專利名稱：藥物化合物菠蘿酰酯及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的藥物化合物菠蘿酰酯、制備方法及其在醫(yī)藥方面的新用途，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域。
菠蘿，為鳳梨科植物鳳梨Ananas comosus(L.)Merr.[Bromelia comosa L.；A.sativusSchult.Et Schult.f.]的果實(shí)。原產(chǎn)美洲，現(xiàn)廣植于熱帶地區(qū)，我國(guó)福建、廣東、海南、廣西、云南等地均有種植。本品始載于清.吳其?！吨参锩麑?shí)圖考》，以露兜子為名。該書記載“露兜子產(chǎn)廣東，一名波羅，生山野間，實(shí)如蘿卜，上生葉一簇，尖長(zhǎng)深齒，味色香具佳。果熟金黃色，皮堅(jiān)如魚鱗狀，去皮食肉，香甜無(wú)渣，六月熟”。
古時(shí)對(duì)于菠蘿葉無(wú)明確記載，現(xiàn)代人們常用菠蘿葉纖維為編織和造紙的原料(《中國(guó)高等植物圖鑒.第5冊(cè)》科學(xué)出版社1976)。近時(shí)有記載菠蘿葉具有消食和胃，止瀉的功效，主治夏日暑瀉，消化不良，胃脘脹痛等(《中華本草.第8卷》上?？茖W(xué)技術(shù)出版社1999)。
菠蘿葉作為藥用的記載比較少見(jiàn)，尤其是未見(jiàn)報(bào)道從菠蘿葉中分離提取的新化合物-菠蘿酰酯及其在醫(yī)藥方面的新用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的藥物化合物菠蘿酰酯。
本發(fā)明的另一目的是提供菠蘿酰酯的一種制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供菠蘿酰酯在醫(yī)藥方面的用途。
本發(fā)明提供的藥物化合物菠蘿酰酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式(I)所示 具體地說(shuō)本發(fā)明提供的菠蘿酰酯為從菠蘿葉分離制備的一種新的化合物，系統(tǒng)命名為1，3-O-di[β-(3，4-dihydroxyphenyl)propenoyl]glycerides，中文名，1，3-O-二-β-3，4-二-羥基苯基丙烯酰甘油酯，其結(jié)構(gòu)如下式(II)
所述的新化合物菠蘿酰酯的理化性質(zhì)及其各種波譜特征如下該化合物為淡黃色無(wú)定形固體，mp218℃，F(xiàn)eCl3顯藍(lán)黑色，易溶于丙酮、甲醇和乙醇等有機(jī)溶劑。
UVλmax(MeOH)nm219，244，326。
IRνmax(KBr)cm-13386，1683，1638，1601，1532，1446，1375，1284，1184，1112，976，811，596。
HRFAB-MS415.1034[M-1]-，(計(jì)算值為415.1034，分子式為C21H20O9)核磁共振1HNMR、13CNMR及DEPT數(shù)據(jù)如下表菠蘿酰酯的核磁共振波譜數(shù)據(jù)(acetone-d6，δppm)NO.13C-NMR DEPT1H-NMR1 65.09CH24.26(2H，m)2 67.47CH 4.17(1H，m)3 65.09CH24.26(2H，m)＞＝0 166.43α，α′ 114.35 CH 6.31(2H，d，J＝16Hz)β，β′ 145.12 CH 7.60(2H，d，J＝16Hz)1′，1″ 126.702′，2″ 114.49 CH 7.16(2H，d，J＝2.0Hz)3′，3″ 145.414′，4″ 147.915′，5″ 115.48 CH 6.86(2H，d，J＝8.0Hz)6′，6″ 121.66 CH 7.04(2H，dd，J＝2.0，8.0Hz)OH 