專利名稱：一種豬卵透明帶－3β蛋白的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說是一種豬卵透明帶-3β蛋白的合成方法。
背景技術(shù)：
在全世界人口急劇增加的今天，避孕的研究正越來越受到人們的重視。以免疫方式抑制受精而非破壞早期胚胎發(fā)育的避孕方式比較符合人道主義精神，因此對(duì)相關(guān)的免疫避孕疫苗的開發(fā)具有重要的意義。哺乳動(dòng)物透明帶是哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞外的一層半透明的酸性糖蛋白膜，在誘發(fā)精子頂體反應(yīng)、精卵識(shí)別、結(jié)合、穿透后阻止多精入卵的過程中起著重要作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞透明帶的研究中，對(duì)小鼠和豬的透明帶的研究最為深入，而豬透明帶(pig Zona pellucida，pZP)對(duì)異種哺乳動(dòng)物有很強(qiáng)的免疫原性，其抗體與人透明帶有交叉反應(yīng)并具有阻斷人精卵相互反應(yīng)的能力，因而可以發(fā)展成為避孕疫苗及其相關(guān)生物制品。
豬卵母細(xì)胞外包繞著一層非細(xì)胞性半透明被膜，它是由生物化學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)截然不同的3種糖蛋白組成，分別是相對(duì)蛋白分子質(zhì)量79kDa的pZP1、59kDa的pZP3α和46kDa的pZP3β。通常認(rèn)為pZP3α上含有精子接觸的主要受體，然而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，pZP3β能輔助pZP3α形成高分子量的復(fù)合物使產(chǎn)生非常高親和性的精卵結(jié)合，其效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pZP3α的單獨(dú)作用，因此pZP3β與精卵反應(yīng)有重要的關(guān)系。另外，由于抗pZP3β抗體能在體外與人ZP發(fā)生交叉反應(yīng)，從而抑制人精卵結(jié)合，故它也一直被看作是研制抗受精避孕疫苗的一個(gè)潛在抗原。因此獲得大量的pZP3β對(duì)于制備相關(guān)避孕疫苗及診斷不育癥試劑盒的開發(fā)是相當(dāng)必要的，而目前獲得pZP3β的方法主要是采用生化提取技術(shù)直接從豬卵巢中提取，這種方法工藝復(fù)雜、成本昂貴、且不適于大量生產(chǎn)。
pZP3β的DNA已于1994年被克隆(Jerrrey D.Harris等，TheJournal of sequencing and mapping，Vol.4，PP.361-393)，有研究人員也針對(duì)該基因進(jìn)行了原核系統(tǒng)的融合表達(dá)，但從目前公開的報(bào)道看，在原核系統(tǒng)中對(duì)其進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)率都很低，而且采用的表達(dá)系統(tǒng)只能用于試驗(yàn)室研究(徐萬祥等，生物工程學(xué)報(bào)，Vol.17，16-19，2001)，對(duì)后期的開發(fā)有局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單、成本低、適用于大規(guī)模生產(chǎn)豬卵透明帶-3β蛋白的方法。
本發(fā)明首先是在不改變天然豬卵透明帶-3β蛋白的氨基酸序列的情況下，對(duì)天然豬卵透明帶-3β基因的翻譯起始區(qū)前十個(gè)密碼子進(jìn)行偏好性的修改。前10個(gè)密碼子未修改前為CCG CAG CCC GTC TGGCAG GAC GAA GGC CAG。經(jīng)過修改后，前10個(gè)密碼子的堿基改變?yōu)镃CG CAACCGGTGTGG CAAGATGAA GGC CAG；修改前G+C含量為73.32％，經(jīng)過綜合考慮密碼子偏好性和對(duì)其G+C含量的適當(dāng)降低，修改后的G+C含量降為63.32％。然后，以此設(shè)計(jì)引物，并引入適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，則上游引物為5’＜ CCG CAACCGGTGTGG CAAGATGAA GGC CAG＞3’，酶切下游引物5’＜ TTA TCA CGA GGT GGG GGA GGA GGT GGA＞3；其中 代表酶切位點(diǎn)的堿基序列。
然后以含有天然未修改的膜外型豬卵透明帶-3β基因的質(zhì)粒pZ57為模板，以合成的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為首先94℃5min，再94℃30sec、58℃45sec、72℃45sec共30個(gè)循環(huán)，再72℃10min。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳分離后，對(duì)目的片段切膠回收，采用常規(guī)的可方便購買到的DNA凝膠回收試劑盒提取純化，收集純化后的目的片段。
