專利名稱：導(dǎo)向多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人組織靶向釋放系統(tǒng)，尤其涉及用于位點(diǎn)特異性釋放的多肽及其鑒定方法。
非特異性系統(tǒng)療法對許多病變主要發(fā)生在特定器官的病情的療效并不理想，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，腸炎及其它退行性或炎癥類疾病。對這些情況，普遍采用的療法不但沒有明顯療效還會(huì)帶來副作用。如果可以將藥物直接釋放到疾病位點(diǎn)將會(huì)極大改進(jìn)現(xiàn)行的療法。
微血管內(nèi)皮(MVE)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病理中起著主要作用，是一個(gè)重要的治療靶位。RA是一種由軟骨和骨頭損傷導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞而引發(fā)的增生性滑膜炎(參考文獻(xiàn)目錄1、2)。RA滑膜炎早期的典型癥狀是新血管的花狀萌芽(新血管發(fā)生)，暗示這是病理學(xué)上的一個(gè)關(guān)鍵因素(參考文獻(xiàn)目錄3)。在疾病確立慢性期，MVE作為炎癥細(xì)胞從血液流向關(guān)節(jié)的通道也很重要(參考文獻(xiàn)目錄4、5)。外滲過程是一個(gè)復(fù)合現(xiàn)象，它通過一系列整合粘附和信號事件來調(diào)控，包括細(xì)胞表面粘附因子(CAMs)和趨化因子(CK)的相互作用(參考文獻(xiàn)目錄6、7)。除適用于所有白細(xì)胞類型的基本機(jī)制外，有證據(jù)表明分別表達(dá)在遷移淋巴細(xì)胞表面和不同組織MVE上的“歸巢受體”和“血管地址素”的特異性配對對不同類型的白細(xì)胞募集到不同的組織發(fā)揮作用(參考文獻(xiàn)目錄8、9)。L-選擇蛋白和GlyCAM兩者間及α4β7和MAdCAM-1兩者間的優(yōu)先相互作用已被充分闡明，它們分別促進(jìn)淋巴細(xì)胞遷移到外周淋巴結(jié)和腸道上的位點(diǎn)(參考文獻(xiàn)目錄10-13)。此外，CK和CK受體(TARC-CCR4和TECK-CCR9)的配對協(xié)同“歸巢”CAMs(CLA和α4β7)分別促進(jìn)淋巴細(xì)胞遷移到皮膚和胃腸道組織(參考文獻(xiàn)目錄14、15)。已知，除淋巴組織，胃腸道，肺，皮膚和關(guān)節(jié)也需要優(yōu)先循環(huán)途徑(參考文獻(xiàn)目錄16、17)。
然而，關(guān)節(jié)特異性MVE“地址素”的鑒定十分困難，至少一部分原因是難以分離到純的滑膜內(nèi)皮細(xì)胞群。更重要的是，體外培養(yǎng)MVE細(xì)胞會(huì)引起去分化，伴隨著重要的組織特異性性狀，如腦MVE緊密連接或胃腸道MVE表達(dá)MAdCAM-1的丟失(參考文獻(xiàn)目錄18-21)。因此，以微環(huán)境中的MVE為靶標(biāo)對確定組織特異性配體十分重要。隨機(jī)多肽的噬菌體展示(參考文獻(xiàn)目錄22-24)和抗體片段庫(參考文獻(xiàn)目錄25-27)的發(fā)展使精確導(dǎo)向不同組織的MVE的設(shè)想在動(dòng)物體內(nèi)成為可能。而且，Ruoslahti及同事已經(jīng)成功的為小鼠七個(gè)被探測的器官和腫瘤微管組織各至少得到了一種特異性歸巢多肽(參考文獻(xiàn)目錄28、29)。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，在體內(nèi)模型中，特異性導(dǎo)向多肽可以作為導(dǎo)向手段，使藥物集中于某一組織(參考文獻(xiàn)目錄29-31)。類似的方法已用單鏈可變區(qū)(sFv)的噬菌體展示(sFv-PDL)在小鼠體內(nèi)分離其胸腺內(nèi)皮特異性抗體(參考文獻(xiàn)目錄32)。最近，據(jù)報(bào)道，一種限制性環(huán)狀RGD多肽，可結(jié)合到αvβ3和αvβ5(共價(jià)結(jié)合到一個(gè)14氨基酸的凋亡前體多肽)，它的噬菌體展示可以導(dǎo)向發(fā)炎的滑膜并抑制膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(參考文獻(xiàn)目錄33)。
此技術(shù)應(yīng)用于人體時(shí)受到了阻礙，由于技術(shù)上的原因和體內(nèi)篩選帶來的倫理問題。然而，將人組織移植到惡性復(fù)合免疫缺陷癥(SCID)小鼠體內(nèi)是一種可行的方法。發(fā)明人已成功地采用這個(gè)模型移植了人滑膜，皮膚，淋巴和胎兒腸道組織(參考文獻(xiàn)目錄34-36)。移植體存活，并通過小鼠皮下血管和移植體微管組織聯(lián)結(jié)發(fā)生血管化?？贵w和人的細(xì)胞經(jīng)小鼠體循環(huán)釋放到移植體，可見這種聯(lián)結(jié)是開放性的也是有功能的(參考文獻(xiàn)目錄34)。更重要的是，移植體MVE維持人粘附分子的表達(dá)，在聯(lián)結(jié)附近形成一個(gè)過渡區(qū)，相鄰表達(dá)人和小鼠的CAMs，這種表達(dá)可以通過移植體內(nèi)注射細(xì)胞因子上調(diào)(參考文獻(xiàn)目錄34)。最后，移植體MVE在其正常微環(huán)境中存活，促進(jìn)組織特異性血管性狀的維持。
上面提到的以前的工藝都沒有提出一種多肽篩選方法，適用于鑒定能夠?qū)蛉私M織的多肽。本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供這樣一種方法及其產(chǎn)物。
本發(fā)明的一個(gè)方面相應(yīng)提供了一種滑膜組織結(jié)合多肽，含有一個(gè)氨基酸序列基序，包括RLP，SPS，HSS，LSS，TWS，YSS，NQR，DRL或DRH。
這里的“滑膜組織結(jié)合多肽”指一種多肽，全身給藥后能夠特異性結(jié)合并優(yōu)先定位到滑膜組織。這里的“基序”指多肽的一部分，可以用一段氨基酸序列限定，具有多肽功能上的特異性，特別是結(jié)合特異性。整個(gè)專利說明書中出現(xiàn)的氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)單字母系統(tǒng)表示。
基序可以包括SPSRF?；蛘?，包括(T或D)HSS(A或R)(T或H)。作為進(jìn)一步可選擇的基序可包括HDRL。優(yōu)選的基序包括HPRLPFA，APNWRLP，SPSPFRA，SPSRFDQ，VSPSRTT，PLSSAQR，TWSATST，THSSATQ，HTHSSNL，PNHSSPH，ADHSSRH，SDYSSRS，QTHNQRY，TNQRLAI，KSTHDRL，PFHDRHS，HPSDRLS或DRLNHQF。
根據(jù)本發(fā)明的多肽，其長度較佳為3-1000個(gè)氨基酸，3-100個(gè)氨基酸更好，3-20個(gè)氨基酸最好。多肽的基序和/或多肽的其余部分可以含有化學(xué)修飾的氨基酸，前提是，對基序的任何修飾都不會(huì)影響其功能上的特征。多肽的功能同源物也屬于本發(fā)明的范圍?！肮δ芡次铩敝敢环N多肽，它保留原肽的滑膜組織結(jié)合活性，且含有一個(gè)基序，和原肽的基序相比，較佳至少有60％的同源性，更好至少有80％的同源性，甚至更好至少有90％的同源性，最好有95％的同源性。功能同源物間氨基酸的變化最好是保守的，即用同一個(gè)家族的一個(gè)氨基酸取代另一個(gè)氨基酸，這些氨基酸的支鏈?zhǔn)窍嚓P(guān)的。
多肽可以是線性的或者是環(huán)狀的。當(dāng)多肽是線性的，其基序的一個(gè)或兩個(gè)末端可以含有一個(gè)或多個(gè)含硫氨基酸。含硫氨基酸可以是C或M。
多肽較佳是環(huán)狀的。
在一些實(shí)施例中，多肽含有一對能夠促進(jìn)多肽發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化的氨基酸。配對的氨基酸較佳位于基序相反末端的方向上，更好位于基序相反的末端。氨基酸配對引起的多肽環(huán)化，可以是一部分多肽也可以是整個(gè)多肽。較佳地是整個(gè)基序，更好地是整個(gè)多肽環(huán)化。氨基酸對較佳是C和C，C和M或M和M。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，基序是C-HPRLPFA-C，C-APNWRLP-C，C-SPSPFRA-C，C-SPSRFDQ-C，C-VSPSRTT-C，C-PLSSAQR-C，C-TWSATST-C，C-THSSATQ-C，C-HTHSSNL-C，C-PNHSSPH-C，C-ADHSSRH-C，C-SDYSSRS-C，C-QTHNQRY-C，C-TNQRLAI-C，C-KSTHDRL-C，C-PFHDRHS-C，C-HPSDRLS-C或C-DRLNHQF-C，其中，C-和-C分別獨(dú)立代表任何種類或數(shù)目的兩側(cè)半胱氨酸間的氨基酸基序之前或之后的氨基酸，其數(shù)目較佳小于20，更好為0。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，基序是C-KSTHDRL-C。
滑膜組織結(jié)合多肽可以含有以上所列基序中的任何一個(gè)氨基酸序列。
多肽可以和一種藥物試劑或診斷試劑偶聯(lián)，藥物試劑較佳是一種抗炎的，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的，細(xì)胞毒性的或免疫抑制的化合物。或者，藥物試劑是一種編碼具有抗炎的，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的，細(xì)胞毒性的或免疫抑制性質(zhì)的多肽的基因。診斷試劑較佳適用于診斷成像，例如包括不透放射染料，熒光染料和放射性核素。
藥物試劑或診斷試劑可以通過接頭組與多肽偶聯(lián)，該接頭組較佳是一個(gè)可彎曲的部分，正如受本領(lǐng)域技術(shù)人員賞識(shí)的，又較佳是由一段氨基酸臂組成。該接頭組較佳的是在適合條件下可水解，這樣，到達(dá)滑膜上的靶位后，試劑就可以從多肽上釋放出來。
