專利名稱：蛋白質(zhì)復合物及其制備方法以及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)復合物及其制備方法以及使用蛋白質(zhì)復合物的生物傳感器、固定化酶等的用途。
背景技術(shù)：
過去，用蛋白質(zhì)包裹蛋白質(zhì)的所謂蛋白質(zhì)復合物是已知的。在該種蛋白質(zhì)復合物的制作中，可以考慮例如，在結(jié)晶狀的蛋白質(zhì)表面涂布溶解的蛋白質(zhì)溶液的方法。
但是，該方法中，使結(jié)晶狀的蛋白質(zhì)不溶解而進行是極為困難的。因此，實情是上述方法在以保護酶、抗原、抗體、細胞因子、受體等有用蛋白質(zhì)(以下稱為目的蛋白質(zhì))為目的時幾乎不能采用。
目的蛋白質(zhì)的保護中，采用將多糖類高分子、聚乙二醇等高分子以共價鍵鍵合在目的蛋白質(zhì)上的方法。該方法是在溫和的反應條件下在目的蛋白質(zhì)的氨基、羰基等官能基上鍵合高分子。但是，該方法不能控制目的蛋白質(zhì)的鍵合部位、催化部位等。另外，鍵合部位、催化部位等因目的蛋白質(zhì)的種類而不同，不能適用于所有的目的蛋白質(zhì)。
目的蛋白質(zhì)的保存中，一般是在低溫下進行保存的方法。另外，在目的蛋白質(zhì)中，也進行添加、混合具有和期待穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)機能的保護物質(zhì)(例如多糖類高分子、聚乙二醇等)的方法。但是，通過這些方法時，由于外在因素環(huán)境的變化，存在損害目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和機能的情況。也就是說，如果周圍出現(xiàn)水、發(fā)生溫度、濕度的上升、結(jié)露等，則目的蛋白質(zhì)與保護物質(zhì)一起容易溶解。另外，如果存在、侵入或產(chǎn)生細菌或真菌等腐敗菌，目的蛋白質(zhì)則會與保護物質(zhì)一起分解、被捕食。因此，目的蛋白質(zhì)是一部分酶、抗體蛋白質(zhì)那樣的高分子蛋白質(zhì)時，該一部分或者在結(jié)構(gòu)上受到變化，如果該一部分由于蛋白質(zhì)分解酶的作用而分解，則機能會完全喪失。但是，使用目的蛋白質(zhì)時，充分地具有該機能是必須的條件。因此，必須逐個驗證保存狀態(tài)下目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)時，必須將目的蛋白質(zhì)從保護物質(zhì)中取出，不僅增加了麻煩而且目的蛋白質(zhì)也容易變性。
但是，在細胞質(zhì)多角體病病毒感染后期，在該感染細胞中形成由多角體蛋白質(zhì)構(gòu)成的多角體，其中包埋了很多病毒顆粒。
該多角體中特異地進入病毒顆粒的原因，可以理解是由于相同病毒顆粒的外殼蛋白質(zhì)VP3與多角體蛋白質(zhì)之間特異的關(guān)系(非專利文獻1)。
本發(fā)明者們，鑒于上述背景技術(shù)，完成了有助于目的蛋白質(zhì)的保護、保存、穩(wěn)定性提高的蛋白質(zhì)復合物及其制備方法的發(fā)明，先提出了申請(專利文獻1)。如上述發(fā)明的說明書所述，其是以使高分子性目的蛋白質(zhì)包埋在該多角體中，另外提高該包埋效率為目的的。此處，通過截短編碼細胞質(zhì)多角體病病毒外殼蛋白質(zhì)的基因，增大可以包埋在多角體中的蛋白質(zhì)的大小(分子量)，而且可以有效地使目的蛋白質(zhì)包埋在該多角體中。而且作為該方法，可以在目的蛋白質(zhì)的N末端或C末端導入構(gòu)成細胞質(zhì)多角體病病毒外層的蛋白質(zhì)VP3的氨基酸序列，雖然該融合蛋白質(zhì)在桿狀病毒載體上出現(xiàn)，但此時，與出現(xiàn)細胞質(zhì)多角體病病毒的多角體蛋白質(zhì)的病毒一起，通過感染昆蟲細胞，可以在多角體中包埋融合蛋白質(zhì)。因此，在桿狀病毒載體上出現(xiàn)的外來蛋白質(zhì)，即目的蛋白質(zhì)，為了插入細胞質(zhì)多角體病病毒的構(gòu)成蛋白質(zhì)的N末端或C末端，必須將編碼細胞質(zhì)多角體病病毒的構(gòu)成蛋白質(zhì)的cDNA與目的蛋白質(zhì)基因融合。此時，構(gòu)成蛋白質(zhì)與編碼目的蛋白質(zhì)基因蛋白質(zhì)的開放讀框變?yōu)榉献x框是重要的，這樣形成細胞質(zhì)多角體病病毒的構(gòu)成蛋白質(zhì)與目的蛋白質(zhì)以一個融合蛋白質(zhì)出現(xiàn)的重組桿狀病毒。
專利文獻1國際公開WO02/36785A1號非專利文獻1 Ikeda et al.(2001)J.Virol.75，988-995發(fā)明的公開本發(fā)明進一步改進上述發(fā)明，通過在特定范圍內(nèi)識別多角體包埋信號VP3而完成。
