專利名稱：在綠色植物中高水平地生產(chǎn)對羥基苯甲酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因表達以及分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，提供一種依賴于獨特表達盒表達、用于在綠色植物中生產(chǎn)對羥基苯甲酸(pHBA)的方法，所述獨特表達盒包含與特定葉綠體靶向序列有效連接的編碼分支酸丙酮酸裂合酶的基因。
背景技術(shù)：
對羥基苯甲酸(pHBA)是一種液晶高分子(LCP)-ZeniteTM的主要單體成分(～65％(重量))。LCP具有優(yōu)于常規(guī)樹脂的特性，例如高強度/堅硬、低熔點粘度、優(yōu)良的環(huán)境抗性、較高溫度下特性的保持以及低透氣性。然而，目前用于合成pHBA的合成方法(Kolbe-Schmitt反應(yīng)(Kolbe和Lautemann，Ann.113125(1869))的成本過高，合成LCP單體的便宜途徑將開發(fā)將其用于汽車工業(yè)、電子工業(yè)和其它工業(yè)的許多新應(yīng)用。生物學(xué)生產(chǎn)提供了一種生產(chǎn)pHBA的不太昂貴途徑的潛力。
已經(jīng)在微生物系統(tǒng)中生產(chǎn)了pHBA。例如，JP 06078780公開了通過在將苯甲酸氧化為pHBA的微生物(最好是曲霉屬(Aspergillus))存在下培養(yǎng)苯甲酸來制備pHBA。另外，已經(jīng)從土壤中分離出能夠?qū)追愚D(zhuǎn)化為pHBA的腸桿菌屬(Enterobacter)菌株(JP 05328981)。此外JP05336980和JP 05336979公開了能夠從對甲酚生產(chǎn)pHBA的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的分離株。同樣，共同擁有的WO 9856920公開了采用不能表達對羥基苯甲酸羥化酶(pHBH)的門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)突變體從甲苯生產(chǎn)pHBA的方法。最后，U.S.6030819公開了在表達分支酸丙酮酸裂合酶(CPL)基因的基因工程大腸桿菌(E.coli)中生產(chǎn)pHBA。
盡管取得了這些成功，但在微生物平臺上生產(chǎn)商業(yè)上有用量的pHBA的能力卻由于應(yīng)用毒性原料和有限的生物量而受到阻礙。需要解決這些問題的用于pHBA生產(chǎn)的方法。
巧合的是，pHBA天然存在于幾乎所有植物、動物和微生物中，盡管是微量的。在許多細菌中，pHBA的產(chǎn)生通過分支酸途徑產(chǎn)生，分支酸是包括苯丙氨酸、酪氨酸、對氨基苯甲酸和泛醌在內(nèi)的許多芳族化合物合成的重要分支點中間體。在大腸桿菌中，分支酸本身經(jīng)歷5個不同的酶促反應(yīng)，產(chǎn)生5種不同的產(chǎn)物，最終負責(zé)pHBA合成的酶是分支酸丙酮酸裂合酶，稱為CPL。后者是大腸桿菌ubiC基因的產(chǎn)物，該基因由兩個不同的研究小組獨立地克隆(Siebert等，F(xiàn)EBS Lett307347-350(1992)；Nichlols等，J.Bacteriol 1745309-5316(1992))。該酶是一種19kDa單體蛋白，不需要已知的輔因子或能量。CPL通過消除其唯一底物的C3烯醇丙酮?；鶄?cè)鏈，催化1mol分支酸直接轉(zhuǎn)化為1mol丙酮酸和1mol pHBA。已經(jīng)在大腸桿菌中過量表達了重組CPL，將其純化至均質(zhì)，并且在生物化學(xué)和動力學(xué)上得到部分表征(Siebert等，Microbiology 104897-904；Nichlols等，J.Bacteriol 1745309-5316(1992))。另外，也提出了關(guān)于CPL酶促反應(yīng)的詳細機制(Walsh等，ChemRev.901105-1129)。
在植物中，已經(jīng)在胡蘿卜組織中(Schnitzler等，Planta，188，594，(1992))、在許多牧草和作物中(Lydon等，J.Agric.Food.Chem.，36，813，(1988))、在楊樹的木質(zhì)素中(Terashima等，Phytochemistry，14，1991，(1972)；和在許多其它植物組織中(Billek等，Oesterr.Chem.，67，401，(1966))發(fā)現(xiàn)了pHBA。植物具有合成pHBA的全部必需酶機器的事實提示，它們可能是用于生產(chǎn)這種單體的有用平臺。例如，作為可再生的資源，植物平臺需要的能耗和材料消耗可能比石化方法或微生物方法低得多。同樣，植物平臺代表了一種比微生物系統(tǒng)大得多的可得到的單體生產(chǎn)生物量。最后，在植物中天然存在pHBA提示，由于過量生產(chǎn)該化合物的宿主毒性可能不成問題。然而，盡管用植物作為生產(chǎn)pHBA的工具有明顯的益處，但所述單體的高水平生產(chǎn)仍不明朗。
需要克服的一個困難在于植物組織中分支酸的代謝命運。事實上，從分支酸產(chǎn)生pHBA在高等植物中要比微生物復(fù)雜得多，因為前者缺乏與CPL功能等同的酶。例如，在紫草(Lithospermun erythrorhizon)中產(chǎn)生pHBA的生物合成途徑據(jù)認為是由多達10個連續(xù)反應(yīng)組成(Loscher和Heide，Plant Physiol.106271-279(1992))，推定全都由不同的酶催化。此外，催化這些反應(yīng)的大多數(shù)酶尚未鑒定出，也沒有克隆出其基因。甚至可得到的關(guān)于pHBA在其它植物種中如何合成的信息甚少。對于更為復(fù)雜的問題，已知參與植物pHBA產(chǎn)生的那些酶跨越兩個不同的途徑，它們受到差別調(diào)節(jié)并且位于不同細胞區(qū)室中。因此，分支酸是主要限于葉綠體和其它類型質(zhì)體的莽草酸途徑的中間體(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))；Sommer等，Plant CellPhysiol.39(11)1240-1244(1998))，而苯丙氨酸下游的所有中間體屬于在胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生的類苯丙酸(phenylpropanoid)途徑。
盡管對于植物正常情況下如何合成pHBA和參與該過程的酶缺乏了解，但比野生型植物積累顯著更高水平的pHBA的轉(zhuǎn)基因植物已有描述。例如，Kazufumi Yazaki，(Baiosaiensu to Indasutori(1998)，56(9)，621-622)論述了將CPL編碼基因?qū)霟煵葜?，以生產(chǎn)其量足以賦予抗蟲性的pHBA。同樣，Siebert等，(Plant Physiol.112811-819(1996))已經(jīng)證明，用組成型表達葉綠體靶向形式的大腸桿菌CPL(稱為“TP-UbiC)轉(zhuǎn)化的煙草植株(Nicotiana tabacum)的pHBA水平升高，比野生型植株高至少3個數(shù)量級(WO 96/00788，以DE 4423022授權(quán))。有趣的是，遺傳修飾的煙草植株僅含微量的游離pHBA。而實際上所有的所述化合物(～98％)被轉(zhuǎn)化為兩種葡萄糖綴合物-一種酚型葡糖苷和一種酯型葡糖苷，其存在比率約為3∶1(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996)；Li等，Plant Cell Physiol.38(7)844-850(1997))。這兩種葡萄糖綴合物是1-β-D-葡糖苷，具有一個與pHBA的羥基或羧基共價連接的單個葡萄糖殘基。當(dāng)分析葉組織時，在該項研究中鑒定的最佳轉(zhuǎn)基因植物的總pHBA葡糖苷含量約為0.52％(干重)。根據(jù)相關(guān)葡萄糖殘基校正，在轉(zhuǎn)基因煙草植物中產(chǎn)生的實際pHBA量僅約為該數(shù)值的一半。
在最近的研究中，用組成型啟動子(Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)1240-1244(1998))和誘導(dǎo)型啟動子(Sommer等，Plant Cell Reports17891-896(1998))在轉(zhuǎn)化煙草細胞培養(yǎng)物中表達了同一人工融合蛋白。盡管pHBA葡糖苷的積累比用全株的原始研究略高，在兩種情況下該水平都不超過0.7％(干重)。相反，當(dāng)在紫草的發(fā)根培養(yǎng)物中檢查TP-UbiC時(Sommer等，Plant Molecular Biology 39683-693(1999))，在根據(jù)未轉(zhuǎn)化對照培養(yǎng)物的內(nèi)源水平進行校正后，pHBA葡糖苷的含量達到高至0.8％(干重)的水平。
盡管這些研究證明了應(yīng)用基因工程提高高等植物中pHBA水平的可行性，但上述TP-UbiC人工融合蛋白不能產(chǎn)生商業(yè)上有用量的所述化合物。這種努力將需要將農(nóng)學(xué)上合適的植物的pHBA含量提高至先前報道的10-20倍的水平。因此，需要對目前的系統(tǒng)作出一種或多種修飾，以達到這些水平。由于CPL的底物分支酸在質(zhì)體中合成，因此一個可供改進的潛在方面可能在于設(shè)計更好的葉綠體靶向序列，以達到在感興趣的細胞區(qū)室中更高水平的酶活性。實際上，在上述幾項研究中，在CPL酶活性和pHBA葡糖苷積累之間顯然有正相關(guān)(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996)；Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)1240-1244(1998)；Sommer等，Plant Cell Reports 17891-896(1998))。此外，在這些研究中，沒有任何證據(jù)指示應(yīng)用TP-UbiC人工融合蛋白，將使所述系統(tǒng)的CPL酶活性飽和。
眾所周知，大多數(shù)天然存在的葉綠體蛋白是核編碼的，作為較大分子量的前體合成，具有一個稱為轉(zhuǎn)運肽的可切割的N末端多肽延伸。人們也普遍認為，轉(zhuǎn)運肽含有轉(zhuǎn)運到葉綠體所必需的所有信息。盡管蛋白輸入的機制細節(jié)仍有待闡明，但已經(jīng)出現(xiàn)幾個重要的事實(a)前體攝入在翻譯后發(fā)生(Chua和Schmidt，Proc Natl.Acad.Sci.756110-6114(1978)；Highfield和Ellis，Nature 271420-424(1978))，并且由葉綠體被膜中存在的蛋白性受體介導(dǎo)(Cline等，J.Biol.Chem.260369132696(1985))；(b)ATP水解是轉(zhuǎn)運的唯一驅(qū)動力(Grossman等，Nature 285625-628(1980)；Cline等，J.Biol.Chem.2603691-3696(1985))；(c)轉(zhuǎn)運肽與外源蛋白的融合有時(但不總是)在體內(nèi)(Van denBroeck等，Nature 313358-362(1985))；Schreier等，EMBO J.425-32(1985))和體外(Wasmann等，Mol.Gen.Genet.205446-453(1986))都足以觸發(fā)被攝入到葉綠體中；最后，(d)在葉綠體輸入后，轉(zhuǎn)運肽被蛋白水解而從前體蛋白除去，從而產(chǎn)生“成熟”多肽。盡管現(xiàn)在已知數(shù)千種轉(zhuǎn)運肽的完整序列，操作這些序列以達到外源蛋白的最佳靶向并且在植物葉綠體區(qū)室中表達，仍是反復(fù)試驗的主題。然而，已經(jīng)很好確立了，簡單地將轉(zhuǎn)運肽與外源蛋白連接不一定保證被葉綠體有效攝入或正確加工。甚至當(dāng)將同一靶向序列與不同蛋白融合時，結(jié)果完全是不可預(yù)測的(Lubben等，The Plant Cell 11223-1230(1989))，不同過客蛋白的轉(zhuǎn)運效率不同。其原因尚不清楚，然而已有提示，葉綠體攝入和的轉(zhuǎn)運肽的去除以某種方式偶聯(lián)，并且某些人工融合蛋白或者不被加工，或者加工效率低。例如，已經(jīng)表明，在Rubisco小亞基前體的天然切割位點附近甚至非常精細的改變也可以導(dǎo)致加工異常(Robinson和Ellis，Eur.J.Biochem.142342-346(1984)；Robinson和Ellis，Eur.J.Biochem.15267-73(1985))和葉綠體攝入減少(Wasmann等，J.Biol.Chem.263617-619(1988))。