本發(fā)明的多肽能夠優(yōu)先定位到滑膜組織，可用于建立位點(diǎn)特異性釋放系統(tǒng)治療疾病，如一般與滑膜關(guān)節(jié)有關(guān)的風(fēng)濕性疾病。多肽可以用標(biāo)準(zhǔn)液相或固相多肽合成技術(shù)制備并可以偶聯(lián)到如藥物試劑或診斷試劑上，使這些試劑位點(diǎn)特異性釋放。這種手段允許使用較高全身劑量的藥物試劑或診斷試劑，同時(shí)將試劑在滑膜外的其它組織引起的副作用維持在耐受水平。
由于這些多肽能夠定位到滑膜MVE，它們可能也通過抑制炎癥細(xì)胞在滑膜區(qū)的聚集而具有內(nèi)在的治療潛力。多肽的有效劑量范圍可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方便地測定。有效劑量范圍較佳是約0.005-5毫克/千克體重，更好的范圍是約0.5-5毫克/千克體重。本發(fā)明的多肽較佳的通過靜脈給藥來釋放。
因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種如上所述的多肽，可用于治療。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供如上所述的多肽的應(yīng)用，用于制備一種治療或預(yù)防炎性和/或退行性關(guān)節(jié)病的藥物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供如上所述的多肽的用途，用于制備一種診斷炎性和/或退行性關(guān)節(jié)病的組合物。
本發(fā)明的多肽也可通過一種標(biāo)準(zhǔn)篩選技術(shù)鑒定特異性的滑膜配體。一旦滑膜配體確定，就可能成為治療靶點(diǎn)。
還在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包括如上所述多肽的藥物或診斷組合物。本發(fā)明的藥物或診斷組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽和任何藥用載體，佐劑或介質(zhì)。本發(fā)明的藥物組合物可用的藥用載體，佐劑或介質(zhì)包括，但不僅僅限于，離子交換劑，鋁鹽，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，緩沖物如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀酯，部分酯化的飽和植物脂肪酸甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如魚精蛋白硫酸鹽，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，二氧化硅膠體，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素類物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。
本發(fā)明的藥物或診斷組合物可以通過口服，非胃腸道，噴霧吸入，或者通過植入儲(chǔ)存器的方式給藥。較佳是通過注射腸胃外給藥。本發(fā)明的藥物或診斷組合物可以含有任何常規(guī)的無毒藥用載體，佐劑或介質(zhì)。這兒的腸胃外包括皮下，皮內(nèi)，靜脈，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜內(nèi)，胸骨內(nèi)，鞘內(nèi)，病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或融合技術(shù)。
藥物或診斷組合物可以是一種無菌注射劑，如一種無菌注射的水或油的懸液。這種懸液可以按已知工藝的技術(shù)進(jìn)行配方，使用合適的分散劑或潤濕劑(如例子中用的吐溫80)和懸浮劑。滅菌注射劑也可以是滅菌可注射的無毒藥用稀釋劑或溶劑的溶液或懸液，如1，3-丁二醇溶液。載體和溶劑可以是甘露糖醇，水，林格溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的固定油類一般作為溶劑或懸浮介質(zhì)。因此，任何溫和的固定油均可被采用，包括合成的單或二甘油酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物均可用于制備注射劑。還有天然的藥用油，如橄欖油或蓖麻油，特別是它們的聚氧乙烯酯的形式。這些油溶液或懸浮液也可以含一種長鏈醇稀釋劑或分散劑，如Ph.Helv或類似的醇。
本發(fā)明的藥物或診斷組合物可以以口服任何可接受的劑量形式給藥，包括但不僅僅限于膠囊，片劑和水懸液或溶液。若為口服片劑，載體普遍使用乳糖或玉米淀粉，并加入潤滑劑，如硬脂酸鎂。若為口服膠囊，使用的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。若為口服水懸液，活性成分與乳化劑和懸浮劑結(jié)合，需要的話可加入甜味劑和/或香味劑和/或色素。
本發(fā)明的藥物或診斷組合物可通過鼻腔氣霧劑或吸入劑給藥。這些組合物可以根據(jù)成熟的藥物配方工藝技術(shù)制備，制成生理鹽水溶液，加入芐醇或其它適合的防腐劑，可提高生物利用度的助吸收劑，氟化碳，和/或其它增溶劑或分散劑。
這些組合物，特別在腸胃外給藥時(shí)，優(yōu)選配制為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體優(yōu)選含有一種或多種天然的較佳是中性的磷脂，如在卵磷脂中發(fā)現(xiàn)的磷脂。多肽較佳在脂質(zhì)體的外表面，可以特異性導(dǎo)向滑膜組織。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明也提供編碼上述多肽的核苷酸序列。在相關(guān)方面，本發(fā)明也提供含這樣的核苷酸序列的載體及其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在相關(guān)方面，也提供相應(yīng)的抗體或其片段，可與本發(fā)明的多肽結(jié)合。
更在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種鑒定多肽的方法，這種多肽能夠結(jié)合到來自第一種動(dòng)物的組織上，該方法包括以下步驟i).將來自第一種動(dòng)物的組織移植到具有減弱免疫反應(yīng)的第二種動(dòng)物的受試動(dòng)物體內(nèi)；ii).將多種多肽導(dǎo)入第二種動(dòng)物體內(nèi)；以及iii).測定多肽在第二種動(dòng)物體內(nèi)的定位。
此方法中所用的第一種動(dòng)物和第二種動(dòng)物是不同的種屬。
在本方法的一個(gè)較好的實(shí)施例中，多肽和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式被導(dǎo)入第二種動(dòng)物體內(nèi)。該噬菌體較佳是M13噬菌體。外殼蛋白較佳是pIII。獲得這種融合蛋白的方法參見參考文獻(xiàn)目錄22-24。
本發(fā)明的方法中所用的多肽可以含有一對能夠促進(jìn)多肽發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化的氨基酸。配對的氨基酸較佳位于基序相反末端的方向上，更好是位于基序相反的末端。多肽的環(huán)化，可以是一部分多肽也可以是整個(gè)多肽，較佳是整個(gè)多肽環(huán)化。配對的氨基酸較佳是C和C，C和M或M和M。多肽可以在體外隨機(jī)合成。
在本方法的實(shí)施例中，多肽以和噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白的形式導(dǎo)入，多肽較佳由噬菌體復(fù)制合成，編碼多肽的核苷酸序列已事先被插入噬菌體基因組。用這種方式獲得多肽的方法參見參考文獻(xiàn)目錄22-24。
動(dòng)物可以是有體循環(huán)的任何動(dòng)物，包括哺乳類，鳥類和兩棲動(dòng)物，較佳是哺乳動(dòng)物。第一種動(dòng)物較佳是人。組織可以包括胃腸道，皮膚，關(guān)節(jié)或淋巴組織。組織較佳包括滑膜組織。第二種動(dòng)物較佳是嚙齒類，最好是小鼠。受試動(dòng)物較佳患有惡性復(fù)合免疫缺陷癥。
本發(fā)明的方法使對能夠?qū)蛱禺惤M織類型的多肽的快速確定成為可能。因此，該法可用于鑒定某些多肽，這些多肽可針對一系列的病情，也就是病變主要定位于特定的器官，有助于治療，或者有助于藥物試劑或診斷試劑的定位。這些病情，如牛皮癬，腸炎或惡性腫瘤。有利的證據(jù)表明，每一種病情都會(huì)偏好表達(dá)組織特異性血管決定子。本法的新穎性基于這樣一個(gè)事實(shí)，第一種動(dòng)物，比如人的靶標(biāo)，可以在移植到第二種動(dòng)物體內(nèi)的活的組織中鑒定。這與以前的靶標(biāo)確定方法，將多肽簡單注射到小鼠體內(nèi)然后器官分析，是有顯著不同的。
本發(fā)明將以實(shí)施例詳細(xì)說明并參見下面的附圖，其中

圖1顯示
a)人滑膜組織移植到SCID小鼠四周后的外觀。移植體是健康的，清晰可見小鼠血管滋養(yǎng)移植體(箭頭)b)人滑膜特異性噬菌體體內(nèi)選擇。將pep-PDL(1×1011pfu)注射SCID小鼠尾靜脈，此小鼠為人滑膜和皮膚組織的雙移植小鼠(2+2移植體/動(dòng)物)。注射15分鐘后，對小鼠實(shí)施心臟灌流，從移植體和小鼠腎臟回收噬菌體。僅滑膜移植體的噬菌體被擴(kuò)增，并將這些噬菌體重新注射小鼠，再富集兩輪。Strep-clone-1噬菌體作為陰性對照。經(jīng)3輪體內(nèi)選擇回收的噬菌體數(shù)目如圖所示。小鼠腎臟作為鼠對照組織。誤差欄顯示平均值標(biāo)準(zhǔn)差，平均值由兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)各三次平板計(jì)數(shù)得到(n＝2動(dòng)物/實(shí)驗(yàn)條件)。較之第一輪選擇和strep-clone-1噬菌體對照，在滑膜組織的第二，三輪富集，可以見到顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ns P＝0.48，**P＝0.0004，***P＜0.0001。在皮膚移植體，小鼠腎臟中的連續(xù)富集，以及對strep-cione-1時(shí)菌體的實(shí)驗(yàn)，都沒有顯著差異，P＞0.05(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))。