本發(fā)明的目的在于提供可以包圍加大尺寸(分子量)的目的蛋白質(zhì)、或者具有熒光或發(fā)光機能或生理活性機能的目的蛋白質(zhì)、以及高分子性的目的蛋白質(zhì)，另外，在復合物狀態(tài)下可以驗證目的蛋白質(zhì)機能的蛋白質(zhì)復合物。
另外，本發(fā)明的目的還在于提供可以不降低包圍了具有各種性質(zhì)的目的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)復合物機能而有效地生產(chǎn)其的制備方法。
而且，本發(fā)明的目的還在于提供利用蛋白質(zhì)復合物的生物傳感器、固定化酶等用途。
本發(fā)明的要點在于，由在封入昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)多角體病病毒外殼蛋白質(zhì)VP3限定的區(qū)域作為多角體包埋信號的目的蛋白質(zhì)形成的蛋白質(zhì)復合物。
VP3限定的區(qū)域，在從N末端到第40個氨基酸殘基和從第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基中的任何一個范圍，此時，本發(fā)明的要點是，由具有限定在從封入昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)多角體病病毒的外殼蛋白質(zhì)VP3的N末端到第40個氨基酸殘基和從第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基中的任何一個范圍內(nèi)的區(qū)域作為多角體包埋信號的目的蛋白質(zhì)形成的蛋白質(zhì)復合物。
多角體蛋白質(zhì)相對于目的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定性提高或保護或保存性提高，或者它們的任意組合效果，此時，本發(fā)明的要旨是，由封入昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)多角體病病毒外殼蛋白質(zhì)限定的區(qū)域，具體地具有限定在從Vp3的N末端到第40個氨基酸殘基和從第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基中任何一個范圍內(nèi)的區(qū)域作為多角體包埋信號的目的蛋白質(zhì)形成、多角體蛋白質(zhì)相對于目的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定性提高或保護或保存性提高，或者它們?nèi)我獾慕M合效果的蛋白質(zhì)復合物。
本發(fā)明的要旨是目的蛋白質(zhì)選自至少一種具有熒光或發(fā)光機能的蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、細胞因子、受體和生理活性蛋白質(zhì)，此時，選自至少一種具有封入昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)多角體病病毒的外殼蛋白質(zhì)限定的區(qū)域，具體地具有限定在從Vp3的N末端到第40個氨基酸殘基和從第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基中任何一個范圍內(nèi)的區(qū)域作為多角體包埋信號，具有熒光和發(fā)光機能的蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、細胞因子、受體和生理活性蛋白質(zhì)的目的蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)復合物，優(yōu)選具有多角體蛋白質(zhì)相對于目的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提高或保護或保存性提高，或它們的組合效果的蛋白質(zhì)復合物。
另外，本發(fā)明的要旨是蛋白質(zhì)復合物的制備方法，該方法是將重組了編碼目的蛋白質(zhì)基因的載體與重組了多角體蛋白質(zhì)基因的載體感染細胞后，培養(yǎng)該細胞，在其中制備由目的蛋白質(zhì)和多角體蛋白質(zhì)構(gòu)成的復合結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)復合物。
