專(zhuān)利名稱(chēng)：抑制β-淀粉狀蛋白肽釋放或合成的內(nèi)酰胺化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域并涉及抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成的化合物。
背景技術(shù)：
PCT申請(qǐng)PCT/US97/22986描述了某些內(nèi)酰胺，它們抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成，因此可用于治療阿爾茨海默氏病。
本發(fā)明化合物(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?alaninyl))-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮可用于抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成，因此可用于治療阿爾茨海默氏病并具有有益效果和安全性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供化合物(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
在一個(gè)其方法方面，本發(fā)明涉及抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成的方法，該方法包括給有此需求的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。在一個(gè)具體的方法的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括有此需求的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。本發(fā)明還提供防止或抑制阿爾茨海默氏病發(fā)展的方法，該方法包括給有此需求的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該組合物包含(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮和可藥用稀釋劑。這類(lèi)組合物可用于抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成，包括阿爾茨海墨氏病的治療。
發(fā)明詳述本文中使用的術(shù)語(yǔ)具有下面所示含義術(shù)語(yǔ)“ee”或“對(duì)映體過(guò)量”是指當(dāng)用式((E1-E2)+(E1+E2))×100％＝ee計(jì)算時(shí)，在兩種對(duì)映體(E1+E2)的混合物中，對(duì)映體E1的百分?jǐn)?shù)是過(guò)量的。本領(lǐng)域公知，對(duì)映體過(guò)量可通過(guò)化合物或其衍生物的毛細(xì)管電泳和手性HPLC測(cè)定。
本文中，有關(guān)相對(duì)于甘油醛的異構(gòu)體的立體化學(xué)的(R)-和(S)-的Cahn-Prelog-Ingold命名以及L-和D-的命名用于指特定異構(gòu)體。
本發(fā)明化合物可如下制備。除非另有說(shuō)明，在下面的反應(yīng)方案中，所有取代基的定義都如前述定義，所有試劑均是本領(lǐng)域熟知的或已知的。
反應(yīng)方案1 在反應(yīng)方案1的步驟1中，式(1)的N-甲基苯乙胺用適宜的二烷氧基羰基乙酸酯轉(zhuǎn)移試劑?；?，得到式(2)化合物。N-甲基苯乙胺有市售，也很容易通過(guò)2-溴或2-氯乙基苯與甲胺在本領(lǐng)域熟知或已知條件下的反應(yīng)來(lái)制備。適宜的二烷氧基羰基乙酸酯轉(zhuǎn)移試劑是其中R4是C1-C4烷基的并且將二烷氧基羰基乙?；D(zhuǎn)移到式(1)化合物上的那些，例如二烷氧基羰基乙酸和二烷氧基羰基乙酰氯(參見(jiàn)Ben-Ishai，Tetrahedron，43，439-450(1987))。
例如，將式(1)化合物與適宜的二烷氧基羰基乙酸接觸，得到式(2)化合物。這類(lèi)偶聯(lián)反應(yīng)是肽合成中常見(jiàn)的，因此可使用肽合成方法中使用的方法。例如，為有助于這種?；?，可使用公知的偶聯(lián)試劑，如碳二亞胺，與此同時(shí)可使用或不使用公知的添加劑，如N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑等。這類(lèi)偶聯(lián)反應(yīng)常使用適合的堿，以清除反應(yīng)期間生成的酸。適宜的堿包括，例如三乙胺、N，N-二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉等。該反應(yīng)一般在惰性的非質(zhì)子極性稀釋劑，如二甲基酰胺、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氫呋喃等中進(jìn)行。該反應(yīng)典型地是在約0℃至約60℃的溫度下進(jìn)行約1至約24小時(shí)。反應(yīng)完全后，通過(guò)常規(guī)方法回收式(2)產(chǎn)物，常規(guī)方法包括提取、沉淀、色譜、過(guò)濾、研制、結(jié)晶等。
或者，例如可將式(1)化合物與適宜的二烷氧基羰基乙酰氯接觸，得到式(2)化合物。這類(lèi)酰氯很容易如下制備由相應(yīng)的酸，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，如在約0-80℃下，在惰性溶劑，如甲苯、二氯甲烷或氯仿中，通過(guò)三氯化磷、三氯氧化磷、五氯化磷、亞硫酰氯或草酰氯的作用，同時(shí)可使用或不使用少量二甲基甲酰胺。該反應(yīng)典型地進(jìn)行1-24小時(shí)。酰氯可被分離和純化或者經(jīng)常是直接使用，即，可進(jìn)行或不進(jìn)行分離和/或純化。這類(lèi)酰化反應(yīng)一般使用適宜的堿，以清除反應(yīng)期間形成的酸。適宜的堿包括，例如吡啶、三乙胺、N，N-二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉等。該反應(yīng)通常在惰性非質(zhì)子極性稀釋劑，如二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃等中進(jìn)行。該反應(yīng)通常在約-20℃至約80℃的溫度下并通常進(jìn)行約1至約24小時(shí)。反應(yīng)完全后，式(2)產(chǎn)物可通過(guò)常規(guī)方法回收，常規(guī)方法包括提取、沉淀、色譜、過(guò)濾、研制、結(jié)晶等。
在反應(yīng)方案1的步驟2中，環(huán)合式(2)化合物，得到式(3)化合物。
例如，將式(2)化合物與酸，例如甲磺酸或硫酸接觸。該反應(yīng)通常使用選擇的酸作為溶劑進(jìn)行。通常，開(kāi)始時(shí)，在約-20℃至約0℃下混合反應(yīng)物，然后使之溫?zé)岬酱蠹s環(huán)境溫度至約60℃的溫度。該環(huán)合反應(yīng)一般需要約12至約72小時(shí)。反應(yīng)完全后，通過(guò)常規(guī)方法回收式(2)的產(chǎn)物，常規(guī)方法包括提取、沉淀、色譜、過(guò)濾、研制、結(jié)晶等。
在反應(yīng)方案1的步驟3中，將式(3)化合物脫保護(hù)，得到式(4)化合物。
這類(lèi)烷氧羰基胺保護(hù)基的除去是本領(lǐng)域公知的和清楚的。例如，參見(jiàn)Protecting Groups in Organic Synthesis，Theodora Greene(1st和2ndEditions，Wiley-Interscience)和Ben-Ishai，Tetrahedron，43，439-450(1987)。
反應(yīng)方案2 在反應(yīng)方案2的步驟1中，將適宜的式(5)的苯乙酸與適宜的式(6)的乙縮醛偶聯(lián)，得到式(7)的化合物。適宜的式(5)的苯乙酸是其中A2是有活性的基團(tuán)，例如-OH、-Cl或-Br的一類(lèi)。適宜的式(6)的乙縮醛是其中R5是C1-C4烷基的一類(lèi)。這類(lèi)偶聯(lián)反應(yīng)是肽合成領(lǐng)域常見(jiàn)的，因此可以使用肽合成中使用的方法，如反應(yīng)方案1的步驟1所示的方法。
另外，反應(yīng)方案2步驟2中描述的偶聯(lián)反應(yīng)可使用式(5)化合物的酰鹵和適宜的式(6)的乙縮醛，在Schotten-Baumann條件下，在混合溶劑，如甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、丙酮或乙醚和水中進(jìn)行。這類(lèi)反應(yīng)使用適宜的堿進(jìn)行，所述堿是例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀。該反應(yīng)通常在攪拌或劇烈攪拌下進(jìn)行并且在約-20℃至約80℃下進(jìn)行通常是約1至約24小時(shí)。反應(yīng)完全后，式(7)的產(chǎn)物通過(guò)常規(guī)方法回收，常規(guī)方法包括提取、沉淀、色譜、過(guò)濾、研制、結(jié)晶等。