c)人滑膜特異性噬菌體體內(nèi)選擇。將pep-PDL(1×1011pfu)注射SCID小鼠尾靜脈，該小鼠為人滑膜單移植小鼠(2移植體/動(dòng)物)。其它實(shí)驗(yàn)條件與b)相同，但體內(nèi)選擇循環(huán)增加到4輪。每輪循環(huán)后回收的噬菌體數(shù)目(pfu/克組織)如圖所示。誤差欄顯示平均值標(biāo)準(zhǔn)差，平均值由兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)各三次平板計(jì)數(shù)得到(n＝2動(dòng)物/實(shí)驗(yàn)條件)。較之第一輪，第三，四輪富集可以見到顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ns P＝0.25，**P＝0.0086，***P＜0.0001，在strep-clone-1噬菌體對照未見差異，P＝0.055(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))；圖2顯示特異性導(dǎo)向噬菌體顯著定位到滑膜移植體的MVE。圖示多肽噬菌體在滑膜移植體和小鼠腎臟的組織學(xué)定位，通過抗M-13噬菌體外殼蛋白抗體和種屬特異性微管標(biāo)記物的免疫組化試驗(yàn)在熒光顯微鏡下檢測。顯示的是第四輪篩選后具有代表性的微觀圖(冷凍組織與圖1b中的樣品相同且等量)。(a)中清晰可見不連續(xù)的M13染色，(c)中沒有顯示同型匹配無關(guān)抗體染色。M13染色與用抗人vWf-FITC多抗顯色的人微管結(jié)構(gòu)有典型的共定位現(xiàn)象(b和d)。而M13免疫反應(yīng)性(e)未顯示用抗鼠CD31-FITC二抗顯色的移植體中的小鼠微管結(jié)構(gòu)(f)有共定位現(xiàn)象。類似的，同一小鼠的腎臟切片的腎小球毛細(xì)血管未顯示M13免疫反應(yīng)性(圖2g)，而鼠CD31顯示陽性(圖2h)。標(biāo)尺線＝50μm；圖3顯示從滑膜移植體回收得到的多肽噬菌體在雙移植動(dòng)物體內(nèi)也有組織導(dǎo)向特異性。在(a)圖中，第三輪體內(nèi)選擇后的滑膜導(dǎo)向多肽噬菌體(見圖1b)被注射到人皮膚和滑膜雙移植的SCID小鼠的尾靜脈(1×1011pfu)，樣品來自一骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者。同濃度的strep-clone-1噬菌體作為無關(guān)噬菌體對照。15分鐘后從滑膜和皮膚移植體回收噬菌體，數(shù)量如圖所示(pfu/克組織)。誤差欄顯示平均值標(biāo)準(zhǔn)差，平均值由兩次實(shí)驗(yàn)各三次平板計(jì)數(shù)得到。在注射了滑膜導(dǎo)向多肽的動(dòng)物體內(nèi)，從滑膜移植體中回收的噬菌體數(shù)量較之于皮膚移植體有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，***P＜0.0002(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))，與滑膜或皮膚移植體中回收的strep-clone-1噬菌體對照相比也有相似的差異。從皮膚移植體中回收的strep-clone-1噬菌體對照和滑膜導(dǎo)向噬菌體間無顯著差異，P＝0.21(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))。(b)圖中，第四輪體內(nèi)選擇后的滑膜導(dǎo)向多肽噬菌體(見圖1c)被注射到人皮膚和滑膜雙移植的SCID小鼠的尾靜脈(20×108pfu)，其余實(shí)驗(yàn)條件同(a)。同樣，可以看到噬菌體特異性定位到滑膜上，***P＜0.0001(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))。(b)所示的冷凍移植體樣品經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)分析得到M13噬菌體在各組織移植體的定位水平(c-f)。可以看到，在滑膜移植體有顯著的M13染色(c)，而在皮膚移植體中的M13免疫反應(yīng)性很小(e)。對照只顯示背景染色(d和f)。標(biāo)尺線＝50μm；
圖4顯示人和小鼠移植體的微管化程度。與圖(3a)和(3b)的樣品等量的冷凍組織，其微管化程度經(jīng)免疫組化測定，用種屬特異性抗人vWf抗體及抗鼠CD31抗體分別染色人和鼠的微管內(nèi)皮。免疫染色的人和鼠的血管體積分?jǐn)?shù)(Vv)用顯微鏡下點(diǎn)數(shù)計(jì)數(shù)，具體方法見方法中的描述。誤差欄顯示三個(gè)切面的平均值標(biāo)準(zhǔn)差。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，滑膜的內(nèi)皮區(qū)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低于皮膚，在人微管結(jié)構(gòu)(**P＝0.0043(c)，**P＝0.003(d))和鼠血管(**P＝0.001(c)，*P＝0.046(d))也是如此(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))。具有代表性的滑膜(c和d)和皮膚移植體(e和f)染色區(qū)如圖所示，抗人vWf抗體染色(c和e)和抗鼠CD31抗體染色(d和f)。標(biāo)尺線＝50μm；圖5顯示滑膜導(dǎo)向噬菌體的多肽插入片段分析以及噬菌體克隆展示候選多肽的體內(nèi)導(dǎo)向性。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)最后一輪體內(nèi)篩選后，隨機(jī)挑選30個(gè)滑膜導(dǎo)向噬菌體克隆，其多肽插入片段被測序。經(jīng)序列比對確定共有基序。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的共有基序展示噬菌體的完整的多肽序列如圖所示(a，b，c)。劃線氨基酸為候選基序，含重復(fù)基序區(qū)域的一些克隆也被列出。括號中顯示在不同克隆中出現(xiàn)的相同基序(見正文)。帶有高頻率共有基序的三個(gè)獨(dú)立的克隆(3.1，1.23，2.10)被擴(kuò)增并重新注射(1×1011pfu)到人滑膜單移植SCID小鼠體內(nèi)(2移植體/動(dòng)物)。同濃度的strep-clone-1噬菌體作為無關(guān)噬菌體對照。15分鐘后小鼠被灌流，測定移植體內(nèi)噬菌體濃度。誤差欄顯示三次平板計(jì)數(shù)的平均值標(biāo)準(zhǔn)差(n＝2動(dòng)物/條件)。從注射候選噬菌體克隆的小鼠滑膜移植體內(nèi)回收到的噬菌體數(shù)與注射strep-clone-1噬菌體的小鼠相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著的差異，***P＜0.0001(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))；圖6顯示合成的生物素標(biāo)記的多肽CKSTHDRLC體內(nèi)特異性定位到滑膜移植體并與原來的多肽噬菌體競爭和相關(guān)組織配體的結(jié)合。人滑膜組織單移植SCID小鼠(2移植體/動(dòng)物)靜脈注射1×1011pfu3.1噬菌體克隆，同時(shí)分四個(gè)劑量組注射生物素標(biāo)記的CKSTHRDLC合成多肽(a)(0，50，250，500μg/動(dòng)物200μl劑量體積)或等量的生物素標(biāo)記的CGTWSHPQC的合成多肽(b)。同濃度的strep-clone-1噬菌體作為無關(guān)噬菌體對照。15分鐘后，處死小鼠，測定移植體及小鼠腎臟中(c和d)的噬菌體數(shù)。誤差欄顯示三次平板計(jì)數(shù)的平均值標(biāo)準(zhǔn)差(n＝3動(dòng)物/劑量組)?？梢钥吹?，CKSTHDRLC合成多肽(a)劑量依賴地抑制親代3.1噬菌體克隆定位到移植體上(最大劑量時(shí)超過80％)。相反，對照多肽(b)對3.1克隆的定位無顯著影響，***p＜0.0001，*P＜0.05(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))。不同實(shí)驗(yàn)組，從小鼠腎臟回收到的噬菌體數(shù)目無差異。P＝0.05(不對稱兩側(cè)t檢驗(yàn))；圖7顯示生物素標(biāo)記的CKSTHDRLC多肽的組織學(xué)分布，顯示其在滑膜移植體中體內(nèi)定位到人血管的情況。與圖6中所示樣品等量的冷凍組織是使用用vector red顯色的堿性磷酸酶ABC檢測系統(tǒng)的免疫組化分析。切片再用抗人vWf-FITC復(fù)染。從注射了3.1噬菌體克隆和500μg/鼠生物素標(biāo)記的CKSTHDRLC合成多肽的小鼠的移植體切片可以清晰地看到與人微管結(jié)構(gòu)共定位的特異免疫反應(yīng)性(a和b)。ABC-AP從切片上除去后不顯色(c)，盡管有人vWf-FITC陽性血管存在(d)。而對注射了500μg生物素標(biāo)記的CGTWSHPQC對照多肽的小鼠的移植體進(jìn)行同樣的分析，沒有特異的免疫反應(yīng)性(e)，這說明盡管有血管存在，對照多肽并沒有定位到移植體上(f)。在無ABC-AP的切片上也沒有觀察到染色(g)，盡管有人源vWf-FITC陽性血管存在(h)。標(biāo)尺線＝50μm。
