專利名稱：蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療心血管疾病的藥物，特別是抗心肌缺血的藥物，同時(shí)涉及從植物中提取的有效部位的新的應(yīng)用，特別是蝙蝠葛酚性生物堿的新的應(yīng)用。
心肌缺血是冠心病的重要致病原因。冠心病全稱為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，心絞痛是其常見癥狀，由心肌急劇的暫時(shí)缺血和缺氧所引起。發(fā)作時(shí)病人胸骨后或左前胸區(qū)出現(xiàn)陣發(fā)性絞痛或悶痛，一般歷時(shí)1-5分鐘，給病人帶來很大痛苦并危及生命。因此，對(duì)心肌缺血的控制和治療是當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界的重要課題。
蝙蝠葛酚性堿(phenolic alkaloids of menispermum dauricum，PAMD)系從防己科植物蝙蝠葛(menispermum dauricum DC)的根莖中提取的雙芐基異喹啉類生物堿。本發(fā)明應(yīng)用的蝙蝠葛酚性堿是用以下方法從防己科植物蝙蝠葛根莖中提取的酚性生物堿(1)從蝙蝠葛根莖粗粉中提取總生物堿；(2)含有生物總堿的提取液經(jīng)NaOH堿化析出粗總堿沉淀；(3)利用酚性堿有效部位的脂溶性特征，以有機(jī)溶媒從粗總堿中提取酚性堿得棕色膏狀物；(4)將以有機(jī)溶媒提取的棕色膏狀物經(jīng)NaOH溶解，過濾除去難溶性的非酚性脂溶性雜質(zhì)，酚性堿水溶液再加酸調(diào)節(jié)pH值，濾集析出物，干燥，得純度高的淺黃色蝙蝠葛酚性堿。
在上述步驟中，從蝙蝠葛根莖粗粉中提取生物總堿的方法是酸水提取法，具體是以0.2％硫酸稀溶液以滲漉法濾取滲漉液；將含有生物總堿的提取液經(jīng)NaOH堿化析出粗總堿沉淀的方法是使用10％NaOH堿化至pH8-8.5獲得沉淀物粗總堿；從粗總堿中提取酚性堿所使用的有機(jī)溶媒是乙醇，具體是將粗總堿碾成60目左右細(xì)粉，以85-95％乙醇在水浴上回流提取，過濾，減壓濃縮得棕色膏狀物；從用有機(jī)溶媒提取的純度較低的棕色膏狀酚性堿中獲得純度高的淺黃色蝙蝠葛酚性堿產(chǎn)物的具體工藝步驟是將有機(jī)溶媒提取物加1％NaOH溶解，過濾，在攪拌下向過濾液加入10％H2SO4調(diào)PH8-8.5濾集沉淀物，水洗，50-55℃通風(fēng)干燥后得高純度淡黃色蝙蝠葛酚性堿。
蝙蝠葛酚性堿(PAMD)抗心肌缺血主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論1.異丙腎上腺素(Iso)增加心肌耗氧量所致大鼠心肌損傷的實(shí)驗(yàn)表明，PAMD能明顯降低血清CK和LDH水平，提高血清中SOD活性及降低血清MDA水平，可減輕心肌組織病理損傷，其作用與地爾硫卓、地奧心血康作用相似。結(jié)果表明，PAMD對(duì)Iso所致大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用，與其抗氧化及改善心肌代謝有關(guān)。
2.手術(shù)結(jié)扎阻斷犬冠狀動(dòng)脈所致急性心肌缺血實(shí)驗(yàn)中，采用心電圖ST段、酶學(xué)及定量組織學(xué)指標(biāo)觀察PAMD對(duì)犬急性心肌缺血的影響，并與DAXXK的抗心肌缺血作用相比較。結(jié)果表明，PAMD能對(duì)抗ST段上移及降低LDH和CK活性，并能降低心肌梗死范圍。PAMD 7mg.kg-130min時(shí)，在對(duì)抗ST段上移及降低LDH活性上優(yōu)于DAXXK 40mg.kg-1(P＜0.01)，降低CK活性的作用與DAXXK相當(dāng)(P＞0.05)；高低劑量PAMD組降低梗死范圍與DAXXK 40mg.kg-1組作用無顯著差異(P＞0.05)。
3.在離體實(shí)驗(yàn)中PAMD對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。PAMD能促進(jìn)LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的恢復(fù)，增加冠脈流量、增強(qiáng)心肌SOD活性及降低MDA含量。PAMD對(duì)LVSP、LVEDP及±dp/dtmax影響及對(duì)心肌SOD、MDA含量變化與DAXXK比較無顯著差異(P＞0.05)，PAMD組能增加冠脈流量，100mg·L-1組在3min時(shí)作用較DAXXK強(qiáng)(P＜0.05)。提示PAMD對(duì)離體大鼠缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。
