專利名稱：生物修飾重組人生長激素復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物修飾重組人生長激素復(fù)合物及其制備方法，屬肽或蛋白質(zhì)的生物修飾物及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人生長激素(hGH)是由人腦垂體前葉分泌的一種由191個氨基酸組成的多肽激素。人們已經(jīng)通過基因工程技術(shù)獲得重組人生長激素(rhGH)。1985年美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)rhGH作為藥品上市，中國也于1998年批準(zhǔn)作為藥品上市(李元主編“基因工程藥物”，化學(xué)工業(yè)出版社，2002年12月第一版P3-5)，主要用于治療兒童自發(fā)性垂體性侏儒癥，臨床上還可用于治療燒傷、骨折、外傷、出血性潰瘍、特納綜合癥、組織壞死、肌肉萎縮癥、骨質(zhì)疏松和肥胖癥等。重組人生長激素是一種活性蛋白，在體內(nèi)很容易被蛋白酶降解而造成生物穩(wěn)定性差，同時重組人生長激素分子量相對較小，為21000，很容易被腎小球濾過，因而體內(nèi)半衰期短(只有30分鐘左右)，需長期反復(fù)注射給藥，一般需要3個月至2年連續(xù)給藥，給病人帶來痛苦和不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提出一種生物修飾重組人生長激素復(fù)合物，其特征在于，它由重組人生長激素rhGH和氨基供體物質(zhì)聚乙二醇衍生物——聚乙二醇烷基胺(PEG)或單甲氧基聚乙二醇胺(mPEG)組成，重組人生長激素的氨基酸序列中含有谷氨酰胺殘基，氨基供體物質(zhì)含有氨基，重組人生長激素的谷氨酰胺殘基的r位酰胺與氨基供體物質(zhì)的伯氨位上的氨基通過酰胺鍵連接在一起，分子量不小于24350。該復(fù)合物有生物穩(wěn)定性高和體內(nèi)半衰期長的優(yōu)點。
本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是將具有谷氨酰胺殘基的重組人生長激素和氨基供體物質(zhì)聚乙二醇烷基胺PEG或單甲氧基聚乙二醇mPEG，在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)的催化下進(jìn)行反應(yīng)，在重組人生長激素谷氨酰胺殘基的γ-位酰胺與氨基供體物質(zhì)的伯氨位上的氨基形成酰胺鍵，從而獲得生物修飾重組人生長激素復(fù)合物，即PEG-rhGH或mPEG-rhGH。
現(xiàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
一種生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法，其特征在于，操作步驟如下第一步，稱取1份重量的重組人生長激素溶解于1000份重量的100mM含有5mMEDTA的Tris-HCl pH6.0溶液中，使之溶解；第二步，向第一步溶液中加入0.8～16份重量的氨基供體物質(zhì)，混和均勻，混和后的溶液中待修飾的重組人生長激素和氨基供體物質(zhì)的摩爾比為1∶5～100，所述的氨基供體物質(zhì)是聚乙二醇烷基胺，分子量為3350；第三步，向第二步所得混和溶液中加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶mTG，混和均勻，使其終濃度為0.1～1.0u/ml；第四步，將上一步處理的含有mTG的混合溶液置于4～55℃下反應(yīng)0.5～24h；第五步，反應(yīng)結(jié)束后，取20ul反應(yīng)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢查修飾程度；第六步，取修飾反應(yīng)混合物上凝膠過濾層析柱進(jìn)行分離純化，分離純化條件為層析柱Superdex75(1×30cm)，緩沖液為含有0.15MNaCl的5mM PB pH7.4，流速為0.5ml/min，柱壓為1.5Mpa；第七步，收集生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的吸收峰溶液；第八步，將收集到的復(fù)合物吸收峰溶液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，得到0.08-0.32mg純的、分子量為不小于24350的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物PEG-rhGH。
本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步特征在于，氨基供體物質(zhì)是單甲氧基聚乙二醇mPEG，分子量為5000，用量為1.2～24份重量。
本發(fā)明的優(yōu)點是通過使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)，在溫和條件下，可以將具有谷氨酰胺基的重組人生長激素與具有氨基的聚乙二醇衍生物之間形成酰胺鍵而成修飾復(fù)合物。這一生物酶修飾方法，具有反應(yīng)條件溫和，容易保持重組人生長激素的生物活性；由于酶反應(yīng)需要一定的空間位阻，因而在重組人生長激素特定位置上進(jìn)行反應(yīng)的可能性高，所以副產(chǎn)物種類少，也易于控制。這種在mTG生物活性酶催化下經(jīng)聚乙二醇衍生物生物修飾的重組人生長激素復(fù)合物，由于聚乙二醇衍生物PEG或mPEG在重組人生長激素表面形成屏障，使得該重組人生長激素復(fù)合物不會被體內(nèi)蛋白酶降解，從而使該重組人生長激素復(fù)合物的生物穩(wěn)定性得到提高。同時由于經(jīng)修飾的重組人生長激素復(fù)合物的分子量變大，不易濾過腎小球，而使該重組人生長激素復(fù)合物的體內(nèi)半衰期大大延長，因而提高了該重組人生長激素的生物利用度。