在這些實(shí)例中，我們報(bào)道了對新的滑膜導(dǎo)向多肽的鑒定，這些多肽從一個(gè)二硫鍵限制的7個(gè)氨基酸的多肽噬菌體展示文庫(pep-PDL)在人/SCID小鼠移植模型經(jīng)過幾輪富集循環(huán)后分離得到。這是第一次有關(guān)具有人滑膜MVE特異導(dǎo)向性多肽的報(bào)道。用這些多肽構(gòu)建導(dǎo)向裝置能將藥物/診斷試劑濃縮到滑膜，將對關(guān)節(jié)病的治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
材料和方法體外多肽噬菌體展示文庫(pep-PDL)的驗(yàn)證鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)特異的多肽噬菌體的擴(kuò)增和測序。
本實(shí)驗(yàn)采用二硫鍵抑制(7個(gè)氨基酸組成的多肽兩側(cè)各接一個(gè)半胱氨酸)的環(huán)化M13噬菌體展示文庫(Ph.D.C7CTM系統(tǒng)，New EnglandBiolabs，Hitchin，UK)。文庫的正確性首先用標(biāo)準(zhǔn)試劑通過廠商提供的鏈霉蛋白生物素?cái)U(kuò)增技術(shù)來驗(yàn)證。在3輪擴(kuò)增后，隨機(jī)挑選10個(gè)噬菌體克隆，測定其DNA序列(采用的引物是prime-96g III(NewEngland Biolabs)，PCR擴(kuò)增選用BigDyeTM終端循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems，Warrington，UK)，測序儀是ABI 377 DNA測序儀)。
人/SCID鼠移植模型體內(nèi)滑膜導(dǎo)向多肽的篩選人組織移植入SCID動(dòng)物。經(jīng)道德委員會(huì)(Ethics Committee)(LREC98/11/27)的批準(zhǔn)，征得患者同意，在RA和OA的病人做關(guān)節(jié)移植手術(shù)時(shí)獲取滑膜和皮膚的樣本。如前所述，將滑膜和皮膚組織單移植或雙移植入SCID C.B-17小鼠皮下(參考文獻(xiàn)目錄34)。
體內(nèi)篩選滑膜特異噬菌體。將人組織移植入4-6周的SCID小鼠體內(nèi)，經(jīng)3-4輪擴(kuò)增富集，滑膜導(dǎo)向多肽得以分離。移植4周后，將多肽噬菌體展示文庫(終濃度為1×1011pfu/200μL鹽溶液)注入麻醉動(dòng)物的尾靜脈。15分鐘后(噬菌體體內(nèi)擴(kuò)增周期)，當(dāng)動(dòng)物處于深度麻醉(Satagal 5μg/鼠，Rhone Merieux France)，用大約50-100ml鹽溶液進(jìn)行左心室灌流以保證噬菌體從血液中清除。取出移植體和小鼠的不同器官，將其等分為兩組，稱重，分別用于噬菌體回收和組化分析。用于免疫組織化學(xué)分析的那組，包埋于光學(xué)切片溫度復(fù)合物(OCT，Miles，CA)，速凍于液氮冷卻的異戊烷(BDH)，存放于-70℃以便分析時(shí)取用。用于噬菌體回收的那組用TBS洗三遍(150mM NaCl，50nm Tris，pH7.4，Sigma，Poole，UK)然后用1ml含蛋白酶抑制劑cocktail(Sigma)的TBS勻漿。在圖1b中所示的樣品勻漿液在TBS中多洗了5遍，因此噬菌體回收較低。用1.6mL 0.1M的甘氨酸(pH2.0)孵育10分鐘，然后用36μL 2M的Tris堿中和，噬菌體從組織中被提純出來。為了便于確定被提純的噬菌體的數(shù)量，在每輪篩選時(shí)，三倍濃度富集的樣品提取物與大腸桿菌宿主ER2737(New England Biolabs)加入熔解的LB瓊脂頂層(7g/L瓊脂糖，1g/L MgCl2.6H2O，Sigma)，然后接種于含IPTG/Xgal的LB瓊脂平板(50mg/L異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，40mg/L 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(Xgal)，Kramel Biotech，Cramlington，UK)。37℃過夜孵育后，數(shù)出藍(lán)色噬菌斑數(shù)，并和其組織來源一一對應(yīng)。對于移植的滑膜組織，挑出剩余的噬菌斑在IPTG/Xgal的LB瓊脂平板上培養(yǎng)擴(kuò)增并測定濃度。將擴(kuò)增的噬菌體與LB培養(yǎng)基上層膠勻漿，離心，取上清沉淀于PEG/NaCl(3.3％PEG8000/0.4M NaCl，Sigma)這樣使擴(kuò)增的噬菌體復(fù)原。收集上述實(shí)驗(yàn)得到的噬菌體并重懸于TBS，測定濃度，用于隨后的體內(nèi)篩選。為了增強(qiáng)滑膜特異性，需進(jìn)行2-3輪體內(nèi)篩選的循環(huán)。
多肽編碼的DNA插入序列的測序。噬菌體展示的特異導(dǎo)向滑膜移植組織的多肽由DNA插入序列編碼，測序以驗(yàn)證多肽噬菌體展示文庫的正確性。隨機(jī)挑取30個(gè)噬菌體克隆作為樣本，最后一輪體內(nèi)篩選后測序。做哺乳類序列同源性分析鑒定共有基序。
具有共同基序的單噬菌體克隆滑膜導(dǎo)向特異性的確認(rèn)。三個(gè)展示共有基序的單噬菌體克隆(1.23，2.10和3.1)或?qū)φ?strep-clone-1)(終濃度為1×1011pfu/200μL鹽溶液)靜脈注射入植入人體滑膜的動(dòng)物(方法如前在“體內(nèi)篩選滑膜特異噬菌體”中所述)。分別測定定位于滑膜移植體的實(shí)驗(yàn)和對照噬菌體克隆數(shù)目。
體外合成滑膜導(dǎo)向多肽。帶有共有基序的多肽采用fMOC化學(xué)合成在自動(dòng)多肽合成儀中合成(Alta Biosciences，Birmingham University，UK)，并可以被生物素標(biāo)記(參考文獻(xiàn)目錄37)。合成后首先用反相層析使肽的純度高于95％，然后以每管2ml均勻分裝，干凍保存。使用前，將肽取出溶于10μL DMSO(BDH)，最終在0.1M的乙酸銨中配成4mg/ml的濃度。
母體噬菌體克隆(3.1phage)和合成生物素標(biāo)記的滑膜移植組織表達(dá)多肽(CKSTHDRLC)的競爭性定位。將含不同濃度(0，50，250，和500μg/200μ/L鼠)生物素標(biāo)記多肽(CKSTHDRLC)的3.1噬菌體克隆(濃度為1×1011pfu)靜脈注入移植人源滑液組織的SCID小鼠，方法如前體內(nèi)篩選所述。選用合成的生物素標(biāo)記的多肽CGTWSHPQC作為對照，同時(shí)選取注射1×1011pfu的strep-clone-1或生物素(biotin)動(dòng)物作對照。15分鐘后，將小鼠灌流，用前述方法確定移植組織的噬菌體數(shù)目。隨后做免疫組織化學(xué)分析。
免疫組織化學(xué)分析M-13噬菌體組織定位的檢測。如前所述(參考文獻(xiàn)目錄38)利用標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)/熒光檢測方法，在被注入整個(gè)噬菌體多肽展示文庫，以及多個(gè)或者單個(gè)噬菌體克隆的動(dòng)物移植組織中，檢測到M13噬菌體外殼蛋白的表達(dá)。方法大致如下厚度10μm的冰凍切片用丙酮固定，然后一抗(anti-M13 Mab，Pharmacia，Uppsala，Sweden)孵育，采用間接堿性磷脂酶免疫組織化學(xué)方法(LSAB，Dako，Ely，UK)可在熒光鏡下看到連接的紅色底物(Vector Red substrate，NovacastraLabs Ltd，Newcastle upon Tyne，UK)。然后用FITC共軛的綿羊抗人(vonWillebrand factor(vWf)-Serotec，Kidlington，UK)或鼠抗鼠CD31(clone MEC13.3，Pharmingen，San Diego，CA)抗體雙標(biāo)組織切片使得移植組織塊中人和鼠的血管被染上。用鼠源抗體(anti-AspergillusNiger glucose oxidase[IgG2a](Dako，UK)作為類似物封閉無關(guān)抗體。所有切片樣品用奧林巴斯BX-60熒光顯微鏡觀察。
移植組織塊中人和鼠源維管結(jié)構(gòu)的檢測和定量。為了檢測移植組織塊中維管化的程度，取人和鼠內(nèi)皮表面做免疫組織化學(xué)檢測，方法如上所述，采用種屬特異性的抗人抗體(vWf)和抗鼠抗體(CD31)。在顯微鏡下用點(diǎn)數(shù)方法(前有述及)來確定免疫標(biāo)記的人源鼠源的血管體積分?jǐn)?shù)(Vv)(參考文獻(xiàn)目錄39)。簡言之，每個(gè)組織塊中2片免疫染色的切片在25倍目鏡下用5×5的計(jì)數(shù)板嚴(yán)格計(jì)數(shù)。片與片之間染上的血管分別在顯微鏡的不同視野下計(jì)數(shù)。分別計(jì)算移植塊中鼠，人和聯(lián)結(jié)維管的平均血管體積分?jǐn)?shù)(mean Vv)。
生物素標(biāo)記肽移植組織塊定位的檢測。通過堿性磷脂酶抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物(ABC-AP)檢測系統(tǒng)(Dako，UK)，利用可見的紅色連接底物(Novocastra，UK)，可以檢測合成的生物素標(biāo)記多肽(CKSTHDRLC)的移植組織定位。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。如未加特別說明，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均取95％的置信區(qū)間。非參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析采用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件包SigmaStat 2.0(Jandel Scientific)。最初，Kruskal Wallis，非參數(shù)ANOVA，單方差分析等方法都曾使用。對于顯著性檢驗(yàn)，非參數(shù)數(shù)據(jù)采用Dunn多對比較檢驗(yàn)，參數(shù)數(shù)據(jù)采用Dunnett檢驗(yàn)。