在反應(yīng)方案2的步驟2中，將式(7)化合物環(huán)合，得到式(8)化合物。這類(lèi)環(huán)合反應(yīng)在酸，如硫酸中進(jìn)行。典型地是，使用酸作為溶劑。通常，該反應(yīng)在約-20℃至約150℃下進(jìn)行，通常需要進(jìn)行約1至約24小時(shí)。反應(yīng)完全后，式(8)產(chǎn)物通過(guò)常規(guī)方法回收，常規(guī)方法包括提取、沉淀、色譜、過(guò)濾、研制、結(jié)晶等。
在反應(yīng)方案2的步驟3中，式(8)化合物進(jìn)行胺轉(zhuǎn)移反應(yīng)，得到式(9)化合物。在反應(yīng)方案2中，描述了肟化反應(yīng)。這類(lèi)肟化反應(yīng)通過(guò)將式(8)的烯醇化物與肟轉(zhuǎn)移試劑，如烷基亞硝酸酯接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)。式(8)的烯醇化物可如下制備將式(8)化合物與適宜的堿，如叔丁醇鉀、二異丙基氨基鋰、hexamethylsilazide鋰、hexamethylsilazide鈉、hexamethylsilazide鉀等反應(yīng)。Wheeler等人在Organic Syntheses，Coll.Vol.VI，p.840中例舉了該類(lèi)肟化反應(yīng)，其中描述了亞硝酸異戊酯與酮反應(yīng)來(lái)制備所需的肟。該反應(yīng)一般在溶劑，如四氫呋喃中進(jìn)行。通常，該反應(yīng)在約-20℃至約50℃下進(jìn)行并且通常需要約1至約24小時(shí)。反應(yīng)完全后，式(8)產(chǎn)物通過(guò)常規(guī)方法回收，常規(guī)方法包括提取、沉淀、色譜、過(guò)濾、研制、結(jié)晶等。
或者，這類(lèi)胺轉(zhuǎn)移反應(yīng)可通過(guò)疊氮化物來(lái)完成。疊氮化物可通過(guò)式(8)的烯醇化物與疊氮化物轉(zhuǎn)移試劑，如甲苯磺酰疊氮和三異丙基苯磺酰疊氮的反應(yīng)形成。Evans等人在J.Am.Chem.Soc.，1124011-4030(1990)41中例舉了這類(lèi)反應(yīng)的實(shí)例。該反應(yīng)通常是在溶劑，如四氫呋喃中進(jìn)行。通常，該反應(yīng)在約-20℃至約50℃下進(jìn)行并且通常需要約1至約24小時(shí)。反應(yīng)完全后，用疊氮化物代替了肟的式(8)產(chǎn)物通過(guò)常規(guī)方法回收，常規(guī)方法包括提取、沉淀、色譜、過(guò)濾、研制、結(jié)晶等。
如反應(yīng)方案2的步驟4中所示，將肟還原為式(4)化合物。這類(lèi)還原反應(yīng)通過(guò)用氫和適宜的催化劑，如阮內(nèi)鎳或鈀催化劑，如披鈀碳處理來(lái)完成。該反應(yīng)通常在溶劑，如四氫呋喃、乙酸乙酯或低級(jí)醇，如甲醇、乙醇和異丙醇中，在乙酸、水、氨水等以及它們的混合物中進(jìn)行。該反應(yīng)通常在大氣壓至約600psi(4137kPa)的氫氣壓下進(jìn)行。通常，該反應(yīng)在約20℃至約100℃下進(jìn)行并且通常需要約1至約24小時(shí)。反應(yīng)完全后，式(4)產(chǎn)物通過(guò)常規(guī)方法回收，常規(guī)方法包括提取、沉淀、色譜、過(guò)濾、研制、結(jié)晶等。
或者，其中胺通過(guò)疊氮化物轉(zhuǎn)移，疊氮基被還原。這類(lèi)還原反應(yīng)通過(guò)上述氫化反應(yīng)進(jìn)行。
反應(yīng)方案A中描述了制備(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的方法。
反應(yīng)方案A 反應(yīng)方案A的步驟1描繪了立體化學(xué)拆分式(4)的適宜的內(nèi)酰胺，得到式(10)的內(nèi)酰胺，即基本上純的(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“基本上純的”是指對(duì)映體純的(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。依據(jù)本發(fā)明，可制備基本上純的(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，其包含大于80％，優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于95％，最優(yōu)選大于97％的(S)對(duì)映體。
例如，通過(guò)二苯甲酰酒石酸鹽、(R)-(-)-d-樟腦磺酸和(D)-(-)-扁桃酸鹽的分級(jí)結(jié)晶可拆分式(4)化合物的(S)-異構(gòu)體。預(yù)期各類(lèi)二苯甲酰酒石酸(酯)鹽都適用于此目的。尤其是優(yōu)選對(duì)位具有選自氫、鹵素、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的取代基的二苯甲酰酯，二-對(duì)甲苯甲酰酒石酸(酯)鹽是優(yōu)選的。使用二-對(duì)甲苯甲酰-L-酒石酸鹽獲得(S)-異構(gòu)體。
依據(jù)本發(fā)明，將式(4)化合物與所選擇的酸接觸。通常，可以使用約0.4摩爾當(dāng)量至大大過(guò)量的選擇的酸，優(yōu)選約0.4-1.5摩爾當(dāng)量，更優(yōu)選約0.5-1.1摩爾當(dāng)量。
該方法通常通過(guò)在溶液中使酸加成鹽結(jié)晶進(jìn)行。特別適合的溶劑是，例如低級(jí)醇，包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇、仲丁醇、異丁醇、叔丁醇、戊醇、異戊醇、叔戊醇、己醇、環(huán)戊醇和環(huán)己醇，甲醇、乙醇和異丙醇是優(yōu)選的。使用抗溶劑可能是有益的。本文中使用的“抗溶劑”是指與溶劑相比，其中鹽是明顯不溶的溶劑。優(yōu)選地，當(dāng)使用抗溶劑時(shí)，它與所選擇的溶劑混溶。適宜的抗溶劑包括醚類(lèi)，如乙醚、甲基叔丁基醚等；和乙酸低級(jí)烷基酯，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯等；和鏈烷烴，如戊烷、己烷、庚烷、環(huán)己烷等。當(dāng)本發(fā)明方法通過(guò)結(jié)晶外消旋混合物的酸加成鹽來(lái)進(jìn)行時(shí)，必須小心地使用抗溶劑，以避免不需要的非對(duì)映體鹽的鹽的結(jié)晶。
通常，結(jié)晶在約40℃至所選擇溶劑的回流溫度的起始溫度下和約0.05摩爾至約0.25摩爾的起始濃度下進(jìn)行。然后使該混合物冷卻，得到鹽。加入晶種可能是有利的。將起始沉淀攪拌約4至約48小時(shí)可能是有利的。優(yōu)選緩慢地冷卻結(jié)晶溶液。最宜使結(jié)晶冷卻到環(huán)境溫度至約-20℃的溫度。可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)收集鹽，包括過(guò)濾、潷析、離心、蒸發(fā)、干燥等。式(10)化合物可以以所選擇酸的酸加成鹽形式直接使用?；蛘?，如本領(lǐng)域公知的那樣，使用前，可在酸交換后以另一種酸加成鹽的形式分離式(10)化合物或者可在堿性條件下通過(guò)萃取以堿的形式分離式(10)化合物。
優(yōu)選的方法得到基本上對(duì)映體純的(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，該方法包括在芳香醛的存在下，以動(dòng)態(tài)方法結(jié)晶酸加成鹽形式的1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，所述酸加成鹽的酸選自二-對(duì)甲苯甲酰-L-酒石酸、(R)-(-)-d-樟腦磺酸和(D)-(-)-扁桃酸。動(dòng)態(tài)方法的優(yōu)勢(shì)在于在結(jié)晶期間，1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮轉(zhuǎn)化為一種異構(gòu)體，這樣提高了產(chǎn)率并避免了包括不需要的異構(gòu)體的廢液。
預(yù)期各類(lèi)芳香醛均適用于該動(dòng)態(tài)方法，我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)實(shí)際上有多種醛是特別適合的。特別地，我們發(fā)現(xiàn)水楊酸是優(yōu)選的，因此在本發(fā)明的動(dòng)態(tài)拆分方法中，水楊醛、5-硝基水楊醛和3，5-二氨水楊醛是更優(yōu)選的。
因此，當(dāng)本發(fā)明方法以動(dòng)態(tài)拆分方式進(jìn)行時(shí)，將1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮與所選擇的酸在芳香醛的存在下進(jìn)行接觸。對(duì)于動(dòng)態(tài)拆分，通常使用約0.9-1.2摩爾當(dāng)量的酸，優(yōu)選1摩爾當(dāng)量。芳香醛常以催化量使用。通常，使用約0.5-0.001摩爾當(dāng)量的芳香醛，約0.1至約0.01摩爾當(dāng)量是優(yōu)選的。