具體實施例方式
所有的實施例均按照上述的制備方法進(jìn)行操作。
實施例1 生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法之一。在本實施例中，用于生物修飾的氨基供體物質(zhì)為聚乙二醇烷基胺。
第一步，稱取1.0mg重組人生長激素溶解于1克的含有5mM EDTA的100mM Tris-HCl pH6.0溶液中，使之溶解；第二步，向第一步溶液中加入0.8mg聚乙二醇烷基胺，混和均勻，使混和后的溶液中待修飾重組人生長激素和聚乙二醇烷基胺的摩爾比為1∶5；第三步，向第二步所得混和物中加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶mTG，混和均勻，使其終濃度為0.1～1.0u/ml；第四步，將第三步所得含有mTG的混合物置于4～55℃下反應(yīng)0.5～24h；第五步，反應(yīng)結(jié)束后，取20ul反應(yīng)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢查修飾程度；第六步，取修飾反應(yīng)混合物上凝膠過濾層析柱進(jìn)行分離純化，分離純化條件為層析柱Superdex75(1×30cm)，緩沖液為含有0.15MNaCl的5mM PB pH7.4，流速為0.5ml/min，柱壓為1.5Mpa；第七步，收集生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的吸收峰溶液；第八步，將收集到的修飾復(fù)合物吸收峰溶液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，得到0.2-0.25mg純的、分子量為不小于24350的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物PEG-rhGH。
實施例2 生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法之二。在本實施例中，用于生物修飾的氨基供體物質(zhì)為聚乙二醇烷基胺。
第一步，稱取1.0mg重組人生長激素溶解于1克的含有5mM EDTA的100mM Tris-HCl pH6.0溶液中，使之溶解；第二步，向第一步溶液中加入8mg聚乙二醇烷基胺，混和均勻，使混和后的溶液中待修飾重組人生長激素和聚乙二醇烷基胺的摩爾比為1∶50；第三步至第七步按實施例一中相應(yīng)操作步驟進(jìn)行；
第八步，將收集到的修飾復(fù)合物吸收峰溶液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，得到0.27-0.32mg純的、分子量不小于24350的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物PEG-rhGH。
實施例3 生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法之三。在本實施例中，用于生物修飾的氨基供體物質(zhì)為聚乙二醇烷基胺。
第一步，稱取1.0mg重組人生長激素溶解于1克的含有5mM EDTA的100mM Tris-HCl pH6.0溶液中，使之溶解；第二步，向第一步溶液中加入16mg聚乙二醇烷基胺，混和均勻，使混和后的溶液中待修飾重組人生長激素和聚乙二醇烷基胺的摩爾比為1∶100；第三步至第七步按實施例一中相應(yīng)操作步驟進(jìn)行；第八步，將收集到的修飾復(fù)合物吸收峰溶液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，得到0.18-0.22mg純的、分子量不小于24350的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物PEG-rhGH。
實施例4 生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法之四。在本實施例中，用于生物修飾的氨基供體物質(zhì)為單甲氧基聚乙二醇胺。
第一步，稱取1.0mg重組人生長激素溶解于含有1克的5mM EDTA的100mM Tris-HCl pH6.0溶液中，使之溶解；第二步，向第一步溶液中加入1.2mg單甲氧基聚乙二醇胺，混和均勻，使混和后的溶液中待修飾重組人生長激素和單甲氧基聚乙二醇胺的摩爾比為1∶5；第三步至第七步按實施例一中相應(yīng)操作步驟進(jìn)行；第八步，將收集到的修飾復(fù)合物吸收峰溶液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，得到0.08-0.13mg純的、分子量不小于26000的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物mPEG-rhGH。
實施例5 生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法之五。在本實施例中，用于生物修飾的氨基供體物質(zhì)為單甲氧基聚乙二醇胺。