4.通過觀察PAMD對(duì)大鼠H/R損傷心肌細(xì)胞的影響，從分子細(xì)胞水平探討了PAMD對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，PAMD可減輕H/R造成的細(xì)胞超為結(jié)構(gòu)的損傷，提高細(xì)胞存活率，減少損傷過程中能量消耗，降低細(xì)胞內(nèi)鈣含量。另外，PAMD可降低缺氧復(fù)氧引起的LDH漏出和細(xì)胞內(nèi)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，減少心肌細(xì)胞NO的生成，使SOD的含量恢復(fù)至正常值。而PAMD對(duì)缺氧性損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用隨著給藥濃度的提高而增強(qiáng)，具有濃度依賴性特征。
5.蝙蝠葛酚性堿對(duì)犬血流動(dòng)力學(xué)及冠脈循環(huán)的影響。結(jié)果表明，①對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響PAMD能使犬LVSP、心率、總外周阻力均明顯降低，而動(dòng)脈血壓、LVEDP、心輸出量、+dp/dtmax、-dp/dtmax、左心作功、心臟指數(shù)變化則無顯著性。②對(duì)冠脈循環(huán)的作用PAMD能使犬冠脈血流量增加，冠脈阻力降低。③對(duì)心肌氧代謝的影響PAMD能使犬心肌氧含量明顯增加，氧利用率明顯降低，然而動(dòng)脈血氧含量和冠狀竇血氧含量無明顯變化。
從以上整體和離體心肌缺血實(shí)驗(yàn)中，用定量組織學(xué)、生理及生化觀測指標(biāo)的結(jié)果顯示PAMD可保護(hù)缺血心肌，減少梗塞范圍及損傷程度；調(diào)節(jié)冠脈循環(huán)、心臟功能及全身血流動(dòng)力學(xué)狀況；改善心肌氧及能量代謝，從而增加心肌供氧及減少耗氧量。PAMD同時(shí)具有抗氧化和防止鈣超載的作用。總之，PAMD具有抗心肌缺血作用。
有關(guān)的具體實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)1.蝙蝠葛酚性堿對(duì)大鼠異丙腎上腺素心肌損傷的保護(hù)作用本實(shí)驗(yàn)旨在觀察PAMD對(duì)異丙腎上腺素(Isoprenaline，ISO)誘發(fā)缺血心肌模型的保護(hù)作用及其與減輕脂質(zhì)過氧化的關(guān)系，并與地爾硫卓、地奧心血康的抗心肌缺血作用進(jìn)行比較。1.1材料和方法1.1.1材料、藥品和主要試劑日本島津8000型全自動(dòng)生化分析儀，上海分析儀器廠721分光光度計(jì)。
PAMD粉劑，按本申請(qǐng)所述制備方法提取，臨用前用0.1mol·L-1HCl溶解，再用0.1mol·L-1NaOH調(diào)pH至6.5-6.8。地爾硫卓原料藥由天津田邊制藥有限公司提供，批號(hào)000315，地奧心血康原料藥由成都地奧公司提供，批號(hào)98206，ISO原料藥由上海大眾藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)2000306。
乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)由北京中生生物工程部技術(shù)公司生產(chǎn)，超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒均由南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所生產(chǎn)。1.1.2實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型健康SD大鼠70只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，體重266±12g，隨機(jī)分為7組，每組10只。①ISO組參照文獻(xiàn)方法建立心肌損傷模型[2]，皮下注射(sc)ISO 85mg·kg-1，并于30min前用與PAMD等容積的生理鹽水(NS)灌胃(ig)。②③④PAMD保護(hù)組在注射ISO前30min給予PAMD灌胃，劑量分別為7.5mg·kg-1、15mg·kg-1、30mg·kg-1。⑤地爾硫卓保護(hù)組作為陽性西藥對(duì)照組，注射ISO前30min給予地爾硫卓10mg·kg-1ig。⑥地奧心血康保護(hù)組作為陽性中藥對(duì)照組，注射ISO前30min給予地奧心血康150mg·kg-1ig。⑦NS組為陰性對(duì)照組，分別ig和sc與PAMD和ISO等容積的NS。1.1.3血清酶學(xué)測定于皮下注射ISO后24小時(shí)從大鼠眼靜脈取血，離心(2400×g)制得血清，應(yīng)用日本島津8000型全自動(dòng)生化分析儀測定LDH和CK活性。1.1.4血清SOD活性及MDA含量測定按上述方法制備血清，采用亞硝酸鹽形成法[Elster EF.Heupel A.Inhibition of nitric formationfrom hydroxylammoniumchloridea simple assay for superoxide dismutase[J].Anal Biochem，1976；70616]測定SOD活性；采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)[向榮、王鼎年。