通過在葉綠體靶向序列中不僅包括所述轉(zhuǎn)運肽和易裂的鍵，而且還包括所述轉(zhuǎn)運肽供體成熟N末端的一小部分，可以在該方面達到某種程度的改進。實際上，這種方法對于另一種細菌蛋白即新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPT-II)在體內(nèi)和體外都已經(jīng)起作用(Van den Broeck等，Nature 313358-362(1985)；Schreier等，EMBO J.425-32(1985)；Wasmann等，Mol.Gen.Genet.205446-453(1986)；Herrera-Estrella等，EP 0189707；U.S.5,728,925；U.S.5,717,084)。因此，由Rubisco小亞基前體的轉(zhuǎn)運肽加上與NPT-II N末端融合的成熟Rubisco的前22個殘基組成的嵌合蛋白被葉綠體的攝入比僅含所述轉(zhuǎn)運肽和易裂鍵的相似構(gòu)建體好得多。然而，這種策略并不十分簡單，并且仍與同過客蛋白的連接不可解脫的高度不可預(yù)測性相關(guān)。這在嘗試將CPL靶向葉綠體的文獻中最容易見到。例如，Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)1240-1244(1998)描述了一種類似的人工融合蛋白，所述融合蛋白包含在其N末端與轉(zhuǎn)運肽和Rubisco小亞基的前21個氨基酸殘基融合的CPL基因產(chǎn)物(例如“TP21UbiC”)。雖然預(yù)期這種修飾將改進葉綠體的攝入和加工，但含有原始構(gòu)建體TP-UbiC的細胞的CPL酶活性和pHBA葡糖苷的水平都高得多。因此，Wasmann等公開內(nèi)容(Mol.Gen Genet.205446-453(1986))的應(yīng)用對一種不同的蛋白具有有害效應(yīng)。
因此，有待解決的問題是提供一種利用細菌蛋白CPL催化的化學(xué)反應(yīng)在植物中以商業(yè)有用水平生產(chǎn)pHBA的方法。這是一個特別不凡的目標(biāo)，因為在上述所有復(fù)雜情況之上，從所述文獻中顯然可以看出大腸桿菌CPL的某些N末端修飾可能導(dǎo)致酶活性的相當(dāng)大的損失(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))。因此，不僅必需鑒定被有效輸入到葉綠體中的人工融合蛋白，而且所述融合蛋白也被蛋白酶加工產(chǎn)生未經(jīng)修飾的CPL或者具有不干擾酶活性的N末端延伸的CPL變異體?，F(xiàn)有技術(shù)未指出這一問題的解決方法。申請人通過構(gòu)建一種使得能夠在葉綠體中足夠高水平地表達CPL酶活性以積累商業(yè)有用水平的pHBA的新型人工融合蛋白，解決了所述的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種在綠色植物中生產(chǎn)pHBA的方法，所述方法包括a)提供一種綠色植物，所述綠色植物具有內(nèi)源分支酸源并且含有具有以下結(jié)構(gòu)的分支酸丙酮酸裂合酶表達盒P-T-C-D-CPL其中P為適合于驅(qū)動分支酸丙酮酸裂合酶基因表達的啟動子；T為編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核酸分子；C為編碼Rubisco葉綠體轉(zhuǎn)運肽切割位點的核酸分子；D為編碼Rubisco葉綠體轉(zhuǎn)運肽供體多肽N末端部分的約4-20個連續(xù)氨基酸的核酸分子；和CPL為編碼成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白的核酸分子；其中P、T、C、D和CPL中的每個有效連接，使得所述盒的表達導(dǎo)致一種嵌合蛋白的翻譯，所述嵌合蛋白包含與成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白N末端融合的葉綠體靶向序列；b)培育所述植物，其培育條件使得所述嵌合蛋白可被表達并且被轉(zhuǎn)運至葉綠體，以供將分支酸轉(zhuǎn)化為對羥基苯甲酸葡糖苷和對羥基苯甲酸衍生物；c)從所述植物中回收對羥基苯甲酸和對羥基苯甲酸衍生物；和d)將所述對羥基苯甲酸葡糖苷和對羥基苯甲酸衍生物加工為游離對羥基苯甲酸。
具體地說，本發(fā)明方法在植物中產(chǎn)生濃度高于2％所述植物生物量干重、優(yōu)選濃度高于10％的對羥基苯甲酸葡糖苷。
另外，本發(fā)明提供一種分支酸丙酮酸裂合酶表達盒，所述表達盒包含一種嵌合基因，所述嵌合基因所具有的核酸分子編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基衍生的葉綠體靶向序列，所述葉綠體靶向序列具有SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列，所述葉綠體靶向序列有效連接于編碼具有SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的分支酸丙酮酸裂合酶的核酸分子。
附圖、序列描述的簡述

圖1顯示了兩種不同葉綠體靶向形式的CPL的一級氨基酸序列比對。這兩種形式都是人工融合蛋白。第3行中的形式對應(yīng)于先前研究中所用的TP-UbiC(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996)Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)1240-1244(1998)；Sommer等，Plant Cell Reports 17891-896(1998)；Sommer等，Plant MolecularBiology 39683-693(1999))，而第2行中的形式對應(yīng)于在本項研究中開發(fā)的TP-CPL。大腸桿菌(E.coli)CPL(第4行)和rbcS2的番茄Rubisco小亞基前體(第1行)也包括在該比對中。對應(yīng)于“成熟”Rubisco小亞基的氨基酸殘基以粗體顯示。Rubisco小亞基前體的N末端葉綠體轉(zhuǎn)運肽以純文本形式顯示。大腸桿菌CPL的一級氨基酸序列以斜體顯示。箭頭指示高度保守的Cys-Met接點(Mazur等，Nuc Acids Res.132373-2386(1985)；Berry-Lowe等，J.Mol.and Appl.Gen.1，483-498(1982))，其中轉(zhuǎn)運肽切割正常發(fā)生，產(chǎn)生成熟Rubisco小亞基。
圖2顯示了中間質(zhì)粒“TP-CPL-pML63”和相關(guān)限制位點的示意圖(環(huán)形圖)。
圖3顯示了二元載體植物表達構(gòu)建體“TP-CPL-pZBL1”的示意圖(環(huán)形圖)，該表達構(gòu)建體在導(dǎo)入農(nóng)桿菌后用于轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥。
圖4顯示了與野生型植株相比，從表達TP-CPL轉(zhuǎn)基因煙草植株(轉(zhuǎn)化體#5)制備的葉片組織提取物的代表性HPLC譜圖。
圖5顯示了15株表達TP-CPL的不同轉(zhuǎn)基因煙草植株的總pHBA-葡糖苷含量。對將原代轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到土壤后5周獲得的新鮮葉片材料進行該分析。
圖6顯示了在表達TP-CPL的轉(zhuǎn)基因煙草植株中總pHBA葡糖苷的年齡依賴性積累。對從各個發(fā)育階段的原代轉(zhuǎn)化體獲得的葉片組織進行該分析?？俻HBA葡糖苷以干重百分比表示。
圖7顯示了野生型煙草植株(第9泳道)和表達TP-CPL的轉(zhuǎn)基因煙草植株(第1-7泳道)的蛋白質(zhì)印跡。對從5周齡原代轉(zhuǎn)化體獲得的葉片組織進行該分析。第8泳道含有20ng純化重組ΔTP-CPL(例如TP-CPL的預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物)。在SDS-PAGE后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝化纖維素上，用抗CPL抗血清的1∶200稀釋液探測。
根據(jù)以下詳細的描述和構(gòu)成本申請一部分的所附序列的描述，可以更加全面地理解本發(fā)明。
申請人提供了16個序列，這些序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequencesand/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”)，并且符合World Intellectual Property Organization(WIPO)Standard ST.25(1998)和EPO和PCT的序列表要求(Rules 5.2和49.5(a-bis)，以及Section 208和Annex C of the Administrative Instructions)。用于核苷酸序列和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式符合37C.F.R.§1.822的規(guī)則。
SEQ ID NO1為可用于將Genbank登記號為M96268的大腸桿菌CPL導(dǎo)入大腸桿菌表達載體pET-24a(+)(Novagen)中的5’引物。
SEQ ID NO2為可用于將Genbank登記號為M96268的大腸桿菌CPL導(dǎo)入大腸桿菌表達載體pET-24a(+)(Novagen)中的3’引物。
SEQ ID NO3為大腸桿菌表達載體pET-24a(+)(Novagen)中Genbank登記號為M96268的大腸桿菌CPL的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO4為大腸桿菌表達載體pET-24a(+)(Novagen)中Genbank登記號為M96268的大腸桿菌CPL的ORF的一級氨基酸序列。
SEQ ID NO5為可用于擴增番茄Rubisco小亞基前體的葉綠體靶向序列以供在大腸桿菌中表達TP-CPL的5’引物。
SEQ ID NO6為可用于擴增番茄Rubisco小亞基前體的葉綠體靶向序列以供在大腸桿菌中表達TP-CPL的3’引物。
SEQ ID NO7為大腸桿菌表達載體pET-24a(+)(Novagen)中所述葉綠體靶向CPL融合蛋白(TP-CPL)的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO8為大腸桿菌表達載體pET-24a(+)(Novagen)中所述葉綠體靶向CPL融合蛋白(TP-CPL)的ORF的一級氨基酸序列。
SEQ ID NO9為可用于擴增TP-CPL的預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物(ΔTP-CPL)并且將其插入大腸桿菌表達載體pET-24d(+)(Novagen)中的5’引物。
SEQ ID NO10為可用于擴增TP-CPL的預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物(ΔTP-CPL)并且將其插入大腸桿菌表達載體pET-24d(+)(Novagen)中的3’引物。
SEQ ID NO11為可用于擴增并修飾TP-CPL而不改變其一級氨基酸序列以供插入體外轉(zhuǎn)錄/翻譯載體pCITE4a(+)(Novagen)中的5’引物。
SEQ ID NO12為可用于擴增并修飾TP-CPL而不改變其一級氨基酸序列以供插入體外轉(zhuǎn)錄/翻譯載體pCITEAa(+)(Novagen)中的3’引物。
SEQ ID NO13為可用于用質(zhì)粒pMH40作為模板擴增3’NOS終止序列的截短形式的5’引物。
SEQ ID NO14為可用于用質(zhì)粒pMH40作為模板擴增3’NOS終止序列的截短形式的3’引物。
SEQ ID NO15為來源于番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基的葉綠體靶向序列。
SEQ ID NO16為經(jīng)加工的葉綠體靶向CPL融合蛋白(TP-CPL)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供以商業(yè)上有用的水平在綠色植物中高水平地生產(chǎn)對羥基苯甲酸(pHBA)的方法。pHBA可用作應(yīng)用于汽車工業(yè)、電子工業(yè)和其它工業(yè)的液晶高分子中的單體。
