser Asp Glu Phe Ser Ser Asn Val Ala Asn Tyr Gln5 10 15Lys Val Gly Met Gln Lys Tyr Ser Thr Leu
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<400>118Asp Lys Phe Thr Asp Gly Val Cys Leu Phe TrP Asn Cys Asn Val5 10 15Asp Arg Tyr Pro Ala Asn Ala Ile Val20<210>119<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>119Tyr Tyr Ser Asp Ser Pro Ser Glu Ser His Gly Lys Gln Val Val5 10 15Ser Asp Ile Asp Tyr20<210>120<211>22<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>120Asn Leu Gly Gly Ala Val Ser Arg His His Ala Asn Glu Tyr Arg5 10 15Gln Tyr Leu Asp Ala Tyr Asn20<210>121<211>13<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>121Ile Tyr Lys Gln Phe Asp Thr Tyr Asn Leu Trp Asn Thr5 10<210>122<211>14<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>122Asp Val Glu Ile Phe Glu Asn Lys Thr Thr Leu Pro Val Asn5 10<210>123<211>19<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>123Glu Leu Trp Ala Lys Arg Asn Ile Lys Pro Val Pro Glu Ile Lys5 10 15
Leu Asn Asn Leu<210>124<211>20<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>124Asn Thr Val Ile Trp Asp Tyr Lys Arg Glu Ala Pro Ala His Val5 10 15Ser Thr Ile Gly Val20<210>125<211>16<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>125Thr Asp Ile Ala Lys Lys Pro Thr Glu Ser Ala Ser Ser Ser Leu5 10 15Thr<210>126<211>44<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>126Val Leu Phe Asp Gly Arg Val Glu Gly Gln Val Asp Leu Phe Arg5 10 15Asn Ala Arg Asn Gly Val Leu Ile Thr Glu Gly Ser Val Lys Gly20 25 30Leu Thr Pro Ser Lys Gly Pro Ala Gln Ala Ser Val Asn Gly35 40<210>127<211>19<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>127Thr Leu Ile Gly Glu Ser Val Lys Thr Gln Phe Asn Tyr Phe Lys5 10 15Lys Val Asp Gly<210>128<211>22<212>PRT
<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>128Glu Thr Tyr Phe Thr Gln Ser Arg Asp Leu Glu Asp Phe Lys Pro5 10 15Arg Ser Gln Met Glu Thr Asp20<210>129<211>13<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>129Asp Glu Phe Ile Gln Arg Tyr Lys Leu Glu Gly Tyr Ala5 10<210>130<211>35<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>130Ala Lys Arg Ser Gln Asp Ser Pro Leu Lys Leu Glu Asp Phe Ile5 10 15Pro Met Asp Ser Thr Val Lys Asn Tyr Phe Ile Thr Asp Ala Gln20 25 30Thr Gly Ser Ser Lys35<210>131<211>16<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>131Leu Trp Ser Lys Asp Gly His Val Glu Thr Phe Tyr Pro Lys Leu5 10 15Gln<210>132<211>24<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>132Asn Leu Tyr Lys Met Gln Arg Met Leu Leu Glu Lys Ser Asp Leu5 10 15Gln Asn Tyr Gly Glu Asn Ala Val Ile20<210>133
<211>22<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>133Tyr Asp Pro Arg Thr Lys His Val Thr Lys Glu Asn Asp Ser Lys5 10 15Glu Gly Phe Phe Thr Tyr Leu20<210>134<211>35<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>134Asn Tyr Leu Gly Lys Pro Lys Glu Gln Ile Asp Gly Tyr Thr Met5 10 15His Ala Asn Tyr Ile Phe Trp Arg Asn Thr Asn Pro Ile Gln Leu20 25 30Ser Ser Tyr Ser Leu35<210>135<211>30<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>135Ser Leu Lys Glu Asn Gln Ile Asn Asp Met Ile Tyr Ser Leu Leu5 10 15Glu Lys Gly Arg Leu Ile Ile Arg Glu Asn Asn Arg Val Val Val20 25 30<210>136<211>32<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>136Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu5 10 15Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His20 25 30Thr Ser<210>137<211>33<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)
<400>137Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg ser Ala Pro Arg Ile5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly20 25 30Gly Arg Asn<210>138<211>41<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>138Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys5 10 15Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys20 25 30Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp35 40<210>139<211>41<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>139Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly20 25 30Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg35 40<210>140<211>41<212>PRT<213>與嚴重的急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)<400>140Ser Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro5 10 15Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr20 25 30Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu35 40