過氧化脂質(zhì)硫代巴比妥酸分光光度法的改進(jìn)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1990；17241-242]定MDA含量。1.1.5心肌病理損傷分級(jí)處死后切取心臟，經(jīng)4％甲醛固定及常規(guī)石蠟包埋后左室前壁取材作組織切片，HE染色，Olympus鏡下觀察，參照文獻(xiàn)[朱接全，曾繁典，胡崇家。蝙蝠葛堿對(duì)貓冠脈結(jié)扎和復(fù)灌性心律失常的影響及電生理作用。中國藥理學(xué)通報(bào)，1991；7(1)23.][王波、陳修。抗心肌缺血藥實(shí)驗(yàn)方法述評(píng)[J]。藥學(xué)通報(bào)，1987；22(10)583-585]將病理損傷程度分級(jí)0級(jí)為無病變正常心肌，1級(jí)為心內(nèi)膜下局灶性心肌病變，I1級(jí)為大范圍局灶性心肌病變，III級(jí)為大范圍廣泛融合性心肌病變。1.1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料用x±s表示，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)；等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。1.2 結(jié)果1.2.1 PAMD對(duì)血清LDH、CK的影響(表1-1)ISO組與NS組相比，血清LDH、CK活性明顯升高(P＜0.01)，表明心肌受損后CK和LDH釋放入血增加。地爾硫卓、DAXXK均能顯著降低LDH、CK活性(P＜0.01)；PAMD能劑量依賴性地降低LDH、CK活性(P＜0.05和P＜0.01)，顯著減輕ISO引起的血清酶學(xué)的升高。PAMD 15mg·kg-1和30mg·kg-1作用與地爾硫卓10mg·kg-1無顯著性差異(P＞0.05)，PAMD30mg·kg-1作用優(yōu)于DAXXK 150mg·kg-1(P＜0.05)表1-1 PAMD對(duì)ISO心肌損傷太鼠血清LDH、CK活性的影響(x±s，n＝10)組別LDH(U·L-1) CK(U·L-1)NS 967±253▲▲284±71▲▲ISO+NS 2127±538500±127ISO+PAMD 7.5mg·kg-11930±561△*465±123△*ISO+PAMD 15mg·kg-11637±458▲398±101▲ISO+PAMD 30mg·Kg-11335±384▲▲*337±83▲▲*ISO+Diltiazem10mg·kg-11429±384▲▲330±86▲▲ISO+DAXXK150mg·kg-11427±375▲▲354±91▲▲與ISO組比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與Diltiazem組比△P＜0.05；與DAXXK組比*P＜0.051.2.2 PAMD對(duì)血清SOD活性、MDA含量的影響(表1-2)ISO組與NS組相比，血清SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P＜0.01)。地爾硫卓、DAXXK均能顯著提高SOD，降低MDA(P＜0.01)；PAMD 15mg·kg-1和30mg·kg-1均能顯著提高SOD，降低MDA(P＜0.05和P＜0.01)。PAMD 15mg·kg-1、30mg·kg-1與地爾硫卓10mg·kg-1、DAXXK 150mg·kg-1對(duì)SOD的作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，PAMD 30mg·kg-1對(duì)MDA的作用優(yōu)于DAXXK 150mg·kg-1(P＜0.05)。
表1-2 PAMD對(duì)ISO心肌損傷大鼠血清SOD活性、MDA含量影響(x±s，n＝10)組別SOD(NU·ml-1) MDA(Nm·ml-1)NS 122.5±31.3▲▲14.12±3.71▲▲ISO+NS 77.7±22.9 30.37±7.66ISO+PAMD 7.5mg·kg-187.0±23.4△*25.29±6.84△ISO+PAMD 15mg·kg-1101.7±25.6▲23.82±5.64▲ISO+PAMD 30mg·kg-1116.1±30.3▲▲21.48±6.51▲▲*ISO+Diltiazem 10mg·kg-1114.1±28.7▲▲19.42±4.86▲▲ISO+DAXXK 150mg·kg-1111.0±28.6▲▲22.97±5.83▲▲與ISO組比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；與Diltiazem組比△P＜0.05；與DAXXK組比*P＜0.051.2.3對(duì)心肌病理學(xué)分級(jí)的影響(表1-3)病理檢查結(jié)果表明ISO組心肌損傷分級(jí)較NS組明顯增加(P＜0.01)，而應(yīng)用PAMD保護(hù)組心肌病變程度顯著減輕，病理學(xué)分級(jí)較ISO組明顯降低(P＜0.05與P＜0.01＝，PAMD與地爾硫卓、DAXXK相比作用無顯著性差異(P＞0.05)。
