專利名稱：一種β－葡聚糖肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由灰樹花菌絲體制備β-葡聚糖肽的方法及其在免疫調(diào)節(jié)和抗癌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
灰樹花(Grifola.frondosa)屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌屬，擔(dān)子菌，為名貴食用和藥用真菌，利用液體發(fā)酵工藝可以獲得大量灰樹花菌絲體。研究表明，灰樹花多糖具有廣泛的藥理活性，但從灰樹花子實(shí)體和發(fā)酵菌絲體中制備的多糖具有不同的結(jié)構(gòu)，在不同的培養(yǎng)條件下得到的灰樹花多糖的結(jié)構(gòu)也有差別；結(jié)構(gòu)不同，活性也不同。在一中國專利(CN1398898A)中，披露了一種灰樹花子實(shí)體多糖肽的制備方法，該方法采用水提取、酸提取、堿提取以及乙醇沉淀獲得多糖肽，所得到的多糖肽中雜蛋白采用氯仿-正丁醇混合溶液(Sevag)法，三氯乙酸法和酶盒法處理，其糖鏈以β-1，3-糖苷鍵為主；在另一專利(CN1398979A)中，披露了一種灰樹花多糖肽的生產(chǎn)方法，該方法采用熱水提取和乙醇沉淀得到多糖肽，該糖肽也是一種混合物，未經(jīng)進(jìn)一步分離，且其糖鏈結(jié)構(gòu)不確定。目前，從灰樹花中制備β-葡聚糖肽還缺乏有效的方法，并且所得到的產(chǎn)品純度不高，還不能有效地用作免疫調(diào)節(jié)劑和抗癌劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以灰樹花發(fā)酵菌絲體為原料制備出一種結(jié)構(gòu)上有新特點(diǎn)的β-葡聚糖肽，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種β-葡聚糖肽，其特征是它的糖鏈以β-1，6-葡聚糖為主鏈，β-1，3-葡聚糖為支鏈。
一種β-葡聚糖肽的制備方法，其特征是將灰樹花菌絲體用乙醇脫脂，用熱水提取，用堿提取，用酸中和，超濾濃縮脫鹽，用乙醇沉淀，再經(jīng)柱色譜分離，用鹽溶液梯度洗脫，按洗脫峰收集合并，并超濾濃縮脫鹽、干燥。
β-葡聚糖肽用作免疫調(diào)節(jié)劑。
β-葡聚糖肽用作抗腫瘤劑。
本發(fā)明一次分離即可容易除去其中的雜蛋白、雜多糖和其它雜質(zhì)得到高純度β-葡聚糖肽，大大簡化了操作并提高了β-葡聚糖肽的制備速度與得率，同時(shí)也避免了采用酶法容易破壞β-葡聚糖肽中肽鏈結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)，該產(chǎn)品具有免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性。
附圖表說明附

