專利名稱：小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病治療劑，其含有白細(xì)胞介素-6(IL-6)的拮抗劑作為有效成分。小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病包括小兒慢性關(guān)節(jié)炎，斯提爾氏病等。
背景技術(shù)：
IL-6是被稱為B細(xì)胞刺激因子2(BSF2)或干擾素β2的細(xì)胞因子。IL-6作為與B淋巴細(xì)胞系細(xì)胞的活化相關(guān)的分化因子被發(fā)現(xiàn)(Hirano，T.etal.，Nature(1986)324，73-76)，之后，已明確IL-6為對各種細(xì)胞的功能有影響的多功能細(xì)胞因子(Akira，S.et al.，Adv.in Immunology(1993)54，1-78)。有報(bào)告指出，IL-6是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞系細(xì)胞的成熟化的因子(Lotz，M.et al.，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258)。
IL-6在細(xì)胞上通過兩種蛋白質(zhì)傳遞其生物學(xué)活性。其一是，IL-6結(jié)合的分子量約80kD的配體結(jié)合性蛋白質(zhì)的IL-6受體(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.et al.，Science(1987)241，825-828)。IL-6受體除了跨細(xì)胞膜在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜結(jié)合型外，主要也作為從其細(xì)胞外區(qū)域形成的可溶性IL-6受體存在。
另一個(gè)是與非配體結(jié)合性的信號(hào)傳遞有關(guān)的分子量約130kD的膜蛋白質(zhì)gp130。IL-6和IL-6受體通過形成IL-6/IL-6受體復(fù)合體、然后和gp130結(jié)合，使IL-6的生物學(xué)活性被傳遞入細(xì)胞內(nèi)(Taga，T.et al.，Cell(1989)58，573-581)。
IL-6拮抗劑為阻礙IL-6的生物學(xué)活性傳遞的物質(zhì)。到目前為止，已知對于IL-6的抗體(抗IL-6抗體)、對于IL-6受體的抗體(抗IL-6受體抗體)、對于gp130的抗體(抗gp130抗體)、IL-6變異體、IL-6或IL-6受體部分肽等。
關(guān)于抗IL-6受體抗體，有很多報(bào)告(Novick，D.et al.，Hybridoma(1991)10，137-146、Huang，Y.W.et al.，Hybridoma(1993)12，621-630、國際專利申請公開號(hào)WO 95-09873、法國專利申請公開號(hào)FR2694767、美國專利號(hào)US 521628)。已知其中之一是通過將小鼠抗體PM-1(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)向人抗體移植得到的人源化PM-1抗體(國際專利申請公開號(hào)WO 92-19759)。
小兒慢性關(guān)節(jié)炎(Chronic Arthritides Diseases of Childhood)是以未滿16歲發(fā)生的慢性關(guān)節(jié)炎疾病為主的疾病，且是在小兒中發(fā)生的膠原性疾病中最多的疾病。由于與成人的慢性風(fēng)濕關(guān)節(jié)病(Rheumatoid Arthritis(RA))有區(qū)別，不能說是類似的疾病，有各種各樣的病型，因此有將其作為與成人的慢性風(fēng)濕關(guān)節(jié)病不同的疾病進(jìn)行處理的傾向。
作為小兒慢性關(guān)節(jié)炎的名稱，在日本是按照美國的診斷基準(zhǔn)使用“幼兒型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎Juvenile Rheumatoid Arthritis(JRA))”，但在歐洲則主要使用幼兒慢性關(guān)節(jié)炎Juvenile Chronic Arthritis(JCA)。最近也使用自發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎Idiopathic Chronic Arthritis(ICA)或是幼兒自發(fā)性關(guān)節(jié)炎Juvenile Idiopathic Arthritis(JIA)等。
小兒慢性關(guān)節(jié)炎的類型被分成幾類，美國風(fēng)濕病學(xué)協(xié)會(huì)(AmericanCollege of Rheumatology(ACR))將在未滿16歲的小兒中發(fā)生的持續(xù)6周或以上的關(guān)節(jié)炎疾病的分為1)全身型(Systemic onset JRA)、2)多關(guān)節(jié)炎型(Polyarticular)、3)少關(guān)節(jié)炎型(Pauciarticular)三種(ARA分類)(JRA Criteria Subcommittee of the Diagnostic andTherapeutic Criteria Committee of the American Rheumatism AssociationArthritis Rheum 20(Suppl)195，1977)。另外在歐洲，European LeagueAgainst Rheumatism(EULAR)雖然在關(guān)節(jié)炎的持續(xù)時(shí)間在三個(gè)月或以上這一點(diǎn)，或由于牛皮蘚、強(qiáng)直性脊椎炎等原因引起的關(guān)節(jié)炎除外這一點(diǎn)等與上述ARA分類不同，但進(jìn)行了同樣三種病型的分類。(Bulletin 4，Nomenclature and classification of Arthritis in Children.Basel，NationalZeitung AG，1977)。
最近，有重新認(rèn)識(shí)這種分類的傾向，International League of Associationfor Rheumatolagy(ILAR)在1995年提出小兒自發(fā)性關(guān)節(jié)炎(IdiopathicArthritides of Childhood)的分類提案(Fink CW，Proposal for thedevelopment of classification criteria for idiopathic arthritides of childhood.J.Rheumatol.，vol.22 1566(1995))，進(jìn)一步在1997年將對其的修改作為ILAR案提案(Southwood TR，Classifying childhood arthritis.Ann.Rheum.Dis.Vol.56，79(1997))。這種分類中分為1)全身型關(guān)節(jié)炎(SystemicArthritides)、2)多關(guān)節(jié)炎型(RF陽性型)(Polyarthritis RF positive)、3)多關(guān)節(jié)炎型(RF陰性型)(Polyarthritis RF negative)、4)少關(guān)節(jié)炎型(Oligoarthritis)、5)發(fā)展型少關(guān)節(jié)炎型(Extended oligoarthritis)、6)附著部炎癥相關(guān)關(guān)節(jié)炎(Enthesitis related Arthritis)、7)牛皮癬相關(guān)關(guān)節(jié)炎(Psoriatic Arthritis)、8)其他。
進(jìn)一步本發(fā)明者們提案將小兒慢性關(guān)節(jié)炎分為1)小兒原發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(Primary Chronic Arthritides ofChildhood)(1)PARASH綜合征(SPRASH syndrome)(SPRASH高熱(spikingfever)，心包炎(pericarditis)，皮疹(rash)，關(guān)節(jié)炎(arthritis)，脾(腫)大(splenomegaly)，肝腫大(hepatomegaly))。
首先出現(xiàn)弛張熱和皮疹癥狀、診斷有漿膜炎、肝脾腫大癥狀，同時(shí)或延遲并發(fā)關(guān)節(jié)炎，但有時(shí)未診斷是關(guān)節(jié)炎。
(2)小兒自發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(Idiopathic Chronic Arthritides ofChildhood)沒有基礎(chǔ)病患，關(guān)節(jié)炎即是病患的中心。
a)類風(fēng)濕病因子(RF)陽性型b)抗核抗體(ANA)陽性型
c)RF/ANA陰性型2)小兒繼發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(Secondary Chronic Arthritides ofChildhood)伴隨遺傳性，非遺傳性的原疾病表現(xiàn)的關(guān)節(jié)炎(橫田俊平、“小児慢性関節(jié)炎の最近の治療法の進(jìn)步”、リウマ于、39卷、860、(1999))。
有報(bào)道指出小兒慢性關(guān)節(jié)炎與各種細(xì)胞因子有關(guān)。特別是，認(rèn)為炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α與抗炎癥細(xì)胞因子IL-1 ra(IL-1受體-拮抗劑)、IL-10、IL-13、sTNFR(可溶性TN F受體)的不平衡與疾病相關(guān)。
作為小兒慢性關(guān)節(jié)炎的治療，以往使用非甾體抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)甾體藥、抗風(fēng)濕藥(金劑等)、免疫抑制劑、氨甲蝶呤(MTX等)治療。但是不同患者其治療效果不一定，所以希望開發(fā)出更有效的治療方法。
斯提爾氏病(Stilldisease)，是1897年英國的小兒科醫(yī)生斯提爾報(bào)道的，該疾病是作為與成人的慢性風(fēng)濕關(guān)節(jié)病具有明顯不同的臨床癥狀的疾病被報(bào)道的在小兒到成人(成人主要是青年期)中發(fā)病的疾病，主要癥狀為發(fā)熱、紅斑、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎等。其中將成人病例稱為成人斯提爾氏病(Adult onset Still’s disease)，在斯提爾氏病中，類風(fēng)濕病因子通常是陰性的。
斯提爾氏病，在小兒中，是在未滿16歲的小兒中發(fā)生的慢性關(guān)節(jié)炎的幼兒性風(fēng)濕疾病(Juvenile Rheumatoid Arthritis(JRA)，JCA(JuvenileChronic Arthritis)，Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA))中的全身發(fā)癥型(Systemic Type)的別名。斯提爾氏病的病因，雖然有關(guān)于病毒等的環(huán)境要因或HLA等的宿主要因或免疫異常等的報(bào)道，但是現(xiàn)在還不十分清楚。