進一步地，本發(fā)明的要旨是生物傳感器，其特征在于蛋白質(zhì)復合物以點狀或線狀排列、固定在基底上的生物傳感器，或者填充該蛋白質(zhì)復合物，使其可以與形成在基底上的凹陷檢測液中的物質(zhì)接觸的生物傳感器，或者將蛋白質(zhì)復合物填充到容器中，使其可以與檢測液中物質(zhì)接觸的生物傳感器，其中蛋白質(zhì)復合物是由具有封入了昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)和細胞質(zhì)多角體病病毒外殼蛋白質(zhì)的限定區(qū)域，具體地在VP3的N末端到第40個氨基酸殘基和從第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基中任何一個范圍內(nèi)限定的區(qū)域作為多角體包埋信號的目的蛋白質(zhì)，具體地由至少一種選自具有熒光或發(fā)光機能的蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、細胞因子、受體和生理活性蛋白質(zhì)的目的蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)復合物，優(yōu)選多角體蛋白質(zhì)相對于目的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定性提高或保護或保存性提高，或者任意之一的組合效果。
另外，本發(fā)明的要旨是將蛋白質(zhì)復合物填充到容器內(nèi)的固定化酶，其中蛋白質(zhì)復合物是由具有封入了昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)和細胞質(zhì)多角體病病毒外殼蛋白質(zhì)的限定區(qū)域，具體地在從VP3的N末端到第40個氨基酸殘基和從第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基中任何一個范圍內(nèi)限定的區(qū)域作為多角體包埋信號的目的蛋白質(zhì)，具體地由至少一種選自具有熒光或發(fā)光機能的蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、細胞因子、受體和生理活性蛋白質(zhì)的目的蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)復合物，優(yōu)選多角體蛋白質(zhì)相對于目的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定性提高或保護或保存性提高，或者任意之一的組合效果。


圖1是說明截短VP3基因的方法和轉(zhuǎn)移載體的制作的圖。
圖2是表示被截短的VP3基因與根據(jù)其編碼的氨基酸殘基的關(guān)系的圖。
圖3通過從多角體是否有綠色熒光來檢測將截短的VP3基因?qū)隕GFP基因，由此編碼的蛋白質(zhì)是否包埋到多角體中。
圖4是截短的VP3的序列保持在其N末端的EGFP是表示以包圍在多角體中的狀態(tài)下觀察的綠色熒光強度。熒光強度的強弱以1+，2+，3+，4+，5+的5級表示。
圖5將VP3的第39個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基作為使包圍到多角體中的載體，將其導入Cyclin-dependent kinase 5的N末端。將該蛋白質(zhì)包圍到多角體后，將其粘在載玻片上，在多角體表面上進行抗原抗體反應。
實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及的蛋白質(zhì)復合物，通過封入昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)包圍具有細胞質(zhì)多角體病病毒外殼蛋白質(zhì)VP3的限定區(qū)域作為多角體包埋信號的目的蛋白質(zhì)。此處，所謂包圍，是指包括目的蛋白質(zhì)被完全包入多角體蛋白質(zhì)內(nèi)的狀態(tài)和有一部分露出多角體蛋白質(zhì)外的埋入狀態(tài)。另外，作為復合物的形狀，包括立方體、長方體、圓柱體等確定形狀或不確定形狀的顆粒狀態(tài)。這樣，可以使被包圍的目的蛋白質(zhì)的量增加，目的蛋白質(zhì)的大小增大，或者可以顯著地提高生理活性機能或催化機能等機能。
本發(fā)明中，VP3的限定區(qū)域，除從N末端到第40外，還有從41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基的范圍。另外，費事而無效，但從N末端從第41個氨基酸殘基到79個氨基酸殘基的區(qū)域與該區(qū)域的N末端或C末端增加10個氨基酸殘基的也可以使用。