結(jié)果體外驗(yàn)證噬菌體展示文庫在開始用人/SCID鼠移植模型做體內(nèi)篩選前，根據(jù)廠商推薦，首先在體外用抗鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)生物擴(kuò)增的方法驗(yàn)證了該噬菌體文庫。通過對隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆編碼多肽的DNA插入序列的測序，證實(shí)所有克隆都顯示與該分子一致的序列，G-X-F/Y/W-S/N-H-P-Q(X表示任意氨基酸)。從這個(gè)實(shí)驗(yàn)中我們挑出一個(gè)克隆(strep-clone-1)表達(dá)特定的多肽C-G-T-W-S-H-P-Q-C作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的對照。
利用人/SCID鼠移植模型體內(nèi)篩選滑液特定導(dǎo)向噬菌體對人/SCID鼠移植模型進(jìn)行多輪體內(nèi)篩選，最終挑出對人滑膜組織有導(dǎo)向性質(zhì)的噬菌體。在首先的一組實(shí)驗(yàn)里，將RA病人的滑膜和皮膚(作為對照)分別植入動(dòng)物體內(nèi)，注射整個(gè)文庫(濃度為1×1011pfu)或者用作對照的克隆(strep-clone-1)。15分鐘后，處死動(dòng)物，分別計(jì)算定位于滑膜和皮膚移植組織以及鼠腎臟(用于鼠源組織對照)的噬菌體數(shù)量(方法在材料與方法中已述及)。另外，將在滑膜移植組織中復(fù)蘇的噬菌體擴(kuò)增至濃度1×1011pfu，重新注入第二和第三只雙移植的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由此，在每輪篩選時(shí)，整個(gè)多肽噬菌體展示文庫可以定位至人源的滑膜或皮膚組織。結(jié)果顯示(如圖1b)，每輪之后，從滑膜移植組織復(fù)原的噬菌體數(shù)目有顯著增加，特別是在第三輪后，而作為對照，來源于皮膚移植組織和鼠腎的噬菌體數(shù)目未見有明顯增加。與此同時(shí)，在對照文庫的克隆組(strep-clone-1)，噬菌體在這三個(gè)組織定位無特異性。當(dāng)我們只用單移植滑膜組織的動(dòng)物，并且增加篩選輪數(shù)至4輪，可以觀察到更大幅度的噬菌體富集(2移植塊/只動(dòng)物)。(結(jié)果見圖1c)。同時(shí)，在第四輪篩選后從移植組織復(fù)原的噬菌體數(shù)目比第一輪篩選后的數(shù)目大幅提高，是前者的600倍。
特定的導(dǎo)向噬菌體肽顯著定位于滑膜微維管內(nèi)皮(MVE)為了確定噬菌體在滑膜移植塊中的解剖定位，在每輪篩選后，從處死動(dòng)物中取得的移植組織復(fù)原后，用免疫染色檢測M13包被蛋白。在最初兩輪篩選后取出的組織塊，可觀察到適度的M13染色，而第三輪和第四輪后，在血管及其周圍被染得很深。用種屬特異的微觀標(biāo)記物進(jìn)一步做免疫熒光染色確定了多肽的維管定位。在圖2中我們給出了在第四輪篩選后顯微鏡下幾處代表性的區(qū)域染色情況(在圖1c中說明的同樣實(shí)驗(yàn)的組織等份)。在(a)中，典型的M13染色區(qū)清晰可見，而用類似物封閉的無關(guān)抗體(c)則未見染上。最重要的是，M13染色區(qū)和用人維管標(biāo)記物(anti-human vWf-FITC多克隆抗體b和d)標(biāo)記的維管組織可見很好的吻合。作為對照，M13染色區(qū)(e)并未與侵入移植組織的鼠維管組織(用anti-murine CD31-FITC做二抗標(biāo)記(f))有吻合。另外，滑膜導(dǎo)向噬菌體并未與鼠的維管組織結(jié)合，如圖示，在鼠腎毛細(xì)血管可被鼠源CD31(h)清晰的染上，而在此出未見M13染上(g)。綜上，通過數(shù)輪體內(nèi)滑膜移植組織的定向，我們分離出專一結(jié)合人源滑膜組織而不是鼠源滑膜組織(MVE)或是人源皮膚的組織和種屬特異性噬菌體。
滑膜導(dǎo)向噬菌體在體內(nèi)維持其組織特異性，并不依賴于其來源的病理滑膜組織移植塊(RA對OA)為了檢測多肽的滑膜導(dǎo)向特性是由滑膜組織內(nèi)在特性決定的，還是與疾病狀態(tài)有關(guān)(例如RA對OA)，在第三輪和第四輪篩選后，我們選取幾組克隆再在體內(nèi)做循環(huán)實(shí)驗(yàn)。選用SCID動(dòng)物，移植來源于OA病人的滑膜組織和皮膚。如前，等量的strep-clone-1噬菌體被注入動(dòng)物體內(nèi)做對照實(shí)驗(yàn)。如圖3a和b所示，從滑膜組織移植塊復(fù)原的噬菌體數(shù)目遠(yuǎn)大于皮膚移植塊。作為對照，注射strep-clone-1噬菌體的動(dòng)物，在皮膚和滑液組織噬菌體的數(shù)目幾乎相等，并且顯著低于挑出的導(dǎo)向滑膜組織的噬菌體組。我們通過免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)一步確認(rèn)滑膜移植組織定向的專一性。我們可以觀察到在滑膜移植組織M13噬菌體包被單白有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)(圖3c)，而在皮膚移植組織僅有很弱的免疫反應(yīng)(圖3e)，陰性對照并未檢測到免疫反應(yīng)(圖3d和3f)。由此，這些實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了滑膜導(dǎo)向噬菌體保持其組織特異性，而不依賴于來自不同病人的滑膜組織造成的不同的病理特征。
滑液的導(dǎo)向性不依賴于移植過程中人或小鼠體內(nèi)的血管形成為了排除定位于被移植的滑液分泌組織傾向是由于移植物周圍血管壁形成增加所至，我們對人和小鼠的所有血管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞表面區(qū)域在滑膜和皮膚移植過程中進(jìn)行研究。如圖4a和b所示，皮膚移植產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞表面增加要稍稍大于滑膜移植。這說明移植中所產(chǎn)生的血管形成并不影響含滑液導(dǎo)向的多肽噬菌體在移植滑膜的特異性定位。典型的移植組織免疫組化區(qū)域可見圖4c-f。在兩種組織移植中都可以發(fā)現(xiàn)顯著的新生血管(數(shù)據(jù)未示)。
對滑液特異性噬菌體中編碼多肽的DNA插入片段進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)具有導(dǎo)向性的特異性共有基序的富集。為了研究在這些具有導(dǎo)向滑膜趨勢的噬菌體所展示的多肽中是否有某些特異性的相同模體，對30個(gè)克隆(在三組不同的實(shí)驗(yàn)過程中，最后一輪篩選后隨機(jī)選擇)中的編碼多肽的DNA插入片段進(jìn)行測序。對這些插入序列進(jìn)行比對，幾個(gè)還有三個(gè)氨基酸或四個(gè)氨基酸的多肽保守區(qū)域被挑選出來。(圖5a，b，c)在一些克隆中還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)共用的或重疊的多肽基序。例如在1.23克隆中HSS基序(與1.30和2.6號克隆共有)分別與在2.16和1.29號克隆中發(fā)現(xiàn)的SSA和SAT基序重疊。此外，DRL(2.10，2.12和3.1號克隆)，和THSS(1.23和3.13號克隆)基序從不同實(shí)驗(yàn)中，無論是第三次篩選或是第四次篩選所收到的克隆中都得到了證實(shí)。
在SCID小鼠中移植人的滑液組織，通過體內(nèi)篩選收集到的多肽序列如下
三倍基序
四倍基序
發(fā)明人接著檢測含有某些這樣的基序的單克隆是否保持滑膜特異性。3個(gè)克隆(1.23，2.10和3.1)，針對每個(gè)克隆設(shè)立一組實(shí)驗(yàn)，將其靜脈注射到移植有人滑膜組織的SCID小鼠中。結(jié)果，圖5d顯示與對照組相比挑選出來的克隆明顯富集于移植的滑膜組織上。特別是含有很強(qiáng)的DRL基序的3.1克隆比對照組高出10倍。因此這組克隆所含有的多肽CKSTHRDLC被挑出來進(jìn)行以下的研究。
合成多肽CKSTHDRLC保留在體內(nèi)導(dǎo)向滑膜特異性并且展示有該多肽的噬菌體可以和同源的滑膜MVE配體競爭。為了證明上述的這些候選多肽的特異性定位于移植的滑膜不依賴于噬菌體本身，我們合成了一段與3.1號克隆表達(dá)的序列CKSTHRDLC相同的序列并用生物素標(biāo)記，用它移植噬菌體的定位。從strep-clone-1噬菌體所展示的多肽序列中挑選合成一段CGTWSHPQC作為無關(guān)對照?；ひ浦驳男∈箢A(yù)先用劑量在50ug-500ug/只動(dòng)物的合成多肽CKSTHRDLC預(yù)處理，再注射1×1011pfu的3.1號克隆噬菌體。作為對照，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，使用CGTWSHPQC合成多肽，劑量不變。噬菌體在移植組織和小鼠組織上的定位用“方法”中提到的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。另一組對照實(shí)驗(yàn)中，給小鼠注射1×1011pfu的strep-clone-1噬菌體。結(jié)果見圖6?？梢园l(fā)現(xiàn)CKSTHRDLC多肽可以很明顯的抑止3.1克隆噬菌體在移植組織的定位，并呈濃度依賴性(最高劑量可以抑止80％的定位)。相反，對照組的多肽對于噬菌體的定位沒有顯著影響。此外，3.1號克隆在移植組織的定位比strep-clone-1克隆高出了9倍，這也證明了先前在圖5d中顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后，c和d顯示了3.1號克隆在小鼠腎臟中的分布?？梢园l(fā)現(xiàn)在小鼠腎臟中只有相當(dāng)于背景級的噬菌體定位，并且不受實(shí)驗(yàn)組與對照組多肽的影響。