成人斯提爾氏病與小兒斯提爾氏病雖然除了發(fā)病年齡不同外還有某些臨床癥狀不同，但基本可認(rèn)為是同種疾病。小兒斯提爾氏病指的是上述的全身發(fā)病型的JRA，但由于JRA在臨床上與成人的風(fēng)濕關(guān)節(jié)疾病(Rheumatoid Arthritis，(RA))有很多地方不同，因此作為別的疾病治療，也由于同樣原因，成人的斯提爾氏病大多作為風(fēng)濕性疾病中獨(dú)立的疾病單位被處理。
作為斯提爾氏病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，已知有Yamaguchi(Journal ofRheumatology.19(3)424-30，1992)、Reginato(Seminars in Arthritis&Rheumatism.17(1)39-57，1987)、Cush(Rheumatology Grand Rounds，University of Pittsburgh Medical CenterJan.30，1984)、Goldman(Southern Medical Journal 73555-563，1980)等標(biāo)準(zhǔn)。
關(guān)于斯提爾氏病與細(xì)胞因子的關(guān)系，曾報(bào)道了IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子與斯提爾氏病的關(guān)系，認(rèn)為其中的IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥性細(xì)胞因子與斯提爾氏病的病態(tài)有某些關(guān)聯(lián)。
關(guān)于IL-6，de Benedetti等人報(bào)告指出在小兒斯提爾氏病中，血清中IL-6值上升(Arthritis Rheum.Vol.34，1158，1991)，同樣據(jù)de Benedetti等人報(bào)道，小兒斯提爾氏病患者的血清中存在大量IL-6/可溶性IL-6受體(sIL-6R)復(fù)合體，可看到這種復(fù)合體的水平與CRP值有相關(guān)關(guān)系(J.Clin.Invest.Vol.93，2114，1994)。另外Rooney等人也作了在小兒斯提爾氏患者的血漿中IL-6與TNF-α的水平上升的報(bào)道(Br J Rheumatol.Vol.34 454，1995)。
作為斯提爾氏病的治療，以往用非甾體抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)甾體藥、抗風(fēng)濕藥(金劑等)、免疫抑制劑、γ球蛋白制劑、氨甲蝶呤(MTX等)。但是由于患者不同其治療效果不一定，因此希望開發(fā)出更有效的治療方法。
發(fā)明的公開因此本發(fā)明是要提供一種與以往的小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病治療劑不同形式的新的小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病的治療劑。在本發(fā)明中，小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病包括小兒慢性關(guān)節(jié)炎以及斯提爾氏病。
本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題，進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6(IL-6)的拮抗劑對小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病有治療效果，并完成了發(fā)明。
因此本發(fā)明提供一種含有白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分構(gòu)成的小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病治療劑。
更具體地說，本發(fā)明提供一種含有白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種含有白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分的斯提爾氏病治療劑。
發(fā)明的實(shí)施方案上述IL-6拮抗劑優(yōu)選是對于IL-6受體的抗體，也優(yōu)選是對于人IL-6受體的單克隆抗體或?qū)τ谛∈驣L-6受體的單克隆抗體。作為上述對于人IL-6受體的單克隆抗體可以列舉PM-1抗體，另外，作為對于小鼠IL-6受體的單克隆抗體可以列舉MR16-1抗體。
上述的抗體優(yōu)選嵌合抗體，人源化抗體或是人抗體，例如有人源化PM-1抗體。
作為本發(fā)明治療劑治療對象的小兒慢性關(guān)節(jié)炎，包括前所述的ARA、EULAR、ILAR以及發(fā)明者們所分類的所有疾病。隨著血清學(xué)診斷法和治療方法的進(jìn)步，現(xiàn)在關(guān)于小兒慢性關(guān)節(jié)炎的疾病類型分類在世界范圍內(nèi)已被重新認(rèn)識(shí)，可以說正處于“病型分類的混亂期”，但是作為本發(fā)明治療劑的優(yōu)選治療對象，有ARA分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型、少關(guān)節(jié)炎型，EULAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型、少關(guān)節(jié)炎型，ILAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型(RF陽性)、多關(guān)節(jié)炎型(RF陰性)、少關(guān)節(jié)炎型、發(fā)展型少關(guān)節(jié)炎型，在本發(fā)明者們的分類中的小兒原發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(SPRASH綜合征、小兒自發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(a.類風(fēng)濕病因子(RF)陽性型，b.抗核抗體(ANA)陽性型，c.RF/ANA陰性型))；作為特別優(yōu)選的治療對象，是ARA分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型，EULAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型，ILAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型(RF陽性)、多關(guān)節(jié)炎型(RF陰性)、發(fā)展型少關(guān)節(jié)炎型，本發(fā)明者們的分類中的小兒原發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(SPRASH綜合征、小兒自發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(a.類風(fēng)濕病因子(RF)陽性型、b.抗核抗體(ANA)陽性型))。進(jìn)一步，作為最優(yōu)選的治療對象，可列舉ARA分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型，EULAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型，ILAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型(RF陽性)、發(fā)展型少關(guān)節(jié)炎型，本發(fā)明者們的分類中的小兒原發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(S PRASH綜合征、小兒自發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(a.類風(fēng)濕病因子(RF)陽性型)。
在本發(fā)明使用的IL-6拮抗劑，若為對小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病顯示出治療效果，則不論其由來、種類和形狀。
IL-6拮抗劑為隔斷IL-6產(chǎn)生的信號(hào)傳遞、阻礙IL-6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。IL-6拮抗劑優(yōu)選為對IL-6、IL-6受體及gp130的任一個(gè)的結(jié)合具有阻礙作用的物質(zhì)。作為IL-6拮抗劑，可以列舉例如抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gp130抗體、IL-6變異體、可溶性IL-6受體變異體或者IL-6或IL-6受體的部分肽、以及和它們顯示相同活性的低分子物質(zhì)。
本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體，可以使用公知的手段作為多克隆或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。作為來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體，有產(chǎn)生于雜交瘤中的抗體、以及通過基因工程的手段產(chǎn)生于用含有抗體基因的表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化的宿主中的抗體。該抗體通過與IL-6結(jié)合，阻礙IL-6與IL-6受體結(jié)合、阻斷IL-6的生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可以列舉MH166(Matsuda，T.et al.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)或SK2抗體(Sato，K.et al.，第21次日本免疫學(xué)會(huì)總會(huì)、學(xué)術(shù)紀(jì)錄(1991)21，166)等。
產(chǎn)生抗IL-6抗體的雜交瘤，基本可以使用公知技術(shù)、如下所述進(jìn)行制備。即，使用IL-6作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進(jìn)行免疫，得到的免疫細(xì)胞按照通常的細(xì)胞融合法和已知的親代細(xì)胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞來制備。
具體地，制備抗IL-6抗體可按下面的方法進(jìn)行。例如，作為取得抗體的致敏抗原被使用的人IL-6可以通過使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541、或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公開的IL-6基因/氨基酸序列得到。
在公知的表達(dá)型載體系中插入IL-6的基因序列、使適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞轉(zhuǎn)化后，用公知的方法純化來自該宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清液中的目的IL-6蛋白質(zhì)，可將該純化IL-6蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。另外，也可以將IL-6蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。