動(dòng)態(tài)方法通常在不含如上所述的抗溶劑的溶劑中進(jìn)行。將1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮、選擇的酸和芳香醛的混合物攪拌，使其轉(zhuǎn)化為所需異構(gòu)體。該轉(zhuǎn)化反應(yīng)通常在環(huán)境溫度至溶劑的回流溫度下進(jìn)行。轉(zhuǎn)化反應(yīng)通常需要6-48小時(shí)。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員清楚，當(dāng)本發(fā)明方法以動(dòng)態(tài)拆分方式進(jìn)行時(shí)，分離產(chǎn)物中存在少量芳香醛使得(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的酸加成鹽的使用復(fù)雜化。因此，動(dòng)態(tài)拆分后，優(yōu)選通過(guò)鹽交換，優(yōu)選以鹽酸鹽形式分離(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，然后使用它或形成堿。
反應(yīng)方案A的步驟2描繪了式PgNH-CHCH3-C(O)-A的適宜的氨基保護(hù)的丙氨酸與式(10)的適宜酰胺的偶聯(lián)反應(yīng)。適宜的氨基保護(hù)的丙氨酸是其中Pg是氨基保護(hù)基、是L-構(gòu)型的并且A是活潑基團(tuán)，如-OH或-C1的化合物，該化合物能與式(10)化合物的氨基偶聯(lián)。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員很容易獲得這類(lèi)氨基保護(hù)的丙氨酸。
反應(yīng)方案A的步驟2中描繪的偶聯(lián)反應(yīng)包括肽合成中常進(jìn)行的反應(yīng)，因此可使用肽合成中使用的合成方法。這類(lèi)方法詳述于反應(yīng)方案1的步驟1中。
反應(yīng)方案A的步驟3描繪了式(11)化合物脫保護(hù)，得到式(12)化合物。這類(lèi)氨基保護(hù)基的脫保護(hù)是本領(lǐng)域公知的。
反應(yīng)方案A的步驟4描繪了式(13)的適宜化合物，(CH3)2CH-CHOH-C(O)A1和式(12)化合物的得到式I化合物的偶聯(lián)反應(yīng)。式(13)的S-異構(gòu)體化合物有市售或者是本領(lǐng)域，包括1997年12月22日提交的PCT申請(qǐng)PCT/US 97/22986中公知的。步驟3中描繪的偶聯(lián)反應(yīng)使用式(13)的酸(其中A1是-OH的化合物)或由其得到的酰鹵(其中A1是-C1或-Br的化合物)，以類(lèi)似于反應(yīng)方案1的步驟1中教導(dǎo)的方式進(jìn)行。
制備式I化合物的另一種方法描繪于反應(yīng)方案A的步驟5中，該步驟顯示了式(10)的適宜的化合物與式(14)的適宜化合物，(CH3)2CH-CHOH-C(O)-NH-CHCH3-C(O)A2的直接得到式I化合物的偶聯(lián)反應(yīng)。式(10)的適宜化合物如步驟2中所描述。式(14)的適宜化合物是其中立體化學(xué)如式I終產(chǎn)物中所需的化合物。
如上所述，式(14)化合物很容易通過(guò)偶聯(lián)羧基保護(hù)的氨基酸，H2N-CHCH3-C(O)OPg1與式(13)的化合物來(lái)制備。這類(lèi)偶聯(lián)反應(yīng)也是本領(lǐng)域公知的，其獲得產(chǎn)物在脫保護(hù)后，得到式(14)化合物。
式I化合物可通過(guò)多種技術(shù)，包括結(jié)晶進(jìn)行分離和純化?？墒褂萌芤航Y(jié)晶和成漿技術(shù)。尤其是，本發(fā)明化合物可通過(guò)在各種無(wú)水和含水溶劑中結(jié)晶來(lái)制備。適宜的溶劑包括含水或不含水的丙酮、低級(jí)醇(如甲醇、乙醇和異丙醇)、乙酸和乙腈；以及乙酸乙酯，乙醚和甲基叔丁基醚。實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)含水丙酮是優(yōu)選的。對(duì)于給定的含水溶劑，使用的水量取決于(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮在溶劑中的相對(duì)溶解度(與水相比的)以及使用結(jié)晶或成漿技術(shù)。
結(jié)晶通常如下進(jìn)行將(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮溶于含水溶劑中，然后使該溶液冷卻，其中可加入或不加入更多的水，得到固體。結(jié)晶通常在約40℃至所選擇含水溶劑的回流溫度的起始溫度下進(jìn)行。然后冷卻該混合物，以得到結(jié)晶二水合物。接種晶種也是有利的。優(yōu)選使結(jié)晶溶液緩慢地冷卻。最適宜將結(jié)晶溶液冷卻到室溫至約-20℃。
通過(guò)下列實(shí)施例和制劑例進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例和制劑例僅是說(shuō)明性的，而不是用于以任何方式來(lái)限制本發(fā)明。
除非另有指明，實(shí)施例和制劑例中使用的術(shù)語(yǔ)具有它們常規(guī)含義。例如“℃”是指攝氏度；“mmol”指毫摩爾；“g”指克；“mL”指毫升；“鹽水”是指飽和的氯化鈉水溶液；“THF”是指四氫呋喃；“HPLC”是指高壓液相色譜，等等。
實(shí)施例11-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的合成往氫化鈉(1.1eq)在15mL無(wú)水DMF中的漿狀物中加入4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(0.0042摩爾)的DMF(10mL)溶液。然后加入碘甲烷(約2eq.)。當(dāng)經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完全時(shí)，將反應(yīng)混合物傾入冰中，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用水洗滌，然后用鹽水洗滌。有機(jī)層然后用無(wú)水硫酸鈉干燥、過(guò)濾并加壓濃縮。殘余物經(jīng)HPLC(LC2000)，用乙酸乙酯/己烷系統(tǒng)洗脫，得到3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
將3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(1eq.)溶于THF并加入異戊腈(1.2eq.)。將該混合物在冰浴中冷卻到0℃。滴加NaHMDS(1.1eq.，1M THF液)。攪拌1小時(shí)或者直至反應(yīng)完全后，濃縮該混合物，然后用1N鹽酸溶液酸化并用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)部分干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠色譜純化后，得到1-羥基亞氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮質(zhì)譜(M+H)+，205.1。
將1-羥基亞氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮溶于EtOH/NH3(20∶1)并使用阮內(nèi)鎳和氫(500psi/3447kPa)在100℃氫化10小時(shí)。將所得混合物過(guò)濾并濃縮，得到油狀物，該油狀物經(jīng)硅膠色譜純化，得到標(biāo)題化合物。
實(shí)施例21-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的合成在室溫下，往20L Morton燒瓶中加入MTBE(5.52L，7體積)和(N-甲基氨基)-乙醛縮二甲醇(614g，5mol)，形成溶液。將碳酸氫鈉(546g，6.5mol)和水(6.31 L，8體積)制得的溶液加到該Morton反應(yīng)燒瓶中。使混合物冷卻至低于10℃并用1小時(shí)的時(shí)間，將苯乙酰氯(789g，5mol)的MTBE(789mL)溶液滴加到該冷卻至低于10℃的反應(yīng)混合物中。添加完畢后，將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。在該步驟進(jìn)行的HPLC分析顯示反應(yīng)完全。用MTBE(4體積)進(jìn)行萃取處理，無(wú)水硫酸鎂干燥后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，得到1.187kg(98％)N-甲基-N-(2，2-二甲氧基乙基)苯乙酰胺液體，(M+H)+＝237.9。在濃厚的氮?dú)夥障拢?L Morton燒瓶中加入H2SO4(1.42L)并將N-甲基-N-(2，2-二甲氧基乙基)苯乙酰胺(712g，3mol)滴加到該反應(yīng)燒瓶中，該滴加產(chǎn)生放熱(22至78℃)。所得反應(yīng)物在110℃加熱3小時(shí)后，冷卻到室溫并轉(zhuǎn)移到20L Morton燒瓶中。在低于10℃下，用氫氧化鈉水溶液(9.18L，5N)處理反應(yīng)混合物。用乙酸乙酯萃取(2×2.85L)，用硫酸鈉干燥后，濃縮，得到520g(73.5％)3-甲基-6，7-二氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的固體。為提高純度，該產(chǎn)物可在MTBE中重結(jié)晶，得到固體，mp＝81-82℃；(M+H)+＝174.2。