8.32(4H，s)本發(fā)明還提供了上述菠蘿酰酯的一種制備方法，該方法包括如下步驟(1)先將藥材重量的5～10倍的醇溶劑進(jìn)行常規(guī)加熱提取，得到提取液；(2)將提取液在50～90℃溫度下減壓濃縮后，用藥材重量的2～5倍水溶解，離心或靜止過(guò)濾，棄去沉淀，取上清液；(3)將上清液通過(guò)大孔吸附樹脂，先用水洗脫，洗脫液廢棄，再用濃度大于70％乙醇洗脫，將洗脫液在溫度50～90℃下減壓濃縮，然后減壓干燥或冷凍干燥，得到菠蘿葉提取物；(4)將菠蘿葉提取物用稀乙醇溶劑溶解，再用硅膠拌樣，用硅膠柱色譜分離，用氯仿∶甲醇或石油醚∶丙酮或氯仿∶丙酮梯度洗脫，用葡聚糖凝膠純化，即制得化合物菠蘿酰酯。
在上述制備方法中，步驟(1)中所述的常規(guī)加熱提取方法的加熱溫度為50℃～90℃，提取次數(shù)為3次，每次為30分鐘至2小時(shí)；加熱提取所用的醇溶液為乙醇、甲醇、丙醇或丁醇，其濃度大于30％。
本發(fā)明的方法中所述的用稀乙醇溶液對(duì)菠蘿葉提取物進(jìn)行溶解時(shí)的乙醇濃度為50～70％。
本發(fā)明所提供的新的藥物化合物菠蘿酰酯的用途，主要是指在制備治療體內(nèi)過(guò)氧化物升高及其由此引起的疾病的藥物中的應(yīng)用以及在制備治療體內(nèi)氧化型低密度脂蛋白和高密度脂蛋白升高的藥物中的應(yīng)用。更具體的說(shuō)，該藥物化合物在學(xué)習(xí)記憶功能障礙，癡呆，動(dòng)脈粥樣硬化，冠心病心絞痛，腦血栓等疾病中的應(yīng)用。
在臨床應(yīng)用時(shí)，以常規(guī)的制劑工藝，單獨(dú)使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物。如散劑，丸劑，膠囊劑，片劑，微囊劑，軟膠囊劑，膜劑，栓劑，注射劑，膏劑，酊劑，散劑，沖劑，氣霧劑，各種外用制劑等。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菠蘿酰酯具有明顯的抑制腦過(guò)氧化物MDA升高的作用。體外給藥，最小有效終濃度為3×10-6g/ml，隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。體外給藥，能夠明顯抑制氧化型低密度脂蛋白的生成，有效濃度為0.3-30ug/ml。藥理實(shí)驗(yàn)表明，菠蘿酰酯具有抗氧化和抑制氧化型低密度脂蛋白升高的作用，以該化合物為活性成分，可以用來(lái)制備治療體內(nèi)過(guò)氧化物升高所引起病癥，以及低密度脂蛋白升高所引起的相關(guān)性疾病，如脂代謝紊亂，動(dòng)脈粥樣硬化，冠心病，癡呆，學(xué)習(xí)記憶功能障礙，腦血栓等。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例和藥物實(shí)驗(yàn)資料使本發(fā)明所說(shuō)的菠蘿酰酯的制備及其用途得以證實(shí)，同時(shí)又不應(yīng)將下列實(shí)施例看作是對(duì)本發(fā)明的限制。
制備實(shí)施例1首先用藥材(500克)重量的5倍的100％甲醇將菠蘿葉在50℃加熱提取3次，每次為30分鐘。然后將提取液在50℃溫度下減壓(壓力98Kpa)濃縮后，用藥材重量的2倍水溶解，離心，棄去沉淀；上清液通過(guò)大孔吸附樹脂，先用水洗脫，洗脫液廢棄，再用95％乙醇洗脫，洗脫液在50℃溫度下減壓(壓力98Kpa)濃縮，濃縮物減壓(壓力98Kpa)干燥，得到菠蘿葉提取物。菠蘿葉提取物用80％乙醇溶解，再用200～300目硅膠拌樣，用硅膠柱色譜分離，石油醚∶丙酮梯度洗脫，用葡聚糖凝膠純化，最后得到該化合物---菠蘿酰酯，每公斤藥材能得到約40mg菠蘿酰酯。
