專(zhuān)利名稱(chēng)：基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程、重組人源銅鋅超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)的制備工藝。
超氧化物歧化酶(SOD)主要有抗衰老、抗炎癥、防輻射、抗氧化等功能，可廣泛應(yīng)用于化妝品、保健品、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的SOD，主要從天然生物體中提取，其中，以動(dòng)物血液提取SOD為主，由于血液制品提取的SOD，存在著外源性感染的危險(xiǎn)性和非人源制品用于人體有抗原性，在醫(yī)療等領(lǐng)域很難發(fā)揮其應(yīng)有的作用。從血液中提取SOD，原料來(lái)源有限，成本高、而且人血制品有外源性感染的危險(xiǎn)性(如肝炎病毒、愛(ài)滋病毒、支原體、衣原體等)。因此不易推廣，難以形成批量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備工藝，本工藝原料充足、成本低、無(wú)外源性污染的危險(xiǎn)性和免疫抗原性。而且生產(chǎn)的SOD活性半衰期長(zhǎng)(水劑常溫10天，水劑冷凍2年，冰干粉2、5-3年)。這樣，應(yīng)用領(lǐng)域可更加廣泛。
基因重組人源銅鋅SOD的制備工藝其技術(shù)方案特點(diǎn)是挑取工程菌單菌落接種在含氨芐的LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，然后接種到含AMAP100μg/mlLB培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃，180轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，OD值達(dá)到1.0時(shí)，收集菌液；取菌液以1∶10的比例，接種到含有AMP100μg/ml的改良M9培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)6小時(shí)，OD值達(dá)2.5-3.0時(shí)，迅速升溫至42℃，熱激誘導(dǎo)表達(dá)，然后在培養(yǎng)3-4小時(shí)，離心收集菌體，用0.9％的NaCl洗兩次后，再用PH7.8TES緩沖液懸浮菌體，冰浴條件下攪拌30分鐘，加入稀釋6倍的TES溶液冰浴條件下攪拌40分鐘，離心取上清液，離心的菌體加TES溶液冷凍，取出速暖到冰水混合物狀，加入稀釋6倍數(shù)的TES溶液，攪拌40分鐘，離心取上清液，將上述上清液經(jīng)超濾濃縮，得粗酶液，粗酶液經(jīng)透析，DEAE-Sephadex-A50離子交換柱層析，使其全部進(jìn)入膠面，再用Sephadex-200分子篩柱層析，收集Cu、Zn-SOD活力部分。自動(dòng)餾分收集器收集、冷凍、干燥。
目的蛋白以分泌性表達(dá)到細(xì)菌內(nèi)膜、外膜之間的周質(zhì)腔中，并且目的蛋白本身具有生物學(xué)活性，不需要進(jìn)行體外變性，復(fù)性處理。因?yàn)闈B透壓法破壞了細(xì)胞外膜，所以，目的蛋白經(jīng)緩沖液抽提，再經(jīng)離子交換，分子篩柱層析就進(jìn)一步得到純化。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于基因重組人源銅鋅SOD，半衰期長(zhǎng)，因此，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，還有產(chǎn)量高，成本低、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式1、搖床培養(yǎng)挑取工程菌(Cu、Zn-SOD/DH5α)的單菌落接種在含LB培養(yǎng)基(每升含蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，氨基芐100μg/ml，瓊脂粉15g)進(jìn)行斜面培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入填加AMP100μg/mlLB加培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，OD值達(dá)到1、0時(shí)，收集菌液。
2、發(fā)酵缶培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的菌液以1∶10的比例，接種于含有改良M9培養(yǎng)基(配方每升含K2HPO46g、KH2PO43g、(NH4)2SO41.5g、NaCl0.5g蛋白胨6g，酵母粉3g、1M MgSO4，葡萄糖10-20g，AMP100μg/ml、Cu2+0.5mM、Zn2+0.01mM)20L發(fā)酵缶中，在30℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)5-6小時(shí)，OD值達(dá)2.5-3.0，迅速升溫42℃，熱激誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)升溫，使阻遏蛋白失活，啟動(dòng)子開(kāi)始啟動(dòng)，SOD蛋白基因開(kāi)始表達(dá)SOD蛋白，再培養(yǎng)3-4小時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)到平衡期開(kāi)始放罐，離心，得菌體500g。