表1-3 PAMD對(duì)ISO心肌損傷大鼠病理損傷程度的影響(n＝10)病理損傷分級(jí)組別P值*0級(jí) I級(jí) II級(jí)III級(jí)NS 91 00＜0.01ISO 00 37ISO+PAMD 7.5mg·kg-102 35ISO+PAMD 15mg·kg-104 33＜0.05ISO+PAMD 30mg·kg-104 42＜0.01ISO+Diltiazem 10mg·kg-102 44ISO±DAXXK 150mg·kg-10253＜0.01多組秩和檢驗(yàn)*與ISO組相比1.3結(jié)論P(yáng)AMD能明顯降低血清CK和LDH水平，提高血清中SOD活性及降低血清MDA水平，可減輕心肌組織病理損傷，其作用與地爾硫卓、地奧心血康作用相似。結(jié)果表明，PAMD對(duì)Iso所致大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用。2.蝙蝠葛酚性堿對(duì)犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎形成心肌梗死的保護(hù)作用2.1材料與方法2.1.1 材料、藥品和主要試劑ECG-6511型心電圖機(jī)，上海醫(yī)用電子儀器廠生產(chǎn)；SC-3型人工呼吸機(jī)，上海醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；日本島津8000型全自動(dòng)生化分析儀。
PAMD粉劑，按本申請(qǐng)所述方法提取，臨用前用0.1mol·L-1HCl溶解，再用0.1mol·L-1NaOH調(diào)pH至6.5-6.8。地奧心血康原料藥由成都地奧公司提供，批號(hào)98206。
乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)由北京中生生物工程部技術(shù)公司生產(chǎn)。硝基四氮唑藍(lán)(NBT)由上海前進(jìn)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。2.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型健康成年家犬30只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不拘，體重15±2kg，隨機(jī)分為5組，每組6只。戊巴比妥鈉30mg·kg-1靜脈麻醉后右側(cè)臥位固定，氣管插管，連接人工呼吸機(jī)。胸部去毛，沿左側(cè)第四肋間隙開胸，暴露心臟，縱行切開心包，將心包緣縫于胸壁，做成搖籃狀心包床，以固定心臟。分離冠狀動(dòng)脈左前降支第三分支根部并結(jié)扎。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組①偽手術(shù)組(F)在左冠狀動(dòng)脈前降支下穿線但并不結(jié)扎，并術(shù)前90min給予與受試組等容積的生理鹽水灌胃(ig)，其它各組均結(jié)扎。②③PAMD保護(hù)組在結(jié)扎前90min分別給予PAMD 3.5mg·kg-1、7mg·kg-1ig。④DAXXK保護(hù)組作為陽性中藥對(duì)照組，結(jié)扎前90min給予DAXXK 40mg·kg-1ig。⑤模型對(duì)照組(NS)結(jié)扎前90min給予與受試組等容積的生理鹽水。2.1.3 心電圖的測定記錄結(jié)扎前、結(jié)扎后15、30、60、120、180min II導(dǎo)心電圖，分析ST段改變。2.1.4血清酶學(xué)測定在結(jié)扎前和完全結(jié)扎后15、30、60、120、180min從左側(cè)頸外靜脈插管采集冠脈竇附近血液制備血清，測血中LDH、CK活性。2.1.5測量心肌梗死范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)束取出心臟，除去血管及脂肪組織，稱取全心重量，再沿冠狀動(dòng)脈溝除去心房，將心室稱重后，橫切成5片，然后將心肌片置于0.25％NBT染液中，振搖染色15分鐘后取出，精確剪去被染色的非梗死心肌，將未染色的梗死心肌稱重，計(jì)算梗死心肌占心室肌百分率，據(jù)此說明梗死范圍大小。2.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。以結(jié)扎后不同時(shí)間實(shí)測值與結(jié)扎前進(jìn)行比較，以藥后不同時(shí)間變化百分率(藥前為100％)進(jìn)行組間比較。2.2 結(jié)果2.2.1 心電圖ST段變化(表2-1)NS組與F組相比，犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后15min始ST段上移，PAMD高低劑量組30min后均可顯著對(duì)抗ST段上移(與NS組相比P＜0.01)，DAXXK 40mg·kg-1組120min后可明顯對(duì)抗ST段上移(P＜0.01)，說明PAMD發(fā)揮作用較DAXXK早，但PAMD與DAXXK相比作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