第一步，稱取1.0mg重組人生長激素溶解于含有1克的5mM EDTA的100mM Tris-HCl pH6.0溶液中，使之溶解；第二步，向第一步溶液中加入12mg單甲氧基聚乙二醇胺，混和均勻，使混和后的溶液中待修飾重組人生長激素和單甲氧基聚乙二醇胺的摩爾比為1∶50；第三步至第七步按實施例一中相應(yīng)操作步驟進(jìn)行；第八步，將收集到的修飾復(fù)合物吸收峰溶液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，得到0.2-0.25mg純的、分子量不小于26000的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物mPEG-rhGH。
實施例6 生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法之六。在本實施例中，用于生物修飾的氨基供體物質(zhì)為單甲氧基聚乙二醇胺。
第一步，稱取1.0mg重組人生長激素溶解于1克的含有5mM EDTA的100mM Tris-HCl pH6.0溶液中，使之溶解；第二步，向第一步溶液中加入24mg單甲氧基聚乙二醇胺，混和均勻，使混和后的溶液中待修飾重組人生長激素和單甲氧基聚乙二醇胺的摩爾比為1∶100；第三步至第七步按實施例一中相應(yīng)操作步驟進(jìn)行；第八步，將收集到的修飾復(fù)合物吸收峰溶液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，得到0.12-0.17mg純的、分子量不小于26000的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物mPEG-rhGH。
權(quán)利要求
1.一種生物修飾重組人生長激素復(fù)合物，其特征在于，它由重組人生長激素rhGH和氨基供體物質(zhì)聚乙二醇衍生物——聚乙二醇烷基胺(PEG)或單甲氧基聚乙二醇胺(mPEG)組成，重組人生長激素的氨基酸序列中含有谷氨酰胺殘基，氨基供體物質(zhì)含有氨基，重組人生長激素的谷氨酰胺殘基的r位酰胺與氨基供體物質(zhì)的伯氨位上的氨基通過酰胺鍵連接在一起，分子量不小于24350。
2.權(quán)利要求1所述的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法，其特征在于，操作步驟如下第一步，稱取1份重量的重組人生長激素溶解于1000份重量的100mM含有5mMEDTA的Tris-HCl pH6.0溶液中，使之溶解；第二步，向第一步溶液中加入0.8～16份重量的氨基供體物質(zhì)，混和均勻，混和后的溶液中待修飾的重組人生長激素和氨基供體物質(zhì)的摩爾比為1∶5～100，所述的氨基供體物質(zhì)是聚乙二醇烷基胺，分子量為3350；第三步，向第二步所得混和溶液中加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶mTG，混和均勻，使其終濃度為0.1～1.0u/ml；第四步，將上一步處理的含有mTG的混合溶液置于4～55℃下反應(yīng)0.5～24h；第五步，反應(yīng)結(jié)束后，取20ul反應(yīng)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢查修飾程度；第六步，取修飾反應(yīng)混合物上凝膠過濾層析柱進(jìn)行分離純化，分離純化條件為層析柱Superdex75(1×30cm)，緩沖液為含有0.15MNaCl的5mM PB pH7.4，流速為0.5ml/min，柱壓為1.5Mpa；第七步，收集生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的吸收峰溶液；第八步，將收集到的復(fù)合物吸收峰溶液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，得到0.08-0.32mg純的、分子量為不小于24350的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物PEG-rhGH。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物修飾重組人生長激素復(fù)合物的制備方法，其特征在于，氨基供體物質(zhì)是單甲氧基聚乙二醇mPEG，分子量為5000，用量為1.2～24份重量。
全文摘要
一種生物修飾重組人生長激素復(fù)合物及其制備方法，屬肽或蛋白質(zhì)的生物修飾物及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。將具有谷氨酰胺殘基的重組人生長激素和氨基供體物質(zhì)聚乙二醇烷基胺PEG或單甲氧基聚乙二醇mPEG，在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)的催化下進(jìn)行反應(yīng)，在重組人生長激素谷氨酰胺殘基的γ－位酰胺與氨基供體物質(zhì)的伯氨位上的氨基形成酰胺鍵，從而獲得生物修飾重組人生長激素復(fù)合物，即PEG－rhGH或mPEG－rhGH。該生物修飾重組人生長激素復(fù)合物有生物穩(wěn)定性高和體內(nèi)半衰期長的優(yōu)點，適宜制備長效型注射型藥劑或研制口服型藥劑。
文檔編號C07K14/61GK1528787SQ200310107990
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者吳自榮, 黃靜, 劉晨, 卞慧芳 申請人:華東師范大學(xué)