3、目的蛋白粗提取濕菌體500g，用0.9％的NaCl洗兩次，然后用1000ml，PH7.8的TES緩沖液懸浮菌體(TES溶液配方0.2M Tris.HCl，0.5mMEDTA，5M蔗糖)冰浴下攪拌30分鐘后，加入稀釋6倍的TES溶液化1500ml再懸浮菌體，12000轉(zhuǎn)/分離心，取上清液，把菌體用于500mlTES溶液懸浮冷凍，取出速暖至冰水混合物狀，再加入750ml稀釋6倍的TES溶液，攪拌40分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分離心，取上清液備用，再用稀釋6倍TES溶液500ML懸浮，12000轉(zhuǎn)/分離心取上清液，合并上清液共4250ml溶液。超濾濃縮至500ml溶液，此即為粗酶液4、目的蛋白的精提DEAE-Sephadex-A50離子交換柱層析。
(1)、粗蛋白在PH7.8層析用緩沖溶液10mMPBS(PBS緩沖液配方每升NaH2PO4，NaHPO4)以0.1mM EDTA置于10mMPBS溶液中，粗蛋白在溶液透析過(guò)液后，加到PBS平衡過(guò)的DEAE-Sephadex-A50柱上，樣品全部進(jìn)入膠面后，再用10mMPBS溶液進(jìn)行梯度洗脫。收集目的蛋白峰溶液。
(2)、Sephadex-G200分子篩柱層析收集DEAE-Sephadex-A50洗脫峰中含有Cu、Zn-SOD的酶液活力部分，用超濾器濃縮，在10mMPBS緩沖液中透析過(guò)也夜，樣品上柱后用10mMPBS，PH7.8溶液洗脫，自動(dòng)餾分收集器收集。經(jīng)離子交換和分子篩柱層析分離后，Cu·Zn-SOD酶純度可達(dá)95％以上，15％PAGE電泳可得單一條帶。加入甘露醇即可冷凍干燥得凍干粉。目的蛋白獲得率為6.4mg/g菌體，其比活性為1.025萬(wàn)μ/mg(鄰苯三酚比色法測(cè)活)
權(quán)利要求
1.一種生物工程基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備工藝，其特征是(1)、挑取工程菌單菌落接種在含氨芐的LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，然后接種到含AMP100μg/ml的LB培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、180轉(zhuǎn)/分，振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，OD值達(dá)到1.0時(shí)，收集菌液；(2)、取上述菌液，以1∶10的比例，接種到含有AMP100μg/ml的改良M9培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)6小時(shí)，OD值達(dá)2.5-3.0時(shí)，迅速升溫至42℃，熱激誘導(dǎo)表達(dá)，然后再培養(yǎng)3-4小時(shí)，離心收集菌體；(3)、取菌體，用0.9％的NaCl洗兩次，然后用PH7.8TES緩沖液懸浮菌體，冰浴條件下攪拌30分鐘，加入稀釋6倍的TES溶液，冰浴條件下攪拌40分鐘，離心取上清液，離心的菌體加TES溶液冷凍，取出速暖至冰水混合物狀，加入稀釋6倍的TES溶液，攪拌40分鐘，離心取上清液，將上述，上清液經(jīng)超濾濃縮，得粗酶液；(4)、粗酶液經(jīng)透析DEAE-Sephadex-A50離子交換柱層析，其全部進(jìn)入膠面后，再用PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白峰溶液，再用Sephadex-200分子篩柱層析，收集含Cu·Zn-SOD酶的活力部分，用PH7.8PBS溶液洗脫，自動(dòng)餾分收集器收集，冷凍、干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶制備工藝，其特征是目的蛋白獲得率為6.4mg/克菌體，目的蛋白比活性為1.025萬(wàn)μ/mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程，基因重組人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備工藝，其特征是首先進(jìn)行工程菌發(fā)酵擴(kuò)增，熱激誘導(dǎo)，收集菌體。經(jīng)緩沖液抽提、再經(jīng)離子交換、分子篩柱層析分離純化。本發(fā)明具有工藝流程簡(jiǎn)單、SOD半衰期長(zhǎng)、產(chǎn)量高、單位成本低等優(yōu)點(diǎn)，本產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用在化妝品、保健食品、醫(yī)療等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1448507SQ02108299
公開(kāi)日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2002年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者董偉東, 劉兆柯, 路海源 申請(qǐng)人:四平市科學(xué)技術(shù)研究院