表2-1 PAMD對(duì)麻醉犬冠脈結(jié)扎前后心電圖ST段移位的影響(x±s，n＝6) Unitmv結(jié)扎后組別 結(jié)扎前15min 30min 60min 120min180minNS 0 0007±0.07※0.10±0.06※※0.12±0.09※※0.13±0.09※※0.10±0.06※※F 0 0.01±0.02 0 0-0.01±0.01 -0.01±0.01PAMD 3.5mg·kg-10 0.04±0.14 -0.01±0.03■■-0.02±0.04■■-0.02±0.03■■0.002±0.01■■PAMD 7mg·kg-10 0.03±0.02 0.003±0.05■■-0.01±0.06■■-0.03 ±0.06■■-0.02±0.08■■DAXXK 40mg·kg-10 0.02±0.08 0.04±0.070.04±0.08 0.01±0.06■■-0.02±0.04■■與NS組比■P＜0.05，■■P＜0.01；與F組比※P＜0.05，※※P＜0.012.2.2 PAMD對(duì)血清酶學(xué)的影響冠脈結(jié)扎后NS組與F組相比，冠脈竇血清LDH活性明顯升高，最大升高幅度為145±14％(P＜0.01)；PAMD組15min后即能劑量依賴地降低LDH活性(與NS組相比P＜0.05或P＜0.01)；DAXXK 40mg·kg-1組30min后始降低LDH活性(P＜0.05或P＜0.01)。PAMD7mg.kg-1在30min時(shí)作用優(yōu)于DAXXK 40mg.kg-1(P＜0.05)，見表2-2。表2-2 PAMD對(duì)麻醉犬冠脈結(jié)扎前后血清LDH(U·L-1)的影響(x±s，n＝6)結(jié)扎后組別 結(jié)扎前15min 30min 60min 120min 180minNS 242±107297±140327±137322±136319±128347±146
％100 121±15 136±22 135±14 135±11145±14F 253±84 255±87 270±84 280±100298±94306±112％100 101±6■■108±10■■110±11■■118±6■■120±14■■PAMD 3.5mg·kg-1250±83 272±104294±105 293±81 302±92314±93％100 108±8■※117±6■※119±13■122±8■127±11■PAMD 7mg·kg-1282±87 286±104302±113 311±106339±116 358±131％100 101±9■■106±10■■*109±8■■119±9■125±8■■DAXXK 40mg·kg-1294±79 320±77 338±74 339±94 351±87363±80％100 110±9※117±10■116±8■■120±2■■125±10■■與NS組比■P＜0.05，■■P＜0.01；與F組比※P＜0.05；與DAXXK組比*P＜0.05NS組結(jié)扎犬冠脈后與F組相比，CK活性明顯升高(P＜0.01)，180min時(shí)與結(jié)扎前相比有顯著差異(P＞0.05)；PAMD組15min始降低CK活性(與NS組相比P＜0.05或P＜0.01)；DAXXK 40mg·kg-1組60min后始降低CK活性(P＜0.05或P＜0.01)。PAMD 7mg·kg-1作用與DAXXK 40mg·kg-1相當(dāng)(P＞0.05)，見表2-3。
表2-3 PAMD對(duì)麻醉犬冠脈結(jié)扎前后血清CK(U·L-1)的影響(x±s，n＝6)結(jié)扎后組別 結(jié)扎前15min 30min60min120min 180minNS520±105 651±149 648±149 649±15 703±128□820±139□□％ 100125±12 124±6.9 125±9 136±11 159±11F 474±181 502±178 514±190 498±148 526±193 622±208％ 100107±8■■109±11■■108±9■■112±10■■133±14■■PAMD 3.5mg·kg-1497±128 527±138 564±139 567±149 613±161 753±190□％ 100114±4■※114±7■114±8■■123±6■※153±18※*PAMD7mg·kg-1493±127 535±111 553±138 571±166 589±154 666±160□％ 100110±7■■113±6■■115±6■119±5■■136±8■■DAXXK40mg·kg-1525±131 615±159 622±170 607±146 626±151 685±141□％ 100117±8※118±6※116±5■※119±5■■132±13■■與結(jié)扎前比□P＜0.05，□□P＜0.01；與NS組比■P＜005，■■P＜0.01；與F組比※P＜0.05；與DAXXK組比*P＜0.052.2.3 對(duì)心肌梗死范圍的影響(表2-4)犬冠脈結(jié)扎引起心肌梗死后，心肌梗死區(qū)占心室及全心重量分別為12.07±2.96％和10.75±2.65％，與F組相比均顯著提高(P＜0.01)。PAMD能降低梗死范圍(P＜0.05或P＜0.01)，與DAXXK相比作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P＞0.05)。