所述方法依賴于編碼修飾形式的酶分支酸丙酮酸裂合酶(CPL)的基因的有效表達，所述酶催化1mol分支酸直接轉(zhuǎn)化為1mol丙酮酸和1mol pHBA。將所述CPL變異體以表達盒形式導(dǎo)入綠色植物中，所述表達盒包含與能夠在植物中驅(qū)動蛋白質(zhì)表達的合適啟動子有效連接的所述CPL編碼序列。另外，所述表達盒含有一個DNA片段，該片段正好位于CPL編碼序列上游并與其相鄰，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽、其天然切割位點和所述轉(zhuǎn)運肽供體多肽的一小部分。所述轉(zhuǎn)運肽的作用是將所述表達盒所編碼的嵌合蛋白靶向葉綠體，并且使其能夠被攝取到負責(zé)分支酸合成的該細胞器中，分支酸為CPL的底物，被轉(zhuǎn)化為pHBA。所述切割位點是該原始轉(zhuǎn)運肽供體所特有的，由該盒編碼的人工蛋白在該位點的切割，釋放出在其N末端包含所述轉(zhuǎn)運肽供體的一小部分的成熟CPL酶的新型多肽。
在本說明書中，使用大量的術(shù)語和縮寫。提供以下定義。
“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”縮寫為PCR。
“分支酸丙酮酸裂合酶”縮寫為CPL，是指編碼催化分支酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸和pHBA的酶的基因。
“對羥基苯甲酸(Para-hydroxybenzoic acid)”或“對羥基苯甲酸(P-hydroxybenzoic acid)”縮寫為pHBA。
術(shù)語“對羥基苯甲酸葡糖苷”或“pHBA葡糖苷”是指包含pHBA和葡萄糖分子的綴合物。
術(shù)語“pHBA衍生物”是指由于所述CPL酶的催化活性可以在植物中形成的pHBA的任何綴合物。
術(shù)語“轉(zhuǎn)運肽”或“葉綠體轉(zhuǎn)運肽”將縮寫為“TP”，是指將葉綠體前體蛋白導(dǎo)向葉綠體中并且隨后被葉綠體加工蛋白酶切除的葉綠體前體蛋白的N末端部分。
術(shù)語“葉綠體靶向序列”是指連接于外源蛋白質(zhì)N末端以便被轉(zhuǎn)運到葉綠體中的任何多肽延伸。就天然存在的葉綠體前體蛋白而論，轉(zhuǎn)運肽被認為是葉綠體靶向序列，盡管最佳攝取和蛋白酶加工可能部分依賴于“成熟”葉綠體蛋白的部分。
術(shù)語“轉(zhuǎn)運肽供體序列”是指來源于所述葉綠體前體蛋白“成熟”部分的葉綠體靶向序列的部分。轉(zhuǎn)運肽供體序列總是位于轉(zhuǎn)運肽切割位點的下游并且緊鄰將轉(zhuǎn)運肽與成熟葉綠體蛋白分開的轉(zhuǎn)運肽切割位點。
術(shù)語“葉綠體加工蛋白酶”是指能夠切割轉(zhuǎn)運肽和成熟葉綠體蛋白之間易裂鍵的蛋白酶。
術(shù)語“轉(zhuǎn)運肽切割位點”是指葉綠體靶向序列中葉綠體加工蛋白酶所作用的兩個氨基酸之間的位點。
正如本文所用的，“分離的核酸片段”是單鏈或雙鏈的RNA或DNA的聚合物，任選地含有合成、非天然或經(jīng)改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離核酸片段可以由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個區(qū)段組成。
“基因”是指表達特定蛋白的核酸片段，包括所述編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列?！疤烊换颉笔侵冈谧匀唤缰邪l(fā)現(xiàn)的具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因?！扒逗匣颉笔侵笧榉翘烊换颉谧匀唤缰胁皇且黄鸫嬖诘恼{(diào)節(jié)序列和編碼序列的任何基因。因此，嵌合基因可以包含來源于不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列、或來源于同一來源但以不同于自然界中所發(fā)現(xiàn)的方式排布的的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。“內(nèi)源基因”是指在生物的基因組中處于其自然位置的天然基因?！巴庠础被蚴侵冈谒拗魃镏胁皇钦４嬖诘?、而是通過基因轉(zhuǎn)移被導(dǎo)入該宿主生物的基因。外源基因可以包含插入到非天然生物中的天然基因、或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化法已經(jīng)被導(dǎo)入到基因組中的基因。
“合成基因”可以從寡核苷酸構(gòu)件裝配，所述構(gòu)件可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成。將這些構(gòu)建連接并退火形成基因區(qū)段，然后將其酶促裝配以構(gòu)建完整的基因。涉及DNA序列的“化學(xué)合成”意指將在體外裝配所述組分核苷酸。DNA的人工化學(xué)合成可以用很好建立的方法來完成，或者可以用大量市售機器中的一種進行自動化化學(xué)合成。因此，可以基于核苷酸序列的優(yōu)化以反映宿主細胞密碼子偏好來定制所述基因，以供進行最佳基因表達。技術(shù)人員會認識到，如果使密碼子選擇偏向于宿主所偏好的密碼子，則有可能達到成功的基因表達。優(yōu)選密碼子的確定可以基于可獲得序列信息、得自宿主細胞的基因的調(diào)查。
“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。“合適的調(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、其中或下游(3’非編碼序列)并且影響所連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應(yīng)物結(jié)合部位和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的核苷酸序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3’。啟動子序列由近端和更遠端上游元件組成，后一元件通常被稱為增強子。因此，“增強子”是可以刺激啟動子活性的核苷酸序列，可能是所述啟動子的固有元件或是為增加啟動子的水平或組織特異性而插入的異源元件。啟動子可以全部得自天然基因，或者由來源于自然界中存在的不同啟動子的不同元件組成，或者甚至可以包含合成核苷酸區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，不同的啟動子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細胞類型中表達，或者在不同發(fā)育階段或者對不同環(huán)境條件作出反應(yīng)而表達。使核酸片段在大多數(shù)時間在大多數(shù)細胞類型中表達的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。時常發(fā)現(xiàn)可用于植物細胞的各種類型的新啟動子，大量的例子可以在Okamuro和Goldberg編輯物(1989)Biochemistry of Plants151-82中找到。人們可進一步認識到，由于在大多數(shù)情況下，調(diào)節(jié)序列的實際邊界尚未完全確定，所以不同長度的核酸片段可能具有同樣的啟動子活性。
“3’非編碼序列”是指位于編碼序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調(diào)節(jié)信號的其它序列。聚腺苷酸化信號通常根據(jù)影響在mRNA前體的3’末端添加聚腺苷酸序列段來鑒定。
術(shù)語“有效連接”是指單一核酸片段上致使一個序列的功能受另一序列影響的核酸序列的連接。例如，當(dāng)啟動子能夠影響編碼序列表達時，啟動子與編碼序列有效連接(即所述編碼序列處于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)?？梢詫⒕幋a序列以有義方向或反義方向與調(diào)節(jié)序列有效連接。
術(shù)語“表達”如本文所用的，是指來源于本發(fā)明核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達也可以是指mRNA翻譯為多肽。
“成熟”蛋白是指翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)從中除去了存在于初級翻譯產(chǎn)物的任何前肽或原肽的多肽?！扒绑w”蛋白是指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物，即仍存在前肽和原肽。前肽和原肽可以但不限于胞內(nèi)定位信號。
“轉(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組中，導(dǎo)致遺傳穩(wěn)定的遺傳。含有所述轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”生物或“重組”生物或“轉(zhuǎn)化”生物。
術(shù)語“質(zhì)?！?、“載體”和“盒”是指染色體外元件，它常常攜帶不是所述細胞中心代謝的部分，通常為環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這類元件可以是得自任何來源的自主復(fù)制型序列、基因組整合型序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已經(jīng)連接或重組為單一構(gòu)建體，能夠?qū)幼悠魏退x基因產(chǎn)物的DNA序列以及合適的3’非翻譯序列導(dǎo)入細胞中?！稗D(zhuǎn)化盒”是指含有外源基因并且具有除所述外源基因以外的有利于轉(zhuǎn)化特定宿主細胞的特定載體。“表達盒”是指含有外源基因并且具有除所述外源基因以外的允許外源宿主中該基因表達增強的元件的特定載體。
此處所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且描述于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(在下文稱為“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F(xiàn).M.等，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。CPL表達盒本發(fā)明提供一種表達盒，所述表達盒可用于表達具有完全活性的修飾形式的分支酸丙酮酸裂合酶(CPL)并且將該多肽靶向宿主植物的葉綠體。通常，所述表達盒將包含(1)處于5’和3’調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄控制下的克隆化CPL基因和(2)一個顯性選擇標(biāo)記。本發(fā)明的表達盒也可以含有一個啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如賦予誘導(dǎo)型或組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)型、或者細胞或組織特異性/選擇性表達的啟動子調(diào)節(jié)區(qū))、一個轉(zhuǎn)錄起始位點、一個核糖體結(jié)合位點、一個RNA加工信號、一個轉(zhuǎn)錄終止位點和/或一個聚腺苷酸化信號。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的盒將另外含有編碼轉(zhuǎn)運肽的序列以及編碼所述轉(zhuǎn)運肽供體一部分的序列，所述轉(zhuǎn)運肽供體的一部分含有一個適合于被宿主植物細胞葉綠體加工蛋白酶加工的轉(zhuǎn)運肽切割位點。本發(fā)明的盒任選地也可以包含一個或多個內(nèi)含子，以有利于CPL表達。
所述CPL基因編碼將1mol分支酸轉(zhuǎn)化為1mol丙酮酸和1molpHBA的酶。最充分表征的CPL基因已經(jīng)從大腸桿菌中分離出來，其GenBank登記號為M96268。
可用于驅(qū)動本發(fā)明CPL基因的啟動子很多，并且是本領(lǐng)域眾所周知的。合適的啟動子將是在植物中起作用的那些啟動子，一般來源于帶有所述CPL表達盒的植物宿主。能夠誘導(dǎo)所述CPL基因表達的任何啟動子和任何終止子的任何組合都可以用于本發(fā)明的盒中。啟動子和終止子的一些合適的例子包括得自胭脂堿合酶(nos)、章魚堿合酶(ocs)和花椰菜花葉病毒(CaMV)基因的啟動子和終止子?？梢允褂玫囊环N類型的有效植物啟動子是一種高水平植物啟動子。與本發(fā)明的遺傳序列有效連接的這類啟動子，應(yīng)該能夠啟動本發(fā)明基因產(chǎn)物的表達。可以在本發(fā)明中使用的高水平植物啟動子包括例如得自大豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ss)的啟動子(Berry-Lowe等，J.Molecular and App.Gen.，1483-498 1982))、和葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動子。已知這兩種啟動子在植物細胞中是光誘導(dǎo)型的(參見例如Genetic Engineering ofPlants，and Agricultural Perspective，A.Cashmore，Plenum，New York(1983)，第29-38頁；Coruzzi，G.等，The Journal of Biological Chemistry，2581399(1983)，和Dunsmuir，P.等，Journal of Molecular and AppliedGenetics，2285(1983))。