制備實(shí)施例2首先用藥材(500克)重量的10倍的30％乙醇將菠蘿葉在90℃加熱提取3次，每次為2小時(shí)。然后提取液在減壓(壓力98Kpa)，溫度在90℃濃縮后，用藥材重量的5倍水溶解，離心，棄去沉淀，上清液通過(guò)大孔吸附樹脂，先用水洗脫，洗脫液廢棄，再用70％乙醇洗脫，洗脫液在溫度為90℃(壓力98Kpa)減壓濃縮，濃縮物減壓(壓力98Kpa)干燥，得到菠蘿葉提取物。菠蘿葉提取物用60％乙醇溶解，再用60-80目硅膠拌樣，用硅膠柱色譜分離，用氯仿∶甲醇梯度洗脫，用葡聚糖凝膠純化，最后得到該化合物---菠蘿酰酯，每公斤藥材能得到約10mg菠蘿酰酯。
制備實(shí)施例3菠蘿酰酯的提取和分離制備首先用藥材(500克)重量的10倍的70％乙醇將菠蘿葉在80℃加熱提取3次，每次為1小時(shí)。然后提取液在減壓(壓力98Kpa)，溫度在50℃濃縮后，用藥材重量的5倍水溶解，離心，棄去沉淀，上清液通過(guò)大孔吸附樹脂，先用水洗脫，洗脫液廢棄，再用80％乙醇洗脫，洗脫液在溫度為50℃(壓力98Kpa)減壓濃縮，濃縮物減壓(壓力98Kpa)干燥，得到菠蘿葉提取物。菠蘿葉提取物用30％乙醇溶解，再用100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱色譜分離，用氯仿∶丙酮梯度洗脫，用葡聚糖凝膠純化，最后得到該化合物---菠蘿酰酯，每公斤藥材能得到約50mg菠蘿酰酯。
藥效實(shí)驗(yàn)例1對(duì)腦MDA生成的影響觀察本發(fā)明菠蘿葉提取物對(duì)小鼠腦MDA生成的抑制作用。本發(fā)明所用菠蘿酰酯，批號(hào)030228。將菠蘿酰酯以生理鹽水配制成所需濃度。實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為雄性ICR小鼠，非近交系封閉群，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重為18-22g。實(shí)驗(yàn)室室溫20-22℃，相對(duì)濕度40％～60％，換氣扇通氣，自然光源12h/日，籠養(yǎng)，每籠10只，每三日清掃籠舍一次。
取正常小鼠，處死后取腦，加入生理鹽水做勻漿液(與腦比例為5∶1)。4℃冰箱靜置5分鐘，取上部均勻混濁液。每管加入腦組織液150uL，加入不同濃度藥液50ul，37℃水浴孵育30分。依次加入10％SDS 0.1ml，50％冰醋酸硫代巴比妥酸液0.5ml和1％鹽酸液2ml。沸水浴15分鐘，取出后冷水置10分鐘，1500轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清于532nm處測(cè)吸光度A值。每組做三復(fù)管。計(jì)算抑制率＝[(對(duì)照組A-給藥組A)/對(duì)照組A×100％]。
所得數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL軟件處理。組間t檢驗(yàn)。
本試驗(yàn)菠蘿酰酯給藥終濃度分別為3×10-7g/ml，3×10-6g/ml，3×10-5g/ml，3×10-4g/ml，3×10-3g/ml。
本試驗(yàn)為體外實(shí)驗(yàn)。本試驗(yàn)空白對(duì)照為等體積生理鹽水.陽(yáng)性藥對(duì)照為維生素E，購(gòu)自Sigma公司。實(shí)驗(yàn)終濃度為3×10-4g/ml。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以Excel軟件處理。
表2 菠蘿酰酯體外對(duì)腦MDA生成的抑制作用(x±s)分組 藥物終濃度 吸光值(532nm)(g/ml)生理鹽水 0.236±0.003菠蘿酰酯 3×10-30.07±0.003**
菠蘿酰酯3×10-40.074±0.002**菠蘿酰酯3×10-50.102±0.004**菠蘿酰酯3×10-60.161±0.004**菠蘿酰酯3×10-70.202±0.003*維生素C 3×10-40.146±0.0011**與生理鹽水組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝3本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菠蘿酰酯體外有較強(qiáng)地抑制缺糖缺氧腦組織MDA生成的作用，最低有效濃度為3×10-6g/ml。提示菠蘿酰酯具有一定的抗氧化的作用，對(duì)于防治因腦內(nèi)過(guò)氧化物升高所引起的神經(jīng)精神功能障礙，癡呆等都有積極的意義。