將3-甲基-6，7-二氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(113.8g，0.657mol)的THF(0.5L)溶液冷卻到0℃并滴加異戊腈(100.75g，0.86mol)。以使溫度保持低于10℃的速率，往所得混合物中加入LiHMDS(1NTHF溶液，854mL，0.854mol)。添加完畢后，使反應(yīng)在室溫下攪拌2-3小時(shí)，同時(shí)通過(guò)HPLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。一旦反應(yīng)完全，將混合物冷卻到0℃，并用HCl水溶液(2N)將pH從12調(diào)至2-3。將所得沉淀攪拌12-16小時(shí)后，過(guò)濾分離并干燥，得到86.3g(64.9％)1-羥基亞氨基-3-甲基-6，7-二氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮；mp＝225-226℃；(M+H)+＝203.0。
將1-羥基亞氨基-3-甲基-6，7-二氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(35g，0.173mol)的乙醇(525mL)溶液與披鈀碳(10％，3.5g)的稀鹽酸(濃水溶液，17.5g在17mL水中)的漿狀物一起加到高壓釜中。將所得混合物在50℃和250psi(1723kPa)下氫化，直至反應(yīng)完全。用乙醇作為溶劑，將反應(yīng)混合物濾過(guò)硅藻土(Celite)濾墊，將濾液濃縮至90mL。將水(350mL)加到該濃縮物中，將所得溶液進(jìn)一步濃縮至約200mL。將二氯甲烷(350mL)加到該水溶液中，然后用氫氧化鈉水溶液(1N)將pH調(diào)至11-11.5。分離有機(jī)部分，含水部分用二氯甲烷(175mL)萃取。將合并的萃取液濃縮為殘余物，該殘余物經(jīng)放置結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物mp＝69-81℃；(M+H)+＝191.0。
實(shí)施例31-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3苯并氮雜-2-酮的合成往22L Morton燒瓶中加入二氯甲烷(4.73L，8體積)、N-甲基苯乙胺(591g，4.33mol)和碳酸氫鈉水溶液(436.7g，5.2mol在4.73L水中的溶液)。將該混合物冷卻到5℃以下并用70分鐘時(shí)間往該冷卻的反應(yīng)混合物中滴加氯乙酰氯(513.7g，4.55mol)的二氯甲烷(887mL)溶液。添加完畢后，HPLC分析顯示反應(yīng)完全。分離兩層，水層用二氯甲烷萃取。合并的有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，得到915.7g(99.8％)N-甲基-N-(2-苯基乙基)-1-氯乙酰胺(M+H)＝212.1。
在氮?dú)夥障拢?2L燒瓶中加入N-甲基-N-(2-苯乙基)-1-氯乙酰胺(883.3g，4.17mol)和鄰二氯苯(6.18L)。加入氯化鋁(1319g，10.13mol)，這引起放熱(22至50℃)。然后將所得反應(yīng)物加熱至165℃2.5小時(shí)，然后經(jīng)約14小時(shí)冷卻到室溫。將反應(yīng)混合物冷卻到約0℃，并且為保持放熱至約40℃，將其分四次加到冷水(8.86L，約5℃)中。分離各層，水層用二氯甲烷(7.07L)萃取并分離各層。將有機(jī)層合并并用鹽酸水溶液(8.83L，1N)萃取，然后用飽和碳酸氫鈉水溶液(7.07L)萃取，經(jīng)硫酸鎂干燥，與硅膠(883g)合并并施于硅膠柱(3.53kg，以二氯甲烷中的漿狀物填充到燒結(jié)的玻璃漏斗中)。該柱用二氯甲烷洗脫，直至收集到25L，然后用乙酸乙酯洗脫，得到產(chǎn)物。將含產(chǎn)物的流分蒸發(fā)，得到3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，為棕褐色固體，608g(83％)。
在氮?dú)夥障?，?2L燒瓶中加入3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(606g，3.46mol)和異戊腈(543g，4.5mol)在THF(7.88L)中的混合物。該混合物冷卻到約0℃后，以使溫度保持低于7℃的速率加入LiHMDS(1N THF溶液，4.5L，04.5mol)。添加完畢后，使反應(yīng)在室溫?cái)嚢杓s2小時(shí)，同時(shí)經(jīng)HPLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。一旦反應(yīng)完全，將混合物冷卻到約0℃，并用HCl水溶液(2N)將pH從12調(diào)至約2-1。將所得沉淀攪拌約6小時(shí)后，過(guò)濾分離并干燥，得到1-羥基亞氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，604.7g(85.6％)。
1-羥基亞氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(625g，3.06mol)和3A乙醇(15.6L)。在劇烈攪拌下，將所得混合物在50℃和250psi(1723kPa)下氫化直至反應(yīng)完全(約4小時(shí))。用乙醇作為溶劑，將反應(yīng)混合物濾過(guò)硅藻土濾墊，濃縮濾液，得到固體。該固體用二氯甲烷(6L)處理，并加入1N氫氧化鈉水溶液，直至水層的pH為11-11.5。攪拌混合物，分離各層，水層用二氯甲烷(2L)萃取。有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物477g(81.9％)。
實(shí)施例4(s)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的合成將1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(1.544g，8.12mmol)在15mL甲醇中微微加熱，形成溶液。在另一個(gè)燒瓶中，將二-對(duì)-甲苯甲酰-L-酒石酸(3.12g，8.08mmol)溶于15mL甲醇并通過(guò)移液管加到溫?zé)岬陌啡芤褐?。加熱該混合物，產(chǎn)生固體沉淀。加入另外30mL甲醇，得到溶液，將該溶液回流30-40分鐘，然后緩慢地冷卻到環(huán)境溫度，得到固體。攪拌約18小時(shí)后，過(guò)濾收集固體并用少量冷甲醇沖洗，得到2.24g(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮二-對(duì)-甲苯甲酰-L-酒石酸鹽(96％產(chǎn)率，94.7％ee)。
(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮二-對(duì)-甲苯甲酰-1-酒石酸鹽(11.83g，20.5mmol)溶于45mL 1.0N氫氧化鈉水溶液中并用二氯甲烷(3×25mL)萃取。合并的二氯甲烷層用35mL 1.0N氫氧化鈉水溶液洗滌，然后用鹽水溶液洗滌，并經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥。真空除去溶劑，得到無(wú)色油狀的標(biāo)題化合物(3.38g)(87％產(chǎn)率，93.2％ee)。
實(shí)施例5(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的合成將1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(6.0g，31.5mmol)在75mL甲醇中微微加熱，形成溶液，并與二-對(duì)-甲苯甲酰-1-酒石酸(12.2g，31.5mmol)在75mL溫?zé)峒状贾械娜芤汉喜?。?duì)該溶液接種晶種，形成固體。加入另外100mL甲醇并攪拌該混合物。攪拌約18小時(shí)后，過(guò)濾收集固體并用少量冷甲醇沖洗，得到6.7g固體。將該固體與甲醇(200mL)合并并攪拌。18小時(shí)后，收集該固體，得到(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮二-對(duì)-甲苯甲酰-L-酒石酸鹽(4.4g)。通過(guò)實(shí)施例4中所述方法分離堿，得到標(biāo)題化合物(96％ee)。
實(shí)施例6(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的合成在22L容器中，在氮?dú)夥障?，加?-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(438g，2.3mol)(約40℃)，得到甲醇溶液(4.38mL)。在另一個(gè)燒瓶中，將二-對(duì)-甲苯甲酰-L-酒石酸(889.7g，2.3mol)溶于4.38L甲醇并加熱至約40℃，然后加入1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的溶液。繼續(xù)加熱并加入另外6.13L甲醇，然后將該混合物回流約45分鐘，然后使其緩慢冷卻到環(huán)境溫度，得到固體。攪拌約18小時(shí)后，過(guò)濾收集固體，并用少量母液沖洗，空氣干燥后，用約2L乙酸乙酯，得到561.6g(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮二-對(duì)-甲苯甲酰-L-酒石酸鹽。合并(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮二-對(duì)-甲苯甲酰-L-酒石酸鹽、二氯甲烷(6.57L)和1N氫氧化鈉水溶液(6.57L)并攪拌。分離各層，有機(jī)層用1N氫氧化鈉水溶液萃取兩次(3.28L)、鹽水萃取一次(2.46L)，然后經(jīng)硫酸鎂干燥、過(guò)濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物250g(57.4％，94.1％ee)。