在本發(fā)明中，當(dāng)需要多肽表達時，一般理想的是在CPL編碼區(qū)的3’末端包括一個聚腺苷酸化區(qū)。所述聚腺苷酸化區(qū)可以來源于多種植物基因或來源于T-DNA。待加入的3’末端序列可以來源于例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或者來源于另一植物基因，或不太優(yōu)選來源于任何其它真核基因。
可以將內(nèi)含子序列加至所述部分編碼序列的5’非翻譯區(qū)或編碼序列，以增加在細胞溶膠中積累的成熟信息的量。在植物和動物表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包括可剪接內(nèi)含子，已經(jīng)表明在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上都增加基因表達，至多增加1000倍。Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.84395-4405(1988)；Callis等，Genes Dev.11183-1200(1987)。基因表達的這類內(nèi)含子增強在置于轉(zhuǎn)錄單位5’末端附近時通常最大。玉米內(nèi)含子Adh1-S內(nèi)含子1、2和6以及Bronze-1內(nèi)含子的應(yīng)用是本領(lǐng)域已知的。一般參見The Maize Handbook，Chapter 116，F(xiàn)reeling和Walbot編著，Springer，New York(1994)。
在一個優(yōu)選實施方案中，將所述CPL蛋白導(dǎo)向葉綠體和其它質(zhì)體會是有用的。通常，通過引入使已表達蛋白靶向質(zhì)體并且也有助于其轉(zhuǎn)運到該細胞器中的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，可實現(xiàn)這一點。許多葉綠體轉(zhuǎn)運肽是已知的，并且可以用于本發(fā)明的表達盒中，包括但不限于來源于以下的葉綠體轉(zhuǎn)運肽豌豆屬(Pisum)(Esutorera等，JP 1986224990；E00977)、胡蘿卜(Luo等，Plant Mol.Biol.，33(4)，709-722(1997；Z33383)、煙草屬(Nicotiana)(Bowler等，EP 0359617；A09029)、稻屬(Oryza)(de Pater等，Plant Mol.Biol.，15(3)，399-406(1990)；X51911)、以及諸如在Herrera-Estrella等，EP 0189707；U.S.5,728,925；U.S.5,717,084(A10396和A10398)中提供的合成序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選從任何植物中分離的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亞基前體蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。得自各種各樣植物的Rubisco小亞基已被很好地表征，得自其中任一種的轉(zhuǎn)運肽將適合于供本發(fā)明中使用。參見例如立碗蘚屬(Physcomitrella)(Quatrano等，AW599738)；百脈根屬(Lotus)(Poulsen等，AW428760)；西瓜屬(Citrullus)(J.S.Shin，AI563240)；煙草屬(Appleby等，Heredity(1997)，79(6)，557-563)；苜蓿(Khoudi等，Gene(1997)，197(1/2)，343-351)；馬鈴薯和番茄(Fritz等，Gene(1993)，137(2)，271-4)；小麥(Galili等，Theor.Appl.Genet.(1991)，81(1)，98-104)；和水稻(Xie等，Sci.Sin.，Ser.B(Engl.Ed.)(1987)，30(7)，706-19)。例如，轉(zhuǎn)運肽可以來源于從植物中分離的Rubisco小亞基，所述植物包括但不限于大豆、油菜、向日葵、棉花、玉米、煙草、苜蓿、小麥、大麥、燕麥、高粱、水稻、擬南芥屬(Arabidopsis)、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麥、亞麻和禾本科牧草。優(yōu)選用于本發(fā)明的是番茄Rubisco小亞基前體蛋白。
葉綠體靶向序列不僅將所需蛋白靶向葉綠體，而且也有助于將其轉(zhuǎn)運到所述細胞器中。這伴隨著由所述葉綠體天然的葉綠體加工蛋白酶在合適的轉(zhuǎn)運肽切割位點上從成熟多肽或蛋白切除所述轉(zhuǎn)運肽。因此，本發(fā)明的葉綠體靶向序列包含一個合適的切割位點，以供正確加工前蛋白為葉綠體中含有的活性成熟多肽。在本發(fā)明中優(yōu)選番茄Rubisco小亞基前體蛋白的葉綠體靶向序列，該序列在天然存在的Cys和Met殘基之間具有一個切割位點，將轉(zhuǎn)運肽與成熟多肽隔開。
用功能性CPL表達盒轉(zhuǎn)化合適的植物宿主，以便在葉綠體中表達CPL并產(chǎn)生pHBA葡糖苷。實際上，能夠支持所述CPL基因表達的任何植物宿主都將是合適的，然而優(yōu)選各種作物，因為它們易于收獲并且生物量大。合適的植物宿主將包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物，例如大豆、油菜(歐洲油菜(Brassica napus)、蕓苔(B.campestris))、向日葵(Helianthus annus)、棉花(Gossypium hirsutum)、玉米、煙草(Nicotiana tabacum)、苜蓿(Medicago sativa)、小麥(Triticum sp)、大麥(Hordeum vulgare)、燕麥(Avena sativa，L)、高粱(Sorghum bicolor)、水稻(Oryza sativa)、擬南芥屬、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麥、亞麻和禾本科牧草。
將構(gòu)建體導(dǎo)入植物細胞宿主中的各種各樣的技術(shù)是可用的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些技術(shù)包括用DNA例如根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化、電穿孔、粒子加速等。[參見例如EP 295959和EP 138341]。一種合適的方法涉及應(yīng)用農(nóng)桿菌(Agrobacterium spp)的Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒的二元型載體。Ti衍生載體轉(zhuǎn)化各種各樣的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，例如大豆、棉花、油菜、煙草和水稻[Pacciotti等(1985)Bio/Technology3241；Byrne等，(1987)Plant Cell，Tissue and Organ Culture 83；Sukhapinda等，(1987)Plant Mol.Biol.8209-216；Lorz等，(1985)Mol.Gen Genet.199178；Portrykus(1985)Mol.Gen.Genet.199183；Park等，J.Plant Biol.(1995)，38(4)，365-71；Hiei等，Plant J.(1994)，6271-282]。用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細胞已經(jīng)接受了廣泛的研究，并且有大量的描述[EP 120516；Hoekema，載于The Binary Plant Vector System，Offset-drukkerij Kanters B.V.；Alblasserdam(1985)，Chapter V，Knauf等，Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium載于Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction，Puhler，A.編著，Springer-Verlag，New York，1983，p.245；和An等，EMBO J.(1985)4277-284]。為了導(dǎo)入植物中，可以如實施例中所述，將本發(fā)明的嵌合基因插入到二元載體中。
其它轉(zhuǎn)化法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的，例如直接攝取外源DNA構(gòu)建體[參見EP 295959]、電穿孔技術(shù)[參見Fromm等(1986)Nature(London)319791]或用包被所述核酸構(gòu)建體的金屬微粒高速彈道轟擊[參見Kline等(1987)Nature(London)32770，和參見美國專利第4,945,050號]。一旦轉(zhuǎn)化后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以讓細胞再生。尤其適用的是最近介紹的將外源基因轉(zhuǎn)化到商業(yè)上重要的作物中的方法，所述作物例如油菜[參見De Block等，(1989)Plant Physiol.91694-701]、向日葵[Everett等，(1987)Bio/Technology 51201]、大豆[McCabe等，(1988)Bio/Technology 6923；Hinchee等，(1988)Bio/Technology 6915；Chee等，(1989)Plant Physiol.911212-1218；Christou等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 867500-7504；EP 301749]、水稻[Hiei等，Plant J.(1994)，6271-282]和玉米[Gordon-Kamm等，(1990)Plant Cell 2603-618；Fromm等，(1990)Biotechnology 8833-839]。
然后將轉(zhuǎn)基因植物細胞置于合適的選擇培養(yǎng)基中，以選擇轉(zhuǎn)基因細胞，然后讓其生長為愈傷組織。從愈傷組織生長出芽，通過在發(fā)根培養(yǎng)基中生長，從所述芽產(chǎn)生小植株。各種構(gòu)建體通常與一種標(biāo)記連接，以供在植物細胞中進行選擇。方便的是，所述標(biāo)記可以是殺生物劑(特別是抗生素，例如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素、氯霉素、除草劑等)抗性。所用的特定標(biāo)記將允許與缺乏被導(dǎo)入的DNA的細胞相比選擇出轉(zhuǎn)化細胞。包括本發(fā)明轉(zhuǎn)錄盒的DNA構(gòu)建體的組分可以從對宿主為天然(內(nèi)源)或外來(外源)的序列中制備。所謂“外源”意指在所述構(gòu)建體所導(dǎo)入的野生型宿主中不存在的序列。異源構(gòu)建體將含有至少一個對于所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)所來源的基因為非天然的區(qū)域。為了確證轉(zhuǎn)基因細胞和植株中存在所述轉(zhuǎn)基因，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行DNA印跡分析。CPL轉(zhuǎn)運到葉綠體中并且隨后加工本發(fā)明依賴于對葉綠體靶向序列的新操作，以實現(xiàn)將所述CPL基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到具有足夠酶活性的葉綠體中，以產(chǎn)生商業(yè)上有用量的pHBA。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個重要方面是不僅包括轉(zhuǎn)運肽，而且包括一個天然存在的葉綠體切割位點和所述轉(zhuǎn)運肽供體的成熟N末端的一小部分。合理的是改進葉綠體攝取并加工所述外源蛋白，以獲得分支酸轉(zhuǎn)化為pHBA的更高的轉(zhuǎn)化率。然而，在被攝入到所述細胞器中之后，轉(zhuǎn)運肽被葉綠體加工酶蛋白酶解除去，產(chǎn)生在其N末端連接有一個小的多肽延伸的CPL變異體。出乎意料的是，這些額外的氨基酸殘基并不干擾CPL酶活性，表達本發(fā)明嵌合蛋白的轉(zhuǎn)化植株積累顯著高于先前報道的量的pHBA衍生物。關(guān)于pHBA的生產(chǎn)，在本領(lǐng)域中尚未認識到該類型專一性的需要。