本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體，可以使用公知的手段作為多克隆抗體或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。作為來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體，有產(chǎn)生于雜交瘤中的物質(zhì)、和通過基因工程的手段，產(chǎn)生于用含有抗體基因的表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化的宿主中的物質(zhì)。該抗體通過與IL-6受體結(jié)合，阻礙IL-6與IL-6受體結(jié)合、阻斷IL-6的生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可以列舉MR16-1抗體(Tamura，T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗體(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國際專利申請公開號(hào)WO 92-19759)等。其中，作為特別優(yōu)選的抗體可以列舉PM-1抗體。
另外，產(chǎn)生PM-1抗體的雜交瘤細(xì)胞株作為PM-1，基于布達(dá)佩斯條約，在平成2年7月10日、作為FERM BP-2998被國際保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(茨城縣つくば市東1丁目1番3號(hào))。另外，產(chǎn)生MR16-1抗體的雜交瘤細(xì)胞株作為大鼠-小鼠雜交瘤MR16-1，基于布達(dá)佩斯條約，在平成3年3月13日、作為FERM BP-5875被國際保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(茨城縣つくば市東1丁目1番3號(hào))。
產(chǎn)生抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤，基本可以使用已知技術(shù)、如下進(jìn)行制備。即，使用IL-6受體作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進(jìn)行免疫，得到的免疫細(xì)胞按照通常的細(xì)胞融合法和已知的親代細(xì)胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆抗體的產(chǎn)生細(xì)胞來制備。
具體地說，制備抗IL-6受體抗體可按下面的方法進(jìn)行。例如，作為引起抗體的致敏抗原被使用的人IL-6受體可以通過使用在歐洲專利申請公開號(hào)EP 325474中公開的、小鼠IL-6受體可以通過使用在日本專利申請公開號(hào)特開平3-155795中公開的IL-6受體基因/氨基酸序列來得到。
IL-6受體蛋白質(zhì)，有在細(xì)胞膜上表達(dá)的蛋白質(zhì)和從細(xì)胞膜脫離的蛋白質(zhì)(可溶性IL-6受體)(Yasukawa，K.et al.，J.Biochem.(1990)108，673-676)兩種?？扇苄訧L-6受體抗體是由與細(xì)胞膜結(jié)合的IL-6受體的實(shí)質(zhì)性細(xì)胞外區(qū)域構(gòu)成的，在缺損跨細(xì)胞膜區(qū)域或跨細(xì)胞膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域方面與膜結(jié)合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白質(zhì)只要是在本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體的制備中作為致敏抗原使用，就可以使用任一種IL-6受體。
在公知的表達(dá)型載體系中插入IL-6受體的基因序列、使適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞轉(zhuǎn)化后，用已知的方法純化來自該宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清液中的目的IL-6受體蛋白質(zhì)，可將該純化IL-6受體蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。另外，也可以將表達(dá)IL-6受體的細(xì)胞或IL-6受體蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。
含有含編碼人IL-6受體的cDNA的質(zhì)粒pIBIBSF2R的大腸桿菌(E.coli)，基于布達(dá)佩斯條約，在1989年1月9日、作為HB101-pIBIBSF2R，保藏號(hào)FERM BP-2232被國際保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所。
本發(fā)明中使用的抗gp130抗體，可以使用公知的手段作為多克隆或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗gp130抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。作為來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體，有產(chǎn)生于雜交瘤中的抗體、和通過基因工程的手段產(chǎn)生于用含有抗體基因的表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化的宿主中的抗體。該抗體通過和gp130結(jié)合，阻礙IL-6/IL-6受體復(fù)合體與gp130結(jié)合、并阻斷IL-6的生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可以列舉AM64抗體(特開平3-219894)、4B11抗體和2H4抗體(US 5571513)B-S12抗體以及B-P8抗體(特開平8-291199)等。
產(chǎn)生抗gp130單克隆抗體的雜交瘤，基本可以使用公知技術(shù)、如下所述進(jìn)行制備。即，使用gp130作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進(jìn)行免疫，得到的免疫細(xì)胞通過通常的細(xì)胞融合法和公知的親代細(xì)胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆抗體的產(chǎn)生細(xì)胞來制備。
具體地，制備單克隆抗體可按下面的方法進(jìn)行。例如，作為引起抗體的致敏抗原被使用的gp130可以使用在歐洲專利申請公開號(hào)EP 411946中公開的gp130基因/氨基酸序列來得到。
在已知的表達(dá)型載體系中插入gp130的基因序列、使適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞轉(zhuǎn)化后，用已知的方法純化來自該宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清液中的目的gp130蛋白質(zhì)，可將該純化gp130受體蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。另外，也可以將表達(dá)gp130的細(xì)胞或gp130蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。
作為用致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物，雖沒有特別的限制，但是優(yōu)選考慮與在細(xì)胞融合中使用的親代細(xì)胞的相容性來進(jìn)行選擇，一般地可以使用嚙齒類動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、倉鼠等。
用致敏抗原免疫動(dòng)物時(shí)可以按已知的方法進(jìn)行。例如，作為一般的方法，通過在哺乳動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下注射致敏抗原進(jìn)行。具體地說，用適量的PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)或生理鹽水等稀釋致敏抗原、懸濁液根據(jù)需要混合通常的佐劑，例如弗氏完全佐劑，乳化后，優(yōu)選每4-21日向哺乳動(dòng)物給藥數(shù)次。另外，致敏抗原免疫時(shí)也可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。
這樣進(jìn)行免疫、確認(rèn)血清中所期望的抗體水平上升后，從哺乳動(dòng)物中取出免疫細(xì)胞、進(jìn)行細(xì)胞融合。作為進(jìn)行細(xì)胞融合的優(yōu)選的免疫細(xì)胞，特別可以列舉脾細(xì)胞。
作為和上述免疫細(xì)胞融合的另一親代細(xì)胞的哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞，適宜使用以前、已知的各種細(xì)胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.et al.J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、F0(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immnnol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合基本可以按照已知的方法、例如Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等進(jìn)行。
更具體地說，上述細(xì)胞融合例如可在細(xì)胞融合促進(jìn)劑存在下，在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中進(jìn)行。作為融合促進(jìn)劑，可使用例如聚乙二醇(PEG)、日本血細(xì)胞凝集病毒(HVJ)等，進(jìn)一步，根據(jù)需要，為了提高融合效率、也可以添加二甲基亞砜等的輔助溶劑來使用。
免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的使用比例，例如，相對于骨髓瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞優(yōu)選為1-10倍。作為上述細(xì)胞融合中使用的培養(yǎng)液，例如，可以使用在上述骨髓瘤細(xì)胞株的增殖中適合的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液，除此之外，還可使用在該種細(xì)胞培養(yǎng)中可使用的通常的培養(yǎng)液，進(jìn)一步，也可能并用胎牛血清(FCS)等的血清補(bǔ)液。
細(xì)胞融合是將上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的規(guī)定量在上述培養(yǎng)液中充分混合，通常在30-60％(w/v)的濃度下添加預(yù)先加熱至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量為1000-6000左右的PEG溶液，通過混合形成目的融合細(xì)胞(雜交瘤)。然后，通過反復(fù)進(jìn)行依次添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，離心除去上清液的操作、可以除去雜交瘤的繁殖中不優(yōu)選的細(xì)胞融合劑等。