發(fā)明人接著還檢查了CKSTHRDLC合成多肽在移植組織中定位。利用在實(shí)驗(yàn)和對照組所使用的多肽都被生物素標(biāo)記，所以可以使用用Vector Red底物顯色的堿性磷酸酶-ABC檢測系統(tǒng)，采用免疫組化的方法精確檢測。結(jié)果見圖7，可見多肽在體內(nèi)滑膜移植組織上有很強(qiáng)的定位(a)，并且它主要結(jié)合在人微血管內(nèi)皮細(xì)胞上，使用FITC標(biāo)記的抗人vWf抗體雙染可以很清楚的觀察到(b)。相反，在注射無關(guān)多肽的小鼠中，移植組織上并沒有檢測到免疫反應(yīng)(e)，盡管人血管清晰可見(f)。連續(xù)的未經(jīng)過ABC-AP復(fù)合物處理的切片并沒有被染色(c和g)，而血管上FITC-vWf呈陽性(d和h)。
這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了3.1號克隆噬菌體顯著的組織和種屬特異性。最為重要的是它證實(shí)了單獨(dú)的多肽本身也具有導(dǎo)向滑膜的功能并且可以競爭性抑制3.1克隆噬菌體與移植組織上MVE配體的結(jié)合。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證，上圖5中的多肽序列根據(jù)其功能部分氨基酸的化學(xué)本質(zhì)進(jìn)行比對(非極性/疏水性，非離子極性，堿性或酸性)。得到下列結(jié)果RLP三倍基序相關(guān)序列CHPRLPFACCAPNWRLPC如C-RLP-CSPS三倍基序相關(guān)序列CSPSPFRACCSPSRFDQCCVSPSRTTC如C-SPSRF-CHSS三倍基序相關(guān)序列CPLSSAQRCCTWSATSTCCTHSSATQCCHTHSSNLCCPNHSSPHCCADHSSRHCCSDYSSRSC如C-(T/D)HSS(A/R)(T/H)-C
NQR三倍基序相關(guān)序列CQTHNQRYCCTNQRLAIC如C-NQR-CDRL三倍基序相關(guān)序列CKSTHDRLCCPFHDRHSCCHPSDRLSCCDRLNHQFC如C-HDRL-C上述序列中C-，-C各別代表任何種類或和數(shù)目的兩側(cè)半胱氨酸間的基序之前或之后的氨基酸，基序在它們之間。
討論通過體內(nèi)噬菌體展示篩選分離人滑膜特異性導(dǎo)向多肽的方法已在這里被描述。通過給噬菌體所含的編碼多肽的DNA插入片段測序可以確定，導(dǎo)向多肽優(yōu)先定位到移植到SCID小鼠體內(nèi)的人滑膜組織。
通過在滑膜組織單移植或滑膜和皮膚組織雙移植的動(dòng)物體內(nèi)多次循環(huán)富集，分離這種滑膜導(dǎo)向噬菌體。后面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使pep-PDL在每輪篩選中定位到人滑膜組織或皮膚組織。因此，皮膚組織既可以富集識(shí)別人血管決定子的噬菌體，又作為組織特異性的對照。三輪篩選之后，發(fā)明人觀察到噬菌體明顯富集到滑膜移植體，皮膚對照組織則沒有。類似的，盡管大量循環(huán)體液通過腎臟，但在這個(gè)組織中并未見到噬菌體富集。而且，從小鼠腎臟和皮膚移植體中回收到的噬菌體的量很相近，可能代表了結(jié)合的基線水平。此外，相同濃度的strep-clone-1噬菌體對照，定位到以上三種組織的量差不多。這些現(xiàn)象在第四輪體內(nèi)篩選中同樣存在。用人滑膜單移植動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這些現(xiàn)象也被證實(shí)。第四輪富集的數(shù)量是第一輪的600多倍。因此，這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了用人/SCID小鼠移植模型體內(nèi)篩選噬菌體的可行性。這些噬菌體優(yōu)先定位到滑膜移植體而不是其它人的組織(皮膚)或小鼠的組織(腎臟)。這和曾經(jīng)報(bào)道過的用一種“純”小鼠體系是相似的(參考文獻(xiàn)目錄28)。這兒描述的方法的優(yōu)點(diǎn)在于允許篩選某種噬菌體，這種噬菌體具有由移植體表達(dá)的人源組織決定子的導(dǎo)向特異性。
選擇得到的噬菌體的滑膜導(dǎo)向特異性在皮膚和滑膜雙移植SCID小鼠體內(nèi)通過重循環(huán)試驗(yàn)重新檢驗(yàn)，皮膚和滑膜來自一名患OA而非RA的病人。原本從RA滑膜移植體回收到的噬菌體克隆經(jīng)第三，四輪體內(nèi)選擇后，優(yōu)先回到OA滑膜移植體。而與皮膚對照組織的基線水平相比，噬菌體對照組顯示出適中的滑膜定位。這些實(shí)驗(yàn)在多個(gè)方面提供了有力的證據(jù)支持滑膜導(dǎo)向噬菌體的組織特異性。首先，他們證明導(dǎo)向特異性是這些噬菌體穩(wěn)定的性質(zhì)。其次，他們證實(shí)這種優(yōu)先的滑膜定位與移植組織的病理狀態(tài)是無關(guān)的(RA對OA)，這一點(diǎn)提示組織特異性可能是由個(gè)體發(fā)育決定的。第三，strep-clone-1噬菌體對照組與滑膜多肽噬菌體兩者比較，它們的行為模式是一致的，這說明導(dǎo)向特異性由多肽本身而非噬菌體成分介導(dǎo)。
為進(jìn)一步研究這一方面，發(fā)明人從滑膜移植體回收得到的噬菌體庫隨機(jī)挑選了90個(gè)克隆，對其編碼多肽的插入DNA序列進(jìn)行測序分析。得到的特異性序列比對，鑒定出幾個(gè)三拷貝和四拷貝的多肽共有基序。某些三拷貝基序在多個(gè)克隆中重復(fù)和/或重疊，有的克隆有多個(gè)基序。此外，有些基序在不同的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)出現(xiàn)。因此，在不同實(shí)驗(yàn)的滑膜移植體中回收到的不同的噬菌體克隆中發(fā)現(xiàn)了共有基序，這個(gè)事實(shí)很可能歸結(jié)于配體介導(dǎo)的選擇過程，同時(shí)提示這些基序很可能對特異性滑膜決定子的識(shí)別相當(dāng)重要。選取三個(gè)高頻率發(fā)生基序的代表性克隆(1.23，2.10和3.1)，進(jìn)一步檢測它們的導(dǎo)向性。較之strep-clone-1噬菌體對照組，這三個(gè)克隆都顯示出顯著的滑膜移植體定位，特別是展示CKSTHDRLC的克隆3.1，含DRL共有基序，比對照幾乎增加了10倍。因此，這個(gè)序列可以直接回答這樣的問題是否是多肽本身，而不依賴于其展示噬菌體，維持其導(dǎo)向滑膜移植體的性質(zhì)。合成的多肽CKSTHDRLC不僅在體內(nèi)表現(xiàn)出滑膜導(dǎo)向特異性，更重要的是，競爭性抑制親代噬菌體與相關(guān)滑膜MVE配體的結(jié)合。
從這里展示的工作來看，由M13噬菌體及CKSTHDRLC多肽與移植體的MVE表現(xiàn)出的強(qiáng)烈的共定位及免疫反應(yīng)性可以推測滑膜配體是由MVE表達(dá)的。盡管MVE配體可能仍是難以確定的滑膜特異性“地址素”(參考文獻(xiàn)目錄17)，一個(gè)有趣的方面是，參與組織特異性導(dǎo)向的分子并不是經(jīng)典的CAMs。比如，一個(gè)膜二肽酶，特別是在體內(nèi)位于肺部而非其它組織，經(jīng)體內(nèi)噬菌體展示確定，是肺導(dǎo)向多肽的受體(參考文獻(xiàn)目錄40)。
滑膜導(dǎo)向多肽不僅是組織特異性的(結(jié)合到滑膜上而不是皮膚上)而且是種屬特異性的(結(jié)合到人的而不是小鼠的組織上)。因此，這些多肽不太可能與內(nèi)皮細(xì)胞普遍表達(dá)的“普通”細(xì)胞粘附?jīng)Q定子結(jié)合。假設(shè)滑膜配體是炎癥依賴的內(nèi)皮CAM也是不成立的，因?yàn)樵谝浦?周后的移植體微管結(jié)構(gòu)中顯示如ICAM-1，VCAM-1和E-選擇蛋白等分子的下調(diào)(參考文獻(xiàn)目錄34)。這增大了這樣一種可能，某種分子參與決定子的表達(dá)，而決定子則參與免疫監(jiān)視過程的體循環(huán)部分。另一種可能性是，如果移植體的維持依賴于形成人鼠聯(lián)結(jié)的新血管，那么，滑膜配體很可能代表了新血管生成的表位。盡管皮膚移植體對照較之滑膜移植體，其新血管化的程度相似甚至稍高，但滑膜導(dǎo)向多肽并不和皮膚移植體結(jié)合。因此，以此為基礎(chǔ)解釋以上的發(fā)現(xiàn)，在滑膜新血管發(fā)生中必然會(huì)有一種組織特異性的因子，這種因子在腫瘤相關(guān)血管中也被推測是存在的(參考文獻(xiàn)目錄29，31)。
這是第一次有關(guān)人滑膜MVE特異性導(dǎo)向的多肽被報(bào)道。通過一種新的導(dǎo)向人組織的方法，移植入SCID小鼠，噬菌體展示體內(nèi)直接篩選，這一系列的步驟完成。這種多肽的鑒定方法，并不依賴于它們的天然配體，開創(chuàng)了這樣的可能性，就是用這些序列構(gòu)建關(guān)節(jié)特異性釋放工具，能夠?qū)⑺幬锘蚧蜉d體直接或以脂質(zhì)體的形式濃縮到這個(gè)組織，這在其它一些系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)(參考文獻(xiàn)目錄31，41，42)。另外的實(shí)驗(yàn)，在多器官包括RA和OA移植的SCID動(dòng)物中進(jìn)行，用于進(jìn)一步確證滑膜特異性。
盡管這兒所描述的方法特指噬菌體展示技術(shù)，但并不限于這個(gè)方法，多肽的體內(nèi)篩選也可以與標(biāo)記分子連接后進(jìn)行。采用噬菌體展示的主要優(yōu)點(diǎn)在于在多肽被回收的同時(shí)其核酸序列也得到了回收。此外，這個(gè)方法可用于鑒定能夠特異性結(jié)合到非滑膜的其它組織的多肽。這些組織并不一定是人源的。
滑膜或非滑膜組織移植到小鼠體內(nèi)的方法見下面的例子，使用人外周淋巴結(jié)(huPLN)。
組織收集，制備，儲(chǔ)存和移植。主動(dòng)脈旁huPLN或頸huPLN來自于血管手術(shù)的患者。