已報道的嘗試在活植株的葉綠體中表達CPL的唯一例子敘述于Siebert等，Plant Physial.112811-819(1996)。然而，在本發(fā)明嵌合蛋白(例如TP-CPL)和Siebert等(參見上文)中敘述的葉綠體靶向形式的大腸桿菌CPL(例如TP-UbiC)之間有許多重要的差異。例如，本發(fā)明的嵌合物包括一個葉綠體靶向序列，該序列具有一個很好確定的切割位點，以供有效去除所述轉(zhuǎn)運肽。另外，在這一特定位點除去轉(zhuǎn)運肽，導(dǎo)致在成熟CPL多肽N末端區(qū)添加5個額外的氨基酸。相反，在Siebert等(參見上文)中敘述的TP-UbiC缺乏很好確定的切割位點，另外含有一段在大腸桿菌CPL的推定的轉(zhuǎn)運肽切割位點和起始子甲硫氨酸殘基之間插入的9個氨基酸的序列段。這些差異在圖1中進一步闡述。
圖1顯示了具有其轉(zhuǎn)運肽的完整番茄Rubisco小亞基前體(第1行)、TP-CPL(第2行)、TP-UbiC(第3行)和大腸桿菌CPL(第1行)的氨基酸序列比對。本發(fā)明的嵌合蛋白(第2行)由與大腸桿菌CPL的起始子Met殘基融合的番茄Rubisco小亞基前體(綠色殘基)的葉綠體轉(zhuǎn)運肽加上“成熟”Rubisco的前4個氨基酸殘基組成。因此，TP-CPL不僅含有完整的轉(zhuǎn)運肽，而且還含有高度保守的正常發(fā)生轉(zhuǎn)運肽去除(例如在箭頭所示的Cys和Met殘基之間)的切割位點。假定在葉綠體中，TP-CPL也在該位置切割，則所得的蛋白質(zhì)將是在其N末端具有5個額外氨基酸殘基的CPL變異體。申請人已經(jīng)在大腸桿菌中表達了預(yù)測的TP-CPL的葉綠體切割產(chǎn)物，將其純化至同質(zhì)，并且表明它在酶活性方面具有完全的功能。申請人也通過從表達本發(fā)明嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草植株中純化“成熟”多肽，并且對其N末端進行Edman降解，證明了蛋白酶加工的確在Cys-Met接點處發(fā)生。
相反，如圖1的第3行所示，TP-UbiC(Siebert等，參見上文)不含正常發(fā)生從Rubisco小亞基前體去除轉(zhuǎn)運肽的切割位點或者屬于成熟Rubisco多肽的任何氨基酸殘基(Mazur等，Nuc Acids Res.132373-2386(1985)；Berry-Lowe等，J.Mol.and Appl.Gen.1，483-498(1982))。實際上，構(gòu)成在大多數(shù)植物種中高度保守的易裂鍵部分的Met殘基已經(jīng)被Ala殘基取代，所述Met殘基可能被葉綠體加工酶識別或可能不識別。另外，Tp-UbiC含有一段在大腸桿菌CPL的推定切割位點的Cys殘基和起始子Met殘基之間并列的9個額外的氨基酸殘基的序列段(以黑體字母顯示)(圖1)。這些額外氨基酸作為TP-UbiC人工融合蛋白的構(gòu)建過程中的克隆人工產(chǎn)物被引入(Siebert等，參見上文)，未研究它們對葉綠體輸入和/或蛋白酶加工的潛在有害影響。無論如何，即使正如所提示的，所述轉(zhuǎn)運肽的切割發(fā)生Cys-Ala接點，所得的“成熟”蛋白也將在其N末端含有9個額外的氨基酸殘基，它們可能對CPL酶活性有有害作用(參見Siebert等(參見上文)的表I，第2行和第4行)。
實施例在以下實施例中進一步明確本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實施例盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅僅作為說明給出。根據(jù)以上的論述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明進行各種變化和修改，使其適合于各種用途和條件。通用方法在實施例中使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且描述于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring Harbor LaboratoryPressCold Spring Harbor，(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F(xiàn).M.等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。
適用于細菌培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。適用于以下實施例中的技術(shù)可以在以下文獻中找到Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips編著)，American Society for Microbiology，Washington，DC(1994))或者Thomas D.Brock，BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，Second Edition，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。用于細菌細胞生長和維持的所有試劑、限制性酶和材料都得自Aldrich Chemica1s(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另有說明。
遺傳序列的操作采用可得自the Genetics Computer Group Inc.的程序組(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)完成。在使用GCG程序“Pileup”時，所使用的空位產(chǎn)生(gap creation)缺省值為12，空位延伸(gap extension)缺省值為4。在使用CGC“Gap”或“Bestfit”程序時，所使用的缺省空位產(chǎn)生罰分為50，而缺省空位延伸罰分為3。當(dāng)在這些GCG程序或任何其它GCG程序中沒有GCG程序參數(shù)提示符時，使用缺省值。
縮寫的含義如下“h”意指小時，“min”意指分鐘，“sec”意指秒，“d”意指天，“ml”意指毫升，“L”意指升。
實施例1大腸桿菌CPL的PCR克隆用兩種PCR引物從基因組DNA擴增大腸桿菌ubiC基因，同時將單一限制位點加至其側(cè)翼區(qū)，以便隨后連接到高拷貝數(shù)質(zhì)粒中。該基因編碼分支酸丙酮酸裂合酶，該酶在下文稱為CPL。用于此目的的引物基于已發(fā)表的大腸桿菌ubic基因的DNA序列(GenBank登記號M96268)，由以下核苷酸組成引物1-(SEQ ID NO1)5′-CTA CTC ATT Tcatat gTC ACA CCC CGC GTT AA-3′引物2-(SEQ ID NO2)5′-CAT CTT ACT aga tctTTA GTA CAA CGG TGA CGC C-3′下劃線的堿基與靶基因雜交，而小寫字母指示加入至所述PCR引物末端的限制位點(NdeI或BglII)。
大腸桿菌ubic基因的擴增采用引物1和2以及得自大腸桿菌菌株W3110(Campbell等，Proc.Natl.Acad.Sci.752276-2284(1978))的基因組DNA來完成。引物1雜交于該基因的開始之處，并且在所述蛋白質(zhì)的起始密碼子處引入一個NdeI位點，而引物2雜交于相反的末端，在緊接終止密碼子之后提供一個BglII位點。100μl PCR反應(yīng)物含有約100ng基因組DNA，兩種引物的終濃度為0.5μM。其它反應(yīng)成分由GeneAmp PCR試劑盒(GeneAmp PCR Reagent Kit)(Perkin Elmer)提供，按照生產(chǎn)商的方案。擴增在DNA熱循環(huán)儀480(Perkin Elmer)中進行22個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘。在最后的循環(huán)之后，在72℃延伸7分鐘。
PCR產(chǎn)物用NdeI和BglII切割，將所得片段連接到已經(jīng)用NdeI和BamHI消化的大腸桿菌表達載體pET-24a(+)(Novagen)中。使用BTX Transfector 100(Biotechnologies and Experimental Research Inc.)，按照生產(chǎn)商的方案，用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B電感受態(tài)細胞(GibcoBRL)；在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基對生長物進行選擇。含有具有CPL插入片段的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子通過使用引物1和2和各個重懸浮菌落作為模板源的PCR反應(yīng)來鑒定；因此，該技術(shù)簡稱為“菌落PCR”。從產(chǎn)生正確大小的PCR產(chǎn)物的代表性菌落分離出質(zhì)粒DNA，對對應(yīng)于所述CPL的完整插入片段進行全測序，以檢查PCR的錯誤；沒有發(fā)現(xiàn)錯誤。在下文將經(jīng)選擇以供進一步操作的質(zhì)粒被稱為“pET24a-CPL”。pET24a大腸桿菌表達構(gòu)建體中CPL的ORF的核苷酸序列及其預(yù)測的一級氨基酸序列分別描述于SEQ ID NO3和SEQID NO4。注意到所述編碼區(qū)與GenBank登記號M96268中給出的ORF相同。
實施例2重組大腸桿菌CPL的過量表達、純化和表征為了產(chǎn)生足量的CPL以供酶表征和抗體產(chǎn)生，將pET24a-CPL導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中。這一步通過用BTX Transfector 100(Biotechnologies and Experimental Research Inc.)，按照生產(chǎn)商的方案進行電穿孔來完成。生長物在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基上進行選擇，選擇出一個菌落以供進一步操作。為了產(chǎn)生重組蛋白，讓含所述質(zhì)粒的菌株在上述培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)物中于30℃生長，在A600nm約為0.8時，用0.15mM IPTG誘導(dǎo)細胞。在同樣的生長條件下進行4.5小時誘導(dǎo)期之后，通過離心收獲細胞，將其貯存于-80℃待用。后續(xù)步驟在0-4℃下進行。
將冷凍的細胞沉淀重懸于約3倍體積的0.1M Tris-HCl(pH7.7)、5mM MgSO4、1mM二硫蘇糖醇、0.03mg/ml DNA酶I、0.5mM苯基甲磺酰氟中，并且在20,000psi下通過弗氏壓碎器兩次。通過離心(43,0000xg，1h)除去碎片，向含有約30mg蛋白質(zhì)/mL的無細胞提取物中補充甘油(5％)，貯存于-80℃下待用。采用Lowry等的方法(Lowry等，J.Biol Chem.193265-275(1951))，用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)，測定蛋白質(zhì)濃度。無細胞提取物的SDS-PAGE分析顯示，所述重組蛋白在所述生長條件下在大腸桿菌BL21(DE3)中表達良好，表達水平超過總可溶性蛋白的15％。然而，在弗氏壓碎器壓碎的提取物的可溶性部分中僅回收約25％的所述重組蛋白，使用該材料如下所述進行純化。