表2-4 PAMD對(duì)麻醉犬心肌梗死范圍的影響(x±s，n＝6)組別 梗死區(qū)/心室(％) 梗死區(qū)/全心(％)NS12.07±2.96※※10.75±2.65※※F0 0PAMD 3.5mg·kg-18.22±2.12■7.38±1.96■PAMD 6.38±1.90■■5.81±1.79■■7mg·kg-1DAXXK 40mg·kg-16.72±1.90■■6.01±1.61■■與NS組比■P＜0.05，■■P＜0.01；與F組比※※P＜0.0012.3結(jié)論P(yáng)AMD 7mg·kg-130min時(shí)，在對(duì)抗ST段上移及降低LDH活性上優(yōu)于DAXXK 40mg·kg-1(P＜0.01)，降低CK活性的作用與DAXXK相當(dāng)(P＞0.05)；高低劑量PAMD組降低梗死范圍與DAXXK 40mg·kg-1組作用無顯著差異(P＞0.05)。PAMD預(yù)防性給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血有明顯的保護(hù)作用。3. 酚性堿對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用3.1材料和方法3.1.1材料和藥品PAMD粉劑，本室按本申請(qǐng)所述制備方法提取，臨用前用0.1mol·L-1HCl溶解，再用0.1mol·L-1NaOH調(diào)pH至6.5-6.8。地奧心血康原料藥由成都地奧公司提供，批號(hào)98206。超氧化歧化酶(SOD)檢測試劑盒及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒均由南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所生產(chǎn)。3.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、操作步驟及測定指標(biāo)體重300±10g♂Wistar大鼠60只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在戊巴比妥鈉麻醉(45mg·kg-1i.p.)和肝素化(500 U·kg-1i.p.)后，迅速取出心臟置4℃KH液中并懸掛于Langendorff灌流裝置上，以95％O2+5％CO2平衡的改良KH液恒溫(37±0.5℃)恒壓[7.84 Kpa(80cmH2O)]灌流，穩(wěn)定灌注15分鐘(預(yù)灌)后，隨機(jī)分成6組，每組10只。①缺血再灌注模型(IR)組KH液灌流，缺血30分鐘后再灌注40分鐘。②正常對(duì)照(C)組KH液灌注70分鐘。③④⑤PAMD保護(hù)組KH液內(nèi)分別加PAMD 1、10、100mg·L-1，余同①組。⑥D(zhuǎn)AXXK保護(hù)組KH液內(nèi)分別加DAXXK 100mg·L-1，余同①組。改良KH液成分(mmol·L-1)NaCl 118，KCl 4.7，MgSO41.2，CaCl21，KH2PO41.2，NaHCO325，Glucose 11.1，Na2EDTA 0.5，pH 7.35-7.45。3.1.3左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)及左室壓最大變化速率(±dp/dtmax)將與SJ-42型多道生理記錄儀相連的導(dǎo)管經(jīng)左心耳切口插入至左心室，記錄預(yù)灌末及再灌注30min時(shí)的LVSP、LVEDP及±dp/atmax。3.1.4 冠脈流量量筒收集在缺血前5min及再灌注1、3、5、10、15、20min時(shí)冠脈流出液以測定冠脈流量(CF)。3.1.5 心肌組織SOD活性及MDA含量心臟灌注末，稱取濕重，剪取心尖組織約0.2g，制成10％勻漿，采用亞硝酸鹽形成法[4]，按照南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所試劑盒說明書測定SOD活性；采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)[5]，按照南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所試劑盒說明書測定MDA含量。3.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。3.2結(jié)果3.2.1 LVSP、LVEDP及±dp/dtmax變化(表3-1)PAMD組能促進(jìn)LVSP、LVEDP及±dp/dtmax恢復(fù)。PAMD100mg·L-1組在缺血再灌注末LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax分別降為預(yù)灌末值的68±8％、73±5％和58±5％，LVEDP升至預(yù)灌末值的49±8％，與IR組相比有顯著差異(P＜0.05)，與DAXXK組作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3.2.2 冠脈流量變化(表3-2)PAMD組能增加冠脈流量，100mg·L-1組在3min時(shí)作用較DAXXK強(qiáng)(P＜0.05)