而且，如果從與生物體相關(guān)的化學物質(zhì)結(jié)合這一點考慮，目的蛋白質(zhì)是酶、抗原、抗體、受體、細胞因子，如果從光化學特性這一點考慮，是發(fā)光蛋白質(zhì)，如果從接受電子的反應這一點考慮，是金屬鍵合蛋白質(zhì)、含有金屬離子的酶。如果從這些目的蛋白質(zhì)的特性考慮，優(yōu)選從其中選擇一種構(gòu)成。
本發(fā)明涉及的蛋白質(zhì)復合物的制備方法，可以是將重組具有VP3限定區(qū)域作為包埋信號的目的蛋白質(zhì)DNA的載體與重組多角體蛋白質(zhì)的載體同時或一起導入昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞、無細胞等的細胞中后，分別將細胞在適宜的條件下培養(yǎng)而成。這樣，蛋白質(zhì)復合物的機能不降低且可以有效地制備蛋白質(zhì)復合物。條件是，所謂重組目的蛋白質(zhì)DNA的載體和重組多角體蛋白質(zhì)DNA的載體，是指質(zhì)粒載體或病毒載體等。它們可以選擇適宜在細胞中分別導入DNA的載體。
作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)復合物的用途，通過在基底上排列、固定蛋白質(zhì)復合物成為受體，通過SPR、光計數(shù)器或水晶震動器等轉(zhuǎn)換器，將光量或質(zhì)量轉(zhuǎn)換為電信號，并顯示，可以作為免疫傳感器、基因傳感器、脂質(zhì)傳感器等生物傳感器使用。基底的材質(zhì)，可以使用玻璃、塑料、金屬等?；蛘撸着c蛋白質(zhì)多角體的聯(lián)結(jié)方法，可以使用明膠、高分子聚合物等粘合劑。
另外，代替上述基底，可以是可以通過檢測液的筒狀容器，通過在該容器內(nèi)填充蛋白質(zhì)復合物使其可以與檢測液中物質(zhì)接觸的生物傳感器。
而且，將具有催化能的蛋白酶、脂肪酶、酯酶等酶的DNA通過與實施例1相同的方法制成顆粒狀蛋白質(zhì)復合物，通過將其填充到各種形狀的容器中，可以作為具有催化能的固定化酶使用。
通過實施例說明本申請發(fā)明的詳細內(nèi)容。本發(fā)明不因這些實施例而有任何限制。
實施例1為了更詳細地說明本發(fā)明，根據(jù)實施例及所附的附圖進行說明。
①作多角體蛋白質(zhì)的病毒的制作在從昆蟲細胞Spodoptera Frugiperda而來的IPLB-Sf21-AE(Sf21)上制造多角體的情況下，為了形成蠶細胞質(zhì)多角體病病毒(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrosis Virus，BmCPV)的立方體多角體，接種重組了BmCPV的H系統(tǒng)多角體蛋白質(zhì)基因的病毒(AcCP-H)(Mori et al.(1993)J.Gen.Virol.74，99-102)。該AcCP-H是在由Autographa californicanucleopolyhedrovirus(AcNPV)衍生的桿狀病毒載體的多角體蛋白啟動子的下游重組了H系統(tǒng)的多角體蛋白質(zhì)基因。
②僅由外殼蛋白質(zhì)VP3限定的區(qū)域形成的信號的解析1)編碼外殼蛋白質(zhì)VP3的BmCPV S4的截短將質(zhì)粒pVP3(XbaI)EGFP(國際公開WO02/36785A1號)用限速酶XbaI消化，在用限速酶KpnI消化。將該DNA在試管內(nèi)溶解在100μl ExoIII buffer中，加熱1μl ExonucleaseIII并攪拌后，在25℃保溫。將該DNA溶液每30秒取樣5μl，加入另外準備在試管中的100μl MB Nuclease Buffer中。在65℃保溫5分鐘使ExonucleaseIII失活后，降溫到37℃加入2μl Mung Bean Nuclease，在37℃保溫30分鐘。用苯酚萃取，用乙醇進行沉淀后，將DNA溶解在50μlKlenow Buffer中，加入1μl Klenow Flagment。在37℃保溫15分鐘，并完全末端修復后，取出10μl，加入100μl準備在另外的試管中的Ligation溶液A中。然后，加入12μl Ligation溶液B并攪拌，在16℃反應3小時進行乙醇沉淀和沖洗。將回收的DNA用限速酶XbaI消化1小時后，放入100μl感受態(tài)細胞JM109中進行形質(zhì)轉(zhuǎn)換。另外，以上操作例如可以用Kilo-Sequence用DeletionKit(TaKaRa社制)，根據(jù)該流程進行(圖1)。
