專利名稱：：大量制備重組DNA-衍生的tPA或K2S分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是屬于血栓溶解及于原核細(xì)胞中制備組織纖溶酶原激活物(tPA)衍生物的領(lǐng)域。本發(fā)明是關(guān)于用以于原核細(xì)胞中制備重組DNA-衍生tPA、其變體或(Kringle2絲氨酸)K2S分子或其變體的方法，其中該tPA或K2S或變體是呈有活性的及正確折疊的形式分泌至細(xì)胞外，且該原核細(xì)胞含有并可表達(dá)一種載體，其包含編碼該tPA或K2S或變體的DNA可操作連接于編碼信號(hào)肽OmpA的DNA上。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于可藉由該方法取得的特定K2S衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步是關(guān)于該DNA分子及使用該DNA分子于該方法中。
背景技術(shù)：
：組織纖溶酶原激活物(tPA)是為一種含有527個(gè)氨基酸殘基的多肽(27)，其分子量為72kDa。該分子分成五個(gè)構(gòu)造性功能域。鄰近N-端區(qū)域者為環(huán)狀的手指功能域，其后接著生長(zhǎng)因子功能域。其后接著兩個(gè)相似的功能域，kringle1與kringle2。手指及kringle2功能域均特異性結(jié)合于纖維蛋白凝塊，因而加速結(jié)合的纖溶酶原的tPA蛋白活化。Kringle2的下游為絲氨酸蛋白酶，其催化位置位于C-端。絲氨酸蛋白酶是負(fù)責(zé)將纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶，此為纖維蛋白生成性止血與凝塊溶解的體內(nèi)平衡中的重要反應(yīng)。tPA的正確折疊需要分子內(nèi)17個(gè)二硫鍵的正確配對(duì)(1)。臨床上，tPA是被選用來(lái)治療急性心肌梗塞、肺栓塞、中風(fēng)(stroke)、周圍動(dòng)脈阻塞、及其他血栓栓塞疾病的溶血栓劑。其優(yōu)點(diǎn)為不引起系統(tǒng)性出血及纖維蛋白原耗竭的副作用(7)。Bowes黑色素瘤細(xì)胞是最先用于治療用途的tPA的制備源(12)。因?yàn)榕R床使用上需要具有良好產(chǎn)率的高度純化蛋白的有效生產(chǎn)的固定制程，故于哺乳類細(xì)胞中進(jìn)行全長(zhǎng)重組-tPA(r-tPA)的構(gòu)筑。以tPA基因轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞以合成r-tPA(8，22)。由培養(yǎng)基中回收并純化藉由哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵系統(tǒng)生產(chǎn)的重組產(chǎn)物。由于具簡(jiǎn)單及經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)的吸引力，許多人致力于研究從微生物，特別是從細(xì)胞，且更特別是從大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)生產(chǎn)tPA(10，13，30)。關(guān)于其低產(chǎn)率及內(nèi)含體的生成，其可導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊及沒(méi)有活性的酶，有許多策略已被提出以克服此等問(wèn)題。數(shù)種的缺失突變變體，包括kringle2加絲氨酸蛋白酶(K2S)是在考慮之列。然而，重組-K2S(r-K2S)的酶活性的獲得僅可于得自細(xì)胞質(zhì)成分的經(jīng)純化內(nèi)含體的再折疊過(guò)程完成時(shí)(16，29)。為要避免繁復(fù)的再折疊過(guò)程，錯(cuò)誤折疊蛋白的混雜及周質(zhì)蛋白的運(yùn)送，可使用特殊的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)(6，31)。盡管tPA在周質(zhì)表達(dá)，但過(guò)度表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致沒(méi)有活性的聚集物，縱使于周質(zhì)的相對(duì)較高氧化狀態(tài)下?，F(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于在大腸埃希氏菌中制備重組K2S的方法有一些說(shuō)明。然而，并未揭示可大量制備生物活性K2S的具成本效益的方法。Obukowicz等人(25)從壁膜間隙表達(dá)并純化r-K2S。此方法的明顯缺點(diǎn)為需額外的周質(zhì)提取步驟，其并不適于大量制備。Saito等人(29)揭示r-K2S的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。該作者使用體內(nèi)復(fù)性程序來(lái)表達(dá)r-K2S，其是以內(nèi)含體的形式從大腸埃希氏菌的細(xì)胞質(zhì)空間中純化出來(lái)。BoehringerMannheim使用類似的繁復(fù)變性/再折疊方法，其涉及消化細(xì)胞，于變性及還原狀態(tài)下溶解并于GSH/GSSG存在之下于氧化狀態(tài)下再活化的步驟，其并不具成本效益(24)且需要氨基酸序列的突變。于1991年，Waldenstrom等人(34)構(gòu)筑一種載體(pEZZK2P)，用以將kringle2加絲氨酸蛋白酶功能域分泌至大腸埃希氏菌培養(yǎng)液中。使用羥胺由IgG-Sepharose純化級(jí)分中移除ZZ融合肽。切割劑羥胺需要將kringle2加絲氨酸蛋白酶的切割位點(diǎn)加以修飾(Asn177→Ser及Asn184→Gln)，以保護(hù)其不受羥胺的水解。然而，所得的非天然，非適當(dāng)折疊的K2S分子并不適于治療用途。其并未揭示關(guān)于纖維蛋白結(jié)合的酶活性/蛋白酶活性。該不尋常序列甚至可能活化人類免疫系統(tǒng)。因此本發(fā)明的所面臨的問(wèn)題是提供可商業(yè)化應(yīng)用于tPA分子及其衍生物，例如K2S的大量制備方法，其中該K2S是以生物活性形式分泌至培養(yǎng)上清液中。
發(fā)明內(nèi)容上述問(wèn)題于本發(fā)明的權(quán)利要求書及說(shuō)明書的范圍內(nèi)獲得解決。權(quán)利要求書及說(shuō)明書的單一或多重使用并不受任何限制且亦包括其它型式。本發(fā)明是關(guān)于在原核細(xì)胞內(nèi)制備重組DNA衍生的組織纖溶酶原激活物(tPA)、tPA變體、Kringle2絲氨酸蛋白酶分子(K2S)或K2S變體的方法，其中該tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體是可胞外分泌成有活性的且正確折疊的蛋白，其特征為該原核細(xì)胞包含并可表達(dá)一載體，該載體包含編碼該tPA，tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA，所述DNA可操作連接于編碼信號(hào)肽OmpA的DNA或其功能性衍生物。出乎意料地，單獨(dú)使用信號(hào)肽OmpA和/或并用N-端氨基酸SEGN(SEQIDNO9)/SEGNSD(SEQIDNO10)，與現(xiàn)有技術(shù)中的任何其他方法相比，可較大程度地將重組DNA-衍生的tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體轉(zhuǎn)移至外表面及促進(jìn)功能性及活性分子釋放至培養(yǎng)基中。穿越外膜之前，重組DNA-衍生的蛋白是先根據(jù)本發(fā)明的方法正確折疊。切下信號(hào)肽以制備成熟分子。出乎意料地，信號(hào)肽移除的效率極高且可導(dǎo)致重組DNA-衍生的蛋白的正確折疊。該信號(hào)肽OmpA可與SesE交互作用并藉由SecA產(chǎn)生的能量而穿過(guò)內(nèi)膜，其結(jié)合于Sec成分(SecE-SecY)。SecY生成分泌孔洞以遞送根據(jù)本發(fā)明的重組DNA-衍生的蛋白。革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜及內(nèi)膜間的空間，周質(zhì)，有較細(xì)胞質(zhì)空間為高的氧化狀態(tài)。此可支持重組蛋白(例如K2S)于周質(zhì)中的雙硫鍵的生成及適當(dāng)折疊以產(chǎn)生活性分子。根據(jù)本發(fā)明，信號(hào)肽需切下以生產(chǎn)成熟分子。GspD分泌素(secretin)與GspS脂蛋白于外膜上的復(fù)合物提供將根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白分泌至胞外基質(zhì)的門徑。此等分泌程序需要能量，其藉由GspE核苷酸結(jié)合蛋白于細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生再轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜蛋白(GspG-J，F(xiàn)及K-N)。GspC藉由一組內(nèi)膜蛋白(GspG-J，F(xiàn)及K-N)及GspD間生成交叉連接子而將能量轉(zhuǎn)移至GspD。于成功穿越外膜之前，重組蛋白已先正確折疊。根據(jù)本發(fā)明的可操作的連接是指將編碼tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA(優(yōu)選為于其N端部分包含編碼SEGN或SEGNSD的核酸)克隆至載體內(nèi)最靠近OmpADNA處，以便達(dá)成OmpA-tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體-融合蛋白的表達(dá)并使之直接分泌至原核宿主細(xì)胞外。典型地，大部分的tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體是可分泌且可再藉由適當(dāng)?shù)姆椒兓?，例如以硫酸銨沉淀和/或親和層析及進(jìn)一步的純化步驟。本發(fā)明亦包括使用誘導(dǎo)劑，例如IPTG或IPTG合并甘油，改良培養(yǎng)條件及收獲期以使活化蛋白量達(dá)最高。于較優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，該編碼OmpA信號(hào)肽的DNA可融合至氨基酸序列為SEGN或SEGNSD或編碼核酸序列TCTGAGGGAAAC(SEQIDNO20)或TCTGAGGGAAACAGTGAC(SEQIDNO1)上并位于tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的N端部分內(nèi)或N端部分處。因此，較優(yōu)選者，該融合蛋白包含OmpA-SEGNSD-tPA、-tPA變體、-K2S分子或-K2S變體。再更優(yōu)選，該特征為SEGN或SEGNSD的氨基酸可攜有點(diǎn)突變或可由非天然氨基酸取代。再更優(yōu)選，OmpA與SEGN或SEGNSD與tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體間有氨基酸或非氨基酸間隔子。因此，于根據(jù)本發(fā)明的較優(yōu)選方法中，該原核細(xì)胞包含并可表達(dá)載體，其包含編碼該tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA可操作連接于編碼信號(hào)肽OmpA的DNA，其是可操作連接于序列為TCTGAGGGAAACAGTGAC的核酸分子或其功能性衍生物。根據(jù)本發(fā)明的方法包含原核宿主細(xì)胞，例如但不限于大腸埃希氏菌(E.coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputide)，奇異變形菌(Proteusmirabilis)，糖酵母屬(Saccharomyces)，畢赤氏酵母屬(Pichia)或葡萄球菌屬(Staphylococcus)，例如肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnsous)。較優(yōu)選者，根據(jù)本發(fā)明的該原核細(xì)胞是為革蘭氏陰性細(xì)胞。較優(yōu)選者，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為該原核細(xì)胞是大腸埃希氏菌。適當(dāng)?shù)木臧ǎ幌抻诖竽c埃希氏菌XL-1blue，BL12(DE3)，JM109，DH系列，TOP10及HB101。較優(yōu)選者，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為進(jìn)行下列步驟a)藉由PCR擴(kuò)增編碼tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA；b)純化PCR產(chǎn)物；c)將該P(yáng)CR產(chǎn)物嵌入包含編碼OmpA信號(hào)肽的DNA及編碼gpIII的DNA的載體內(nèi)，其使用的方法可使該P(yáng)CR產(chǎn)物上游可操作連接于該載體的編碼OmpA信號(hào)肽的DNA，下游連接于編碼gpIII的DNA；d)于該tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體與gpIII之間嵌入終止密碼子；e)藉由原核細(xì)胞表達(dá)該載體；f)純化該tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體。于根據(jù)本發(fā)明的步驟a)中，引物的選擇/設(shè)計(jì)很重要，使其可克隆出位于表達(dá)載體的正確位置及方向上的DNA(參見實(shí)例1)。因此，實(shí)例1及圖4中示例的引物包含本發(fā)明的重要方面。步驟c)的gpIII是指基因蛋白III，其主要存在于噬菌粒載體中。嵌入終止密碼子可避免gpIII的轉(zhuǎn)錄，因而最后導(dǎo)致所欲tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的分泌。任何用以嵌入終止密碼子的適當(dāng)方法均可使用，例如定點(diǎn)誘變(例如WeinerMP，CostaGL(1994)PCRMethodsAppl4(3)S131-136；WeinerMP，CostaGL，SchiettlinW，ClineJ，MathurE，BauerJC(1994)Gene151(1-2)119-123；亦參見實(shí)例1)。任何載體均可用于本發(fā)明的方法，該載體較優(yōu)選者為噬菌粒載體(參見以下)。較優(yōu)選者，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為該tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體是選自人類組織纖溶酶原激活物(tPA，圖16)或其片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物、融合蛋白或糖基化變體。此等片段、等位變體、功能性變體、基于簡(jiǎn)并核酸密碼子的變體，具有根據(jù)本發(fā)明的tPA蛋白的融合蛋白、根據(jù)本發(fā)明的tPA的糖基化變體或化學(xué)衍生物可包括一個(gè)、數(shù)個(gè)或所有的下列功能域或亞單位或其變體1.手指功能域(4-50)2.生長(zhǎng)因子功能域(50-87)3.Kringle1功能域(87-176)4.kringle2功能域(176-262)5.蛋白酶功能域(276-527)功能域的編號(hào)/命名是根據(jù)Genbank登錄號(hào)碼GI137119或Nature301(5897)，214-221(1983)。