表3-1 PAMD對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注時(shí)LVSP、LVEDP及±dp/dtmax的影響(x±s，n＝10)組別 LVSP(kPa) LVEDP(kPa)+dp/dtmax(kPa/s) -dp/dtmax(kPa/s)(mg·L-1) 缺血前再灌注30min 缺血前 再灌注30min 缺血前 再灌注30min缺血前再灌注30minC 11.99±1.30 11.94±1.31▲▲0.11±0.04 0.11±0.03▲▲316.7±74.2316.3±74.1▲▲206.1±47.2206.4±46.3▲▲IR12.36±1.24 4.44±0.50 0.13±0.07 0.55±0.26 338.5±79.0134.8±25.2 258.8±66.6105.0±20.1PAMD1 12.57±0.73 4.73±0.43**0.16±0.06 0.69±0.33**349.9±73.0147.7±31.2**263.5±72.3115.8±27.0**PAMD 10 13.09±1.17 6.30±1.18▲▲**0.17±0.05 0.67±0.22**385.3±100.1 204.4±72.2▲▲295.3±63.3151.9±53.6▲▲PAMD 100 12.72±1.31 8.68±0.97▲▲0.17±0.05 0.37±0.12▲370.7±94.7270.6±71.8▲▲278.9±72.2197.9±48.9▲▲DAXXK 100 12.28±0.86 8.33±0.80▲▲0.14±0.07 0.35±0.19▲▲321.0±92.6223.2±68.5▲▲244.7±67.7174.6±51.8▲▲與IR組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，與DAXXK組相比**P＜0.01
表3-2 PAMD對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注時(shí)冠脈流量的影響(x±s，n＝10)組別 再灌注缺血前(mg·L-1) 1min3min 5min10min15min 20min 30minC 6.50±1.70 6.44±1.72▲▲6.47±1.71▲▲6.42±1.72▲▲6.38±1.75▲▲6.35±1.76▲▲6.30±1.78▲▲6.30±1.74▲▲IR6.12±1.59 1.33±0.341.39±0.30 1.37±0.34 1.38±0.33 1.38±0.25 1.36±0.33 1.34±0.34PAMD 16.05±1.51 1.51±0.271.68±0.27▲**1.68±0.29▲**1.58±0.27**1.62±0.27▲**1.57±0.25**1.56±0.29**PAMD 10 5.71±1.47 1.65±0.50*2.66±0.57▲▲2.42±0.57▲▲**2.19±0.51▲▲**2.12±0.49▲▲*1.94±0.50▲▲**1.81±0.49▲*PAMD 100 6.03±1.49 1.61±0.553.39±0.96▲▲*3.14±0.92▲▲2.75±0.65▲▲2.51±0.66▲▲2.37±0.65▲▲2.06±0.52▲▲DAXXK 100 6.38±1.70 1.29±0.352.62±0.79▲▲3.36±0.77▲▲3.11±0.75▲▲2.74±0.67▲▲2.68±0.66▲▲2.48±0.68▲▲與IR組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，與DAXXK組相比*P＜0.05，**P＜0.01
3.2.3 心肌SOD、MDA含量變化(表3-3)IR組心肌SOD活性較C組明顯降低(P＜0.01)，MDA含量明顯增高(P＜0.001)，給予PAMD可增強(qiáng)心肌SOD活性，降低MDA含量。100mg·L-1組與IR組比較有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.001)，與DAXXK100mg·L-1無顯著差異(P＞0.05)。表3-3 PAMD對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注時(shí)心肌SOD活性及MDA含量的影響(x±s，n＝10)組別(mg·L-1) SOD活性(×10Nu/g干重) MDA含量(×10nmol/g干重)C 375±46▲▲3.11±0.85▲▲▲IR283±97 5.98±1.12PAMD1 312±67 4.96±0.66▲PAMD10360±64▲3.70±1.07▲▲▲PAMD100 394±67▲▲3.59±1.00▲▲▲DAXXK 100 358±43▲3.71±1.03▲▲▲與IR組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.013.3 結(jié)論P(yáng)AMD能促進(jìn)LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的恢復(fù)，增加冠脈流量、增強(qiáng)心肌SOD活性及降低MDA含量。顯示PAMD對(duì)離體大鼠缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。