2)重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建將形質(zhì)轉(zhuǎn)換的大腸桿菌撒入含有卡那霉素的2×TY盤上，并在37℃培養(yǎng)一晚，將產(chǎn)生的菌落在含有卡那霉素的2×TY培養(yǎng)基上培養(yǎng)一晚。萃取出質(zhì)粒DNA后，用限速酶BgIII和BamHI消化，進行電泳。確認DNA片斷變短，再進行序列解析，確認該DNA片斷的堿基序列。將堿基序列確認所必須的質(zhì)粒DNA溶液用限速酶NotI消化，桿狀病毒載體的轉(zhuǎn)移載體pVL 1392(PHARMINGEN社制)插入NotI部位。將其在100μl的感受態(tài)細胞JM109中形質(zhì)轉(zhuǎn)換，撒入含有氨芐青霉素的2×TY盤中，并在37℃培養(yǎng)一晚。將產(chǎn)生的菌落在含有氨芐青霉素的2×TY培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)一晚，萃取出質(zhì)粒DNA，進行序列解析。解析結(jié)果，選擇嵌入為正確方向插入的，成為重組轉(zhuǎn)移載體pAcVP3(x)/EGFP(條件是x表示編碼BmCPV的VP3的S4cDNA的堿基數(shù)(圖2)。
3)重組桿狀病毒的構(gòu)建分別將各5μg構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體pAcVP3(x)/EGFP與0.5μg的線狀Baculogold Baculovirus DNA(PHARMINGEN社制)同時通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法在昆蟲培養(yǎng)細胞Sf21上進行轉(zhuǎn)染。然后進行噬斑純化，制作重組病毒AcVP3(x)/EGFP。
③以EGFP為目的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)復合物的制作1)Sf21細胞上重組蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)進行作為對照的AcVP3/GFP(Ikeda et al.，(2001)J.Virol.75，988-995)和AcCP-H(Mori et al.(1993)J.Gen.Virol.74，99-102)的雙感染、AcVP3(XbaI)/GFP(國際公開WO02/36785A1號)和AcCP-H的雙感染。另外，以截短VP3為目的進行AcVP3(x)/GFP和AcCP-H的雙感染。這些雙感染分別在10p.f.u./細胞中進行。將病毒在室溫下1小時內(nèi)吸附在細胞上后，除去病毒液，加入2ml含有10小牛胎兒血清的TC-100并在27℃保溫4天。
2)多角體的精制從第4天的感染細胞回收立方體的多角體，PBS(20mM NaH2PO4，20mM Na2HPO4，150mM NaCl，pH7.2)洗滌后，在冰水中用勻漿器磨碎。磨碎液用1％的土溫20洗滌后，通過離心回收多角體。再通過用1.5M-2.2M蔗糖的密度勾配法再50,000Xg離心45分鐘，萃取出多角體餾分。將萃取出的樣品通過PBS洗滌后，再15,000Xg離心10分鐘回收精制的多角體。
3)向多角體的EGFP包圍的測定從AcVP3(x)/GFP和AcCP-H和作為對照的AcVP3/GFP和AcCP-H的雙感染、AcVP3(XbaI)/GFP和AcCP-H的雙感染的細胞中精制多角體并用熒光顯微鏡(OLYMPUS-IX71社制)，通過從多角體的熒光的有無判斷向多角體的EGFP的包圍(圖3)。結(jié)果，任何情況下均觀察到從多角體的綠色熒光，確認多角體中VP3/GFP、VP3(XbaI)/GFP包圍。
其次，對于如圖2所示制作的AcVP3(x)/GFP全部，研究向多角體的EGFP的包圍。結(jié)果，可以看到因含有從VP3基因的5’末端到第250個堿基的區(qū)域?qū)隕GFP基因5’末端的嵌合體基因上被編碼的VP3(250)/GFP分子包埋在多角體中。即，意味著到VP3的N末端的79個氨基酸殘基的區(qū)域上存在蛋白質(zhì)分子在多角體中特異地包埋的信號(多角體包埋信號)，由于該信號的存在，VP3(250)/GFP分子被包圍在多角體中，結(jié)果，如圖3所看到的，可觀察從多角體發(fā)出的綠色熒光。
但是，將從VP3基因的5’末端到第130個堿基導入EGFP基因的5’末端的嵌合體基因的情況下，由該嵌合體基因編碼的融合GFP分子VP3(130)/GFP包圍多角體的機能消失，完全觀察不到從多角體的綠色熒光(圖3)。這樣，到VP3N末端的第39個氨基酸殘基的區(qū)域不存在多角體包埋信號。