實(shí)施例7(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮鹽酸鹽的合成將1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(31.9g，168mmol)在約300mL乙酸異丙酯中制成漿狀物并加熱至45℃。在一個(gè)單獨(dú)的燒瓶中，在約130mL異丙醇中加熱(R)-(-)-D-扁桃酸(25.0g，164mmol)直至形成溶液，并將其加到上面得到的1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮/乙酸異丙酯漿狀物中，得到溶液，該溶液中快速形成沉淀。將該混合物在45℃下加熱約3小時(shí)。將5-硝基水楊酸(2-羥基-5-硝基苯甲醛)(1.40g，8.38mmol，5mol％)加到該溫?zé)崛芤褐胁⒃?5℃攪拌該混合物。約14小時(shí)后，使該漿狀物冷卻到環(huán)境溫度并攪拌2小時(shí)，然后過(guò)濾收集固體并用70mL冷的乙酸異丙酯沖洗，在40℃真空烤箱中干燥，得到46.62g(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(R)-扁桃酸鹽(82.9％產(chǎn)率，98.4％ee)。
在環(huán)境溫度，將(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(R)-扁桃酸鹽(2.42g，7.06mmol，98.4％ee)在25mL乙酸乙酯中制成漿狀物。加入濃鹽酸水溶液(1.1mL，約11.2mmol)并將該混合物加熱到50℃并劇烈攪拌3.5小時(shí)。使該漿狀物冷卻到環(huán)境溫度，過(guò)濾并用甲基叔丁基醚(約10mL)沖洗，得到1.48g標(biāo)題化合物(92.5％產(chǎn)率，97.9％ee)。
實(shí)施例8(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨?；?-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的合成在氮?dú)夥障拢趫@底燒瓶中裝入N-t-Boc-L-丙氨酸(1.0eq.)、羥基苯并三唑水合物(約1.1eq.)和(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(1.0eq.)的THF溶液。將Hunig堿(N，N-二異丙基乙基胺，1.1eq.)加到充分?jǐn)嚢璧脑摶旌衔镏?，然后加入EDC(1.1eq.)。在環(huán)境溫度攪拌4-17小時(shí)后，減壓除去溶劑，將殘余物加到乙酸乙酯和水中，用飽和碳酸氫鈉水溶液、1N鹽酸水溶液、鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并減壓除去溶劑，得到1-(N-t-Boc-1-丙氨?；?氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮質(zhì)譜(M+H)+，362.3。
往在NZ下、在冰浴中冷卻到約10℃的攪拌下的1-(N-t-Boc-1-丙氨?；?氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮在1，4-二噁烷(0.03-0.09M)中的溶液中通入無(wú)水氯化氫氣10-15分鐘。將該溶液加蓋，移走冷卻浴，使溶液溫?zé)岬江h(huán)境溫度并攪拌2-8小時(shí)，經(jīng)TLC檢測(cè)原料的消耗(1.0)。濃縮溶液，得到1-(L-丙氨?；?-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，該產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化，即可使用。
在氮?dú)夥障?，形?-(L-丙氨?；?-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-3-甲基-2H-3-苯并氮雜-2-酮(1.0eq.)、羥基苯并三唑水合物(1.1eq.)和(S)-2-羥基-3-甲基-丁酸(1.0eq.)在THF中的混合物。將Hunig堿(N，N-二異丙基乙基胺，1.1eq.)加到充分?jǐn)嚢璧脑摶旌衔镏?，然后加入EDC(1.1eq.)。在環(huán)境溫度攪拌4-17小時(shí)后，減壓除去溶劑，殘余物加到乙酸乙酯(或類(lèi)似溶劑)和水中，用飽和碳酸氫鈉水溶液、1N HCl、鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥并減壓除去溶劑，得到標(biāo)題化合物。
實(shí)施例9(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨?；?-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的合成在氮?dú)夥障?，在園底燒瓶中加入N-t-Boc-L-丙氨酸(249.5g，1.32mol)、羥基苯并三唑水合物(232.2g，1.52mol)和(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(250.8g，1.32mol)的THF(3.76L)液。將該混合物冷卻到5℃以下，然后加入Hunig堿(N，N-二異丙基乙基胺，188.4g，1.45mol)，再加入EDC(283.7g，1.45mol)。攪拌6小時(shí)后，將該反應(yīng)混合物溫?zé)岬江h(huán)境溫度并攪拌約14小時(shí)。減壓除去溶劑，殘余物加到乙酸乙酯(3.76L)和水(1.76L)中，分離各層，有機(jī)層用水(1.76L)萃取，將水層合并并用乙酸乙酯(1.76L)萃取。合并有機(jī)層，用飽和碳酸氫鈉水溶液萃取(1.76L)，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥、過(guò)濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，得到1-(N-t-Boc-L-丙氨?；?氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，463g(97.2％)。
使用表面下分散管，將無(wú)水HCl氣體通入冷卻到約0℃的乙酸乙酯(1.76L)中制備HCl的乙酸乙酯溶液。將上面制得的HCl的乙酸乙酯溶液加到劇烈攪拌的1-(N-t-Boc-L-丙氨?；?氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮(462g，1.28mol)的乙酸乙酯(3.7L)中的漿狀物中。加入另外的乙酸乙酯(1L)并使該反應(yīng)混合物溫?zé)岬绞覝夭嚢?2小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)混合物，得到固體。該固體用乙腈(5L)制成漿狀物，加熱至回流后，冷卻到約60℃，然后過(guò)濾并干燥，得到1-(L-丙氨?；?-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮，389.8g(94.7％)。
在氮?dú)夥障?，在THF(4.8L)中混合1-(L-丙氨?；?-(S)-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-3-甲基-2H-3-苯并氮雜-2-酮(369.5g，1.18mol)、羥基苯并三唑水合物(207.6g，1.36mol)、Hunig堿(N，N-二異丙基乙基胺，352.2g，2.71mol)和(S)-2-羥基-3-甲基-丁酸(140.6g，1.18mol)并將其冷卻到5℃以下。加入EDC(253.7g，1.3mol)，使該反應(yīng)混合物溫?zé)岬江h(huán)境溫度并攪拌。約25小時(shí)后，該反應(yīng)混合物用二氯甲烷(5.54L)稀釋并用水(2.22L)萃取。有機(jī)層用水(2.22L)萃取，水層合并并用二氯甲烷(5.54L)萃取。合并有機(jī)層，用水萃取兩次(2.22L)，用飽和碳酸氫鈉水溶液萃取(2.22L)，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，得到428g固體(100％)。將該固體加到含丙酮(3.42L)和水(0.856L)的溶劑混合物中并微微溫?zé)?40℃)。將該溶液分為～2L的份，往每份中加入水(7.19L)，同時(shí)將該渾濁溶液溫?zé)嶂?0℃。加完水后，使該渾濁溶液冷卻到環(huán)境溫度，得到固體，將其以漿狀物形式在環(huán)境溫度下攪拌約14小時(shí)，然后過(guò)濾并干燥，得到二水合物形式的標(biāo)題化合物，310.6g(66.2％)。