圖1為本發(fā)明制備的β-葡聚糖肽的紅外光譜圖。
附圖2為本發(fā)明制備的β-葡聚糖肽的13C-NMR譜圖從圖1可以看出，本發(fā)明的產(chǎn)品在3382cm-1處為O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，且存在分子間氫鍵，2894cm-1處為糖環(huán)上C-H振動(dòng)峰，1631cm-1和1413cm-1處為糖肽中酰胺(-NH-CO-)鍵吸收峰，1075-1180cm-1處三個(gè)峰為吡喃葡萄糖特征吸收峰，896cm-1為葡萄糖端基βC-H的變角振動(dòng)特征吸收峰，由此可以證明該產(chǎn)品為β-葡聚糖肽。
從圖2可知，所得β-葡聚糖肽中糖鏈的13C-NMR信號(hào)歸屬如下103.6ppm和103.2ppm為βC1→取代信號(hào)峰；86.9ppm和86.3ppm為βC3→取代信號(hào)峰；70.4ppm為βC6→取代信號(hào)峰；76.5ppm，68.6ppm，和76.7ppm分別為未取代C3，C4，C5信號(hào)峰。
具體實(shí)施例方式
向100克灰樹花菌絲體中加入1000毫升濃度為95％的乙醇水溶液，80℃提取2小時(shí)，離心收集沉淀，然后向該沉淀中加入1500毫升蒸餾水，于100℃回流提取2小時(shí)，離心收集沉淀，然后向該沉淀中加入1000毫升5％(重量百分比，下同)NaOH水溶液，于4℃攪拌提取6小時(shí)，離心收集清液，該清液用醋酸中和并離心收集上清液，將后者超濾濃縮、脫鹽，加入無水乙醇使乙醇濃度為85％，離心收集沉淀，該沉淀進(jìn)一步用Q-Sepharose FF柱色譜分離，用含有氯化鈉(pH7)的水溶液進(jìn)行梯度洗脫，得到β-葡聚糖肽，它的分子量1萬-20萬道爾頓，其中總糖含量65％-98％，肽含量35-2％。
本發(fā)明中所述的95％乙醇可以是75％-95％的乙醇；所述的NaOH可該用KOH，濃度可以是2％-20％，堿液提取溫度可以是-5℃-75℃，堿液提取時(shí)間可以是2-24小時(shí)。所述的醋酸中和可以用稀鹽酸或者稀硫酸；所述的Q-Sepharose FF可以改用DOWEX MSA-1或者DEAE-Sephacel。
用本發(fā)明的產(chǎn)品按現(xiàn)有的方法對(duì)小鼠作了免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1和表2所示。表1為β-葡聚糖肽對(duì)小鼠免疫器官的影響，表2為β-葡聚糖肽對(duì)小鼠抑瘤率的影響。從表1和表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明的β-葡聚糖肽能明顯提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，抑瘤率達(dá)73％，具有明顯的提高免疫和抗癌活性。
表1 β-葡聚糖肽對(duì)小鼠免疫器官的影響

表2 β-葡聚糖肽對(duì)小鼠抑瘤率的影響

權(quán)利要求
1 一種β-葡聚糖肽，其特征是它的糖鏈中以β-1，6-葡聚糖為主鏈，β-1，3-葡聚糖為支鏈。
2 一種β-葡聚糖肽的制備方法，其特征是將灰樹花菌絲體用乙醇脫脂，用熱水提取，用堿提取，用酸中和，超濾濃縮脫鹽，用乙醇沉淀，再經(jīng)柱色譜分離，用鹽溶液梯度洗脫，按洗脫峰收集合并，并超濾濃縮脫鹽、干燥。
3 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述的堿為NaOH或者KOH。堿提取濃度為2-20％，堿液提取的溫度-5-75℃，堿提取的時(shí)間為2-24小時(shí)；所述的酸可以是稀醋酸，稀鹽酸或稀硫酸。
4 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述的柱色譜分離填料為DOWEX MSA-1，Q-Sepharose F.F或者DEAE-Sephacel，洗脫用的鹽溶液為含氯化鈉的水溶液，采用梯度洗脫，并用紫外監(jiān)測器檢測。
5 β-葡聚糖肽用作免疫調(diào)節(jié)劑。
6 β-葡聚糖肽用作抗腫瘤劑。
全文摘要
一種β－葡聚糖肽，其特征是它的糖鏈中以β－1，6－葡聚糖為主鏈，β－1，3－葡聚糖為支鏈。制備時(shí)將灰樹花菌絲體用乙醇脫脂，用熱水提取，用堿提取，用酸中和，超濾濃縮脫鹽，用乙醇沉淀，再經(jīng)柱色譜分離，用鹽溶液梯度洗脫，按洗脫峰收集合并，并超濾濃縮脫鹽、干燥。本發(fā)明一次分離即可容易除去其中的雜蛋白、雜多糖和其它雜質(zhì)得到高純度β－葡聚糖肽，大大簡化了操作并提高了β－葡聚糖肽的制備速度與得率，同時(shí)也避免了采用酶法容易破壞β－葡聚糖肽中肽鏈結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)。該產(chǎn)品可用于制備免疫調(diào)節(jié)劑和抗癌藥物。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1663959SQ200410023840
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2004年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月27日
發(fā)明者于廣利, 徐澤平, 趙峽, 李春林 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué), 徐澤平