而且，從VP3的第135個堿基到292個堿基通過PCR法放大，制備將其導入EGFP基因的5’末端的嵌合體基因。結(jié)果，這些編碼從VP3的N末端的第41個氨基酸殘基到第93個氨基酸殘基的區(qū)域?qū)隕GFP的N末端。同樣地確認VP3(135-292)/EGFP是否包圍在多角體中，觀察多角體的綠色熒光。
從以上結(jié)果可知，導入VP3并且蛋白質(zhì)包埋在多角體中，VP3的N末端的極限區(qū)域，即從VP3的N末端第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基的范圍具有作為多角體包埋信號的機能。
截短VP3的效果通過將編碼從VP3基因5’末端，各長度區(qū)域的基因?qū)隚FP基因的5’末端，在GFP的N末端導入VP3衍生的各種氨基酸序列區(qū)域。比較因從該嵌合體基因發(fā)現(xiàn)的融合GFP分子綠色熒光的發(fā)色。結(jié)果，如圖4所示，隨著導入GFP的N末端的VP3區(qū)域的截短，綠色熒光的發(fā)色增大。但是，在從VP3的N末端到第79個氨基酸殘基更短的情況下，幾乎為相同的綠色熒光發(fā)色。這樣，在目的蛋白質(zhì)上導入其它氨基酸序列的情況下，隨著該序列長度的變短目的蛋白質(zhì)的生理活性增高。但是，如果該序列短于必要長度，則作為該信號的機能喪失。
本發(fā)明得到的VP3多角體中包圍目的蛋白質(zhì)的信號，導入目的蛋白質(zhì)分子的情況下，使該目的蛋白質(zhì)包圍在多角體中具有足夠的機能，而且，是不會妨礙該目的蛋白質(zhì)的生理活性的長度。而且，由于通過本發(fā)明，VP3的長度變短，表示只有該消除的部分大小的分子可以包埋在多角體中，本發(fā)明的效果高。
下面，按照實施例1的順序作為目的蛋白質(zhì)使用來自人的Cyclin-dependent kinase(CDK5)，對使用邊長為10微米的立方體蛋白質(zhì)復合物的生物傳感器進行說明。
實施例2在載玻片上排列復合物制作生物傳感器。
在載玻片上滴加5μl明膠溶液(明膠0.5，Crk0.02)。另外，Crk是硫酸鉀鉻CHROMIUM POTASSIUM SULFATE(防腐劑)。
與新的載玻片表側(cè)慢慢地融合，溶液擴展緩慢地引入兩側(cè)。明膠完全干燥后，劇烈攪拌下滴加1μl復合物溶液，然后制成干燥的生物傳感器。將其浸漬在蒸餾水中直至使用傳感器。
另外，所謂復合物溶液是指將在Sf21細胞中大量發(fā)現(xiàn)的復合物精制，懸浮于蒸餾水中的溶液。
驗證驗證方法①過氧化物酶活性的抑制在滴加復合物的部分裝上過氧化氫溶液(用PBS調(diào)節(jié)最終濃度為1％)，室溫下處理15分鐘，用PBS洗滌(為了不殘留過氧化氫溶液)。
這樣，抑制了成為背景的過氧化物酶活性。
②正常血清的封閉(5％NHS)將正常的馬血清添加含0.3％TritonX-100的PBS(T-PBS)并調(diào)節(jié)最終濃度為5％。室溫經(jīng)過20分鐘后，用T-PBS洗滌。
③一次抗體反應用含有5％血清的T-PBS將抗Cdk5單克隆抗體稀釋100倍，在37℃反應3小時。然后用T-PBS洗滌。
④生物素標記抗鼠IgG抗體反應將生物素標記的二次抗體用T-PBS稀釋100倍，在37℃反應1小時。用T-PBS洗滌。
另一方面，將ABC反應中使用的A溶液、B溶液用T-PBS稀釋100倍，反應至少30分鐘。
⑤與ABC試劑的反應(VECTASTAIN ABC KIT STANDARDPK-6100)室溫反應一小時后，用T-PBS洗滌。
⑥洗滌下面由于DBA與磷酸反應形成沉淀，為了替代PBS，用50mMTRIS-HC(pH7.5)輕輕洗滌，置換溶液。
⑦與DAB基質(zhì)的保溫在50mM Tris-HCI溶液中添加DAB粉末，使?jié)舛葹?0mg/ml，再加入16μl的過氧化氫水，室溫反應25分鐘。反應結(jié)束后，浸漬在50mM Tris-HCI溶液中。
⑧用甘油PBS的封入將載玻片干燥后的甘油PBS滴加一滴在樣品上，從上面似乎并沒有氣泡進入蓋玻片。
用上述驗證方法，嘗試包圍目的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)復合物與沒有任何蛋白質(zhì)包圍的多角體抗原、抗體反應。結(jié)果如圖5所示，包圍Cdk5的蛋白質(zhì)復合物，在其表面可以看到Cdk5分子與對于Cdk5抗體的抗原、抗體反應。因此，包圍融合目的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)復合物表面上可以看到抗原抗體反應，即抗原蛋白質(zhì)與抗體蛋白質(zhì)間的蛋白質(zhì)分子間的相互作用。