該雜交瘤通過在通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來進(jìn)行選擇。在該HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，持續(xù)使目的雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)滅絕所需的充分的時(shí)間、通常要持續(xù)數(shù)日-數(shù)周。然后，實(shí)施通常的極限稀釋法、進(jìn)行產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤的篩選和克隆。
另外，除了在人以外的動(dòng)物中免疫抗原得到上述雜交瘤以外、將人淋巴細(xì)胞在體外被所期望的抗原蛋白質(zhì)或抗原表達(dá)細(xì)胞致敏、使致敏B淋巴細(xì)胞和人骨髓瘤細(xì)胞、例如U266融合，也可以得到對期望的抗原或抗原表達(dá)細(xì)胞具有結(jié)合活性的所期望的人抗體(參照特公平1-59878)。進(jìn)一步，也可以對具有人抗體基因儲(chǔ)藏庫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物給與抗原或抗原表達(dá)細(xì)胞，按上述方法得到所期望的人抗體(參照國際專利申請公開號(hào)WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
產(chǎn)生這樣制備的單克隆抗體的雜交瘤，可在通常的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，另外，也可在液氮中長期保存。
從該雜交瘤取得單克隆抗體時(shí)，可以采用將該雜交瘤用通常的方法培養(yǎng)、得到其培養(yǎng)上清液的方法，或?qū)㈦s交瘤投入與其有相容性的哺乳動(dòng)物中使其增殖、得到其腹水的方法等。前者的方法適于得到高純度的抗體，另一方面，后者的方法適于抗體的大量生產(chǎn)。
例如，產(chǎn)生抗IL-6受體抗體的雜交瘤的制備，可以按照特開平3-139293中公開的方法進(jìn)行?？梢赃M(jìn)行將基于布達(dá)佩斯條約，在平成2年年7月10日、作為FERM BP-2998被國際保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(茨城縣つくば市東1丁目1番3號(hào))的產(chǎn)生PM-1抗體的雜交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)、得到腹水，從該腹水純化PM-1抗體的方法，或?qū)⒃撾s交瘤在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中、例如10％胎牛血清、含有5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)RPMI1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制)等中培養(yǎng)，由該培養(yǎng)上清液純化PM-1抗體的方法。
本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用基因重組技術(shù)，由雜交瘤克隆抗體基因，將其整合入適當(dāng)?shù)妮d體，然后將載體導(dǎo)入宿主中而產(chǎn)生的重組型抗體(例如，參照Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具體地，產(chǎn)生目的抗體的細(xì)胞，例如由雜交瘤分離編碼抗體的可變(V)區(qū)域的mRNA。mRNA的分離可以按照公知的方法，例如胍超離心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制備總RNA，使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)等制備mRNA。另外，通過使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)直接制備mRNA。
由得到的mRNA使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成抗體V區(qū)域的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等進(jìn)行。另外，進(jìn)行cDNA的合成及擴(kuò)增中也可以使用用5′-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech制)及PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919-2932)。由得到的PCR產(chǎn)物純化目的DNA片斷，與載體DNA連結(jié)。進(jìn)一步，由此制備重組載體、導(dǎo)入大腸桿菌等中、選擇集落制備所期望的重組載體。目的DNA的堿基序列可通過已知的方法、例如脫氧法確認(rèn)。
若得到編碼目的抗體的V區(qū)域的DNA、將其和編碼期望的抗體恒定區(qū)域(C區(qū)域)的DNA連結(jié)，整合入表達(dá)型載體中。另外，也可以將含有編碼抗體的V區(qū)域的DNA整合入含有抗體C區(qū)域的DNA的表達(dá)型載體中。
制備本發(fā)明中使用的抗體，是將下述的抗體基因整合入表達(dá)型載體，以使其在表達(dá)控制區(qū)域、例如在增強(qiáng)子、啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。然后，通過該表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、可以使抗體表達(dá)。
本發(fā)明中，以降低對人的異種抗原性等作為目的、可以使用人為地改變了的基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。這些修飾抗體可以用已知的方法制備。
嵌合抗體可通過將編碼上述得到的抗體V區(qū)域的DNA與編碼人抗體C區(qū)域的DNA連結(jié)，通過將其整合入表達(dá)型載體中、導(dǎo)入宿主產(chǎn)生得到(參照歐洲專利申請公開號(hào)EP 125023、國際專利申請公開號(hào)WO92-19759)。使用該已知方法，可以得到本發(fā)明中有用的嵌合抗體。
例如，含有編碼嵌合PM-1抗體的L鏈及H鏈的V區(qū)域的DNA的質(zhì)粒，分別被命名為pPM-k3和pPM-h1，具有該質(zhì)粒的大腸桿菌基于布達(dá)佩斯條約，在1991年2月11日分別作為NCIMB 40366和NCIMB 40362被國際保藏在國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(National Collectionsof Industrial and Marine Bacteria Limited)。
人源化抗體也被稱為重構(gòu)人抗體，是將人以外的哺乳動(dòng)物、例如小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植入人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)得到的抗體，也知道其一般的基因重組方法(參照歐洲專利申請公開號(hào)EP 125023、國際專利申請公開號(hào)WO 92-19759)。
具體地說，將設(shè)計(jì)為連結(jié)小鼠抗體的CDR和人抗體的構(gòu)架區(qū)域(FR)的DNA序列，通過PCR法由在制造成末端部分具有重疊部分的多個(gè)寡核苷酸合成。將得到的DNA與編碼人抗體C區(qū)域的DNA連結(jié)，然后通過整合入表達(dá)型載體中，將其導(dǎo)入宿主產(chǎn)生可得到(參照歐洲專利申請公開號(hào)EP 239400、國際專利申請公開號(hào)WO 92-19759)。
通過CDR連結(jié)的人抗體的FR，可選擇互補(bǔ)決定區(qū)域形成良好的抗原結(jié)合部位的物質(zhì)。根據(jù)需要，也可以置換抗體可變區(qū)域的構(gòu)架區(qū)域的氨基酸以使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗體、人源化抗體中也可以使用人抗體C區(qū)域。作為人抗體C區(qū)域，可以列舉Cγ，例如，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。另外，為了改善抗體及其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，也可以修飾人抗體C區(qū)域。
嵌合抗體由來自人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的可變區(qū)域和來自人的抗體C區(qū)域構(gòu)成，人源化抗體由來自人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)域和來自人抗體的構(gòu)架區(qū)域和C區(qū)域構(gòu)成，為了降低人體內(nèi)的抗原性，它們作為本發(fā)明中使用的抗體是有用的。
作為本發(fā)明中使用的人源化抗體的優(yōu)選具體實(shí)例，可以列舉人源化PM-1抗體(參照國際專利申請公開號(hào)WO 92-19759)。
另外，作為人抗體的取得方法，除上述方法以外，已知還有使用人抗體的基因庫，通過淘選取得人抗體的技術(shù)。例如，將人抗體的可變區(qū)域作為單鏈抗體(scFv)用噬菌體顯示方法使其在嗜菌體表面表達(dá)，可選擇與抗原結(jié)合的嗜菌體。如果解析選擇的嗜菌體基因，可以決定與抗原結(jié)合的編碼人抗體的可變區(qū)域的DNA的序列。如果明確了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，則可使用該序列制作適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，從而可以取得人抗體。這種方法已是眾所周知的，可以參考WO 92/01047，WO 92/20791，WO93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388。
如上所述構(gòu)建的抗體基因，可以通過公知的方法使之表達(dá)、取得。在哺乳類細(xì)胞的情況下，可通過功能性結(jié)合了經(jīng)常使用的有用的啟動(dòng)子、被表達(dá)的抗體基因、在其3′側(cè)下游的poly A信號(hào)的DNA或含有該DNA的載體使之表達(dá)。例如作為啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，可以列舉人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
另外，作為其它在本發(fā)明中使用的可用于抗體表達(dá)時(shí)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，也可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV 40)等的病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或人促進(jìn)因子-1α(HEF1α)等來自哺乳類細(xì)胞的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