當(dāng)作為藥物使用時(shí)，本發(fā)明化合物通常以藥物組合物形式使用。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，該組合物包含有效量的N-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮和可藥用稀釋劑。這類(lèi)組合物用于抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成，包括治療阿爾茨海默氏病。因此，本發(fā)明包括N-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮用于制備抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成，尤其包括治療阿爾茨海默氏病的藥物的用途。
(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮可以通過(guò)各種途徑給藥。本發(fā)明化合物可以以使所述化合物以有效量為生物利用的任何形式或模式給藥，包括口服和非胃腸途徑。例如，本發(fā)明化合物可以通過(guò)口服、吸入、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、直腸、眼、局部、舌下、頰等途徑給藥。
在制備本發(fā)明組合物時(shí)，通常將活性成分與賦形劑混合，通過(guò)用賦形劑稀釋或包封在這類(lèi)載體中，所述載體可以呈膠囊、扁囊、紙袋或其它容器形式。本發(fā)明化合物可以單獨(dú)或者以藥物組合物形式給藥，所述藥物組合物即是與可藥用稀釋劑，如載體或賦形劑混合的形式，它們的比例與性質(zhì)由本發(fā)明化合物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)、選擇的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐來(lái)決定。(Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Edition，Mack Publishing Co.(1990))。
本發(fā)明藥物組合物以藥物領(lǐng)域公知的方式制備。載體或賦形劑可以是固體、半固體或液體物質(zhì)，它們可以用作活性成分的載體或介質(zhì)。適宜的載體或賦形劑是本領(lǐng)域公知的。藥物組合物可適于口服、吸入、非胃腸或局部使用，并且可以以片劑、膠囊、氣溶膠、吸入劑、栓劑、溶液、懸浮劑等形式對(duì)患者給藥。
對(duì)于口服治療給藥目的，可以將化合物與賦形劑摻混并以片劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿、糯米紙囊劑(wafers)、口嚼膠(chewing gums)等形式使用。這些制劑應(yīng)包含至少4％的本發(fā)明化合物，但活性成分的量可以根據(jù)具體形式發(fā)生變化，其含量通常為單位制劑重量的2％至約90％。存在于組合物中的化合物的量是可獲得適合劑量的量。本發(fā)明優(yōu)選的組合物和制劑可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
片劑、丸劑、膠囊、錠劑等還可包含一種或多種下列輔料粘合劑，如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖；崩解劑，如藻酸、Primogel、玉米淀粉等；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、硅油或Sterotex；助流劑，如膠態(tài)二氧化硅；并可加入甜味劑，如蔗糖或糖精；或者矯味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或橙子香精。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除上述類(lèi)型的輔料外，它還可包含液體載體，如聚乙二醇或脂肪油。
其它劑量單位形式可包含調(diào)整劑量單位物理形式的其它各類(lèi)材料，如包衣材料。因此，片劑或丸劑可用糖、蟲(chóng)膠或其它包衣劑包衣。除本發(fā)明化合物外，糖漿可包含作為甜味劑的蔗糖以及某些防腐劑、染料和著色劑和矯味劑。用于制備這些各類(lèi)組合物的材料應(yīng)是藥學(xué)純的并且在使用量下是無(wú)毒的。
對(duì)于非胃腸給藥目的，可將本發(fā)明化合物摻入溶液或懸浮液中。這些制劑通常包含占其重量至少0.1％的本發(fā)明化合物，但該量也可在在0.1至約90％的范圍內(nèi)變化。存在于這類(lèi)組合物中的本發(fā)明化合物的量應(yīng)是可獲得適宜劑量的量。溶液或懸浮液還可包含一種或多種下列輔料無(wú)菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、非揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調(diào)整滲透壓的物質(zhì)，如氯化鈉或葡萄糖?？蓪⒎俏改c制劑密封在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多次給藥的小瓶中。優(yōu)選的組合物和制劑可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
本發(fā)明化合物也可經(jīng)局部給藥，此時(shí)載體可適宜地包括溶液、軟膏或凝膠基質(zhì)。基質(zhì)，例如可包含一種或多種下列物質(zhì)凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑，如水和乙醇，以及乳化劑和穩(wěn)定劑。局部用制劑可包含約0.1-10％w/v(每體積的重量)濃度的式I化合物或其可藥用鹽。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的制劑使用透皮給藥裝置(“貼劑”)。這類(lèi)透皮貼劑可用于連續(xù)或間斷的輸送受控量的本發(fā)明化合物。用于遞送藥物的透皮貼劑的結(jié)構(gòu)和應(yīng)用是本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)，例如1991年6月11日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利5,023,252，在此通過(guò)引用并入該專(zhuān)利?？蓸?gòu)建這類(lèi)貼劑用于連續(xù)、脈動(dòng)或根據(jù)需要釋放藥物。
為更全面地說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施，下面描述代表性的藥物組合物。下列實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，并非用于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
制劑實(shí)施例1制備包含下列成分的硬明膠膠囊成分量(mg/膠囊)活性成分 30.0淀粉 305.0硬脂酸鎂 5.0將上述成分混合并以340mg的量填充到硬明膠膠囊中。
制劑實(shí)施例2使用下列組分制備片劑組分量(mg/片)活性成分 25.0纖維素，微晶的 200.0膠態(tài)二氧化硅 10.0硬脂酸 5.0將各組分混合并壓縮成片，每片重240mg。
制劑實(shí)施例3制備包含下列組分的干粉吸入劑成分 重量％活性成分5乳糖95將活性成分與乳糖混合并將該混合物加到干粉吸入裝置中。
制劑實(shí)施例4如下制備每片含30mg活性成分的片劑組分 量(mg/片)活性成分30.0mg淀粉45.0mg微晶纖維素 35.0mg聚乙烯吡咯烷酮(10％無(wú)菌水溶液)4.0mg羧甲基淀粉鈉4.5mg硬脂酸鎂0.5mg滑石1.0mg總計(jì)120mg將活性成分、淀粉和纖維素通過(guò)20目美國(guó)篩并充分混合。將聚乙烯吡咯烷酮的溶液與所得粉末混合，然后使其通過(guò)16目美國(guó)篩。將如此制得的顆粒在50-60℃干燥并通過(guò)16目美國(guó)篩。然后往該顆粒中加入預(yù)先篩過(guò)30目美國(guó)篩的羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂和滑石，混合之后在壓片機(jī)上壓片，得到每片重150mg的片劑。
制劑實(shí)施例5如下制備每枚膠囊包含40mg藥物的膠囊組分量(mg/膠囊)活性成分 40.0mg淀粉 109.0mg硬脂酸鎂 1.0mg總計(jì) 150.0mg
將通過(guò)20目美國(guó)篩的活性成分、淀粉和硬脂酸鎂混合并以150mg的量填充到硬明膠膠囊中。
制劑實(shí)施例6如下制備每枚含25mg活性成分的栓劑成分量活性成分25mg飽和脂肪酸甘油酯 加至 2,000mg將活性成分篩過(guò)60目美國(guó)篩并懸浮于使用需要的最低熱量預(yù)先熔融的飽和脂肪酸甘油酯中。然后將該混合物傾入名義上2.0g容量的栓劑模具中并使其冷卻。
制劑實(shí)施例7如下制備每5ml劑量含50mg藥物的懸浮劑成分 量活性成分 50.0mg黃原膠 4.0mg羧甲基纖維素鈉(11％)微晶纖維素(89％) 50.0mg蔗糖 1.75g苯甲酸鈉 10.0mg矯味劑和色素 適量?jī)艋又? 5.0ml混合活性成分、蔗糖和黃原膠，使其通過(guò)10目美國(guó)篩，然后與預(yù)先制備的微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉的水溶液混合。用適量水稀釋苯甲酸鈉、矯味劑和色素并在攪拌下加入。然后加入足量水以產(chǎn)生所需體積。
制劑實(shí)施例8如下制備每枚包含15mg藥物的膠囊組分 量(mg/膠囊)活性成分 15.0mg
淀粉407.0mg硬脂酸鎂3.0mg總計(jì)425.0mg混合活性成分、淀粉和硬脂酸鎂，使其通過(guò)20目美國(guó)篩，并以560mg的量填充到硬明膠膠囊中。