較優(yōu)選者，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為該tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體是選自人類組織纖溶酶原激活物(tPA)或其片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物、融合蛋白或糖基化變體的Kringle2(4.)加絲氨酸蛋白酶(5.)K2S變體。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為該載體是為噬菌粒，其包含編碼OmpA信號(hào)肽的DNA及編碼gpIII的DNA。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為該載體是為pComb3HSS噬菌粒(亦參見實(shí)例1)。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為該DNA序列包含編碼OpmA及K2S的下列DNA序列或其功能性變體或由于簡(jiǎn)并核苷酸密碼所致的變體，或由編碼OpmA及K2S的下列DNA序列或其功能性變體或由于簡(jiǎn)并核苷酸密碼所致的變體所組成ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQIDNO2)更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為OmpA的DNA序列包含或由下列序列或其功能性變體或由于簡(jiǎn)并核苷酸密碼所致的變體所組成ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQIDNO3)。該DNA編碼OmpA的下列氨基酸序列。OmpA因而包含或由以下列氨基酸序列或其片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物或糖基化變體為特征的蛋白所組成，作為本發(fā)明的一部分MKKTAIAIAVALAGFATVAQAA(SEQIDNO21)。非翻譯區(qū)可包含調(diào)控元件，例如轉(zhuǎn)錄起始單元(啟動(dòng)子)或增強(qiáng)子。該啟動(dòng)子可，例如為構(gòu)成性，可誘導(dǎo)性或發(fā)育調(diào)控性啟動(dòng)子。較優(yōu)選者，不排除其他已知的啟動(dòng)子，人類巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus)(CMV)及勞斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus)(RSV)的構(gòu)成性啟動(dòng)子，及猴病毒40(Simianvirus40)(SV40)和單純皰疹病毒啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子包含抗生素抗性啟動(dòng)子，熱休克啟動(dòng)子，激素誘導(dǎo)性“乳房腫瘤病毒啟動(dòng)子”及金屬硫蛋白啟動(dòng)子。較優(yōu)選的啟動(dòng)子包括T3啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子，Lac/aral及Ltet0-1。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為編碼tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA位于lac啟動(dòng)子和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)，例如Shine-Dalgarno序列之后(亦參見實(shí)例)。較優(yōu)選者，根據(jù)本發(fā)明的方法特征亦為該編碼tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA是選自編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸87-527，174-527，180-527或220-527的至少90％的DNA群。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征亦為K2S的DNA序列包含或由下列序列所組成TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA(SEQIDNO4)本發(fā)明亦涉及由于簡(jiǎn)并密碼所致的前述核酸分子的變體或其片段，可于嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交于前述核酸的核酸，等位變體或功能性變體。本發(fā)明亦涉及這樣的核酸，該核酸包含K2S核酸融合至編碼另一蛋白分子的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的嚴(yán)謹(jǐn)條件是用以篩選85％以上，較優(yōu)選為90％以上同源性的條件(Sambrook等人，1989；MolecularCloningALaboratoryManual，2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。雜交反應(yīng)可于例如6×SSC/5×Denhardt′s溶液/0.1％SDS(SDS十二烷基硫酸鈉)中于65℃進(jìn)行。嚴(yán)謹(jǐn)程度決定于洗滌步驟。因此，例如用以篩選具有大約85％或更高的同源性的DNA序列時(shí)的適當(dāng)條件為0,2×SSC/0,01％SDS/65℃，用以篩選具有大約90％或更高的同源性的DNA序列時(shí)的適當(dāng)條件為0,1×SSC/0,01％SDS/65℃。所述試劑的組成參見Sambrook等人的描述(1989，同前述)。本發(fā)明的另一重要部分是為人類組織纖溶酶原激活物的變體，其包含或由Kringle2(4.)加絲氨酸蛋白酶(5.)(縮寫成K2S)蛋白或其變體或片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物、融合蛋白或糖基化變體所組成。功能域的編號(hào)/命名是根據(jù)Genbank登錄號(hào)碼GI137119或Nature301(5897)，214-221(1983)，其中該Kringle2功能域的范圍為氨基酸176-262且蛋白酶功能域的范圍為氨基酸276-527。因此，根據(jù)本發(fā)明，較優(yōu)選的K2S分子可包括氨基酸176-527，包括Kringle2及蛋白酶間的氨基酸(氨基酸263至275；示例于圖中(結(jié)構(gòu)A))。根據(jù)本發(fā)明的K2S分子包含最小部分的Kringle2功能域和蛋白酶功能域，但仍保留蛋白酶活性及纖維蛋白結(jié)合活性(其測(cè)定如說(shuō)明/實(shí)例中的示例)。根據(jù)本發(fā)明的該K2S分子包含其N端部分的氨基酸SEGN或SEGNSD(見下文)。較優(yōu)選的K2S分子并不包括tPA分子的氨基酸1至3或1至5。較優(yōu)選者，根據(jù)本發(fā)明的K2S分子于位置177及184處具有氨基酸Asn，即以根據(jù)本發(fā)明的方法，其不需如Waldenstrom所揭示的用以改良產(chǎn)率的修飾。因此，根據(jù)本發(fā)明的較優(yōu)選K2S分子具有天然氨基酸序列(無(wú)突變)，這與現(xiàn)有技術(shù)中已知的分子不同。最優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的該K2S分子是為這樣一種分子，其特征為天然氨基酸序列或其部分，不具有tPA的氨基酸1至3或1至5但包含N端的氨基酸SEGN或SEGNSD以改善產(chǎn)率和/或分子的正確折疊。根據(jù)本發(fā)明的K2S分子必需于N端部分包含一肽，其特征為其氨基酸序列為SEGN，其有助于使用前述說(shuō)明的方法商業(yè)化生產(chǎn)可正確折疊、分泌的K2S蛋白。該特征為SEGN的4個(gè)氨基酸在N端可多出一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，然而該氨基酸必需位于相反于C端部分的N端部分。最優(yōu)選，該特征為SEGN的氨基酸可攜有點(diǎn)突變或可由非天然氨基酸取代。因此，于另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于K2S蛋白，其特征為其包含序列確定為SEGN的氨基酸或其變體或片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物、融合蛋白或糖基化變體。此等片段示例于，例如圖10(結(jié)構(gòu)B-1)及圖11(結(jié)構(gòu)B-2)中193-527氨基酸的范圍。結(jié)構(gòu)B-1于位置261處具有天然氨基酸Cys，而B-2的該處氨基酸是為Ser取代。根據(jù)本發(fā)明的另外的片段包含氨基酸220-527(圖14，構(gòu)造C)或包含氨基酸260-527(圖15，構(gòu)造D)，該片段可根據(jù)本發(fā)明藉由加入氨基酸SEGN和/或以Ser取代Cys-261而進(jìn)行修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員可測(cè)定出根據(jù)本發(fā)明的K2S的最小長(zhǎng)度以便保留其生物功能并藉由N端部分加入氨基酸SEGN以產(chǎn)生具有改善的產(chǎn)率和/或正確折疊的K2S分子。因此，另一較優(yōu)選的具體實(shí)施方案是為該最小K2S分子于N端部分具有SEGN。于另一重要的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于K2S蛋白，其特征為其包含序列確定為SEGNSD的氨基酸或其變體或片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物、融合蛋白或糖基化變體。此等片段示例于，例如圖12(結(jié)構(gòu)B-3)及圖13(結(jié)構(gòu)B-4)中191-527氨基酸的范圍。結(jié)構(gòu)B-3于位置261處具有天然氨基酸Cys，而B-4的該處氨基酸是為Ser取代。根據(jù)本發(fā)明的另外的片段包含氨基酸220-527(圖14，構(gòu)造C)或包含氨基酸260-527(圖15，構(gòu)造D)，其可根據(jù)本發(fā)明藉由加入氨基酸SEGNSD和/或以Ser取代Cys-261而修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員可測(cè)定出根據(jù)本發(fā)明的K2S的最小長(zhǎng)度以便保留其生物功能并藉由N端部分加入氨基酸SEGNSD以產(chǎn)生具有改善的產(chǎn)率和/或正確折疊的K2S分子。因此，另一較優(yōu)選的具體實(shí)施方案是為該最小K2S分子于N端部分具有SEGNSD。本發(fā)明的另一較優(yōu)選具體實(shí)施方案是關(guān)于一種K2S蛋白，其包含特征為下列氨基酸序列的蛋白或其變體或片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物或糖基化變體SEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP*(SEQIDNO11)根據(jù)本發(fā)明，*是指終止(即由終止密碼子編碼)。此K2S分子示例于圖8。根據(jù)本發(fā)明的一種K2S分子變體是關(guān)于將K2S融合于另一蛋白分子的融合蛋白。本發(fā)明的另一較優(yōu)選具體實(shí)施方案是關(guān)于K2S蛋白，其是由特征為下列氨基酸序列的蛋白所組成SEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP*(SEQIDNO11)該K2S分子可由前述說(shuō)明的DNA分子編碼。本發(fā)明的另一重要方面是關(guān)于DNA分子，其特征為其編碼a)OmpA蛋白或其功能性衍生物可操作連接于b)編碼含有組織纖溶酶原激活物蛋白的kringle2功能域及絲氨酸蛋白酶功能域的多肽的DNA分子。較優(yōu)選者，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子的特征亦為該DNA序列包含或由下列編碼OmpA及K2S的DNA序列或其功能性變體或由于簡(jiǎn)并核苷酸密碼而得的變體所組成ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQIDNo2)該DNA分子編碼下列OmpA及K2S的融合蛋白。該OmpA及K2S的融合蛋白特征為其包含或由以下列氨基酸序列或其片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物或糖基化變體為特征的蛋白所組成，其形成本發(fā)明的重要部分MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRPG(SEQIDNO8)本發(fā)明的另一較優(yōu)選方面是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其特征為該DNA序列b)是編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸87-527的至少90％(本文中使用的編號(hào)是如GI137119或Nature301(5879)，214-221(1983))。本發(fā)明的另一較優(yōu)選方面是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其特征為該DNA序列b)是編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸174-527的至少90％。本發(fā)明的另一較優(yōu)選方面是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其特征為該DNA序列b)是編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸180-527的至少90％。本發(fā)明的另一較優(yōu)選方面是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其特征為該DNA序列b)是編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸220-527的至少90％。本發(fā)明的另一較優(yōu)選方面是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其特征為該DNA序列a)是于嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至下列序列ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQIDNO3)。本發(fā)明的另一較優(yōu)選方面是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其特征為該DNA序列a)是由下列序列所組成ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQIDNO3)。本發(fā)明的另一較優(yōu)選方面是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其特征為該DNA序列b)是于嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至下列序列TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA(SEQIDNO4).本發(fā)明的另一較優(yōu)選方面是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其特征為該DNA序列b)是由下列序列所組成TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA(SEQIDNO4).