純化的第一步需要陰離子交換色譜。將一等份(1.0mL)含有重組CPL的大腸桿菌無細胞提取物快速解凍至室溫，用去離子水以1∶1稀釋，然后通過0.2μm Acrodisc濾器(Gelman Sciences，Cat.No.4192)過濾。將所有樣品上樣至Mono Q HR 5/5柱(Pharmacia Biotech Inc)，于25℃用緩沖液Q(50mM Tris-HCI，pH7.7，10mM亞硫酸鈉，1mMEDTA)、以1ml/min的流速展開。在這些條件下，重組CPL不吸附于所述陰離子交換樹脂上，在展開的前幾分鐘期間從所述柱子上被等度洗脫下來。在一個試管中收集柱流通液，補充5％(w/v)甘油，于4℃在Centricon-10(Amicon Inc.)中濃縮至450μl的終體積。在該簡單操作之后，根據(jù)SDS-PAGE(Laemmli U.，Nature 227680-685(1970))和考馬斯藍染色判斷，所述重組蛋白的純度約為90％。在下一步中，將200μl濃縮樣品上樣至用含0.3M NaCl的緩沖液Q預(yù)先平衡的7.5×600mmTSK G3000SW凝膠過濾柱(TOSOH Corp.)。該柱以1.0mL/min(25℃)的流速展開，在19.7-21min之間高度純化的重組CPL被洗脫。將后者保持在冰上，而將剩余的一半樣品以同樣方式加工。將兩個凝膠過濾柱的峰流分合并，補充甘油(5％)，濃縮至約12mg蛋白/mL，貯存于-80℃待用。純化蛋白的產(chǎn)量約為3.7mg，相當(dāng)于所述無細胞提取物中存在的總蛋白的約12％。過載考馬斯染色凝膠的目測表明最終的重組蛋白制劑的純度超過98％。
讓純化重組CPL經(jīng)過Edman降解，表明所述蛋白的起始子Met殘基在大腸桿菌中被除去。然而，除了這一微小的翻譯后修飾之外，重組CPL的前13個氨基酸與SEQ ID NO4中所示蛋白(例如真實大腸桿菌蛋白的ORF)的殘基2-14相同。通過電噴霧電離質(zhì)譜術(shù)測定，純化重組CPL的原聚體分子量為18644.6道爾頓。這一數(shù)值與根據(jù)不包括起始子Met殘基時的所述DNA序列預(yù)測的分子量(18645.49道爾頓)非常吻合。根據(jù)這些觀測結(jié)果，合理地推斷起始子Met殘基也從天然大腸桿菌蛋白中被切除，因為后者的核苷酸序列與重組CPL相同。
開發(fā)一種連續(xù)分光光度測定，以評價所述純化重組蛋白的催化活性。該測定基于伴隨分支酸轉(zhuǎn)化為pHBA、由于后者的芳環(huán)形成引起的246 nm的吸光度的增加。于25℃下在含有90mM Tris-HCl(pH7.6)、0.2M NaCl、100μM分支酸鋇(Sigma)和各種量的純化重組CPL的石英比色杯中，測量初始產(chǎn)物生成速率；用酶引發(fā)反應(yīng)。用pHBA于246nm下11,220M-1的消光系數(shù)，根據(jù)吸光度的變化計算產(chǎn)物的生成。在范圍為5μM-100μM的濃度的pHBA下，在相同的條件下測量吸光度；吸光度與pHBA的濃度成正比。基于上述測定，純化重組CPL于25℃的轉(zhuǎn)換數(shù)約為36min-1。以大得多的規(guī)模純化的同一重組蛋白的兩種其它制劑，在同樣的條件下得到略高的轉(zhuǎn)換數(shù)(例如41min-1和42min-1)。在文獻中可得到的有關(guān)該酶的唯一數(shù)值是49min-1(Nichols等，J.Bacteriol.1745309-5316(1992))，但所述測定于37℃進行。假定所述CPL酶反應(yīng)的特征是Q10(溫度系數(shù))至少為2，那么這些觀測結(jié)果表明，上述的純化重組蛋白具有完全的活性。
實施例3CPL葉綠體靶向形式TP-CPL的構(gòu)建分支酸為CPL的生理底物，是包括氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸在內(nèi)的多種芳族化合物合成的一種重要的分支點中間體。在植物中，分支酸在位于葉綠體和其它類型質(zhì)體中的莽草酸途徑中生成(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))。因此，必需提供具有N末端葉綠體靶向序列的CPL，所述葉綠體靶向序列能夠?qū)⑼庠吹鞍子行?dǎo)向葉綠體，即分支酸產(chǎn)生的部位。通過構(gòu)建由與CPL的起始子Met殘基融合的來源于番茄Rubisco小亞基前體蛋白的葉綠體靶向序列組成的嵌合蛋白，完成這一步；所得的融合蛋白在下文被稱為“TP-CPL”。為了產(chǎn)生對應(yīng)于Rubisco小亞基轉(zhuǎn)運肽和“成熟”Rubisco的前4個氨基酸殘基的DNA片段，使用PCR。擴增的靶是質(zhì)粒pTSS1-91-(#2)-IBI(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))，它含有rbcS2的番茄Rubisco小亞基前體的全長cDNA克隆(Sugita等，Mol Gen Genet.209247-256(1987)；Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))。該反應(yīng)使用以下引物引物35′-CTA CTC ACT TAG ATC Tccatg gCT TCC TCT GTC ATT TCT- 3′′(SEQ ID NO5)引物45′-CAT CTT ACT cat atg CCA CAC CTG CAT GCA GC-3′(SEQ ID NO6)引物3的下劃線部分雜交于Rubisco小亞基前體的前21個核苷酸，并且在所述葉綠體靶向序列起始處的起始子Met殘基之處引入一個NcoI位點(小寫字母)。如所示的，該引物在其5’端也含有一個BglII位點(粗體字母)，緊接NcoI位點的上游。引物4在所述葉綠體靶向序列的另一端雜交于Rubisco小亞基前體的ORF的核苷酸167-184。將一個單一NdeI位點工程改造到該引物中(小寫字母)，以允許含有所述葉綠體靶向序列的PCR片段連接至位于pET-24a表達構(gòu)建體中CPL起始密碼子之處的NdeI位點。100μl的PCR反應(yīng)物含有約75ngpTSS1-91-(#2)-IBI以及終濃度約為0.9μM的引物3和4。擴增在DNA熱循環(huán)儀480(Perkin Elmer)中進行25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘；在最后的循環(huán)之后進行72℃7分鐘的延伸期。所述PCR產(chǎn)物用BglII和NdeI消化，連接到已經(jīng)用相同限制性酶切割以除去小DNA片段(106bp)、僅含載體序列包括T7啟動子的pET24a-CPL中。用電穿孔將連接反應(yīng)混合物導(dǎo)入大腸桿菌DH10B中，生長物在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基上選擇。用引物2和3，通過菌落PCR，鑒定帶有含插入的葉綠體靶向序列的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。選擇出產(chǎn)生正確大小的PCR產(chǎn)物的一個代表性質(zhì)粒以供進一步操作；該質(zhì)粒在下文稱為“pET24a-TP-CPL”。為了證實沒有PCR錯誤，用定制的引物，對對應(yīng)于所擴增葉綠體靶向序列的質(zhì)粒區(qū)域進行全測序。TP-CPL的ORF的核苷酸序列及其預(yù)測的一級氨基酸序列分別描述于SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。
實施例4TP-CPL的預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物具有完全的活性用質(zhì)粒pet24a-TP-CPL中的插入片段作為模板，通過PCR產(chǎn)生對應(yīng)于TP-CPL的預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物的氨基酸序列(例如MQVWH-CPL)的DNA片段。該反應(yīng)使用以下引物引物55′CTA CTC ATT Tga agacTG CAT GCA GGT GTG GCA T-3′(SEQ ID NO9)引物65′-CAT CTT ACT gtc gacTTT AGT ACA ACG GTG ACG C-3′(SEQ ID NO10)引物5的下劃線部分結(jié)合于TP-CPL基因插入片段的5’端，并且恰好在所述預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物(在下文稱為“ΔTP-CPL”)起始子Met殘基上游引入一個單一BBSI位點(小寫字母)。引物6雜交于所述基因插入片段的相反端，在緊接終止密碼子之后提供一個單一SalI位點(小寫字母)。所述PCR產(chǎn)物用BBSI(它留下NcoI匹配的“粘性末端”)和SalI切割，將所得的片段連接到用NcoI和SalI消化的大腸桿菌表達載體pET-24d(+)(Novagen)中。采用BTX Transfector 100(Biotechnologies and Experimental Research Inc.)，按照生產(chǎn)商的方案，用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B電感受態(tài)細胞(GibcoBRL)中；生長物在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中進行選擇。用適當(dāng)?shù)囊?，通過菌落PCR鑒定含有具有ΔTP-CPL插入片段的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。從產(chǎn)生正確大小的PCR產(chǎn)物的菌落中分離出一個代表性質(zhì)粒(例如pET24a-ΔTP-CPL)，對對應(yīng)于ΔTP-CPL的插入片段進行全測序，以證實沒有PCR錯誤。
為了表達所述重組蛋白以供純化和動力學(xué)分析，采用電穿孔將pET24a-ΔTP-CPL導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)中。將轉(zhuǎn)化細胞平板接種于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基上，選擇一個代表性菌落以供進一步操作。讓300ml培養(yǎng)物在上述培養(yǎng)基中于30℃生長。在A600nm約為0.8時，加入IPTG至終濃度為0.15mM。在同樣條件下誘導(dǎo)4.5小時后，通過離心收獲細胞，將其貯存于-80℃。后續(xù)步驟在0-4℃下進行，除非另有說明。
將冷凍的細胞沉淀重懸于2.5ml含有0.1M Tris-HCl(pH7.7)、5mM MgSO4、1mM二硫蘇糖醇、0.03mg/ml DNA酶I、0.5mM苯基甲磺酰氟的溶液中，使其通過20,000psi下的弗氏壓碎器兩次。對無細胞提取物進行離心(43,000xg，25min)，小心取出上清液(4.5ml)，補充5％甘油并貯存于-80℃待用。用于ΔTP-CPL的純化方案與上述用于未經(jīng)修飾的重組大腸桿菌CPL的方案基本相同。簡而言之，將上述全部樣品解凍，用Centriprep-10(Amicon Inc)將其濃縮至2.5ml的終體積。然后用以緩沖液Q預(yù)先平衡的PD-10凝膠過濾柱(Pharmacia BiotechInc)，按照生產(chǎn)商的方案，將樣品交換到緩沖液Q中。在Centriprep-10中，將體積縮小至2ml，將全部樣品上樣至Mono Q HR 10/10柱(Pharmacia Biotech Inc)，用緩沖液Q以4ml/min(25℃)展開。收集在2-3分鐘之間洗脫的物質(zhì)，加入甘油至終濃度為5％(v/v)。在Centricon-10(Amicon Inc)中將樣品濃縮至200μl，上樣至7.5×600mmTSK G3000SW凝膠過濾柱(TOSOH Corp.)。該柱用含有0.3M NaCl的緩沖液Q(25℃)以1ml/min展開，重組ΔTP-CPL在20.7-22min之間被洗脫。給含有所述純化重組蛋白的流分補充5％甘油，濃縮至約0.7mg蛋白/ml，儲存于-80℃待用。
用實施例2中描述的分光光度測定，于25℃測定純化的重組ΔTP-CPL的酶活性。在這些條件下，轉(zhuǎn)換數(shù)為40.7min-1。該數(shù)值實際上與用無N末端延伸的純化重組大腸桿菌CPL獲得的數(shù)值相同(例如36-42min-1)。這一觀測結(jié)果清楚地表明，融合于ΔTP-CPL N末端的5個額外的氨基酸殘基并不損害酶活性，還提示TP-CPL的預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物可能具有完全的活性。