制劑實(shí)施例9如下制備皮下給藥制劑成分量活性成分1.0mg玉米油 1ml根據(jù)活性成分在玉米油中的溶解度，在該制劑中可使用多達(dá)約5.0mg或更多的活性成分(如果需要)。
制劑實(shí)施例10如下制備局部用制劑成分量活性成分1-10g乳化蠟 30g液體石蠟20g白軟石蠟 加至 100g將白軟石蠟加熱至熔化。摻入液體石蠟和乳化蠟并攪拌直至溶解。加入活性成分并繼續(xù)攪拌，直至活性成分分散。然后使該混合物冷卻至固化。
在其方法的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成的方法，該方法包括給需此抑制的患者施用有效量的N-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。在一個(gè)特定方法的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括給需此治療的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
還認(rèn)識(shí)到，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員通過(guò)治療目前患阿爾茨海默氏病的患者或者預(yù)防性地治療處在發(fā)展為該病的危險(xiǎn)境地的患者可以影響阿爾茨海默氏病。因此術(shù)語(yǔ)“治療”用于指其中可減緩、干預(yù)、抑制、控制或阻斷阿爾茨海默氏病的進(jìn)程的，而不必表示所有癥狀全部消除。如此，本發(fā)明方法包括預(yù)防處于發(fā)展為阿爾茨海默氏病的危險(xiǎn)境地的患者的阿爾茨海默氏病的發(fā)作、抑制阿爾茨海默氏病的進(jìn)程以及治療晚期阿爾茨海默氏病。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“患者”是指患有與β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成增多有關(guān)的病癥，包括阿爾茨海默氏病的溫血?jiǎng)游铮绮溉閯?dòng)物。應(yīng)該清楚，豚鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、馬、牛、羊和人均是該術(shù)語(yǔ)含義范圍內(nèi)的動(dòng)物的實(shí)例。有此治療需求的患者很容易被診斷。
本文使用的術(shù)語(yǔ)式I化合物的“有效量”是指抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成，特別是治療阿爾茨海默氏病有效的量。
有效量可容易地由作為本領(lǐng)域技術(shù)人員的主治診斷醫(yī)生采用常規(guī)技術(shù)并觀察在類(lèi)似情況下獲得的結(jié)果來(lái)確定。在N-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的有效量、劑量的確定中，主治診斷醫(yī)生應(yīng)考慮多種因素，包括、但不限于N-((S)-2-羥基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的效價(jià)和特性；患者的種類(lèi)；其體形、年齡和一般健康狀況；疾病涉及的程度和嚴(yán)重程度；個(gè)體患者的反應(yīng)；給藥方式；給藥制劑的生物利用度特性；選擇的劑量方案；其它伴隨藥物的使用；以及其它相關(guān)情況。
N-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的有效量預(yù)期為約0.1毫克/千克體重/天(mg/kg/天)至約100mg/kg/天。由本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定優(yōu)選的量。
N-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮無(wú)水物的量預(yù)期為約0.1毫克/千克體重/天(mg/kg/天)至約100mg/kg/天。由本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定優(yōu)選的量。
在包括下列的各種生物體系中試驗(yàn)本發(fā)明的N-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮的無(wú)水物。
實(shí)施例A檢測(cè)β-淀粉狀蛋白產(chǎn)生的抑制劑的細(xì)胞篩選在具有Swedish突變的細(xì)胞系中測(cè)定上面多種式I化合物抑制β-淀粉狀蛋白產(chǎn)生的能力。該篩選測(cè)定使用細(xì)胞(K293＝人腎細(xì)胞系)，該細(xì)胞是以國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)94/105698和Citron等人12中描述的方式，用包含Lys651Met652突變?yōu)锳sh651Leu652(APP751編號(hào))的雙重突變的淀粉狀蛋白前體蛋白751(APP751)的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。這種突變常被稱(chēng)為Swedish突變，將稱(chēng)為“293 751 SWE”的細(xì)胞在補(bǔ)加10％胎牛血清的Dulbecco最低基本培養(yǎng)基(Sigma，St.Louis，MO)中以2-4×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂鋪于Corning 96孔培養(yǎng)板上。為獲得測(cè)定線性范圍內(nèi)的β-淀粉狀蛋白的ELISA結(jié)果(-0.2-2.5ng/mL)，細(xì)胞數(shù)是重要的。
在37℃下，在用10％二氧化碳平衡的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，取出培養(yǎng)基，并且每孔用200μL含式I化合物(藥物)的培養(yǎng)基置換進(jìn)行2小時(shí)的預(yù)處理并如上培養(yǎng)細(xì)胞。用100％二甲基亞砜制備藥物儲(chǔ)備液，使得處理中使用的最終藥物濃度，二甲基亞砜濃度不超過(guò)0.5％，而實(shí)際上，一般等于0.1％。
在預(yù)處理結(jié)束時(shí)，再次取出培養(yǎng)基，并用如上的新鮮的包含藥物的培養(yǎng)基置換，并將細(xì)胞再培養(yǎng)2小時(shí)。處理后，將培養(yǎng)板在BeckmanGPR中以1200rpm轉(zhuǎn)速在室溫下離心5分鐘，以沉淀?xiàng)l件培養(yǎng)基中的細(xì)胞碎片。如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/105698中所述，將每孔中100μL的條件培養(yǎng)基或其適宜的稀釋液轉(zhuǎn)移到預(yù)先包被抗β-淀粉狀蛋白肽的13-28氨基酸的抗體266[P.Seubert，Nature(1992)359325-327]的ELISA培養(yǎng)板上并在4℃下貯藏過(guò)夜。第二天，使用標(biāo)記的抗β-淀粉狀蛋白肽的1-5氨基酸的抗體3D6[P.Seubert，Nature(1992)359325-327]進(jìn)行ELISA測(cè)定，以測(cè)定產(chǎn)生的β-淀粉狀蛋白肽的量。
通過(guò)改進(jìn)的Hansen等人的方法測(cè)定化合物的細(xì)胞毒性作用。往組織培養(yǎng)板中殘留的細(xì)胞中加入25μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)(Sigma，St.Louis，MO)儲(chǔ)備溶液(5mg/mL)，至終濃度為1mg/mL。將細(xì)胞在37℃保溫1小時(shí)，通過(guò)加入等體積的MTT溶解緩沖液(20％w/v十二烷基硫酸鈉在50％二甲基甲酰胺中的溶液，pH 4.7)阻斷細(xì)胞活性。在室溫下振搖過(guò)夜進(jìn)行完全萃取。在Molecular Device的UVmax微量培養(yǎng)板閱讀器上測(cè)定作為細(xì)胞存活指示劑的OD562nm和OD650nm的差異。
將β-淀粉狀蛋白肽ELISA的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合并以ng/mL β-淀粉狀蛋白肽表示。為規(guī)一化細(xì)胞毒性，將這些結(jié)果除以MTT結(jié)果并以相對(duì)于不含藥物的對(duì)照的百分?jǐn)?shù)表示。所有結(jié)果均是至少6次重復(fù)測(cè)定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施例Bβ-淀粉狀蛋白的釋放和/或合成的體內(nèi)抑制該實(shí)施例舉例說(shuō)明如何測(cè)試本發(fā)明化合物體內(nèi)抑制β-淀粉狀蛋白的釋放和/或合成。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，使用3-4月齡的PDAPP小鼠[Games等人，(1995)Nature 373523-527]。根據(jù)測(cè)試的化合物，通常以1-10mg/mL的濃度配制化合物。由于化合物的低溶解性因素，它們可使用不同的載體進(jìn)行配制，如使用玉米油(Safeway，South SanFrancisco，CA)；10％乙醇的玉米油溶液；2-羥基丙基-β-環(huán)糊精(Research Biochemicals International，Natick MA)和羧甲基纖維素(Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)。