例如，使用SV 40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，按照Mulligan等的方法(Mulligan，R.C.et al.，Nature(1979)277，108-114)，或者，在使用HEF1α啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，按照Mizushima等的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地實(shí)施。
在大腸桿菌的情況下，可以功能性結(jié)合被經(jīng)常使用的有用的啟動(dòng)子、為了抗體分泌的信號(hào)序列、被表達(dá)的抗體基因并使之表達(dá)。例如作為啟動(dòng)子，可以列舉1acZ啟動(dòng)子、arab啟動(dòng)子。在使用1acZ啟動(dòng)子時(shí)，可以按照Ward等的方法(Ward，E.S.et al.，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.et al.FASEB J.(1992)6，2422-2427)，使用arab啟動(dòng)子時(shí)，可以按照Better等的方法(Better，M.et al.Science(1988)240，1041-1043)。
作為為了抗體分泌的信號(hào)序列，在產(chǎn)生于大腸桿菌的周質(zhì)間隙時(shí)，可以使用pelB信號(hào)序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分離產(chǎn)生于周質(zhì)間隙的抗體后，將抗體的結(jié)構(gòu)適當(dāng)?shù)卦僬郫B使用(例如，參照WO96/30394)。
作為復(fù)制起點(diǎn)，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)等的物質(zhì)，進(jìn)一步，為了增加宿主細(xì)胞系中的基因復(fù)制數(shù)量，表達(dá)型載體，可以含有氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標(biāo)記。
為了制備本發(fā)明中使用的抗體，可以使用任意的生產(chǎn)系。對于為制造抗體的生產(chǎn)系，有體外和體內(nèi)的生產(chǎn)系。作為體外的生產(chǎn)系，可以列舉使用真核細(xì)胞的生產(chǎn)系或使用原核細(xì)胞的生產(chǎn)系。
使用真核細(xì)胞時(shí)，有使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、或真菌細(xì)胞的生產(chǎn)系。作為動(dòng)物細(xì)胞，已知(1)哺乳類細(xì)胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、Hela、Vero等，(2)兩棲類細(xì)胞，例如爪蟾卵細(xì)胞，或(3)昆蟲細(xì)胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作為植物細(xì)胞，已知來自煙草(Nicotiana tabacum)的細(xì)胞，可以將其進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細(xì)胞，已知酵母、例如酵母(Saccharomyces)屬、例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，絲狀真菌、例如曲霉(Aspergillus)屬、例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核細(xì)胞時(shí)，有使用細(xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)系。作為細(xì)菌細(xì)胞，已知大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
通過轉(zhuǎn)化將目的抗體基因?qū)脒@些細(xì)胞中，通過在體外培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可得到抗體。培養(yǎng)按公知的方法進(jìn)行。例如，作為培養(yǎng)液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等的血清補(bǔ)液。另外，通過將導(dǎo)入了抗體基因的細(xì)胞移入動(dòng)物的腹腔等，也可以在體內(nèi)產(chǎn)生抗體。
另一方面，作為體內(nèi)的生產(chǎn)系，可以列舉使用動(dòng)物的生產(chǎn)系或使用植物的生產(chǎn)系。使用動(dòng)物時(shí)，有使用哺乳類動(dòng)物、昆蟲的生產(chǎn)系等。
作為哺乳動(dòng)物，可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotech nology Applications，1993)。另外，作為昆蟲，可以使用蠶。使用植物時(shí)，例如可以使用煙草。
在這些動(dòng)物或植物中導(dǎo)入抗體基因，在動(dòng)物或植物的體內(nèi)使抗體產(chǎn)生，然后回收。例如，在編碼山羊β酪蛋白那樣的在乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基因中插入抗體基因作為融合基因進(jìn)行制備。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片斷注入山羊的胚胎中，將該胚胎導(dǎo)入母山羊體內(nèi)。從容納該胚胎的山羊生出的轉(zhuǎn)基因山羊或其子孫產(chǎn)生的乳汁中可得到所期望的抗體。為了增加由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有期望抗體的乳汁量，也可以對轉(zhuǎn)基因山羊使用適宜的激素。(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
另外，使用蠶時(shí)，可使蠶感染插入了目的抗體基因的桿狀病毒，通過該蠶的體液得到期望的抗體(Maeda，S.et al.，Nature(1985)315，592-594)。另外，使用煙草時(shí)，在植物表達(dá)用載體、例如pMON 530中插入目的抗體基因，在根癌病菌樣的細(xì)菌中導(dǎo)入該載體。使煙、例如煙草感染該細(xì)菌，通過該煙葉可得到期望的抗體(Julian，K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
如上所述，在用體外或體內(nèi)的生產(chǎn)系產(chǎn)生抗體時(shí)，可以將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別整合入表達(dá)型載體中、同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主，或者也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA整合入單一的表達(dá)型載體中、使宿主轉(zhuǎn)化(參照國際專利申請公開號(hào)WO 94-11523)。
本發(fā)明中使用的抗體，只要適于使用在本發(fā)明中，也可以是抗體的片斷或其修飾物。例如，作為抗體的片斷，可以列舉Fab、F(ab′)2、Fv或H鏈和L鏈的Fv用適當(dāng)?shù)倪B接物連結(jié)而成的單鏈Fv(scFv)。
具體地說，抗體用酶、例如木瓜酶、胃蛋白酶處理生成抗體片段，或者，構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因、將其導(dǎo)入表達(dá)型載體中后，在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中使之表達(dá)(例如，參照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可以通過連結(jié)抗體的H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域得到。該scFv中，H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域通過連接物、優(yōu)選通過肽連接物被連結(jié)(Huston，J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域可以是來自上述記載的抗體的任一種。作為連結(jié)V區(qū)域的肽連接物，可以使用例如由12-19個(gè)氨基酸殘基組成的任意的單鏈肽。
編碼scFv的DNA，可以通過將編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)域的DNA、以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)域的DNA作為模板，使用規(guī)定其兩端的引物對，通過PCR法將這些序列中編碼期望的氨基酸序列的DNA部分?jǐn)U增，然后，進(jìn)一步組合引物對并擴(kuò)增得到，該引物規(guī)定編碼肽連接物部分的DNA并使其兩端分別連結(jié)H鏈、L鏈。
另外，一旦制備編碼scFv的DNA、則可以按照常規(guī)方法得到含有它們的表達(dá)型載體和該表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化的宿主，另外，使用該宿主按照常規(guī)方法，可以得到scFv。
這些抗體的片斷，可以與上述相同，取得它的基因并使之表達(dá)、通過宿主產(chǎn)生。在本發(fā)明中所說的“抗體”中也包含這些抗體的片段。
作為抗體的修飾物，可以使用和聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。在本發(fā)明中所說的“抗體”中也包含這些抗體的修飾物。為了得到這種抗體修飾物，可通過對得到的抗體進(jìn)行化學(xué)修飾得到。這些方法在該領(lǐng)域已經(jīng)被確立。
如上所述生產(chǎn)、表達(dá)的抗體可以從細(xì)胞內(nèi)外、宿主分離純化至均一。本發(fā)明中使用的抗體的分離、純化可以用親和層析進(jìn)行。作為親和層析中使用的層析柱，可以列舉例如蛋白質(zhì)A柱、蛋白質(zhì)G柱。作為蛋白質(zhì)A柱中使用的載體，可以列舉例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，可以使用在通常的蛋白質(zhì)中使用的分離、純化方法，沒有什么限制。
例如，若適當(dāng)選擇、組合除上述親和層析以外的色譜法、過濾、超濾、鹽析、透析等，可以分離、純化本發(fā)明中使用的抗體。作為色譜法，可以列舉例如離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過濾等。這些色譜法適用于HPLC(高效液相色譜)。另外，也可以使用反相HPLC(反相HPLC)。
上述所得抗體的濃度測定可以通過吸光度的測定或ELISA等進(jìn)行。即，用吸光度的測定時(shí)，用PBS(-)適當(dāng)稀釋后、測定280nm的吸光度、1mg/ml相當(dāng)于1.35OD、算出濃度。另外，用ELISA時(shí)，可以如下進(jìn)行測定。即，將用0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制)100μl加入96孔板(Nunc制)中，在4℃下溫育1夜、固定化抗體。封閉后、添加適當(dāng)稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含有抗體的樣品、或作為標(biāo)準(zhǔn)品的人IgG(CAPPEL制)100μl、室溫下溫育1小時(shí)。