藥效實(shí)驗(yàn)例2體外對(duì)氧化型低度脂蛋白升成的抑制作用本發(fā)明所用雄性家兔，體重2.274±0.537Kg。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院動(dòng)物室提供。合格證號(hào)京動(dòng)管質(zhì)字(96)第006號(hào)。本發(fā)明所用菠蘿酰酯，批號(hào)030228。將菠蘿酰酯以生理鹽水配制成所需濃度。
本發(fā)明試驗(yàn)LDL的提取制備。25％的烏拉坦耳緣靜脈麻醉(2ml-4ml/kg)，耳靜脈體內(nèi)肝素抗凝，頸總動(dòng)脈取血100ml左右，用終濃度為0.4mg/ml的EDTA抗氧化。1500rpm離心10min，取血漿。
配密度梯度液d＝1.0 即0液的配制0.01％EDTA，PH＝7.4-8.0d＝1.1 液的配制取0液100mL+NaBr13.5gd＝1.2 液的配制取0液100mL+NaBr29.5gd＝1.21 液的配制取0液100mL+NaBr30gd＝1.3 液的配制取血漿100mL+NaBr40g鋪梯度密度層先用長(zhǎng)針頭管吸取0液7mL鋪于容量為25.9mL的Beckman離心管底部，而后小心將吸取了約7mL的d＝1.1液長(zhǎng)針頭插入Beckman試管底部緩緩加入液體，使0液上浮，余下依此法加入d＝1.3液的血漿，注意一定要使各液面分層。
超速離心角度轉(zhuǎn)頭Ti50.2，XL-90 Beckman離心管25.9mL，45000rpm，1.4h，10℃。
透析透析袋的處理。以2％(W/V)NaHCO3+1mmoL/LEDTA(PH8.0)1000mL煮10分鐘(稱2gNaHCO3溶于100mL D.W.中，稱0.37g EDTA溶于1000mL D.W.中即可)。重D.W.洗用1mmoL/LEDTA(PH8.0)煮10分鐘。冷至4℃?zhèn)溆?。用前用重D.W.洗內(nèi)壁。
透析液配制0.85％NaCl 8.5g，0.02Mtris-HCl 2.42g，0.01％EDTA 0.1g，0.03％NaN30.3g，共1000mL(pH7.4)。
透析條件避光，密閉，4℃，24h，換4-5次液。
將PEG-20000覆蓋于透析袋上，隨時(shí)觀察濃縮情況(一般濃縮為1mg/mL左右)。蛋白定量。于UV-280nm處測(cè)LDL中蛋白濃度，用1.0mg/mL的牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品.LDL稀釋。將LDL蛋白濃度稀釋到0.25mg/mL，2mL。用時(shí)2倍稀釋，即蛋白濃度0.125mg/mL。每個(gè)劑量做3復(fù)管。
LDL測(cè)試。取0.125mg/mL的LDL的液內(nèi)加入測(cè)試藥物，即時(shí)測(cè)OD值，然后水浴(20℃)30分鐘后加入CuSO4H2O 5umoL/L，水浴30分鐘后測(cè)定OD234nm.以加入CuSO4H2O后30分鐘的OD值與加入CuSO4H2O前所測(cè)OD值的差值[OD(30分鐘)-OD(0分鐘)]，表明其氧化型低密度脂蛋白生成的速率，以此反應(yīng)藥物的抑制作用。