用26號(hào)枕頭對(duì)小鼠進(jìn)行皮下給藥，3小時(shí)后，通過(guò)CO2麻醉對(duì)動(dòng)物施行安樂(lè)死，使用以0.5M EDTA(pH8.0)涂敷的1cc 25G5/8″結(jié)核菌素注射器/針頭通過(guò)心臟穿刺取血。將血液放入包含EDTA的Becton Dickinson vacutainer管中并在5℃以1500xg離心15分鐘。然后取出小鼠的大腦，切下皮層和海馬并置于冰上。
1.腦組織測(cè)定為制備用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISAs)的海馬和皮層組織，使用Kontes電動(dòng)乳缽(Fisher，Pittsburgh PA)將各大腦區(qū)域在10體積冰冷的胍緩沖液(5.0M胍-HCl，50mM Tris-HCl，pH8.0)中勻漿化。在室溫下，使勻漿物輕輕在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上搖動(dòng)3-4小時(shí)，然后貯藏在-20℃直至進(jìn)行定量分析β-淀粉狀蛋白。
大腦勻漿物用冰冷的酪蛋白緩沖液
進(jìn)行1∶10稀釋?zhuān)写耸闺业淖罱K濃度降至0.5M，然后在4℃下以16,000xg離心20分鐘。為獲得ELISA測(cè)定的最佳范圍，如果需要，加入其中加有0.5M鹽酸胍的酪蛋白緩沖液進(jìn)一步稀釋樣品。制備β-淀粉狀蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(1-40或1-42氨基酸)，以使0.1％牛血清白蛋白(BSA)存在下的最終組成為0.5M胍。
測(cè)定β-淀粉狀蛋白(aa1-40)和β-淀粉狀蛋白(aa1-42)的整個(gè)β-淀粉狀蛋白夾層ELISA由針對(duì)β-淀粉狀蛋白的兩種單克隆抗體(mAb)組成。捕獲抗體266[P.Seubert，Nature(1992)359325-327]對(duì)β-淀粉狀蛋白的13-28氨基酸具有特異性。對(duì)β-淀粉狀蛋白的1-5氨基酸具有特異性的抗體3D6[Johnson-Wood等人，PNAS USA(1997)941550-1555]被生物素化并且在該測(cè)定中被用作報(bào)道抗體。3D6生物素化方法使用制造商(Pierce，Rockford IL)的NHS-生物素標(biāo)記免疫球蛋白的方法，不同的是使用100mM碳酸氫鈉，pH8.5的緩沖液。3D6抗體不識(shí)別分泌的淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)或全長(zhǎng)的APP，但僅檢測(cè)具有氨基末端的天冬氨酸的β-淀粉狀蛋白。該檢測(cè)的敏感性低限為～50pg/ml(11pM)并且對(duì)濃度高達(dá)1ng/ml的內(nèi)源性鼠β-淀粉狀蛋白肽不表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性。
定量測(cè)定β-淀粉狀蛋白(aa1-42)的夾層ELISA構(gòu)造使用mAb21F12[Johnson-Wood等人，PNAS USA(1997)941550-1555](其識(shí)別β-淀粉狀蛋白的33-42氨基酸)作為捕獲抗體。在該測(cè)定中，生物素化的3D6也是報(bào)道抗體，其敏感性低限為～125pg/ml(28pM)。
在室溫下，以10μg/ml用266和21F12捕獲mAbs過(guò)夜包被96孔免疫測(cè)定培養(yǎng)板(Costar，Cambidge MA)。對(duì)該板吸氣并在室溫下用0.25％人血清白蛋白的PBS緩沖液阻斷至少1小時(shí)，然后貯藏在4℃直至使用。使用前，該板用洗滌緩沖液(Tris-緩沖的鹽水，0.05％Tween20)重新水合。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加到該培養(yǎng)板中并在4℃保溫過(guò)夜。在測(cè)定的每一步驟之間，該板用洗滌緩沖液洗滌3次。將用酪蛋白培養(yǎng)緩沖液(0.25％酪蛋白，PBS，0.05％Tween 20，pH7.4)稀釋到0.5μg/ml的生物素化的3D6加到孔中，在室溫下保持1小時(shí)。將用酪蛋白培養(yǎng)緩沖液1∶4000稀釋的Avidin-HRP(Vector，Burlingame CA)加到孔中，在室溫保持1小時(shí)。加入呈色底物，Slow TMB-ELISA(Pierce，Cambridge MA)并使其反應(yīng)15分鐘，之后加入2N H2SO4阻止酶反應(yīng)。使用Molecular Devices Vmax(Molecular Devices，MenloPark CA)測(cè)定在450nm和650nm處的吸收差異來(lái)定量反應(yīng)產(chǎn)物。
2.血液測(cè)定EDTA血漿用樣品稀釋液(0.2gm/l磷酸二氫鈉·H2O，2.16gm/l磷酸氫二鈉·7H2O，0.5gm/l硫柳汞，8.5gm/l氯化鈉，0.5ml TritonX-405，6.0g/l不含球蛋白的牛血清白蛋白；和水)進(jìn)行1∶1稀釋。使用上述腦組織測(cè)定中β-淀粉狀蛋白總量的測(cè)定方法(266捕獲劑/3D6報(bào)道分子)測(cè)定樣品稀釋液中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，不同的是使用樣品稀釋液代替所述的酪蛋白稀釋液。
由前面的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)組合物和方法進(jìn)行各種修飾和改變。所有落入所附權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的這類(lèi)修飾均應(yīng)包括在本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.化合物(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
2.一種藥物組合物，它包含(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁酰基)-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮和可藥用稀釋劑。
3.一種抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成的方法，該方法包括給需此抑制的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
4.一種治療阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括給需此治療的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨?；?-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
5.一種預(yù)防阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括給有此需要的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
6.一種抑制阿爾茨海默氏病發(fā)展的方法，該方法包括給有此需要的患者施用有效量的(N)-((S)-2-羥基-3-甲基-丁?；?-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮。
7.作為藥用的權(quán)利要求1的化合物。
8.用于治療阿爾茨海默氏病的權(quán)利要求1的化合物。
9.用于預(yù)防阿爾茨海默氏病的權(quán)利要求1的化合物。
10.用于抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成的權(quán)利要求1的化合物。
11.用于抑制阿爾茨海默氏病發(fā)展的權(quán)利要求1的化合物。
12.權(quán)利要求1的化合物用于制備抑制β-淀粉狀蛋白肽的釋放和/或其合成，包括治療阿爾茨海默氏病的藥物的用途。
13.權(quán)利要求1的化合物用于制備預(yù)防阿爾茨海默氏病和/或抑制阿爾茨海默氏病的發(fā)展的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供化合物(N)－((S)－2－羥基－3－甲基－丁酰基)－1－(L－丙氨?；?－(S)－1－氨基－3－甲基－4，5，6，7－四氫－2H－3－苯并氮雜－2－酮、其組合物和該化合物的使用方法。
文檔編號(hào)C07D487/02GK1486184SQ01822100
公開(kāi)日2004年3月31日 申請(qǐng)日期2001年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月17日
發(fā)明者J·E·奧蒂亞, V·約翰, L·H·拉蒂默, S·L·麥克丹尼爾, J·S·尼森, E·D·托爾塞特, J·S·董, J E 奧蒂亞, 尼森, 托爾塞特, 拉蒂默, 董, 麥克丹尼爾 申請(qǐng)人:伊萊利利公司, 伊蘭藥品公司