洗滌后，加入稀釋了5000倍的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的抗人IgG(BIOSOURCE制)100μl，在室溫下溫育1小時(shí)。洗滌后，加入底物溶液溫育后、用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)測定405nm的吸光度，算出目的抗體的濃度。
本發(fā)明中使用的IL-6變異體，具有和IL-6受體的結(jié)合活性、且為不傳遞IL-6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。即，雖然IL-6變異體相對于IL-6受體與IL-6競爭結(jié)合，但是由于不傳遞IL-6的生物學(xué)活性，故將阻斷IL-6產(chǎn)生的信號(hào)傳遞。
IL-6變異體是通過置換IL-6的氨基酸序列的氨基酸殘基、引入變異而制備的。雖然不管作為IL-6變異體原料的IL-6的由來，但是若考慮到抗原性等、優(yōu)選人IL-6。
具體地說，IL-6的氨基酸序列可以使用已知的分子模型程序、例如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)來預(yù)測其二次結(jié)構(gòu)，通過進(jìn)一步評(píng)價(jià)被置換的氨基酸殘基對總體的影響來進(jìn)行。決定適當(dāng)?shù)闹脫Q氨基酸殘基后、以含有編碼人IL-6基因的堿基序列的載體作為模板，按照通常使用的PCR法引入變異使氨基酸被置換，可以得到編碼IL-6變異體的基因。按照需要，將其整合入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)型載體中、按照上述重組型抗體的表達(dá)、產(chǎn)生及純化方法可以得到IL-6變異體。
作為IL-6變異體的具體實(shí)例，在Brakenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93、及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357-1367、WO 96-18648、WO 96-17869中有公開。
本發(fā)明中使用的IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，具有和各自IL-6受體或IL-6的結(jié)合活性，且為不傳遞IL-6生物學(xué)活性的物質(zhì)。即，IL-6部分肽或IL-6受體部分肽與IL-6受體或IL-6結(jié)合，通過捕捉它們可特異地阻礙IL-6與IL-6受體的結(jié)合。其結(jié)果，由于不傳遞IL-6的生物學(xué)活性，因此將阻斷IL-6產(chǎn)生的信號(hào)傳遞。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是由在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中與IL-6和IL-6受體的結(jié)合相關(guān)區(qū)域的一部分或全部的氨基酸序列組成的肽。這種肽通常由10～80、優(yōu)選為20～50、更優(yōu)選為20～40個(gè)氨基酸殘基組成。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，可通過在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中特定與IL-6和IL-6受體的結(jié)合相關(guān)的區(qū)域，將其一部分或全部的氨基酸序列用通常已知的方法、例如基因工程方法或肽合成法來制備。
通過基因工程方法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時(shí)，可將編碼期望的肽的DNA序列整合入表達(dá)型載體中，按照上述重組型抗體的表達(dá)、產(chǎn)生及純化方法可以得到。
通過肽合成法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時(shí)，可以使用在肽合成中通常用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具體地說，也可以按照續(xù)藥品的開發(fā)第14卷肽合成監(jiān)修矢島治明廣川書店1991年中記載的方法進(jìn)行。作為固相合成法，可以使用使與要合成的肽的C末端對應(yīng)的氨基酸與例如在有機(jī)溶劑中不溶性的支撐體結(jié)合，通過交互重復(fù)進(jìn)行將用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)了α-氨基及側(cè)鏈官能團(tuán)的氨基酸按從C末端到N末端方向的順序逐一縮合氨基酸的反應(yīng)、和使樹脂上結(jié)合的氨基酸或肽的α-氨基的保護(hù)基團(tuán)脫離的反應(yīng)，使肽鏈延長的方法。固相肽合成法根據(jù)使用的保護(hù)基團(tuán)種類，可大致分為Boc法和Fmoc法。
這樣合成目的肽后，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)以及將肽鏈從支撐體切斷的反應(yīng)。與肽鏈的切斷反應(yīng)中，在Boc法中可以通常使用氟化氫或三氟甲磺酸、而Fmoc法中可以使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氫中，在苯甲醚存在的情況下處理上述保護(hù)肽樹脂。然后，進(jìn)行保護(hù)基團(tuán)的脫離和從支撐體的切斷、回收肽。通過將其凍結(jié)干燥、可以得到粗肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中可以進(jìn)行與上述相同的操作，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)以及從支撐體切斷肽鏈的反應(yīng)。
得到的粗肽，由于適用于HPLC，因此可以進(jìn)行分離、純化。洗脫時(shí)，可以使用在蛋白質(zhì)的純化中通常使用的水-乙腈系溶劑在最適條件下進(jìn)行。分別取得相當(dāng)于所得色譜法的曲線峰的餾分、將其冷凍干燥。對于這樣純化的肽餾分、通過根據(jù)質(zhì)譜分析的分子量解析、氨基酸組成分析、或氨基酸序列解析等來鑒定。
IL-6部分肽及IL-6受體部分肽的具體實(shí)例，在特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098及美國專利公報(bào)US 5210075中公開。
本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑的IL-6信號(hào)傳遞阻礙活性，可以用通常使用的方法評(píng)價(jià)。具體地說，培養(yǎng)IL-6依賴性人骨髓瘤細(xì)胞株(S6B45，KPMM2)，人レンネルトT淋巴瘤細(xì)胞株KT3，IL-6依賴性細(xì)胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6、同時(shí)使IL-6拮抗劑共存，由此可以測定IL-6依賴性細(xì)胞的3H-胸苷的攝取。另外，培養(yǎng)IL-6受體表達(dá)細(xì)胞U266、加入125I標(biāo)記的IL-6，同時(shí)加入IL-6拮抗劑，由此測定與IL-6受體表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的125I標(biāo)記的IL-6。在上述分析體系中，如果除了使IL-6拮抗劑存在的組以外、還準(zhǔn)備不含IL-6拮抗劑的陰性對照組，比較兩者得到的結(jié)果，可以評(píng)價(jià)IL-6拮抗劑的IL-6抑制活性。
如下述實(shí)施例所示，由于通過給藥抗IL-6受體抗體，在小兒慢性關(guān)節(jié)炎患者中能夠看到治療效果，因此表明抗IL-6受體抗體等IL-6拮抗劑作為小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病治療劑是有用的。
本發(fā)明的治療對象是哺乳動(dòng)物。治療對象的哺乳動(dòng)物優(yōu)選為人。
本發(fā)明的小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病治療劑可以口服或非口服地全身或局部給藥。例如，可以選擇點(diǎn)滴等的靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、栓劑、灌腸、口服性腸溶劑等，可以按照患者的年齡、癥狀來選擇適宜的給藥方法。有效給藥量在每次1kg體重0.01mg～100mg的范圍內(nèi)選擇。或者，也可以選擇每個(gè)患者1～1000mg、優(yōu)選為5～50mg的給藥量。優(yōu)選的給藥量、給藥方法是，例如，在抗IL-6受體抗體的情況下，血液中存在的游離抗體程度的量為有效給藥量，作為具體的例子，1kg體重每月(4周)分1次到幾次給藥0.5mg～40mg、優(yōu)選1mg～20mg，例如在2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等給藥日程表下，用點(diǎn)滴等靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法的給藥方法等。給藥日程表可以在觀察病情和血液檢查值的動(dòng)向的同時(shí)將給藥間隔由2次/周或1次/周調(diào)整為1次/2周、1次/3周、1次/4周那樣延長給藥間隔。
本發(fā)明的小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病治療劑，也可以同時(shí)含有在給藥路徑下藥物所容許的載體或添加物。作為這種載體及添加物的例子，可以列舉水、藥物中容許的有機(jī)溶劑、膠原蛋白、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、一縮二丙二醇、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作為藥品添加物容許的表面活性劑等。使用的添加物，按照劑型可以從上述中適宜選擇或組合使用，但不限于這些。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例和參考例對本發(fā)明進(jìn)行具體的說明，但本發(fā)明并不僅限于這些。
實(shí)施例1對有以下經(jīng)過的全身型幼兒風(fēng)濕性關(guān)節(jié)患者(5歲、男性)，實(shí)行MRA治療。
治療前的經(jīng)過弛張熱(連日～40℃的單峰性發(fā)熱)、兩膝關(guān)節(jié)痛、皮疹癥狀。白血球增多，抗核抗體陰性、類風(fēng)濕因子陰性、血沉值亢進(jìn)、CRP值高等診斷后，開始用阿司匹林給藥，但是并未改善弛張熱和關(guān)節(jié)炎，且全身狀癥狀惡化。因此改為大量口服給藥甾體藥物(強(qiáng)的松龍30mg/日)，看到各種癥狀的改善。但是伴隨著強(qiáng)的松龍的逐漸減少，在量為10mg/日時(shí)，又復(fù)發(fā)了，住院后，用甲基強(qiáng)的松龍(mPSL)脈沖療法和血漿交換療法，進(jìn)一步同時(shí)并用環(huán)孢霉素A(Cs A)也無改善，炎癥癥狀增強(qiáng)(白血球數(shù)25400/μL、CRP11.2mg/dL)，基于用血漿交換療法+mPSL脈沖療法+Cs A的見解，作為后療法用強(qiáng)的松龍-氟聯(lián)苯丙酸進(jìn)行控制弛張熱，臨床上能看到退熱，但是血液的炎癥卻仍然維持很高的值(CRP＞5mg/dL)，出院后由于有周期性的弛張熱，實(shí)行外來中心的治療觀察。但是，患者訴說在發(fā)熱時(shí)背部疼痛增強(qiáng)，MBI等的精查結(jié)果，確認(rèn)在第4～5胸椎有破壞性傷，可認(rèn)為是由于甾體導(dǎo)致的受壓骨折。由于有必要向胸椎免負(fù)荷，在床上保持安靜狀態(tài)約一年，下肢肌肉顯著衰退，成為完全不能步行的狀態(tài)。雖然繼續(xù)強(qiáng)的松龍+氟聯(lián)苯丙酸+Cs A三者療法，但CRP也未降低至5mg/dL或以下。