本發(fā)明的另一較優(yōu)選具體實(shí)施方案是關(guān)于含有根據(jù)本發(fā)明的DNA序列的載體。本發(fā)明的另一較優(yōu)選具體實(shí)施方案是關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的載體，其中該DNA序列是位于lac啟動(dòng)子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)之后。根據(jù)本發(fā)明適當(dāng)?shù)妮d體包括，但不限于病毒性載體，例如痘苗病毒(Vaccinia)，Semliki-Forest病毒及腺病毒屬(Adenovirus)，噬菌粒載體及其類似者。較優(yōu)選的載體為有益用于大腸埃希氏菌，但亦可用于任何其他原核性宿主，例如pPROTet.E，pPROLar.A，pBAD家族，pSE家族及pQE家族成員及pCAL中。本發(fā)明的另一較優(yōu)選具體實(shí)施例是關(guān)于載體pComb3HSS，其含有根據(jù)本發(fā)明的DNA，其中該gpIII蛋白的表達(dá)藉由缺失編碼該gpIII蛋白的DNA分子或藉由編碼含異源性蛋白的多肽的基因及蛋白III基因間的終止密碼子而受到抑制。本發(fā)明的另一重要方面是關(guān)于包含根據(jù)本發(fā)明的DNA分子的原核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一重要方面是關(guān)于包含根據(jù)本發(fā)明的載體的原核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一重要方面是關(guān)于包含根據(jù)本發(fā)明的DNA分子的大腸埃希氏菌宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一重要方面是關(guān)于包含根據(jù)本發(fā)明的載體的大腸埃希氏菌宿主細(xì)胞。本發(fā)明的再另一重要方面是根據(jù)本發(fā)明的DNA分子或根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞在制備具有組織纖溶酶原激活物活性的多肽的方法中的用途。本發(fā)明的再另一重要方面是如上所述的根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用，其中該方法是為根據(jù)本發(fā)明的方法。另一非常重要的方面是包含藉由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的賦形劑及載體的藥物組合物。該物質(zhì)的一實(shí)例是前述說(shuō)明的K2S分子。本文所使用的“藥學(xué)上可接受的載體”一詞是指?jìng)鹘y(tǒng)使用于制藥領(lǐng)域的賦形劑或添加劑。此等生理可接受的化合物包括，例如碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化劑，例如抗壞血酸或谷胱甘肽，絡(luò)合劑，低分子量蛋白或其他穩(wěn)定劑或賦形劑(亦可參見Remington′sPharmaceuticalSciences(1990，18thed.MackPubl.，Easton))。根據(jù)本發(fā)明的所述藥物組合物有益于作為大丸劑(bolus)靜脈給藥，例如5至10秒鐘靜脈內(nèi)給藥一次大丸劑。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于將藉由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的物質(zhì)使用于治療中風(fēng)、心肌梗塞、急性心肌梗塞、肺栓塞、任何動(dòng)脈阻塞，例如，冠狀動(dòng)脈阻塞、顱內(nèi)動(dòng)脈(例如供給腦的動(dòng)脈)阻塞，周圍動(dòng)脈阻塞、深層靜脈血栓或與不正常血液凝固有關(guān)的疾病的藥物制造中。下列實(shí)例是用來(lái)幫助了解本發(fā)明且其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1材料及方法引物設(shè)計(jì)。為要擴(kuò)增tPA基因的特定部分，故合成引物對(duì)sK2/174[5′GAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGAC3′](SEQIDNO22)和ASSP[5′GAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCCGGTCGCATGTTGTCACG3′](SEQIDNO23)(LifeTechnologiesGrand，Island，NY)。此等引物的設(shè)計(jì)是根據(jù)擷取自NCBI資料庫(kù)的人類tPA基因(g137119)。其利用SfiI末端克隆位點(diǎn)(畫線處)并以噬菌粒pComb3HSS內(nèi)的gpIII基因的自ATG的讀框可遍布于整個(gè)嵌入序列的方式合成。另一組用于定點(diǎn)誘變的引物是設(shè)計(jì)以與介于pComb3H-K2S的基因III和K2S基因間的序列退火。具有突變堿基(畫線處)，其用以產(chǎn)生新的終止密碼子的引物序列是為MSTPA[5′ACATGCGACCGTGACAGGCCGGCCAG3′](SEQIDNO24)和MASTPA[5′CTGGCCGGCCTGTCACGGTCGCATGT3′](SEQIDNO25)。藉由PCR擴(kuò)增K2S基因。將1μgsK2/174及ASSP引物連同50ng的p51-3模板(得自HiroshiSasaki博士，F(xiàn)ujisawaPharmaceutical，Japan)懸浮于100微升的PCR混合物中。最后于溶液中加入2.5U用量的Taq聚合酶(RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)定量擴(kuò)增條件是起始于突然開始于85℃，4分鐘，再于95℃變性50秒，于42℃退火50秒，于72℃延續(xù)1.5分鐘。重復(fù)進(jìn)行35回合。將該混合物置于72℃下10分鐘。將1110bp的擴(kuò)增產(chǎn)物接著以QLAquickPCR純化試劑盒(QIAGEN，Hilden，Gerany)純化。以限制酶確認(rèn)經(jīng)純化產(chǎn)物的正確性。構(gòu)筑可表達(dá)K2S的噬菌粒。將經(jīng)純化的K2SPCR產(chǎn)物及pComb3HSS噬菌粒(由美國(guó)ScrippsInstitute，CarlosF.Barbas博士贊助提供)以SfiI(RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)水解以制備特定的粘性克隆位點(diǎn)。將四微克的經(jīng)純化PCR產(chǎn)物以60U的SfiI于50℃消化18小時(shí)。至于pComb3HSS，將20微克的噬菌體載體以100USfiI處理之。將經(jīng)純化的K2SPCR產(chǎn)物及pComb3HSS(～3300bp)的消化產(chǎn)物隨后藉由QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Hilden，Germany)進(jìn)行凝膠純化。將5U的T4連接酶加至0.7微克的經(jīng)純化SfiI消化的pComb3HSS及0.9微克的經(jīng)純化SfiI消化的PCR產(chǎn)物的混合物中。置于30℃下進(jìn)行接合反應(yīng)18小時(shí)。該新構(gòu)筑的噬菌粒命名為pComb3H-K2S。XL-1Blue的轉(zhuǎn)化。將200微升的CaCl2所致的感受態(tài)大腸埃希氏菌XL-1Blue(Stratagene，LaJolla，CA)以70ng的經(jīng)接合或經(jīng)突變的產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于含100微克/毫升氨芐青霉素(ampicillin)及10微克/毫升四環(huán)素(Sigma，SaintLouis，MO)的LB瓊脂上使之增殖。將瓊脂于37℃培養(yǎng)18小時(shí)后，挑出數(shù)個(gè)抗生素抗性克隆以藉由堿溶解法用于噬菌粒的微量制備中。將各個(gè)經(jīng)純化的質(zhì)粒進(jìn)行SfiI限制性酶切分析。將含有質(zhì)粒(其中具有正確的SfiI限制性酶切位點(diǎn))的轉(zhuǎn)化子隨后于37℃，于含氨芐青霉素100微克/毫升及四環(huán)素10微克/毫升的100mlLB培養(yǎng)基中增殖18小時(shí)。質(zhì)粒的大量制備是藉由使用QIAGEN質(zhì)粒大量制備試劑盒(QIAGEN，Hilden，Gemany)進(jìn)行的。將經(jīng)純化質(zhì)粒藉由SfiI再度檢測(cè)特異的限制酶切位點(diǎn)并藉由AmpliTaqDNA聚合酶終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer公司，F(xiàn)orsterCity，CA)測(cè)序。pComb3H-K2S的定點(diǎn)誘變。將10ng的pComb3H-K2S模板與125ng的MSTPA及MASTPA引物混合。將2.5U的PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene，LAJolla，CA)加至混合物中以進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。反應(yīng)開始為一回合的95℃，30秒。再接著16回合的95℃，30秒；55℃，1分鐘及68℃，9分鐘。再隨后將該反應(yīng)管置于冰上2分鐘。為要破壞模板鏈，故于擴(kuò)增反應(yīng)中加入10U的DpnI限制酶(Stratagene，LAJolla，CA)并于37℃培養(yǎng)1小時(shí)。將此合成產(chǎn)物(MpComb3H-K2S)進(jìn)一步用以轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌XL-1Blue。噬菌體-展示重組-K2S的制備。將pComb3H-K2S轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌XL-1Blue后，實(shí)行噬菌體展示技術(shù)。將經(jīng)pComb3H-K2S轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌XL-1Blue克隆于10毫升的含氨芐青霉素100微克/毫升及四環(huán)素10微克/毫升的超培養(yǎng)液中，于37℃增殖至O.D.[600nm]達(dá)1.5為止。隨后將該細(xì)菌培養(yǎng)液于100毫升的相同培養(yǎng)基內(nèi)增殖并培養(yǎng)2小時(shí)。使用1012pfu的VCSM13輔助噬菌體(Stratagene，LAJolla，CA)感染經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌XL-1Blue。培養(yǎng)3小時(shí)后，將最終濃度為70微克/毫升的卡納霉素(kanamycin)加至培養(yǎng)液中。使培養(yǎng)液于37℃下振蕩(200RPM)18小時(shí)。再藉由添加4％w/vPEGMW8000(Sigma，SaintLouis，MO)及3％w/vNaCl收獲于gp3上具有K2S的噬菌體(K2S-)。最后，將收獲的噬菌體再懸浮于2毫升pH7.4的PBS中。噬菌體數(shù)的測(cè)定是藉由感染大腸埃希氏菌XL-1Blue。如先前的說(shuō)明(21)計(jì)算每毫升的菌落生成單位(cfu/ml)。于振蕩三角瓶中表達(dá)重組-K2S。將經(jīng)MpComb3H-K2S轉(zhuǎn)化的XL-1Blue于37℃，于pH7.0及氨芐青霉素(100微克/毫升)存在下培養(yǎng)于100毫升的超培養(yǎng)液(3％w/v胰蛋白胨，2％w/v酵母提取物及1％w/vMOPS)中，直至O.D.[600nm]達(dá)0.8為止。隨后，以1mM的IPTG(Promega，Madison，WI)誘發(fā)蛋白合成。將細(xì)菌進(jìn)一步于30℃振蕩培養(yǎng)(200RPM)6小時(shí)。收集培養(yǎng)上清液并以55％飽和硫酸銨沉淀(32)。將沉淀于pH7.2的PBS中回溶并于4℃下，于相同的緩沖溶液中透析18小時(shí)。如先前由Ames等人說(shuō)明者(2)，藉由利用氯仿沖擊由細(xì)菌細(xì)胞提取周質(zhì)蛋白。重組-K2S的免疫分析定量。為要檢測(cè)r-K2S，故于固相上包被抗-kringle2功能域單克隆抗體(16/B)(由UteZacharias博士慷慨提供，CentralInstituteofMolecularBiology，Berlin-Buch，Germany)。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的ELISA洗滌及封閉程序。將五十微升的1011cfu/ml的K2S-或分泌性r-K2S加至各個(gè)抗-kringle2包被的孔中?？乖?抗體檢測(cè)的進(jìn)行如下。于洗滌步驟后，在各個(gè)反應(yīng)孔加入綿羊抗-M13結(jié)合性HRP(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)或綿羊抗-tPA結(jié)合性HRP(Cedarlane，Ontario，Canada)。將底物TMB加至各孔中，反應(yīng)30分鐘后，最終以H2SO4溶液終止反應(yīng)。使用標(biāo)準(zhǔn)黑色素瘤tPA86/670(NationalInstituteforBiologicalStandardandControl，Hertfordshine，UK)作為陽(yáng)性對(duì)照。酰胺水解活性分析。用以檢測(cè)tPA酰胺水解活性的試驗(yàn)試劑盒是購(gòu)自Chromogenix(Molndal，Sweden)。使用含有纖溶酶原及S-2251的底物混合物以測(cè)定絲氨酸蛋白酶酶活性。將各個(gè)銨沉淀樣品的10-2稀釋液于具有或不具刺激劑-人類纖維蛋白原片段的情況下分析。分析步驟是根據(jù)COASETt-PA手冊(cè)。SDS-PAGE及免疫轉(zhuǎn)印。將得自培養(yǎng)上清液的經(jīng)透析的沉淀產(chǎn)物進(jìn)一步以centricon10(AMICON，Beverly，MA)濃縮10倍。藉由SDS-PAGE，15％分離凝膠，于還原緩沖液中將該濃縮樣品進(jìn)行蛋白分離，接著將之電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。再將該硝酸纖維素膜以4％脫脂乳封閉2小時(shí)。為要檢測(cè)r-K2S，故將經(jīng)適當(dāng)稀釋的綿羊抗-tPA結(jié)合性HRP涂布于硝酸纖維素膜上。以靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)AmplifiedOpti-4CN試劑盒(BIORAD，Hercules，CA)顯現(xiàn)免疫反應(yīng)帶。共聚合的纖溶酶原聚丙烯酰胺凝膠電泳。將11％分離性丙烯酰胺凝膠與纖溶酶原及明膠共同聚合，如Heussen等人先前的說(shuō)明(14)。濃縮膠為4％濃度且不含纖溶酶原及明膠。于4℃及8mA的固定電流下進(jìn)行電泳。殘留于凝膠片中的SDS可于室溫，于2.5％TritonX-100中緩慢搖動(dòng)1小時(shí)后移除。然后將該凝膠片于37℃，置于0.1M，pH8.3的甘氨酸-NaOH中5小時(shí)。最后，藉由標(biāo)準(zhǔn)考馬斯藍(lán)(R-250)染色系統(tǒng)將該凝膠片染色并脫色。具有酶活性的肽位置不會(huì)被染劑染色，故與藍(lán)色背景形成對(duì)比。結(jié)果K2S基因攜帶性載體的構(gòu)筑。吾人利用引物SK2/174和ASSP從載體p51-3擴(kuò)增tPA的kringle2加絲氨酸蛋白酶部分(kringle2功能域內(nèi)的Ser174至絲氨酸蛋白酶中的Pro527)。