實施例5體外蛋白質(zhì)輸入將TP-CPL輸入到分離的葉綠體中在將TP-CPL導(dǎo)入到高等植物之前，重要的是表明它可能被葉綠體攝入。通過合成放射性形式的人工融合蛋白，并進行典型的葉綠體蛋白質(zhì)輸入試驗，進行這一步。第一步是產(chǎn)生可以用來用[35S]甲硫氨酸放射性標(biāo)記所述蛋白的DNA構(gòu)建體，以供轉(zhuǎn)運實驗用。為此，修飾編碼TP-CPL的序列，以供用引物7和8，用質(zhì)粒pet24A-TP-CPL中的插入片段作為PCR擴增的模板，插入到體外轉(zhuǎn)錄/翻譯載體pCITE4a(+)(Novagen)的MscI和BglII位點中。引物75′-CTA CTC ATT tgg cca GCT CTG TCA TTT CTT CAG CAG C-3′(SEQ ID NO11)引物85′-CAT CTT ACT aga tct TTA GTA CAA CGG TGA C-3′(SEQ ID NO12)引物7雜交于恰好在TP-CPL起始密碼子之后的核苷酸序列段(下劃線區(qū)域)，并且在起始子Met殘基之處加入一個單一MscI位點(以小寫字母表示)。引物8結(jié)合于該基因插入片段的另一端，緊接終止密碼子之后引入一個單一BglII位點。任一種引物都沒有在所述人工融合蛋白中引入任何氨基酸改變。所得的PCR片段用MscI和BglII消化，連接于用MscI和BamHI切割的pCITE4a(+)中；BglII和BamHI產(chǎn)生匹配的“粘性末端”。采用電穿孔將連接反應(yīng)混合物導(dǎo)入大腸桿菌DH10B中，將轉(zhuǎn)化細胞平板接種在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基上。選擇帶有具正確插入片段的質(zhì)粒的一個代表性菌落(通過菌落PCR鑒定，采用合適的引物)，以供進一步操作。對質(zhì)粒DNA進行全測序，以證實沒有PCR錯誤。
接著，用[35S]甲硫氨酸和“Single Tube Protein System 2，T7”試劑盒(Novagen)，按照銷售商的方案，對上述質(zhì)粒構(gòu)建體進行體外轉(zhuǎn)錄/翻譯。用含有60mM未標(biāo)記甲硫氨酸的2X輸入緩沖液(Viitanen等，J.Biol.Chem.26315000-15007(1988))終止反應(yīng)。從14日齡的豌豆幼苗(Pisum sativum)分離葉綠體，用放射性標(biāo)記的TP-CPL進行體外輸入測定(Viitanen等，J.Biol.Chem.26315000-15007(1988))。用蛋白酶后處理來鑒別結(jié)合多肽和輸入多肽(Cline等，J.Biol.Chem.2603691-3696(1985))。然后通過Percoll墊離心，重純化完整的質(zhì)體，將其重懸于150μl2X凝膠樣品緩沖液中，如先前描述的方法(Viitanen等，J.Biol.Chem.26315000-15007(1988))通過SDS-PAGE/熒光自顯影分析。
TP-CPL的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯導(dǎo)致合成表觀分子量約25kDa(基于SDS-PAGE的遷移率(Laemmli，U.K.，Nature 227680-685(1970))的放射性多肽，所述分子量與根據(jù)其DNA序列預(yù)測的數(shù)值(25188Da)一致。在存在ATP時，該多肽被葉綠體攝入并加工成較小的大小，它看來與考馬斯染色純化的重組ΔTP-CPL(例如TP-CPL的預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物)共遷移。經(jīng)典的蛋白酶保護實驗確立，在輸入測定后用完整的葉綠體回收的所述放射性多肽事實上已經(jīng)被內(nèi)化。
相反，當(dāng)將葉綠體在確實支持蛋白質(zhì)輸入的條件(例如在黑暗中，無ATP)下孵育時，沒有觀察到TP-CPL的攝入和加工。在無能量供給的條件下，用完整的質(zhì)體回收的唯一放射性條帶是全長的融合蛋白TP-CPL。此外，對應(yīng)于后者的放射性條帶在用蛋白酶處理后完全消失，證明它并未被輸入，而是僅僅結(jié)合于葉綠體外膜。綜合而言，這些結(jié)果清楚地證明，連接于TP-CPL N末端的所述葉綠體靶向序列能夠?qū)⑺鋈斯と诤系鞍讓?dǎo)向葉綠體，并且在攝入到細胞器之后，以預(yù)期的方式發(fā)生蛋白酶加工。
實施例6用于煙草和擬南芥轉(zhuǎn)化的表達質(zhì)粒的構(gòu)建在確立TP-CPL被葉綠體有效攝入(實施例5)并且被切割為具有高CPL活性的新蛋白(實施例4)之后，決定將其導(dǎo)入植物中。為了產(chǎn)生可以用于在煙草和擬南芥中組成型表達的構(gòu)建體，將對應(yīng)于全長TP-CPL融合蛋白的DNA片段亞克隆到修飾形式的質(zhì)粒pML63中。后者衍生于pML40，含有以下遺傳元件一個CaMV 35S啟動子、一個cab前導(dǎo)序列、uidA編碼區(qū)和NOS聚腺苷酸化信號序列。簡而言之，CaMV35S啟動子是一段在轉(zhuǎn)錄起始位點之后延伸8個堿基對的1.3kb DNA片段(Odell等，(1985)Nature 303810-812)。在其3’端有效連接cab前導(dǎo)序列，這是從葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因22L獲得的60bp非翻譯雙鏈DNA片段(Harpster等(1988)Mol.Gen.Genet.212182-190)。在cab前導(dǎo)序列的3’端融合編碼蛋白β-葡糖醛酸糖苷酶(例如“GUS”)的uidA基因(Jefferson等(1987)EMBO J 63901)。最后，在GUS基因的3’端連接一個含有得自胭脂堿合酶(例如“NOS”)基因(Depicker等(1982)J.Mol.Appl.Genet.1561-564)的聚腺苷酸化信號序列的800bp DNA片段。這些DNA片段結(jié)合在一起包含35S-GUS嵌合基因，通過標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將其插入到載體pGEM9Zf(-)(Promega；Madison WI)中，得到質(zhì)粒pMH40。
質(zhì)粒pML63與pMH40基本相同，但具有截短形式的3’NOS終止序列，用以下方式產(chǎn)生。首先，pMH40用SalI消化，將兩種所得的4.03kb和2.9kb的DNA片段重新連接，得到具有反向取向的所述35S啟動子/cab22前導(dǎo)序列/GUS基因/3’NOS終止盒的質(zhì)粒。然后，所得的構(gòu)建體用Asp718I和HindIII消化，釋放含有3’NOS終止序列的770bp片段。棄去后者，用采用pMH40作為模板并且用引物9和10通過PCR產(chǎn)生的較短的形式取代。引物95′-CCC GGG GGT ACC TAA AGA AGG AGT GCG TCG AAG-3′(SEQ ID NO13)引物105′-GAT ATC AAG CTT TCT AGA GTC GAC ATC GAT CTA GTA ACA TAG ATG A 3′(SEQ ID NO14)所述PCR產(chǎn)物用HindIII和Asp718I消化，產(chǎn)生含有279bp 3’NOS終止序列、始于已發(fā)表序列(Depicker等，J.Mol Appl Genet(1982)1561-574)的核苷酸1277(TAA終止密碼子)且終止于核苷酸1556的298 bp片段。將該PCR片段連接到pML3中，產(chǎn)生質(zhì)粒pML63。
如上所述，pML63含有所述35S啟動子控制下的GUS編碼區(qū)和截短形式的3’NOS終止子。因此，它含有在植物中組成型表達GUS所必需的全部轉(zhuǎn)錄信息。為了產(chǎn)生TP-CPL的類似構(gòu)建體，用NcoI和EcoRI消化質(zhì)粒pML63。這種操作僅釋放GUS基因插入片段，留下調(diào)節(jié)側(cè)翼序列和完整載體的其余部分。質(zhì)粒pet24a-TP-CPL也用NcoI和EcoRI處理，這釋放出TP-CPL融合蛋白的完整編碼區(qū)。通過瓊脂糖凝膠電泳純化對應(yīng)于后者的小DNA片段(693bp)，并將其與通過用NcoI和EcoRI切割pML63獲得的大載體片段(4.63bp)進行標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)。采用電穿孔將連接反應(yīng)混合物導(dǎo)入大腸桿菌DH10B中，生長物在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基上進行選擇。用引物2和3，通過菌落PCR鑒定帶有含所插入TP-CPL編碼序列的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。選擇產(chǎn)生正確大小的PCR產(chǎn)物的一個代表性質(zhì)粒，以供進一步操作。在下文稱為“TP-CPL-pML63”的最終構(gòu)建體的示意圖示于圖2中。
用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤片轉(zhuǎn)化的二元載體是質(zhì)粒pZBL1，該質(zhì)粒于1997年6月24日保藏于ATCC，保藏號為209128。pZBL1含有得自pBR322的復(fù)制起點；細菌nptI卡那霉素抗性基因；銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)質(zhì)粒pVS1(Itoh等，1984)的復(fù)制區(qū)和穩(wěn)定區(qū)；van den Elzen等，1985描述的T-DNA邊界(border)，其中作為右邊界片段一部分的OCS增強子(從OCS啟動子的-320延伸至-116)(Greve等，1983，J.Mol.Appl.Genet.1499-511)被除去；和一個作為卡那霉素抗性植物選擇標(biāo)記的NOS/P-nptII-OCS 3’基因。為了表達TP-CPL，質(zhì)粒pZBL1用SalI消化，SalI在右邊界和左邊界之間的單一位點切割，該位置為插入外源基因且穩(wěn)定整合到植物基因組中的理想位置。為了將無插入片段的重連接的可能性降至最低，經(jīng)切割的載體用牛小腸堿性磷酸酶(GibcoBRL)按照生產(chǎn)商的建議去磷酸化。為了獲得可能插入到所述二元載體的片段，質(zhì)粒TP-CPL-pML63也用SalI消化。這一處理釋放出作為2.4kb DNA片段的TP-CPL融合基因的完整轉(zhuǎn)錄單位(例如35S啟動子/cab22前導(dǎo)序列/TP-CPL/3’NOS終止子)。后者通過瓊脂糖凝膠電泳純化，并與如上所述從pZBL1獲得的去磷酸化11.0kb片段進行標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)。采用電穿孔將所述連接反應(yīng)混合物導(dǎo)入大腸桿菌DH10B中，生長物在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基上進行選擇。用引物2和3，通過菌落PCR鑒定帶有含TP-CPL融合基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，通過用KpnI進行限制性酶消化分析確定所述插入片段的取向。在選擇以供進一步操作、在下文稱為“TP-CPL-pZBL1”的質(zhì)粒中，TP-CPL的起始密碼子與T-DNA的右邊界片段相鄰，如圖3圖示。如下所述，這種表達構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，以進行pHBA的過量生產(chǎn)。
實施例7轉(zhuǎn)基因煙草植株的產(chǎn)生采用凍融轉(zhuǎn)化法(Holsters等，Mol.Gen.Genet.163181-187)，將質(zhì)粒TP-CPL-pZBL1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404(Hoekema等，Nature303179-180(1983))中。將細胞于28℃平板接種于也含有卡那霉素(1000μg/ml)和利福平(20μg/ml)的YEP培養(yǎng)基(每升10g胰蛋白胨、10g酵母膏和5g NaCl)上，用合適的引物，通過PCR鑒定帶有所述二元構(gòu)建體的菌落。
用于葉盤片侵染的盆栽煙草植株(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)在生長室中生長，維持14hr 21℃光照、10hr 18℃黑暗周期，相對濕度大約為80％，用混合冷白熒光和白熾燈。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤片轉(zhuǎn)化基本上按照De Blaere等，Meth.Enzymol.153277-292所述的方法進行，進入以下的修改。用無菌紙鉆孔器和4-6周齡的植株，從完整的葉片準(zhǔn)備直徑8mm的葉盤片。通過將葉盤片在帶有TP-CPL-pZBL1、在Murashige Minamal Organics培養(yǎng)基中重懸至OD600為～Z的農(nóng)桿菌濃縮溶液中浸沒30分鐘進行接種。將接種的葉盤片直接置于含有(每升)30g蔗糖、1mg 6-芐氨基嘌呤(BAP)、0.1mg萘乙酸、8g瓊脂和得自GibcoBRL的1個包裝的Murashige′s Minimal Organics培養(yǎng)基(cat.#23118-029)的培養(yǎng)基上。在光照下于28℃培養(yǎng)3天后，將葉盤片轉(zhuǎn)移至也含有卡那霉素(300μg/ml)和頭孢噻肟(500μg/ml)的相同組成的新鮮培養(yǎng)基上，以便根據(jù)轉(zhuǎn)化煙草細胞的生長進行選擇，并且消除殘留的農(nóng)桿菌。葉盤片在上述生長條件下培育3周，然后以3周的間隔轉(zhuǎn)移至組成相同的新鮮培養(yǎng)基上，直至獲得可供根誘導(dǎo)用的最適芽的大小。芽在含有(每升)1個包裝的Murashige′s Minimal Organics培養(yǎng)基、8g瓊脂和10g蔗糖的培養(yǎng)基上生根。約4周后，將植株轉(zhuǎn)移到土壤中，讓其在生長室中在上述條件下生長至成熟。