治療結(jié)果由于開始以2mg/kg給藥，沒見到特別的副作用，因此增加至4mg/kg，每周給藥一次。在那以前確認(rèn)的發(fā)熱很快消失，CRP約2周后陰性化，全身倦怠感也被去除，能見到患者有朝氣。強(qiáng)的松龍可慢慢減量，減至1mg/日。
從以上結(jié)果可知，MRA對阿司匹林、氟聯(lián)苯丙酸等非甾體抗炎藥，長期大量的甾體藥物(強(qiáng)的松龍(プレドニン)、甲基強(qiáng)的松龍(メドロ—ル)等)、環(huán)孢霉素A、甲氨蝶呤等免疫抑制藥都不能抑制病狀的小兒慢性關(guān)節(jié)炎的治療是有效的。因此，IL-6拮抗劑，特別是抗IL-6受體抗體對小兒慢性關(guān)節(jié)炎，特別是作為ARA分類的全身型、EULAR分類的全身型、ILAR分類的全身型、本發(fā)明者們分類的SPRASH綜合征的小兒慢性關(guān)節(jié)炎的治療劑是有用的。
實(shí)施例2
22歲女性。1998年4月，大腿、前胸部、手指處出現(xiàn)點(diǎn)狀紅斑，5月肩、肘、膝關(guān)節(jié)痛。出現(xiàn)38℃的發(fā)熱。開始使用非甾體抗炎藥抗炎劑(NSAIDs)，但發(fā)熱還是持續(xù)，7月白血球數(shù)18100/μl，CRP 18.3mg/dl，血清鐵蛋白440ng/ml。診斷為成人斯提爾氏病。2000年1月初出現(xiàn)39℃的發(fā)熱以及出現(xiàn)關(guān)節(jié)痛，認(rèn)為成人斯提爾氏病的復(fù)發(fā)(CRP 15.8mg/dl，鐵蛋白205.8mg/ml)。
由于甾體減量困難，因此并用氨甲蝶呤MTX及環(huán)孢霉素(CsA)，但不能抑制病勢。由于病勢加重，呼吸狀態(tài)惡化，需要人工呼吸管理。用甾體脈沖療法改善了病勢，但并發(fā)了重癥骨質(zhì)疏松癥。開始用人源化的抗IL-6受體抗體(MRA)治療。每2周通過點(diǎn)滴靜脈注射MRA 200mg。給藥6日后炎癥反應(yīng)陰性化，腎上腺皮質(zhì)甾體藥物能順利的減量，也未見嚴(yán)重的副作用。
從以上結(jié)果可知，MRA對于聯(lián)用MTX和CsA也不能抑制病狀的成人斯提爾氏病有效。因此，IL-6的拮抗劑，特別是抗IL-6受體抗體作為斯提爾氏病特別是成人斯提爾氏病的治療劑是有用的。
參考例1.人可溶性IL-6受體的制備使用含有編碼按Yamasaki等的方法(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)得到的IL-6受體的cDNA的質(zhì)粒pBSF2R.236，通過PCR法制備可溶性IL-6受體。用限制酶Sph I消化質(zhì)粒pBSF2R.236，得到IL-6受體cDNA、將其插入mp18(Amersham制)中。使用設(shè)計(jì)為以便在IL-6受體cDNA中導(dǎo)入終止密碼子的合成寡引物，通過體外突變形成系統(tǒng)(Amersham制)、用PCR法在IL-6受體cDNA中導(dǎo)入變異。通過該操作終止密碼子被導(dǎo)入氨基酸345的位置，得到編碼可溶性IL-6受體的cDNA。
為了在CHO細(xì)胞中表達(dá)可溶性IL-6受體，使其與質(zhì)粒pSV(Pharmacia制)連結(jié)，得到質(zhì)粒pSVL344。在含有dhfr的cDNA的質(zhì)粒pECEdhfr中插入用Hind III-Sal I切斷的可溶性IL-6受體cDNA，得到CHO細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pECEdhfr344。
通過磷酸鈣沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)向dhfr-CHO細(xì)胞株DXB-1l(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)轉(zhuǎn)染10μg的質(zhì)粒pECEdhfr344。將轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用含有1mM谷氨酰胺、10％透析FCS、100U/ml青霉素和100μ/ml鏈霉素的不含核苷的αMEM選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)3周。
被選擇的CHO細(xì)胞用極限稀釋法篩選，得到單一的CHO細(xì)胞克隆。用20nM～200nM濃度的氨甲蝶呤擴(kuò)增該CHO細(xì)胞克隆，得到產(chǎn)生人可溶性IL-6受體的CHO細(xì)胞株5E27。用含有5％FBS的伊斯考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(IMDM、Gibco制)培養(yǎng)CHO細(xì)胞株5E27?；厥张囵B(yǎng)上清液，用ELISA測定培養(yǎng)上清液中的可溶性IL-6受體的濃度。其結(jié)果，可以確認(rèn)在培養(yǎng)上清液中存在可溶性IL-6受體。
參考例2.抗人IL-6抗體的制備用10μg的重組型IL-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41)和弗氏完全佐劑一起免疫BALB/c小鼠，每周連續(xù)進(jìn)行免疫至血清中能檢出抗IL-6抗體為止。從局部淋巴節(jié)中取出免疫細(xì)胞，用聚乙二醇1500使其與骨髓瘤細(xì)胞株P(guān)3U1融合。按照使用HAT培養(yǎng)液的Oi等的方法(Selective Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，SanFrancisco，351，1980)選擇雜交瘤，建立產(chǎn)生抗人IL-6抗體的雜交瘤。
產(chǎn)生抗人IL-6抗體的雜交瘤如下所示進(jìn)行IL-6結(jié)合分析。即，將柔軟的聚乙烯制的96孔微孔板(Dynatech Laboratories，Inc.制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氫鹽碳酸鹽緩沖溶液(pH 9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10μg/ml，Cooper Biomedical，Inc制Malvern，PA)在4℃下包被一夜。然后，將板用含有100μl的1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室溫下處理2小時(shí)。
將其用PBS洗滌后，在各孔中加入100μl的雜交瘤培養(yǎng)上清液、在4℃下溫育一夜。洗滌該板后、在各孔中加入125I標(biāo)記的重組型IL-6使其達(dá)到2000cpm/0.5ng/孔，洗滌后用γ計(jì)數(shù)器(Beckman Gamma 9000，Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)測定各孔的放射活性。通過IL-6結(jié)合分析，216雜交瘤克隆中32個(gè)雜交瘤克隆為陽性。在這些克隆中可得到最終穩(wěn)定的MH166.BSF2。該雜交瘤產(chǎn)生的抗IL-6抗體MH166具有IgG1κ型的亞型。
然后，使用IL-6依賴性小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2研究與MH166抗體導(dǎo)致的雜交瘤增殖相關(guān)的中和活性。將MH60.BSF2細(xì)胞分別注入小孔中達(dá)到1×104/200μl/孔，向其中加入含有MH166抗體的試樣，培養(yǎng)48小時(shí)，加入0.5μCi/孔的3H胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，進(jìn)而連續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。將細(xì)胞放置在玻璃濾紙上，用自動(dòng)采集機(jī)(LaboMash Science Co.，Tokyo，Japan)處理。作為對照使用兔抗IL-6抗體。
其結(jié)果，MH166抗體，劑量依賴性地阻礙被IL-6誘導(dǎo)的MH60.BSF2細(xì)胞的3H胸苷的攝取。由此可知，MH166抗體中和IL-6的活性。
參考例3.抗人IL-6受體抗體的制備使按Hirata等的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900-2906)制備的抗IL-6受體抗體MT18與通過CNBr活化的瓊脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制，Piscataway，NJ)按照附上的配方結(jié)合，純化IL-6受體(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)。將人骨髓瘤細(xì)胞株U266用含有1％毛地黃皂苷(Wako Chemicals制)、10mM三乙醇胺(pH7.8)及0.15M NaCl的1mM對氨基苯基甲磺酰氟鹽酸鹽(Wako Chemicals制)(毛地黃皂苷緩沖液)裂解，和與瓊脂糖4B珠結(jié)合的MT18抗體混合。然后，將該珠用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次、作為用于免疫的部分純化IL-6受體。
用由3×109個(gè)U266細(xì)胞得到的上述部分純化IL-6受體每10天免疫BALB/c小鼠4次，然后用常規(guī)方法制備雜交瘤。用下述方法調(diào)查來自成長陽性孔的雜交瘤培養(yǎng)上清液對IL-6受體的結(jié)合活性。用35S-蛋氨酸(2.5mCi)標(biāo)記的5ラ107個(gè)U266細(xì)胞，用上述毛地黃皂苷緩沖液使之裂解。將裂解的U266細(xì)胞和0.04ml容量的與瓊脂糖4B珠結(jié)合的MT18抗體混合，然后，用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次，使用0.25ml毛地黃皂苷緩沖液(pH3.4)使35S-蛋氨酸標(biāo)記的IL-6受體洗脫，用0.025ml的1M Tris(pH 7.4)中和。
將0.05ml的雜交瘤培養(yǎng)上清液和0.01ml的蛋白G瓊脂糖(Phramacia制)混合。洗滌后，將瓊脂糖和上述制備的0.005ml35S標(biāo)記的IL-6受體溶液一起溫育。用SDS-PAGE分析免疫沉降物，研究與IL-6受體反應(yīng)的雜交瘤培養(yǎng)上清液。其結(jié)果確立了反應(yīng)陽性雜交瘤克隆PM-1(FERM BP-2998)。產(chǎn)生于雜交瘤PM-1的抗體具有IgG1κ型的亞型。
用人骨髓瘤細(xì)胞株U266研究雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體相對于人IL-6受體的IL-6的結(jié)合抑制活性。人重組型IL-6用大腸桿菌制備(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41-45)、用Bolton-Hunter試劑(NewEngl and Nuclear，Boston，MA)進(jìn)行125I標(biāo)記的(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981)。