將經(jīng)擴(kuò)增的1110bp產(chǎn)物藉由瓊脂凝膠電泳證實(shí)(圖1，第2泳道)并藉由位于5′及3′末端上的雙SfiI切割位點(diǎn)將之嵌入pComb3HSS噬菌粒內(nèi)的正確讀框中。因而產(chǎn)生新載體，pComb3H-K2S，其含有K2S。于此載體中，K2S是上游側(cè)接于OmpA信號(hào)序列及下游為gp3。K2S的正確嵌入的確認(rèn)是藉由以SfiI進(jìn)行限制分析(圖2，第3泳道)，PCR-分析(于1110bp處顯示單一帶)，及DNA測(cè)序。pComb3H-K2S模式圖示于圖3中。噬菌體展示性r-K2S。使用VCSM13絲狀噬菌體感染經(jīng)pComb3H-K2S轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌XL-1Blue，X[K2S]。于病毒包裝過(guò)程中，VCSM13會(huì)增殖并摻入K2S-gp3融合蛋白中。收獲的重組噬菌體(K2S-)以由PEG-沉淀的噬菌體再感染大腸埃希氏菌Xl-1Blue測(cè)得的，濃度為5.4×1011cfu/ml。藉由三明治ELISA確認(rèn)此等重組噬菌體顆粒的r-K2S表達(dá)。將噬菌體結(jié)合性異源K2S蛋白藉由單克隆抗-kringle2抗體(16/B)，利用綿羊抗-tPA結(jié)合性HRP抗體檢測(cè)系統(tǒng)辨識(shí)之。此分析的吸光值為1.12±0.03(表1)。于1012個(gè)噬菌體顆粒上可測(cè)得的K2S量相等于標(biāo)準(zhǔn)黑色素瘤tPA的蛋白336ng。為要證實(shí)K2S-gp3融合蛋白是連接于噬菌體顆粒，故以綿羊抗-M13抗體結(jié)合性HRP取代綿羊抗-tPA結(jié)合性HRP抗體。此免疫反應(yīng)顯示的吸光值為1.89±0.07(表1)。反之，倘若捕捉抗體為綿羊抗-M13抗體，則用綿羊抗-tPA抗體結(jié)合性HRP觀察到極低的K2S；其吸光值僅為0.17±0.01(表1)。此暗示僅有少量的經(jīng)純化噬菌體顆粒攜有K2S-gp3融合蛋白。使用自非轉(zhuǎn)化性大腸埃希氏菌Xl-1Blue所制備的VCSM13作為陰性對(duì)照。MpComb3H-K2S的構(gòu)筑。吾人以突變引物(MSTPA和MASTPA)輔助，于pComb3H-K2S內(nèi)的K2S與gp3間產(chǎn)生終止密碼子(圖4)。為要增加新合成及突變的MpComb3H-K2S，故將循環(huán)擴(kuò)增混合物以DpnI完全水解以降解舊dam甲基化的pComb3H-K2S模板(DpnI較喜好dam甲基化DNA)。以pComb3H-K2S轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌XL-1Blue后，篩選出XM[K2S]轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步研究。bp取代的結(jié)果，有一接近K2S基因的3′端的SfiI切割位點(diǎn)于定點(diǎn)誘變后喪失。以SfiI切割的線形MpComb3H-K2S經(jīng)觀察其于4319bp處并無(wú)嵌入的K2S基因片段出現(xiàn)(圖5，第3泳道)。因此，由MpComb3H-K2S編碼的K2S基因于大腸埃希氏菌XM[K2S]內(nèi)表達(dá)成非-gp3融合形式。K2S的表達(dá)及純化。K2S于大腸埃希氏菌XM[K2S]內(nèi)的表達(dá)是由IPTG誘發(fā)。利用ELISA可于壁膜間隙及培養(yǎng)液內(nèi)檢測(cè)r-K2S。藉由三明治ELISA測(cè)定各個(gè)制品中的異源性蛋白量及與標(biāo)準(zhǔn)tPA的關(guān)系。由O.D.[600nm]為50的100毫升的振蕩三角瓶培養(yǎng)菌液中，其周質(zhì)級(jí)分產(chǎn)出1.38微克的r-K2S(約為32％)，然而2.96微克的r-K2S(約為68％)可得于經(jīng)銨沉淀的培養(yǎng)上清液中。使用三明治ELISA確認(rèn)得自經(jīng)VCSM13感染的大腸埃希氏菌XM[K2S]的經(jīng)PEG沉淀的噬菌體。以抗-M13結(jié)合性HRP并未測(cè)得由單克隆抗-kringle2抗體捕捉的r-K2S，此表示倘若gp3遺失，則K2S不會(huì)存在于噬菌體顆粒上。酰胺水解活性分析。倘若絲氨酸蛋白酶功能域存在于樣品中，則纖溶酶原可轉(zhuǎn)換成纖溶酶。所產(chǎn)的纖溶酶可進(jìn)一步水解S-2251底物而產(chǎn)生有色產(chǎn)物，對(duì)-硝基苯胺，其于405nm處有最大的吸光值。重組產(chǎn)物的比活性與吸光值有一致性。評(píng)估并比較各個(gè)樣品，即K2S-，周質(zhì)r-K2S或培養(yǎng)上清液r-K2S的纖維蛋白原依賴性酶活性。K2S-及周質(zhì)r-K2S二者均顯示特別低的酶活性，其低于測(cè)試的敏感度(0.25IU/毫升)。培養(yǎng)上清液的r-K2S具有7IU/毫升的纖維蛋白原依賴性酶活性。所以，自100毫升培養(yǎng)基中可獲得共700IU的酶活性。若無(wú)纖維蛋白原，則無(wú)法觀察到由培養(yǎng)上清液純化的r-K2S的酶活性，然而，標(biāo)準(zhǔn)黑色素瘤tPA可顯示出一些活性。藉由免疫轉(zhuǎn)印證實(shí)重組蛋白。得自大腸埃希氏菌XM[K2S]的培養(yǎng)上清液的部分純化r-K2S以綿羊抗-tPA抗體測(cè)得的分子量為39kDa(圖6)。陰性對(duì)照組，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌XL-1Blue的部分純化培養(yǎng)上清液于相似大小處并無(wú)反應(yīng)帶。藉由PAGE對(duì)活性酶定位。于電泳前，先將纖溶酶原與明膠共同聚合并固定于聚丙烯酰胺凝膠中。分析大腸埃希氏菌XL-1Blue，經(jīng)pComb3HSS轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌XL-1Blue及大腸埃希氏菌XM[K2S]的經(jīng)硫酸胺沉淀后的培養(yǎng)上清液(圖7)。將所有樣品于非還原條件下處理以保留絲氨酸蛋白酶的正確構(gòu)象和活性。僅可于大腸埃希氏菌XM[K2S]的經(jīng)硫酸胺沉淀之的培養(yǎng)上清液中在34kDa及37kDa處看到經(jīng)絲氨酸蛋白酶水解的纖溶酶原透明區(qū)域。其它樣品均無(wú)透明區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)黑色素瘤tPA的陽(yáng)性對(duì)照泳道亦于66kDa及72kDa位置處顯示出酶活性。參考文獻(xiàn)1.Allen，S.，H.Y.Naim，andN.J.Bulleid.1995.Intracellularfoldingoftissue-typeplasminogenactivator.EffectsofdisulfidebondformationonN-linkedglycosylationandsecretion.J.Biol.Chem，2704797-4804.2.Ames，G.F.，C.Prody，andS.Kustu.1984.Simple，rapid，andquantitativereleaseofperiplasmicproteinsbychloroform.J.Bacteriol.1601181-1183.3.Barbas，c.F.III，A.S.Kang，R.A.Lemer，andS.J.Benkovic.1991.AssemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurfacesthegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.887978-7982.4.Barbas，C.F.III，amdJ.Wagner.1995.Synthetichumanantibodiesselectingandevolvingfunctionalproteins.ACompaniontoMethodsinEnzymologyu894-103.5.Bennett，W.F.，N.F.Paoni，B.A.Keyt，D.Botstein，A.J.Jones，L.Presta，F(xiàn).M.Wurn，andM.J.Zoller，1991.Highresolutionanalysisoffunctionaldeterminantsonhumantissue-typeplasminogenactivator.JBiolChem.2665191-5201.6.Betton，J.M.，N.Sassoon，M.Hofnung，andM.Laurent.1998.Degradationversusaggregationofmisfoldedmaltose-bindingproteinintheperiplasmofEscherichiacoli.J.Biol.Chem.2738897-8902.7.Camiolo，S.M.，S.Thorsen，andT.Astrup.1971.Fibrinogenolysisandfibrinolysiswithtissueplasminogenactivator，urokinase，streptokinase-activatedhumanglobulinandplasmin.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.38277-280.8.Cartwright，T.1992.Productionoft-PAfromanimalcellculture，p.217-245.InR.E.Spier，andJ.B.Griffiths(ed.)，AnimalCellBiotechmology，Vol5.AcademicPress，N.Y.9.Curry，K.A.，A.w.Yem，M.R.Deibel，Jr.，N.T.Hatzenbuhler，J.G.Hoogerheide，andC.S.Tomich.1990.Escherichiacoliexpressionandprocessingofhumaninterleukin-1betafusedtosignalpeptides.DNACellBiol.9167-175.10.Datar，R.V.，T.Cartwright，anC.-G.Rosen.1993.Processeconomicsofanimalcellandbacterialfermentationsacasestudyanalysisoftissueplasminogenactivator，Biotechnology11349-357.11.Denefle，P.，S.Kovarik，T.Ciora，N.Gosselet，J.C.Benichou，M.Latta，F(xiàn).Guinet，A.Ryter，andJ.F.Mayaux.1989.HeterologousproteinexportinEscherichiacoliinfluenceofbacterialsignalpeptidesontheexportofhumaninterleukin1beta.Gene85499-510.12.Griffiths，J.B.，A.Electricwala.1987.Productionoftissueplasminogenactivatorsfromanimalcells.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.34147-166.13.Harris，T.J.，T.Patel，F(xiàn).A.Marston，S.Little，J.S.Emtage，G.Opdenakker，G.Volckaert，W.Rombauts，A.Billiau，andP.DeSomer.1986.CloningofcDNAcodingforhumantissue-typeplasminogenactivatoranditsexpressioninEscherichiacoli.Mol.Biol.Med.3279-292.14.Heussen，C.，andE.B.Dowdle.1980.Electrophoreticanalysisofplasminogenactivatorsinpolyacrylamidegelscontainingsodiumdodecylsulfateandcopolymerizedsubstrates.Anal.Biochem.102196-202.15.Heussen，C.，F(xiàn).Joubert，andE.B.Dowdle.1984.PurificationofhumantissueplasminogenactivatorwithErvthrinatrypsininhibitor.J.Biol.Chem.25911635-11638.16.Hu，C.K.，U.Kohnert，O.Wilhelm，S.Fischer，andM.Llinas.1994.Tissue-typeplasminogenactivatordomain-deletionmutaneBM06.022modularstability，ibhibitorbinding，andactivationcleavage.Biochemistry3311760-11766.17.Kipriyanov，S.M.，G.Moldenhauer，andM.Little.1997.Highlevelproductionofsolublesinglechainantibodiesinsmall-scaleEscherichiacolicultures.J.Immunol.Methods20069-77.18.Ko，J.H.，D.K.Park，I.C.Kim，S.H.Lee，andS.M.Byun.1995.High-levelexpressionandsecretionofstreptokinaseinEschefichiacoli.Biotechnol.Lett.171019-1024.19.Kouzuma，Y.，N.Yamasaki，andM.Kimura.1997.Thetissue-typeplasminogenactivatorinhibitorETIafromBrythrinavarigeatastructuralbasisfortheinhibitoryactivitybycloning，expression，andmutagenesisofthecDNAencodingETla.J.Biochem.(Tolyo)121456-463.20.Lasters，I.，N.VanHerzeele，H.R.Lijnen，D.Collen，andL.Jespers.1997.Enzymaticpropertiesofphage-displayedfragmentsofhumanplasminogen.Eur.J.Biochem.244946-952.21.Lobel，L.I.，P.Rausch，I.Trakht，S.Pollak，andJ.W.Lustbader.1997.FilamentousphagedisplayingtheextracellulardomainofthehLH/CGreceptorbindhCGspecifically.Endocrinologye1381232-1239.22.Lubiniecki，A.，R.Arathoon，G.Polastri，J.Thomas，M.Wiebe，R.Gamick，A.Jones，R.vanReis，andS.Builder.Selectedstrategiesformanufactureandcontrolofrecombinanttissueplasminogenactivatorpreparedfromcellculture，p.442-451.InR.E.Spier，J.B.Griffiths，J.Stephenne，andP.J.Crooy(ed.)，Advancesinanimalcellbiologyandtechnologyforbioprocesses.Butterworths，London.23.Lucic，M.R.