HuPLN的大小和外觀都正常。樣本在移植前進(jìn)行常規(guī)的H&E組織學(xué)試驗(yàn)，在組織學(xué)外觀上是正常的。整個(gè)過程得到了醫(yī)院道德委員會(huì)的許可(LREC n99/03/19)。樣品分為兩份，一份用于免疫組化，另一份用于移植。用于免疫組織化學(xué)分析的那組，包埋于光學(xué)切片溫度復(fù)合物(OCT，Miles，CA)，速凍于液氮冷卻的異戊烷(BDH)，存放于-70℃以便分析時(shí)取用。用于移植的樣品，切成0.5cm3的小片，凍在含20％DMSO(Sigma)的熱滅活的胎牛血清中(PAA LabsGmbH，Linz，Austria，儲(chǔ)存在液氮中直至移植(見Wahid et al.(2000).Clin.Exp.Immunol.122，133-142)。樣品在手術(shù)前解凍，用生理鹽水洗滌，放在生理鹽水濕潤的無菌紗布上，并置于冰上。米色的SCIDC.B-17(NOD/LtSz-scid/scid)小鼠在Kings College無病原體的條件下飼養(yǎng)，i.p注射0.2ml Dormitor(0.1mg/ml SKB)和0.1ml ketamine(0.1mg/ml SKB)麻醉。在每只SCID小鼠(鼠齡4-6周)耳后的背側(cè)皮膚上劃一刀切口，將組織皮下植入。傷口用可溶性縫合線(Ethicon)縫合。4-5周后，經(jīng)免疫組化遷移試驗(yàn)檢測，移植成功。選擇這種特殊的小鼠品系，是為了使huPLN被小鼠體循環(huán)中的NK細(xì)胞殺死的可能性降為最小。NOD/LtSz-scid/scid小鼠不僅不能產(chǎn)生T或B細(xì)胞，也沒有NK細(xì)胞活性(但能產(chǎn)生無功能的NK細(xì)胞)。
移植體存活率評價(jià)。在宏觀或蘇木精和伊紅染色丙酮固定恒冷箱切片的顯微鏡觀察的免疫組化或形態(tài)學(xué)分析之前，先評價(jià)移植體的存活率。移植體壞死或含非移植組織(如，小鼠皮膚和肌肉)被排除。
移植體內(nèi)人微管結(jié)構(gòu)評價(jià)。為確證人微管結(jié)構(gòu)的維持與細(xì)胞粘附分子(CAM)有關(guān)，也為了評估移植體經(jīng)細(xì)胞因子/趨化因子刺激后CAM表達(dá)的調(diào)節(jié)情況，需評價(jià)移植前和移植后人ICAM1，VCAM1，和E-選擇蛋白的表達(dá)，采用種屬特異性mAb和標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化技術(shù)。CAM相對的表達(dá)情況用0-4的染色強(qiáng)度的相對值來衡量，0表示無染色，4表示最強(qiáng)染色。為檢測人源移植體的微管結(jié)構(gòu)是否是開放的并與滲入移植體的小鼠微管組織聯(lián)結(jié)，給小鼠i.v注射生物素標(biāo)記的抗人ICAM1抗體或生物素標(biāo)記的同型匹配的對照抗體(MOPC21)。10分鐘后小鼠被處死，移植體包埋在OCT中速凍。恒冷箱切片在抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC-AP)中溫育30分鐘，然后用Vector Red底物試劑盒顯影。接著，切片在FITC標(biāo)記的抗人VWFVIII(Serotec，UK)中溫育，用來確定人的血管，由此測定抗ICAM1抗體和對照抗體的定位。切片在浸片劑溶液，(Immunofluor，ICN Ltd)中固定，在紫外-熒光顯微鏡下觀察。
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<223>人工序列<400>1Ser Pro Ser Arg Phe1 5<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>T或D
<220>
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<223>人工序列<400>5Ala Pro Asn Trp Arg Leu Pro1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列<400>8Val Ser Pro Ser Arg Thr Thr1 5
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<223>人工序列<400>10Thr Trp Ser Ala Thr Ser Thr1 5<210>11<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列<400>12His Thr His Ser Ser Asn Leu1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列<400>14Ala Asp His Ser Ser Arg His1 5<210>15<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列<400>16Gln Thr His Asn Gln Arg Tyr1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>17Thr Asn Gln Arg Leu Ala Ile1 5<210>18<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>18Lys Ser Thr His Asp Arg Leu1 5<210>19<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>19Pro Phe His Asp Arg His Ser1 5<210>20<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>20His Pro Ser Asp Arg Leu Ser1 5<210>21<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>21Asp Arg Leu Asn His Gln Phe1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>22Cys His Pro Arg Leu Pro Phe Ala Cys1 5
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<223>人工序列<400>24Cys Ser Pro Ser Pro Phe Arg Ala Cys1 5<210>25<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>25Cys Ser Pro Ser Arg Phe Asp Gln Cys1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>26Cys Val Ser Pro Ser Arg Thr Thr Cys1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>27Cys Pro Leu Ser Ser Ala Gln Arg Cys1 5<210>28<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>28Cys Thr Trp Ser Ala Thr Ser Thr Cys1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>29Cys Thr His Ser Ser Ala Thr Gln Cys1 5
<210>30<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>30Cys His Thr His Ser Ser Asn Leu Cys1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>31Cys Pro Asn His Ser Ser Pro His Cys1 5<210>32<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>32Cys Ala Asp His Ser Ser Arg His Cys1 5<210>33<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>33Cys Ser Asp Tyr Ser Ser Arg Ser Cys1 5<210>34<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>34Cys Gln Thr His Asn Gln Arg Tyr Cys1 5<210>35<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>35Cys Thr Asn Gln Arg Leu Ala Ile Cys1 5<210>36<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>36Cys Lys Ser Thr His Asp Arg Leu Cys1 5
<210>37<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>37Cys Pro Phe His Asp Arg His Ser Cys1 5<210>38<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>38Cys His Pro Ser Asp Arg Leu Ser Cys1 5<210>39<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>39Cys Asp Arg Leu Asn His Gln Phe Cys1 5<210>40<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>40Cys Gly Thr Trp Ser His Pro Gln Cys1 5<210>41<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>任一氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>F，Y或W<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>S或N<400>41Gly Xaa Xaa Xaa His Pro Gln1 5<210>42<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>42Cys Arg Leu Pro Cys