目標(biāo)載體pET-3c采用NdeI和BamHI雙酶切，PCR擴(kuò)增的pZP3β基因片段也用NdeI和BamHI雙酶切，分別純化后用T4DNA連接酶16℃1h～16h連接。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布LB-AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取3-5個(gè)菌落小規(guī)模提取質(zhì)粒，酶切鑒定，再將有酶切片段的重組子進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，進(jìn)一步確定pZP3β目的基因片段已克隆到pET-3c載體中，形成重組質(zhì)粒pET-ZP3β。
將重組質(zhì)粒pET-ZP3β轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)pLYSs，涂布LB-AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取1個(gè)菌落，于含有AMP和氯霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)，至OD值約為0.6時(shí)，加人IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pZP3β非融合目的蛋白，誘導(dǎo)3h后收集菌體，加入蛋白裂解液進(jìn)行SDS-PAGE表達(dá)分析。
完成表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE后，將凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，以將所有蛋白條帶轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，采用-抗pZP3β抗體的兔抗豬IgGs和二抗羊抗兔IgG進(jìn)行免疫印記分析。
本發(fā)明對(duì)pZP3β的DNA序列首先去信號(hào)肽和跨膜區(qū)使之成為膜外型的非融合基因，在不改變氨基酸序列的情況下進(jìn)行了適當(dāng)位點(diǎn)的點(diǎn)突變，克隆到適合工業(yè)化生產(chǎn)的表達(dá)載體中，再轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)墓こ叹羞M(jìn)行表達(dá)。通過這一系列的調(diào)整，結(jié)果表明只有這種修改后的基因序列才能在原核表達(dá)系統(tǒng)中能得到理想的非融合膜外型豬卵透明帶-3β蛋白的表達(dá)。用該方法來生產(chǎn)豬卵透明帶-3β蛋白具有工藝簡單、成本低、適用于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是重組質(zhì)粒pET-ZP3β中目的片段的測序結(jié)果圖；圖2是重組質(zhì)粒pET-ZP3β的酶切鑒定和PCR鑒定電泳圖；圖3是pZP3β蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖；圖4是pZP3β蛋白的免疫印記分析電泳圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
(1)引物合成引物由上海博亞生物工程公司合成。
ZPF5’＜ CCG CAACCGGTGTGG CAAGATGAAGGC CAG＞3’ZPR5’＜ TTA TCA CGA GGT GGG GGA GGA GGTGGA＞3(2)pZP3β目的基因片段的PCR擴(kuò)增以pZ57為模板，以合成的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為首先94℃5min，再94℃30sec、58℃45sec、72℃45sec共30個(gè)循環(huán)，再72℃10min。切膠回收，收集目的片段pZP3β。
(3)重組質(zhì)粒pET-ZP3β的構(gòu)建pET-3c用NdeI和BamHI雙酶切，PCR擴(kuò)增的pZP3β基因片段也用NdeI和BamHI雙酶切，分別純化后用T4DNA連接酶16℃30min連接。
(4)重組質(zhì)粒pET-ZP3β的酶切鑒定和PCR鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布LB-AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取3-5個(gè)菌落小規(guī)模提取質(zhì)粒，酶切鑒定，再將有酶切片段的重組子進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，進(jìn)一步確定pZP3β目的基因片段已克隆到pET-3c載體中，形成重組質(zhì)粒pET-ZP3β。
見圖1，重組質(zhì)粒pET-ZP3β經(jīng)上海博亞生物工程有限公司測序鑒定，結(jié)果證明，其核苷酸序列于預(yù)期的一致。
見圖2，經(jīng)DNA電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-ZP3β經(jīng)雙酶切得到一近1000bp左右的片段，而且通過引物進(jìn)行PCR的鑒定也表明擴(kuò)增得到一段近1000bp左右的片段，說明目的基因已克隆入表達(dá)載體中。