本發(fā)明所用蒸餾水為空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照藥為維生素C(分析純)，批號(hào)011206。北京芳草醫(yī)藥化工研制公司生產(chǎn)。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3表3 不同藥物對(duì)氧化低密脂蛋白生成的影響劑量(ug/ml) OD(30分鐘)-OD(0分鐘)生理鹽水 0.0073±0.0015模型+生理鹽水 0.0847±0.0161##模型+菠蘿酰酯0.3 0.039±0.0164*模型+菠蘿酰酯3 0.0163±0.0068**模型+菠蘿酰酯300.017±0.003**模型+維生素C 0.5 0.0203±0.0108**與生理鹽水組相比，##P＜0.01。與模型+生理鹽水組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝3。
菠蘿酰酯在終濃度為0.3，3，30ug/ml時(shí)，對(duì)Cu2SO4誘導(dǎo)的LDL氧化為氧化型LDL(ox-LDL)有明顯的抑制作用。陽(yáng)性對(duì)照藥VC，具有明顯的抑制ox-LDL產(chǎn)生的作用。已知ox-LDL對(duì)于動(dòng)脈平滑肌有明顯的侵蝕作用，它可以使內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而使血管內(nèi)壁受損，而使血栓形成并附壁。因此菠蘿酰酯的這種抑制ox-LDL的作用對(duì)于防止冠心病和腦血栓具有重要的臨床意義。
權(quán)利要求
1.一種藥物化合物菠蘿酰酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如(I)所示
2.一種如權(quán)利要求1所述藥物化合物菠蘿酰酯的制備方法，該方法包括如下步驟(1)先將藥材重量的5～10倍的醇溶劑在50℃～90℃下進(jìn)行加熱提取，得到提取液；(2)將提取液在50～90℃溫度下減壓濃縮后，用藥材重量的2～5倍水溶解，離心或靜止過(guò)濾，棄去沉淀，取上清液；(3)將上清液通過(guò)大孔吸附樹脂，先用水洗脫，洗脫液廢棄，再用濃度大于70％的乙醇洗脫，將洗脫液在溫度50～90℃下減壓濃縮，然后減壓干燥或冷凍干燥，得到菠蘿葉提取物；(4)將菠蘿葉提取物用稀乙醇溶劑溶解，再用硅膠拌樣，用硅膠柱色譜分離，用氯仿∶甲醇或石油醚∶丙酮或氯仿∶丙酮梯度洗脫，用葡聚糖凝膠純化，即制得化合物菠蘿酰酯。
3.按照權(quán)利要求2所述的菠蘿酰酯的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的加熱提取所用的醇溶液為乙醇、甲醇、丙醇或丁醇，其濃度大于30％。
4.按照權(quán)利要求2所述的菠蘿酰酯的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的提取次數(shù)為3次，每次為30分鐘至2小時(shí)。
5.按照權(quán)利要求2所述的菠蘿酰酯的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述的稀乙醇的濃度為50～70％
6.權(quán)利要求1所述的菠蘿酰酯在制備治療體內(nèi)過(guò)氧化物升高及其由此引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的菠蘿酰酯在制備治療體內(nèi)氧化型低密度脂蛋白和高密度脂蛋白升高的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
藥物化合物菠蘿酰酯及其制備方法和用途，涉及一種從菠蘿葉中分離出來(lái)的新的藥物化合物及其制備方法。該化合物具有結(jié)構(gòu)式(I)。本發(fā)明還涉及該化合物在制備治療體內(nèi)過(guò)氧化物升高、氧化型低密度或高密度脂蛋白升高所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07C67/52GK1566073SQ0313757
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者杜力軍, 王偉, 邢東明, 丁怡, 向蘭, 王雪莉 申請(qǐng)人:清華大學(xué)