1 5<210>43<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>43Cys Ser Pro Ser Arg Phe Cys1 5<210>44<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>T或D<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>A或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>T或H<400>44Cys Xaa His Ser Ser Xaa Xaa Cys1 5<210>45<211>5
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>45Cys Asn Gln Arg Cys1 5<210>46<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>46Cys His Asp Arg Leu Cys1 權(quán)利要求
1.一種與滑膜組織結(jié)合的多肽，含有一個(gè)包括RLP，SPS，HSS，LSS，TWS，YSS，NQR，DRL或DRH的氨基酸基序。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的基序包括SPSRF。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的基序包括(T或D)HSS(A或R)(T或H)。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的基序包括HDRL。
5.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的基序包括HPRLPFA，APNWRLP，SPSPFRA，SPSRFDQ，VSPSRTT，PLSSAQR，TWSATST，THSSATQ，HTHSSNL，PNHSSPH，ADHSSRH，SDYSSRS，QTHNQRY，TNQRLAI，KSTHDRL，PFHDRHS，HPSDRLS或DRLNHQF。
6.如上述任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述的基序包含能夠引起多肽發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化的氨基酸。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述的氨基酸對是C和C，C和M或M和M。
8.如權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述的基序是CHPRLPFAC。
9.如權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述的基序是CKSTHDRLC。
10.如權(quán)利要求6-9中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述的基序是環(huán)化的。
11.包含如上述任一權(quán)利要求所述的一種氨基酸基序的多肽。
12.如上述任一權(quán)利要求所述的多肽，與一種藥物試劑或診斷試劑偶聯(lián)。
13.如權(quán)利要求12所述的多肽，其中的藥物試劑是一種抗炎的，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的，細(xì)胞毒性的或免疫抑制的化合物。
14.如權(quán)利要求12所述的多肽，其中的藥物試劑是一種基因。
15.如權(quán)利要求12所述的多肽，其中的診斷劑適用于診斷成像。
16.如上述任一權(quán)利要求所述的多肽，可用于治療。
17.如權(quán)利要求1-15中任一權(quán)利要求所述的多肽在制備用于治療或預(yù)防炎性的和/或退行性的關(guān)節(jié)病藥物中的應(yīng)用。
18.包含如權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述多肽的一種藥物或診斷組合物。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物配制為脂質(zhì)體。
20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中的多肽至少位于脂質(zhì)體的外表面。
21.編碼如權(quán)利要求1-11中任一權(quán)利要求所述多肽的核苷酸序列。
22.能夠結(jié)合到如權(quán)利要求1-15中任一權(quán)利要求所述多肽的抗體或其片段。
23.一種多肽的鑒定方法，這種多肽能夠與來自第一種哺乳動(dòng)物的組織結(jié)合，該方法包括以下步驟i)將來自第一種哺乳動(dòng)物的組織移植到具有減弱免疫反應(yīng)的第二種動(dòng)物的受試動(dòng)物體內(nèi)；ii)將多種多肽導(dǎo)入第二種動(dòng)物體內(nèi)，以及iii)測定多肽在第二種動(dòng)物體內(nèi)的定位。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的多肽以和噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白的形式被導(dǎo)入受試動(dòng)物體內(nèi)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的噬菌體是M13噬菌體。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的外殼蛋白是p111。
27.如權(quán)利要求23-26中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的多肽兩側(cè)是一對氨基酸，能夠引起多肽的分子內(nèi)環(huán)化。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的氨基酸對是C和C，C和M或M和M。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其中的多肽在體外隨機(jī)合成。
30.如權(quán)利要求24-28中任一權(quán)利要求所述的方法，其中的多肽由噬菌體復(fù)制合成，編碼多肽的核苷酸序列已事先被插入噬菌體基因組。
31.如權(quán)利要求23-30中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的第一種哺乳動(dòng)物是人。
32.如權(quán)利要求23-31中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的組織包括滑膜組織。
33.如權(quán)利要求23-32中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的第二種動(dòng)物是小鼠。
34.如權(quán)利要求23-33中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的第二種動(dòng)物的受試動(dòng)物患有惡性復(fù)合免疫缺陷癥。
35.上述權(quán)利要求中所列的一個(gè)或多個(gè)多肽。
36.具有以下所列序列中的一個(gè)的多肽PC3 2.10 CDRLNHQFCPC4 1.1 CKSTHDRLCPC5 1.23 CTHSSATQC
37.具有上述權(quán)利要求中所列序列中的一個(gè)的多肽，應(yīng)用于治療炎性或退行性關(guān)節(jié)病。
38.如權(quán)利要求35-36所述的多肽，與細(xì)胞毒性藥物或基因偶聯(lián)。
39.如權(quán)利要求35-36所述的多肽，配制為脂質(zhì)體。
40.如權(quán)利要求35-36所述的多肽，與一種成像方式結(jié)合。
41.包括如權(quán)利要求35-36所述多肽的一種藥物或診斷組合物。
42.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，用于靜脈給藥。
43.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，靜脈給藥劑量為0.5-5毫克/千克體重。
44.一種治療關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬關(guān)節(jié)炎血清陰性關(guān)節(jié)病)的方法，其中包括一種或多種如權(quán)利要求35-36所述多肽的給藥方式。
全文摘要
一種與滑膜組織結(jié)合的多肽，含有一個(gè)包括RLP，SPS，HSS，LSS，TWS，YSS，NQR，DRL或DRH的氨基酸基序。較佳的基序包括HPRLPFA，APNWRLP，SPSPFRA，SPSRFDQ，VSPSRTT，PLSSAQR，TWSATST，THSSATQ，HTHSSNL，PNHSSPH，ADHSSRH，SDYSSRS，QTHNQRY，TNQRLAI，KSTHDRL，PFHDRHS，HPSDRLS或DRLNHQF。也提供一種能夠與來源于第一種哺乳動(dòng)物的組織結(jié)合的多肽的鑒定方法，方法包括以下步驟將來自第一種哺乳動(dòng)物的組織移植到具有減弱免疫反應(yīng)的第二種哺乳動(dòng)物的受試動(dòng)物體內(nèi)；將多種多肽導(dǎo)入第二種動(dòng)物體內(nèi)；以及測定多肽在第二種動(dòng)物體內(nèi)的定位。
文檔編號C07K7/64GK1575299SQ02821238
公開日2005年2月2日 申請日期2002年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月5日
發(fā)明者康斯坦蒂努·皮茲阿利斯, 斯泰夫魯斯·帕納伊 加布里埃爾 申請人:倫敦王室學(xué)院