標(biāo)記如下1λDNA/HindIII；2pET-3C；；3pET-ZP3β；4pET-ZP3β/Nde I+BamH I；5pET-ZP3β的PCR鑒定(PCR ofpET-ZP3β)；6Φ174/HicII；7pET-3C/Nde I+BamH I(5)重組質(zhì)粒pET-ZP3β轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)pLYSs及其誘導(dǎo)表達(dá)pZP3β將重組質(zhì)粒pET-ZP3β轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)pLYSs，涂布LB-AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取1個(gè)菌落，于含有AMP和氯霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)，至OD值約為0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pZP3β非融合目的蛋白，誘導(dǎo)3h后收集菌體，加入蛋白裂解液進(jìn)行SDS-PAGE表達(dá)分析。
見圖3，SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌體蛋白電泳條帶與為誘導(dǎo)的菌體電泳條帶相比，在42Kb處可見一清晰的條帶，為表達(dá)的pZP3β非融合目的蛋白，與理論預(yù)計(jì)相一致。
標(biāo)記如下1、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(Marker)；2、誘導(dǎo)后的重組工程菌(induced)；3、誘導(dǎo)前的重組工程菌(uninduced)。
(6)重組pZP3β蛋白表達(dá)產(chǎn)物的免疫印記分析完成表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE后，將凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，以將所有蛋白條帶轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，采用一抗pZP3β抗體的兔抗豬IgGs和二抗羊抗兔IgG進(jìn)行免疫印記分析。
見圖4，經(jīng)Westen-blot的分析，在42Kb處有一特異的印跡，說明能與抗pZP3β抗體特異結(jié)合，是預(yù)期的目的蛋白。
標(biāo)記如下1、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(Marker)；2、誘導(dǎo)后的重組工程菌(induced)；3、誘導(dǎo)前的重組工程菌(uninduced)。
權(quán)利要求
1.一種合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于采用基因工程方法合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于所述的基因工程方法包括如下步驟(1)以5’＜CATATG CCG CAA CCG GTG TGG CAA GAT GAA GGCCAG＞3’和5’＜GGATCC TTA TCA CGA GGT GGG GGA GGA GGTGGA＞3’為引物，質(zhì)粒pZ57為模板，PCR擴(kuò)增豬卵透明帶-3β基因；(2)PCR擴(kuò)增的pZP3β基因片段與目標(biāo)載體pET-3c用NdeI和BamHI雙酶切，然后用連接酶連接成重組質(zhì)粒pET-ZP3β；(3)重組質(zhì)粒pET-ZP3β轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)pLYSs并用刺激因子誘導(dǎo)其表達(dá)pZP3β。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于步驟(1)所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為首先94℃5min，再94℃30sec、58℃45sec、72℃45sec共30個(gè)循環(huán)，再72℃10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于步驟(2)所述的連接酶為T4DNA連接酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于步驟(2)所述的用連接酶連接的反應(yīng)條件為16℃1h～16h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于步驟(3)所述的刺激因子為IPTG。
全文摘要
一種豬卵透明帶－3β蛋白的合成方法。豬卵透明帶－3β蛋白與精卵反應(yīng)有重要關(guān)系。抗pZP3β抗體能在體外與人卵透明帶發(fā)生交叉反應(yīng)，從而抑制人精卵結(jié)合，故其一直被看作是研制抗受精避孕疫苗的一個(gè)潛在抗原。因此獲得大量的pZP3β對(duì)于制備相關(guān)避孕疫苗及診斷不育癥試劑盒的開發(fā)是相當(dāng)必要的。而目前獲得pZP3β的方法主要是采用生化提取技術(shù)直接從豬卵巢中提取，該種方法工藝復(fù)雜、成本昂貴、且不適于大量生產(chǎn)。本發(fā)明提供了一種工藝簡單、成本低、適用于大規(guī)模生產(chǎn)豬卵透明帶－3β蛋白的方法。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1789281SQ20041007739
公開日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者朱偉杰, 謝秋玲, 陳小佳, 孫奮勇, 李菁, 洪岸 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)