工業(yè)上的可利用性以上，如詳細說明所述，根據(jù)本發(fā)明，封入原來的昆蟲病毒構(gòu)成多角體的蛋白質(zhì)的多角體蛋白質(zhì)與僅以細胞質(zhì)多角體病病毒外殼蛋白質(zhì)VP3的限定區(qū)域作為信號，通過將其導入目的蛋白質(zhì)，可以有效地生產(chǎn)多角體蛋白質(zhì)與目的蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)復合物。
而且，將具有酶活性、抗原、抗體反應、蛋白質(zhì)間相互作用等生理活性機能的蛋白質(zhì)分子通過多角體蛋白質(zhì)包圍而得到的蛋白質(zhì)復合物可以作為優(yōu)異的生物傳感器、固定化酶使用。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)復合物，是由封入昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)與具有以細胞質(zhì)多角體病病毒的外殼蛋白質(zhì)VP3限定區(qū)域作為多角體包埋信號的目的蛋白質(zhì)構(gòu)成的。
2.權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)復合物，其中VP3限定區(qū)域在從N末端到第40個氨基酸殘基和從第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基的任何一個范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)復合物，其中多角體蛋白質(zhì)相對于目的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提高或者保護或保存性提高，或者帶來它們?nèi)我獾慕M合效果。
4.權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)復合物，其中目的蛋白質(zhì)是選自具有熒光或發(fā)光機能的蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、細胞因子、受體、以及生理活性蛋白質(zhì)中的至少一種。
5.一種蛋白質(zhì)復合物的制備方法，該方法是將嵌入編碼目的蛋白質(zhì)基因的載體，與嵌入多角體蛋白質(zhì)基因的載體一起感染細胞后，培養(yǎng)該細胞，在其中制備由作為目的的蛋白質(zhì)與多角體蛋白質(zhì)構(gòu)成的復合結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)復合物。
6.一種生物傳感器，其特征在于是將權(quán)利要求1至4中任一項記載的蛋白質(zhì)復合物點狀或線狀地排列、固定在基底上。
7.一種生物傳感器，其特征在于是將權(quán)利要求1至4中任一項記載的蛋白質(zhì)復合物以可以與在基底上形成的凹陷檢測液中物質(zhì)接觸的方式填充的。
8.一種生物傳感器，其特征在于是將權(quán)利要求1至4中任一項記載的蛋白質(zhì)復合物以可以與檢測液中物質(zhì)接觸的方式填充到容器內(nèi)的。
9.一種固定化酶，是將權(quán)利要求1至4中任一項記載的蛋白質(zhì)復合物的目的蛋白質(zhì)填充到作為酶的容器中形成的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)復合物及其制備方法。還提供利用蛋白質(zhì)復合物的生物傳感器、固定化酶等用途。由封入昆蟲病毒的多角體蛋白質(zhì)與具有細胞質(zhì)多角體病病毒的外殼蛋白質(zhì)VP3的限定區(qū)域，具體地從N末端到第40個氨基酸殘基與從第41個氨基酸殘基到第79個氨基酸殘基中任何一個范圍內(nèi)的區(qū)域作為多角體包埋信號的目的蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)復合物及其制備方法。多角體蛋白質(zhì)具有相對于目的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提高或者保護或保存性提高，或它們?nèi)我獾慕M合效果。目的蛋白質(zhì)，選自具有熒光或發(fā)光機能的蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、細胞因子、受體和生理活性蛋白質(zhì)中的至少一種。以將上述蛋白質(zhì)復合物以點狀或線狀排列、固定在基底上為特征的生物傳感器。
文檔編號C07K14/005GK1723282SQ20048000185
公開日2006年1月18日 申請日期2004年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月10日
發(fā)明者池田敬子 申請人:株式會社蛋白質(zhì)晶體