，B.E.Forbes，S.E.Grosvenor，J.M.Carr，J.C.Wallace，andG.Forsberg.1998.SecretioninEscherichiacoliandphage-displayofrecombinantinsulin-likegrowthfactorbindingprotein-2.J.Biotechnol.6195-108.24.Martin，U.，S.Fischer，U.Kohnert，H.Lill，R.Rudolph，G.Sponer，A.Stem，andK.Strein.1990.Propertiesofanovelplasminogenactivator(BM06.022)producedinEscherichiacoli.Z.Kardiol.79167-170.25.Obukowicz，M.G.，M.E.Gustafson，K.D.Junger，R.M.Leimgruber，A.J.Wittwer，T.C.Wun，T.G.Warren，B.F.Bishop，K.J.Mathis，D.T.McPherson，N.R.Siegel，M.G.Jenning，B.B.Brightwell，J.A.Diaz-Cllier，L.D.Bell，C.S.Craik，andW.C.Tacon.1990.Secretionofactivekringle-2-serineproteaseinEscherichiacoli.Biochemistry299737-9745.26.Parmley，S.F.，andG.P.Smith.1988.Antibody-selectablefilamentousfdphagevectorsaffinitypurificationoftargetgenes.Gene73305-318.27.Pennica，D.，W.E.Holmes，w.J.Kohr，R.N.Harkins，G.A.Vehar，C.A.Ward，W.F.Bennett，E.Yelverton，P.H.Seeburg，H.I.Heyneker，D.V.Goeddel，a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gggcctgggcaaacataattac240tgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctg300acgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccag360cctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggct420gccatctttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactc480atcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccac540cacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaa600tttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgac660attgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtc720cgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctc780tccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcggagcggctgaaggaggct840catgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtc900accgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcac960gacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgact1020ttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtac1080acaaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccg1128<210>3<211>66<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichiacoli)<400>3atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtggcccag60gcggcc66<210>4<211>1065<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S蛋白的編碼序列<400>4tctgagggaaacagtgactgctactttgggaatgggtcagcctaccgtggcacgcacagc60ctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggcaaggtt120tacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattactgccgg180aatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctgacgtgg240gagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccagcctcag300tttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggctgccatc360tttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactcatcagc420tcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccaccacctg480acggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaatttgaa540gtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgacattgcg600ctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtccgcact660gtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctctccggc720tacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcggagcggctgaaggaggctcatgtc780agactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtcaccgac840aacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcacgacgcc900tgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgactttggtg960ggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtacacaaag1020gttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccgtga1065<210>5<211>1128<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述OmpA-K2S融合蛋白的編碼序列<400>5atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtggcccag60gcggcctctgagggaaacagtgactgctactttgggaatgggtcagcctaccgtggcacg120cacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggc180aaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattac240tgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctg300acgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccag360cctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggct420gccatctttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactc480atcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccac540cacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaa600tttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgac660attgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtc720cgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctc780tccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcggagcggctgaaggaggct840catgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtc900accgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcac960gacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgact1020ttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtac1080acaaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccg1128<210>6<211>66<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichiacoli)<400>6atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtggcccag60gcggcc66<210>7<211>1065<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S蛋白的編碼序列<400>7tctgagggaaacagtgactgctactttgggaatgggtcagcctaccgtggcacgcacagc60ctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggcaaggtt120tacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattactgccgg180aatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctgacgtgg240gagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccagcctcag300tttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggctgccatc360tttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactcatcagc420tcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccaccacctg480acggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaatttgaa540gtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgacattgcg600ctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtccgcact660gtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctctccggc720tacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcggagcggctgaaggaggctcatgtc780agactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtcaccgac840aacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcacgacgcc900tgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgactttggtg960ggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtacacaaag1020gttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccgtga1065<210>8<211>377<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述OmpA-K2S融合蛋白<400>8MetLysLysThrAlaIleAlaIleAlaValAlaLeuAlaGlyPheAla151015ThrValAlaGlnAlaAlaSerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGly202530AsnGlySerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAla354045SerCysLeuProTrpAsnSerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThr505560AlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyr65707580CysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisValLeuLys859095AsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThr100105110CysGlyLeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGly115120125LeuPheAlaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAla130135140LysHisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlyIleLeu145150155160IleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArg165170175PheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgVal180185190ValProGlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleVal195200205HisLysGluPheAspAspAspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeu210215220GlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAlaGlnGluSerSerValVal225230235240ArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAspTrpThr245250255GluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPhe260265270TyrSerGluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSer275280285ArgCysThrSerGlnHisLeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMet290295300LeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHis305310315320AspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeuAsnAsp325330335GlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGly340345350GlnLysAspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAsp355360365TrpIleArgAspAsnMetArgProGly370375<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述肽序列<400>9SerGluGlyAsn1<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述肽序列<400>10SerGluGlyAsnSerAsp15<210>11<211>354<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S174-527<400>11SerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGlySerAlaTyrArg151015GlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsn202530SerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAla354045GlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGly505560AspAlaLysProTrpCysHisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrp65707580GluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGlyLeuArgGlnTyr859095SerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAla100105110SerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerPro115120125GlyGluArgPheLeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIle130135140LeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeu145150155160ThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValProGlyGluGluGlu165170175GlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAsp180185190AspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSer195200205SerArgCysAlaGlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuPro210215220ProAlaAspLeuGlnLeuProAspTrpThrGluCysGluLeuSerGly225230235240TyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSerGluArgLeuLys245250255GluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHis260265270LeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThr275280285ArgSerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAsp290295300SerGlyGlyProLeuValCysLeuAsnAspGlyArgMetThrLeuVal305310315320GlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLysAspValProGly325330335ValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMet340345350ArgPro<210>12<211>331<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S197-527<400>12SerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsnSerMetIleLeuIleGlyLys151015ValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLys202530HisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHis354045ValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSer505560CysSerThrCysGlyLeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIle65707580LysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAla859095IlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCysGly100105110GlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPhe115120125GlnGluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThr130135140TyrArgValValProGlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLys145150155160TyrIleValHisLysGluPheAspAspAspThrTyrAspAsnAspIle165170175AlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAlaGlnGluSer180185190SerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuPro195200205AspTrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeu210215220SerProPheTyrSerGluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyr225230235240ProSerSerArgCysThrSerGlnHisLeuLeuAsnArgThrValThr245250255AspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGlyProGlnAla260265270AsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCys275280285LeuAsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeu290295300GlyCysGlyGlnLysAspValProGlyValTyrThrLysValThrAsn305310315320TyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMetArgPro325330<210>13<211>339<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S193-527，已經(jīng)修飾<400>13SerGluGlyAsnSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrp151015AsnSerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSer202530AlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAsp354045GlyAspAlaLysProTrpCysHisValLeuLysAsnArgArgLeuThr505560TrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGlyLeuArgGln65707580TyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIle859095AlaSerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSer100105110ProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrp115120125IleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHisHis130135140LeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValProGlyGluGlu145150155160GluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAsp165170175AspAspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAsp180185190SerSerArgCysAlaGlnGluSerSerValValArgThrValCysLeu195200205ProProAlaAspLeuGlnLeuProAspTrpThrGluCysGluLeuSer210215220GlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSerGluArgLeu225230235240LysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGln245250255HisLeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAsp260265270ThrArgSerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGly275280285AspSerGlyGlyProLeuValCysLeuAsnAspGlyArgMetThrLeu290295300ValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLysAspValPro305310315320GlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsn325330335MetArgPro<210>14<211>335<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S193-527，已經(jīng)修飾<400>14SerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsnSerMetIle151015LeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeu202530GlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLys354045ProTrpCysHisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCys505560AspValProSerSerSerThrCysGlyLeuArgGlnTyrSerGlnPro65707580GlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAlaSerHisPro859095TrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArg100105110PheLeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAla115120125AlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeuThrValIle130135140LeuGlyArgThrTyrArgValValProGlyGluGluGluGlnLysPhe145150155160GluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAspAspThrTyr165170175AspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCys180185190AlaGlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAsp195200205LeuGlnLeuProAspTrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLys210215220HisGluAlaLeuSerProPheTyrSerGluArgLeuLysGluAlaHis225230235240ValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHisLeuLeuAsn245250255ArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGly260265270GlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGly275280285ProLeuValCysLeuAsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIle290295300SerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLysAspValProGlyValTyrThr305310315320LysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMetArgPro325330335<210>15<211>343<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S191-527，已經(jīng)修飾<400>15SerGluGlyAsnSerAspThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSer151015CysLeuProTrpAsnSerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAla202530GlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCys354045ArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisValLeuLysAsn505560ArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCys65707580GlyLeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeu859095PheAlaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLys100105110HisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlyIleLeuIle115120125SerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPhe130135140ProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValVal145150155160ProGlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHis165170175LysGluPheAspAspAspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGln180185190LeuLysSerAspSerSerArgCysAlaGlnGluSerSerValValArg195200205ThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAspTrpThrGlu210215220CysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyr225230235240SerGluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArg245250255CysThrSerGlnHisLeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeu260265270CysAlaGlyAspThrArgSerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAsp275280285AlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeuAsnAspGly290295300ArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGln305310315320LysAspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrp325330335IleArgAspAsnMetArgPro340<210>16<211>343<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S191-527，已經(jīng)修飾<400>16SerGluGlyAsnSerAspThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSer151015CysLeuProTrpAsnSerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAla202530GlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCys354045ArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisValLeuLysAsn505560ArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerSerSerThrCys65707580GlyLeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeu859095PheAlaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLys100105110HisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlyIleLeuIle115120125SerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPhe130135140ProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValVal145150155160ProGlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHis165170175LysGluPheAspAspAspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGln180185190LeuLysSerAspSerSerArgCysAlaGlnGluSerSerValValArg195200205ThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAspTrpThrGlu210215220CysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyr225230235240SerGluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArg245250255CysThrSerGlnHisLeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeu260265270CysAlaGlyAspThrArgSerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAsp275280285AlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeuAsnAspGly290295300ArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyG1n305310315320LysAspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrp325330335IleArgAspAsnMetArgPro340<210>17<211>308<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S220-527<400>17SerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnPro151015AspGlyAspAlaLysProTrpCysHisValLeuLysAsnArgArgLeu202530ThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGlyLeuArg354045GlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAsp505560IleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArg65707580SerProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCys859095TrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHis100105110HisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValProGlyGlu115120125GluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPhe130135140AspAspAspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSer145150155160AspSerSerArgCysAlaGlnGluSerSerValValArgThrValCys165170175LeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAspTrpThrGluCysGluLeu180185190SerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSerGluArg195200205LeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSer210215220GlnHisLeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGly225230235240AspThrArgSerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGln245250255GlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeuAsnAspGlyArgMetThr260265270LeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLysAspVal275280285ProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAsp290295300AsnMetArgPro305<210>18<211>268<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述K2S260-527<400>18SerCysSerThrCysGlyLeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArg151015IleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAla202530AlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCys354045GlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCys505560PheGlnGluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArg65707580ThrTyrArgValValProGlyGluGluGluGlnLysPheGluValGlu859095LysTyrIleValHisLysGluPheAspAspAspThrTyrAspAsnAsp100105110IleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAlaGlnGlu115120125SerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeu130135140ProAspTrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAla145150155160LeuSerProPheTyrSerGluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeu165170175TyrProSerSerArgCysThrSerGlnHisLeuLeuAsnArgThrVal180185190ThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGlyProGln195200205AlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuVal210215220CysLeuAsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGly225230235240LeuGlyCysGlyGlnLysAspValProGlyValTyrThrLysValThr245250255AsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMetArgPro260265<210>19<211>527<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>19SerTyrGlnValIleCysArgAspGluLysThrGlnMetIleTyrGln151015GlnHisGlnSerTrpLeuArgProValLeuArgSerAsnArgValGlu202530TyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHisSerValProVal354045LysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGln505560AlaLeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAla65707580GlyLysCysCysGluIleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGln859095GlyIleSerTyrArgGlyThrTrpSerThrAlaGluSerGlyAlaGlu100105110CysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLysProTyrSerGly115120125ArgArgProAspAlaIleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCys130135140ArgAsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAla145150155160GlyLysTyrSerSerGluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGly165170175AsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGlySerAlaTyrArgGlyThrHis180185190SerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsnSerMetIle195200205LeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeu210215220GlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLys225230235240ProTrpCysHisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCys245250255AspValProSerCysSerThrCysGlyLeuArgGlnTyrSerGlnPro260265270GlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAlaSerHisPro275280285TrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArg290295300PheLeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAla305310315320AlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeuThrValIle325330335LeuGlyArgThrTyrArgValValProGlyGluGluGluGlnLysPhe340345350GluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAspAspThrTyr355360365AspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCys370375380AlaGlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAsp385390395400LeuGlnLeuProAspTrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLys405410415HisGluAlaLeuSerProPheTyrSerGluArgLeuLysGluAlaHis420425430ValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHisLeuLeuAsn435440445ArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGly450455460GlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGly465470475480ProLeuValCysLeuAsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIle485490495SerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLysAspValProGlyValTyrThr500505510LysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMetArgPro515520525<210>20<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述SEGN的編碼序列<400>20tctgagggaaac12<210>21<211>22<212>PRT<213>Escherichiacoli<400>21MetLysLysThrAlaIleAlaIleAlaValAlaLeuAlaGlyPheAla151015ThrValAlaGlnAlaAla20<210>22<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>22gaggaggaggtggcccaggcggcctctgagggaaacagtgac42<210>23<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>23gaggaggagctggccggcctggcccggtcgcatgttgtcacg42<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>24acatgcgaccgtgacaggccggccag26<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>25ctggccggcctgtcacggtcgcatgt2權(quán)利要求1.在原核細(xì)胞中制備重組DNA-衍生的組織纖溶酶原激活物(tPA)、tPA變體、Kringle2絲氨酸蛋白酶分子(K2S)或K2S變體的方法，其中所述tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體是呈有活性的及正確折疊的蛋白形式分泌至細(xì)胞外，其特征為所述原核細(xì)胞含有并可表達(dá)一種載體，該載體包含與編碼信號(hào)肽OmpA或其功能性衍生物的DNA可操作連接的編碼所述tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA。2.權(quán)利要求1的方法，其特征為所述原核細(xì)胞包含并可表達(dá)一種載體，該載體包含編碼所述tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA，該DNA可操作連接于編碼信號(hào)肽OmpA的DNA，后一種DNA可操作連接于由序列TCTGAGGGAAACAGTGAC(SEQIDNO1)限定的核酸分子或其功能性衍生物。3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征為所述原核細(xì)胞是大腸埃希氏菌。4.權(quán)利要求1-3之一的方法，其特征為實(shí)施下列步驟a)藉由PCR擴(kuò)增編碼所述tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA；b)純化PCR產(chǎn)物；c)將所述PCR產(chǎn)物嵌入含有編碼OmpA信號(hào)肽的DNA及編碼gpIII的DNA的載體內(nèi)，在所述載體中使所述PCR產(chǎn)物上游可操作連接于編碼OmpA信號(hào)肽的DNA，下游連接于編碼gpIII的DNA；d)于所述tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體與gpIII之間嵌入終止密碼子；e)藉由原核細(xì)胞表達(dá)所述載體；f)純化所述tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體。5.權(quán)利要求1-4之一的方法，其特征為所述載體是為噬菌粒，其包含編碼OmpA信號(hào)肽的DNA及編碼gpIII的DNA。6.權(quán)利要求1-5之一的方法，其特征為所述載體是pComb3HSS噬菌粒。7.權(quán)利要求1-6之一的方法，其特征為連接于K2S上游的OmpA的DNA序列包含下列序列或其功能性變體或由于簡(jiǎn)并核苷酸密碼所致的變體ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQIDNO2)8.權(quán)利要求1-7之一的方法，其特征為所述OmpA的DNA序列包含下列序列ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQIDNO3)。9.權(quán)利要求1-8之一的方法，其特征為所述OmpA的DNA序列是由下列序列所組成ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQIDNO3)。10.權(quán)利要求1-9之一的方法，其特征為所述tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA是位于lac啟動(dòng)子和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)之后。11.權(quán)利要求1-10之一的方法，其特征為編碼所述tPA、tPA變體、K2S分子或K2S變體的DNA選自編碼下列的DNA分子人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸87-527，174-527，180-527或220-527的至少90％。12.權(quán)利要求5-11之一的方法，其特征為K2S的DNA序列包含下列序列或其功能性變體或由于簡(jiǎn)并核苷酸密碼所致的變體TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA(SEQIDNO4)13.權(quán)利要求5-12之一的方法，其特征為K2S的DNA序列由下列序列組成TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA(SEQIDNO4)14.一種DNA分子，其編碼a)OmpA蛋白或其功能性衍生物，它可操作連接于b)編碼含有組織纖溶酶原激活物蛋白的kringle2功能域及絲氨酸蛋白酶功能域的多肽的DNA分子。15.權(quán)利要求14的DNA分子，其特征為所述DNA序列包含下列序列或其功能性變體或由于簡(jiǎn)并核苷酸密碼所致的變體ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQIDNO5)16.權(quán)利要求14或15的DNA分子，其特征為所述DNA序列是由下列序列所組成ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQIDNO5)17.權(quán)利要求14-16之一的DNA分子，其特征為所述DNA序列b)編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸87-527的至少90％。18.權(quán)利要求14-17之一的DNA分子，其特征為所述DNA序列b)編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸174-527的至少90％。19.權(quán)利要求14-18之一的DNA分子，其特征為所述DNA序列b)編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸180-527的至少90％。20.權(quán)利要求14-19之一的DNA分子，其特征為所述DNA序列b)編碼人類組織纖溶酶原激活物蛋白的氨基酸220-527的至少90％。21.權(quán)利要求14-20之一的DNA分子，其特征為所述DNA序列a)于嚴(yán)謹(jǐn)條件下與下列序列雜交ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQIDNO6)。22.權(quán)利要求14-21之一的DNA分子，其特征為所述DNA序列a)是由下列序列所組成ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQIDNO6)。23.權(quán)利要求14-22之一的DNA分子，其特征為所述DNA序列b)于嚴(yán)謹(jǐn)條件下與下列序列雜交TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA(SEQIDNO7)24.權(quán)利要求14-23之一的DNA分子，其特征為所述DNA序列b)是由下列序列所組成TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA(SEQIDNO7)25.OmpA與K2S的融合蛋白，其含有以下列氨基酸序列或其片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物或糖基化變體為特征的蛋白MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYTVHKEFDDDTYDNDLALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRPG(SEQIDNO8)26.權(quán)利要求25的OmpA與K2S的融合蛋白，其由以下列氨基酸序列為特征的蛋白所組成MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSWRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRPG(SEQIDNO8)27.一種K2S蛋白，其特征為其含有由序列SEGN(SEQIDNO9)限定的蛋白和/或其變體或片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物、融合蛋白或糖基化變體。28.權(quán)利要求27的K2S蛋白，其特征為其包含由序列SEGNSD(SEQIDNO10)限定的蛋白和/或其變體或片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物、融合蛋白或糖基化變體。29.權(quán)利要求27或28的K2S蛋白，其特征為其包含以下列氨基酸序列或其片段、功能性變體、等位變體、亞單位、化學(xué)衍生物或糖基化變體為特征的蛋白SEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP*(SEQIDNO11)30.權(quán)利要求27-30之一的K2S蛋白，其特征為其是由以下列氨基酸序列為特征的蛋白所組成SEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP*(SEQIDNO11)31.一種載體，其含有權(quán)利要求14至24任一項(xiàng)的DNA序列。32.權(quán)利要求31的載體，其中所述DNA序列是位于lac啟動(dòng)子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)之后。33.含有權(quán)利要求14至24任一項(xiàng)的DNA的載體pComb3HSS，其中所述gpIII蛋白的表達(dá)是藉由刪除編碼所述gpIII蛋白的DNA或藉由在編碼下述多肽的基因與編碼蛋白III的基因間的終止密碼子而受壓制或抑制，所述多肽含人類組織纖溶酶原激活物蛋白的kringle2功能域及絲氨酸蛋白酶功能域。34.一種原核宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求14至24任一項(xiàng)的DNA分子。35.一種原核宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求31至33任一項(xiàng)的載體。36.一種大腸埃希氏菌宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求14至24任一項(xiàng)的DNA分子。37.一種大腸埃希氏菌宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求31至33任一項(xiàng)的載體。38.一種用途，其為權(quán)利要求14-24之一的DNA分子，權(quán)利要求31-33任一項(xiàng)的載體，權(quán)利要求34-37任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，在制備具有組織纖溶酶原激活物活性的多肽的方法中的用途。39.權(quán)利要求38的用途，其中所述方法為權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的方法。全文摘要本發(fā)明是屬于血栓溶解及于原核細(xì)胞中制備組織纖溶酶原激活物(tPA)衍生物的領(lǐng)域。本發(fā)明是關(guān)于用以于原核細(xì)胞中制備重組DNA－衍生tPA、其變體或(Kringle2絲氨酸)K2S分子或其變體的方法，其中所述tPA或K2S或變體是呈有活性的及正確折疊的形式分泌至細(xì)胞外，且所述原核細(xì)胞含有并可表達(dá)一種載體，其包含編碼所述tPA或K2S或變體的DNA可操作連接于編碼信號(hào)肽OmpA的DNA上。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于可藉由所述方法取得的特定K2S衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步是關(guān)于所述DNA分子及使用所述DNA分子于所述方法中。文檔編號(hào)C07K19/00GK1541271SQ01818898公開日2004年10月27日申請(qǐng)日期2001年11月7日優(yōu)先權(quán)日2000年11月14日發(fā)明者羅爾夫-岡瑟·沃納,羅爾夫-岡瑟沃納,弗里德里克·戈茨,里克戈茨,塔亞皮瓦塔納,查特蔡·塔亞皮瓦塔納,吉拉德杰·馬諾斯羅伊,杰馬諾斯羅伊,馬諾斯羅伊,阿蘭亞·馬諾斯羅伊申請(qǐng)人:貝林格爾·英格海姆國(guó)際有限公司,貝林格爾英格海姆國(guó)際有限公司