將4×105個(gè)U266細(xì)胞與70％(v/v)雜交瘤PM-1的培養(yǎng)上清液和14000cpm的125I標(biāo)記的IL-6一起培養(yǎng)一小時(shí)。將70μl樣品鋪到400μl的微植菌聚乙烯管中的300μl的FCS上，離心后，測定細(xì)胞上的放射活性。
結(jié)果表明，雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合。
參考例4.抗小鼠IL-6受體抗體的制備通過Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168-173記載的方法，制備對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
在含有10％FCS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)產(chǎn)生小鼠可溶性IL-6受體的CHO細(xì)胞，從其培養(yǎng)上清液使用將抗小鼠IL-6受體抗體RS12(參照上述Saito，T.et al)固定于Affigel 10凝膠(Biorad制)的親和性色譜柱純化小鼠可溶性IL-6受體。
混合得到的小鼠可溶性IL-6受體50μg和弗氏完全佐劑，向ウイスタ—大鼠的腹部注射。2周后開始用弗氏不完全佐劑追加免疫。第45天采集大鼠脾臟細(xì)胞，使2×108個(gè)脾臟細(xì)胞按照常規(guī)方法與1×107個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3U1和50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制)細(xì)胞融合后，在HAT培養(yǎng)基中篩選雜交瘤。
在包被了兔抗大鼠IgG抗體(Cappel制)的板上加入雜交瘤培養(yǎng)上清液后，使小鼠可溶性IL-6受體反應(yīng)。然后，通過使用兔抗小鼠IL-6受體抗體和堿性磷酸酯酶標(biāo)記的的綿羊抗兔IgG的ELISA法篩選對于小鼠可溶性IL-6受體產(chǎn)生抗體的雜交瘤。對已確認(rèn)產(chǎn)生抗體的雜交瘤克隆進(jìn)行2次亞篩選，得到單一的雜交瘤克隆。此克隆被命名為MR16-1。
用MH60.BSF2細(xì)胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951-956)用3H胸苷的攝取研究該雜交瘤產(chǎn)生的抗體在小鼠IL-6的信息傳遞中的中和活性。在96孔板上制備MH60.BSF2細(xì)胞至1ラ104個(gè)/200μl/孔。在該板上加入10pg/ml的小鼠IL-6和MR16-1抗體或RS12抗體12.3～1000ng/ml，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)44小時(shí)后，加入1μCi/孔的3H胸苷。4小時(shí)后測定3H胸苷的攝取。結(jié)果表明，MR16-1抗體抑制MH60.BSF2細(xì)胞的3H胸苷攝取。
因此表明，雜交瘤MR16-1(FERM BP-5874)產(chǎn)生的抗體，阻礙IL-6與IL-6受體的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病治療劑，含有白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分組成。
2.一種小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，含有白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分。
3.如權(quán)利要求2中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，IL-6拮抗劑是對IL-6受體的抗體。
4.如權(quán)利要求3中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對IL-6受體的單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求4中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對人IL-6受體的單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求4中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
7.如權(quán)利要求3～6的任一項(xiàng)中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是重組抗體。
8.如權(quán)利要求5中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
9.如權(quán)利要求6中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
10.如權(quán)利要求3～5的任一項(xiàng)中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
11.如權(quán)利要求10中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的人源化抗體是人源化的PM-1抗體。
12.如權(quán)利要求2～11的任一項(xiàng)中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，上述小兒慢性關(guān)節(jié)炎是ARA分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型、少關(guān)節(jié)炎型；EULAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型、少關(guān)節(jié)炎型；ILAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型(RF陽性型)、多關(guān)節(jié)炎型(RF陰性型)、少關(guān)節(jié)炎型、發(fā)展型少關(guān)節(jié)炎型；本發(fā)明者們分類中的小兒原發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(SPRASH綜合征，小兒自發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(a.類風(fēng)濕病因子(RF)陽性型、b.抗核抗體(ANA)陽性型、c.RF/ANA陰性型))。
13.如權(quán)利要求2～11的任一項(xiàng)中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，上述小兒慢性關(guān)節(jié)炎是ARA分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型；EULAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型；ILAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型(RF陽性型)、多關(guān)節(jié)炎型(RF陰性型)、發(fā)展型少關(guān)節(jié)炎型；本發(fā)明者們分類中的小兒原發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(SPRASH綜合征，小兒自發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(a.類風(fēng)濕病因子(RF)陽性型、b.抗核抗體(ANA)陽性型))。
14.如權(quán)利要求2～11的任一項(xiàng)中記載的小兒慢性關(guān)節(jié)炎治療劑，上述小兒慢性關(guān)節(jié)炎是ARA分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型；EULAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型；ILAR分類中的全身型、多關(guān)節(jié)炎型(RF陽性型)、發(fā)展型少關(guān)節(jié)炎型；本發(fā)明者們分類中的小兒原發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(SPRASH綜合征，小兒自發(fā)性慢性關(guān)節(jié)炎(a.類風(fēng)濕病因子(RF)陽性型)。
15.一種斯提爾氏病治療劑，含有白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分。
16.如權(quán)利要求15中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，IL-6拮抗劑是對于IL-6受體的抗體。
17.如權(quán)利要求16中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對于IL-6受體的抗體是對于IL-6受體的單克隆抗體。
18.如權(quán)利要求17中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對人IL-6受體的單克隆抗體。
19.如權(quán)利要求17中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
20.如權(quán)利要求16～19的任一項(xiàng)中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是重組抗體。
21.如權(quán)利要求18中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
22.如權(quán)利要求19中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
23.如權(quán)利要求16～18的任一項(xiàng)中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
24.如權(quán)利要求23中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的人源化抗體是人源化的PM-1抗體。
25.如權(quán)利要求15～24的任一項(xiàng)中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，斯提爾氏病是成人斯提爾氏病。
26.如權(quán)利要求15～24的任一項(xiàng)中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，斯提爾氏病是小兒的斯提爾氏病。
全文摘要
一種小兒慢性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病，如小兒慢性關(guān)節(jié)炎，斯提爾氏病等的治療劑，以白細(xì)胞介素－6(IL－6)拮抗劑為有效成分。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1499983SQ0280778
公開日2004年5月26日 申請日期2002年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月2日
發(fā)明者吉崎和幸, 弘, 西本憲弘, 巖本雅弘, 次, 簑田清次, 平, 橫田俊平, 佳子, 宮前多佳子 申請人:中外制藥株式會(huì)社