(按照條約第19條的修改)1.一種分離的肽,所述肽包括選自SEQ ID NOS3-22,28-37和136-140的氨基酸序列,及其類似物。
2.一種具有式a--X--c--Z--b的分離的肽,其中X和Z具有獨立地選自SEQ ID NOS3-22,28-37和136-140的氨基酸序列,及其類似物,并且其中a是有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的氨基端,1-8個氨基酸或取代物;b是有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的羧基端,1-8個氨基酸或取代物;和c是有效促進串聯(lián)排列的兩個肽的偶聯(lián)或提高串聯(lián)的肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的一個或兩個氨基酸或取代物的接頭。
3.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NOS3,19,22,28,31,37,136,137,138,139和140,及其類似物。
4.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO3或其類似物組成。
4.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO3或其類似物組成。
5.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO19或其類似物組成。
6.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO22或其類似物組成。
7.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO28或其類似物組成。
8.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO31或其類似物組成。
9.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO3權利要求
1.一種分離的肽,所述肽包括選自SEQ ID NOS1-4,6-16,18-22,24-33,35-41,43-62,64-73,75-77,79-81,83-100,102-105,107-113,115-118,120-127和129-140的氨基酸序列,及其類似物。2.一種具有式a--X--c--Z--b的分離的肽,其中X和Z具有獨立地選自SEQ ID NOS1-4,6-16,18-22,24-33,35-41,43-62,64-73,75-77,79-81,83-100,102-105,107-113,115-118,120-127和129-140的氨基酸序列,及其類似物,并且其中a是有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的氨基端,1-8個氨基酸或取代物;b是有效促進肽的偶聯(lián)或增加肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的羧基端,1-8個氨基酸或取代物;和c是有效促進串聯(lián)排列的兩個肽的偶聯(lián)或提高串聯(lián)的肽的免疫原性或抗原活性或促進與支持基質(zhì)的附著的一個或兩個氨基酸或取代物的接頭。
3.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列選自SEQ ID NOS3,19,22,28,31,37,136,137,138,139和140,及其類似物。
4.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO3或其類似物組成。
5.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO19或其類似物組成。
6.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO22或其類似物組成。
7.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO28或其類似物組成。
8.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO31或其類似物組成。
9.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO37或其類似物組成。
10.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO136或其類似物組成。
11.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO137或其類似物組成。
12.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO138或其類似物組成。
13.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO139或其類似物組成。
14.按照權利要求1或2的分離的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO140或其類似物組成。
15.一種混合物,其包括至少兩種如權利要求1-14任一項限定的肽或其類似物。
16.一種抗體,其特異性結(jié)合于如權利要求1-14任一項所限定的肽或其類似物或如權利要求15所限定的混合物。
17.權利要求16的抗體,其特征在于所述抗體由單克隆抗體或多克隆抗體組成。
18.一種混合物,其包括至少兩種在權利要求16或17中限定的抗體。
19.一種檢測指示SARS-CoV的抗體的存在或缺乏的體外診斷方法,所述抗體結(jié)合于按照權利要求1-14任一項的肽或其類似物從而形成免疫復合物,所述方法包括如下步驟a)使按照權利要求1-14任一項的肽或其類似物與生物樣品接觸一段時間并在足夠形成免疫復合物的條件下;和b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或缺乏。
20.一種檢測指示SARS-CoV的抗體的存在或缺乏的診斷試劑盒,所述試劑盒包括-按照權利要求1-14任一項的肽或其類似物和-檢測肽-抗體免疫復合物的試劑;其中所述肽或其類似物、試劑、生物參比樣品和比較樣品以足夠進行所述檢測的量存在。
21.權利要求19的試劑盒,其還包括-檢測肽-抗體免疫復合物的試劑和/或缺乏與所述肽或其類似物免疫結(jié)合的抗體的生物參比樣品,其中所述生物參比樣品和比較樣品以足夠進行所述檢測的量存在。
22.一種檢測指示SARS-CoV的肽或蛋白質(zhì)存在或缺乏的體外診斷方法,所述肽或蛋白質(zhì)與按照權利要求16或17的抗體結(jié)合以形成免疫復合物,所述方法包括如下步驟a)使按照權利要求16或17的抗體與生物樣品接觸一段時間并在足夠形成免疫復合物的條件下;和b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或缺乏。
23.一種檢測指示SARS-CoV的肽或蛋白質(zhì)的存在或缺乏的診斷試劑盒,所述試劑盒包括-按照權利要求16或17的抗體和-檢測肽-抗體免疫復合物的試劑;其中所述抗體、試劑、生物參比樣品和比較樣品以足夠進行所述檢測的量存在。
24.權利要求23的試劑盒,其還包括缺乏與所述抗體免疫性結(jié)合的肽的生物參比樣品和/或包括可與所述抗體特異性結(jié)合的肽的比較樣品,其中所述生物參比樣品和比較樣品以足夠進行所述檢測的量存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測人和動物的與嚴重急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARS-CoV)感染的新肽及其混合物。因此,本發(fā)明提供SARS-CoV診斷方法和試劑盒。
文檔編號C07K14/165GK1820021SQ200480019575
公開日2006年8月16日 申請日期2004年5月5日 優(yōu)先權日2003年5月9日
發(fā)明者M·霍德, J·M·拉克魯瓦 申請人:亞特斯公司
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