按順序關(guān)機(jī)。箱體內(nèi)充盈氮?dú)?，密閉皮塞，然后開啟前箱體大門，逐盒取出，迅速充氮?dú)?、密塞，加鋁蓋鎖口、包裝。輔料在藥劑中的作用為氨基乙酸 氨基乙酸有增溶和穩(wěn)定pH作用。
甘露醇為凍干品骨架支撐劑。
權(quán)利要求
1.蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用。
2.按以下方法制備的蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用(1)從蝙蝠葛根莖粗粉中提取總生物堿；(2)含有生物總堿的提取液經(jīng)NaOH堿化析出粗總堿沉淀；(3)利用酚性堿有效部位的脂溶性特征，以有機(jī)溶媒從粗總堿中提取酚性堿得棕色膏狀物；(4)將上述以有機(jī)溶媒提取的棕色膏狀物經(jīng)NaOH溶解，過濾除去難溶性的非酚性脂溶性雜質(zhì)，酚性堿水溶液再加酸調(diào)節(jié)pH值，濾集析出物，干燥，得純度高的淺黃色蝙蝠葛酚性堿。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用，其特征在于所說的從蝙蝠葛根莖粗粉中提取生物總堿的方法是酸水提取法。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用，其特征在于所說的將含有生物總堿的提取液經(jīng)NaOH堿化析出粗總堿沉淀的方法是使用10％NaOH堿化至pH8-8.5，獲得沉淀物粗總堿。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用，其特征在于從粗總堿中提取酚性堿所使用的有機(jī)溶媒是乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用，其特征在于從粗總堿中提取酚性堿所使用的有機(jī)溶媒是乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3或6所述的蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用，其特征在于從用有機(jī)溶媒提取的純度較低的棕色膏狀酚性堿中獲得純度高的淺黃色蝙蝠葛酚性堿產(chǎn)物的具體工藝步驟是將有機(jī)溶媒提取物加1％NaOH溶解，過濾，在攪拌下向過濾溶液入10％H2SO4調(diào)PH8-8.5濾集沉淀物，水洗，50-55℃通風(fēng)干燥，得高純度淡黃色蝙蝠葛酚性堿。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用，其特征在于從用有機(jī)溶媒提取的純度較低的棕色膏狀酚性堿中獲得純度高的淺黃色蝙蝠葛酚性堿產(chǎn)物的具體工藝步驟是將有機(jī)溶媒提取物加1％NaOH溶解，過濾，在攪拌下向過濾溶液入10％H2SO4調(diào)PH8-8.5濾集沉淀物，水洗，50-55℃通風(fēng)干燥，得高純度淡黃色蝙蝠葛酚性堿。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蝙蝠葛酚性堿在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用，其特征在于從以有機(jī)溶媒提取的純度較低的棕色膏狀酚性堿中獲得純度高的淺黃色蝙蝠葛酚性堿產(chǎn)物的具體工藝步驟是將有機(jī)溶媒提取物加1％NaOH溶解，過濾，在攪拌下向過濾溶液入10％H2SO4調(diào)PH8-8.5濾集沉淀物，水洗，50-55℃通風(fēng)干燥，得高純度淡黃色蝙蝠葛酚性堿。
10.以蝙蝠葛酚性堿為活性成分的藥物制劑在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的任務(wù)是提供蝙蝠葛酚性堿新的醫(yī)療用途，即在制備用于治療心肌缺血藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用的蝙蝠葛酚性堿是從防己科植物蝙蝠葛的根莖中提取的酚性生物堿。整體和離體心肌缺血實(shí)驗(yàn)顯示，蝙蝠葛酚性堿可保護(hù)缺血心肌，減少梗塞范圍及損傷程度，調(diào)節(jié)冠脈循環(huán)、心臟功能及全身血流動(dòng)力學(xué)狀況，改善心肌氧及能量代謝，從而增加心肌供氧及減少耗氧量，同時(shí)具有抗氧化和防止鈣超載的作用，揭示蝙蝠葛酚性堿具有抗心肌缺血作用。
文檔編號(hào)C07D217/00GK1458149SQ02115870
公開日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2002年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月18日
發(fā)明者胡崇家, 曾繁典, 龔培力, 杜佐華, 潘錫平 申請(qǐng)人:伊春藥業(yè)有限公司