實施例8pHBA葡糖苷標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成為了合成pHBA酯葡糖苷，將110mmol 4-羥基苯甲酸與含55mmol氧化雙(三丁基錫)的1L苯混合。在氮氣環(huán)境下，用共沸裝置將混合物原位加熱至回流達16小時。減壓除去苯，得到主要為4-羥基苯甲酸三丁基錫酯的澄清的油狀物(Ogawa等，(1982)Tetrahedron 362641-2648)。下一步，將含25mmol乙酰溴-a-D-葡萄糖的1.2L1，2-二氯乙烷加入至25mmol 4-羥基苯甲酸三丁基錫酯中間體，然后加入12.5mmol溴化四丁基銨。在氮氣環(huán)境下加熱混合物至回流達3小時，通過TLC，通過用硫酸炭化進行檢測，監(jiān)測反應(yīng)進程。減壓除去溶劑，在硅膠上，用乙酸乙酯和己烷的1∶1混合物洗脫，純化乙酰保護的pHBA酯葡糖苷。然后，乙酰保護基用10％甲醇水溶液中的1當(dāng)量碳酸鉀選擇性皂化3小時。減壓除去溶劑，用甲醇干凈地研磨pHBA酯葡糖苷。過濾除去后者，所得的白色粉末表現(xiàn)出熔點為209-210℃。通過1HNMR證實所述pHBA酯葡糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
為了合成pHBA酰基葡糖苷，將16.4mmol 4-羥基苯甲酸甲酯和14.6mmol乙酰溴-a-D-葡萄糖溶于7.0ml無水吡啶中，然后加入23.3mmol 99.99％氧化銀。在氮氣環(huán)境下于室溫攪拌反應(yīng)物3小時。經(jīng)過濾收集不溶性銀鹽，用吡啶洗滌，將合并的濾液和洗滌液減壓濃縮，注入冰冷水的混合物中。收集暗褐色固體，用水沖洗，溶于氯仿和二氯甲烷的1∶1混合物中，隨后用碳酸鈉作為干燥劑干燥。讓溶液通過celite過濾，減壓除去溶劑。然后用硅膠色譜純化羥基連接的苯甲酸甲酯乙酰保護的葡糖苷(Durkee等，(1979)Carbohydrate Research 77252-254)；柱子用乙酸乙酯和己烷的1∶2混合物洗脫。將純化的化合物溶于40ml甲醇中，加入1.5mmol甲醇鈉。4.5小時后，溶液變?yōu)辄S色，減壓除去溶劑；將所得的殘余物溶于25ml水中。將溶液濃縮至約5ml，讓其結(jié)晶，得到所述羥基連接的苯甲酸甲酯葡糖苷；收集晶體，然后在高真空下干燥。為了選擇性地皂化所述甲酯基團，將2.5mmol羥基連接的苯甲酸甲酯葡糖苷溶于25ml水中，加入2.5ml 1M NaOH。于室溫攪拌過夜后，中和溶液，將其濃縮至約5ml，讓其結(jié)晶，得到所需的pHBA?；咸擒?。發(fā)現(xiàn)該化合物的熔點為108-110℃，通過1HNMR證實其化學(xué)結(jié)構(gòu)。
實施例9制備供pHBA葡糖苷分析用的煙葉樣品從煙草植株莖頂部三分之一的部分選擇沿中脈測量約15cm的健康葉片。用剪刀快速剪取葉片遠端1/3部分的組織(100mg鮮重)，置于含有陶瓷珠的Biopulverizer H管(cat.no.6570-201或6540-401)中，后兩者都得自BIO 101(Joshua Way，Vista，CA)。在加入1ml甲醇后，給管加蓋，用以5m/s速度操作的Savant FastPrep FP120組織破碎裝置機械攪拌40秒。接著，將試管置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上，于室溫以400rpm劇烈攪拌1小時。用常規(guī)臺式微量離心機離心(10,000xg，10min)，使提取物澄清，小心取出含有兩種pHBA葡糖苷的上清液，轉(zhuǎn)移到空管中。采用旋轉(zhuǎn)振蕩器和上述條件，周0.5ml甲醇于室溫重提取剩余的不溶性葉片材料30分鐘。將第二次提取產(chǎn)生的上清液與第一次提取的上清液合并，將樣品儲存于-20℃以供隨后的加工。用分析天平和甲醇的密度將質(zhì)量轉(zhuǎn)換為體積，通過重量分析測量加入到每種葉片材料樣品中的甲醇體積以及在提取和離心后回收的終體積。
如下進一步加工所述樣品以供HPLC分析。除非另有說明，所有的步驟均在室溫下進行。將一等份甲醇提取物轉(zhuǎn)移至微量離心管，如上所述測量其實際體積。在Speed-Vac(Savant Instruments)中開始加熱，真空除去溶劑，使所述樣品完全干燥。將干燥殘余物溶于100μl0.2N HCl中，加入0.7mL水飽和的乙醚。在劇烈渦旋混合和離心之后，小心取出乙醚相并將其棄去，樣品用乙醚如上所述重新提取。然后，將一等份的剩余水相(50μl)通過0.22um醋酸纖維素濾膜(Costar EZ-spin)過濾，注射到用90％緩沖液A(0.1％甲酸水溶液)和10％緩沖液B(甲醇)以1ml/min預(yù)平衡的Vydac 218TP54 PROTEIN AND PEPTIDEC18柱中。在注射樣品后，柱子立即用在20min期間產(chǎn)生的至終濃度為50％緩沖液B的線性梯度展開。流速為1ml/min。用分光光度計于254nm監(jiān)測酚型和酯型pHBA葡糖苷的洗脫。圖4顯示了一株表達TP-CPL的煙草植株(轉(zhuǎn)化體#5)和一株野生型植株的代表性HPLC譜圖。
用真正的pHBA葡糖苷標(biāo)準(zhǔn)(參見上文)校正HPLC分離的保留時間，在所用的HPLC條件下準(zhǔn)確地測量兩種化合物的消光系數(shù)。因此，用H/P Chemstation提供的軟件，對峰面積進行積分，用已知量的合適標(biāo)準(zhǔn)獲得的數(shù)值用來定量測定每次注射的pHBA葡糖苷的微克量。在計及注射到柱子上的原始甲醇提取物的稀釋度和所占的百分率后，對所述數(shù)值進行校正，以反映得自所分析葉片樣品的總回收率。將其與所分析植物組織(例如在同一天得自同一植株的，干重)的各個測量結(jié)果偶聯(lián)，使得能夠?qū)HBA-葡糖苷以干重百分比表示。
實施例10卡那霉素抗性在第一自交子代中的分離通過自交產(chǎn)生的原代煙草轉(zhuǎn)化體#34的種子通過在也含有0.1％SDS的10％漂白溶液[含5.25％Na(OCl)2的Clorox]中于室溫溫和攪拌下浸漬30分鐘進行表面消毒。無抗生素選擇的200粒種子的發(fā)芽率為97.5％。相反，在接種到也含有卡那霉素(300μg/ml)的發(fā)芽培養(yǎng)基上的500粒種子中，約20％表現(xiàn)出隱性表型(例如卡那霉素敏感性種子與卡那霉素抗性種子之比為1∶4)。由于轉(zhuǎn)化體#34的分離比非常接近1∶3的單基因顯性性狀的理論比值(例如，與雙基因座事件特征性的1∶16比值相對比)，所以可以推斷，所述選擇標(biāo)記和TP-CPL基因表達構(gòu)建體穩(wěn)定整合到基因組的單一基因座中。
實施例11煙草葉片提取物中CPL酶活性的測量制備得自野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片組織提取物，如先前描述的方法(Siebert等，PlantPhysiol.112811-819(1996))并略加修改，分析其CPL酶活性。葉片樣品(2g濕重)在冰冷研缽中用2.6ml含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1％β-巰基乙醇、1mM EDTA、1mM苯基甲磺酰氟和75mg/ml聚乙烯聚吡咯烷酮的溶液中勻漿。除非另有說明，所有的后續(xù)步驟均在0-4℃下進行。在低速離心除去不溶性物質(zhì)后，用PD-10凝膠過濾柱(Pharmacia Biotech Inc)，按照生產(chǎn)商的建議，將樣品的緩沖液交換為50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA和200mMNaCl。用Bio-Rad(Bradford)蛋白質(zhì)測定測量蛋白質(zhì)的濃度。
CPL酶測定如下進行?；痉磻?yīng)混合物(終體積500μl)含有50mMTris pH8.0(于37℃)、10mM EDTA、200mM NaCl和150μM純化分支酸鋇(Siebert等Microbiology 140897-904(1994))。在于37℃孵育5分鐘后，用含有50μg蛋白質(zhì)的煙草葉片提取物引發(fā)反應(yīng)。在于37℃2分鐘后，用0.3ml 0.75M乙酸鈉(pH4)終止反應(yīng)，測定在反應(yīng)中產(chǎn)生的pHBA的量。為了監(jiān)測產(chǎn)物的回收，每管接受9,500dpm的[14C]-標(biāo)記的pHBA(55mCi/mmol)作為內(nèi)標(biāo)?；旌衔镉?ml H2O飽和的乙酸乙酯抽提，收集有機相并使其干燥。然后用實施例9中所述的完全相同的柱子和條件，通過反相HPLC定量測定pHBA的量。收集對應(yīng)于pHBA的峰，通過液體閃爍計數(shù)測量放射性的量。以下報道的關(guān)于CPL酶活性的數(shù)值以每mg蛋白質(zhì)的pkats表示，并且已經(jīng)根據(jù)所述內(nèi)標(biāo)和從分支酸通過自發(fā)分解產(chǎn)生的少量pHBA的回收率進行了校正(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))。
實施例12表達TP-CPL的轉(zhuǎn)基因煙草植株的分析如上所述，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤片轉(zhuǎn)化將TP-CPL導(dǎo)入煙草(Nicotiana tabacum)中，以測定其對pHBA葡糖苷積累的影響。根據(jù)圖5中所示的數(shù)據(jù)，顯然該人工融合蛋白實際上優(yōu)于先前已經(jīng)用來升高植物中pHBA水平的其它葉綠體靶向形式的大腸桿菌CPL(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996)；Sommer等，Plant Cell Reports17891-896(1998))。該分析用得自通過不同的轉(zhuǎn)化事件產(chǎn)生的15株煙草植株(原代轉(zhuǎn)化體)的葉片組織進行。請注意，到僅在植株轉(zhuǎn)移至土壤后5周時取樣。正如所預(yù)期的，原代轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出各種水平的pHBA葡糖苷，從總干重的0至2.3％不等。這種類型的變異通常在幾乎所有的植物轉(zhuǎn)化實驗中觀察到，推定反映出由于所謂的“位置”效應(yīng)(例如，所述性狀基因在基因組的不同位置穩(wěn)定整合)和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)引起的不同水平的基因表達。在本項研究中也發(fā)生相似的現(xiàn)象得到用針對純化重組大腸桿菌CPL的抗血清進行的煙草轉(zhuǎn)化體的蛋白質(zhì)印跡分析的支持。例如，盡管大多數(shù)所述植株(例如14/15)具有免疫學(xué)可檢測水平的所述外源蛋白，但在表達水平上仍有相當(dāng)大的變異。然而，一般而言，在蛋白質(zhì)印跡信號強度和pHBA葡糖苷的積累之間有正相關(guān)，與先前的觀察(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))；Sommer等，Plant Cell Physiol.39(11)1240-1244(1998)；Sommer等，Plant CellReports 17891-896(1998))一致。
基于干重，5周齡煙草植株的平均pHBA葡糖苷含量為1.12％(+/-0.186％)，其中括號中的數(shù)字為平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。更重要的是，僅在原代轉(zhuǎn)化體中的3株轉(zhuǎn)化體(#13、#19和#37)的pHBA葡糖苷水平低于0.52％，這是在用TP-UbiC人工融合蛋白獲得的相似研究中獲得的最高水平(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))。此外，在本項研究中的三株最佳植株(#8、#34和#39)的pHBA葡糖苷含量至少為2％干重。
為了檢查所需表型的穩(wěn)定性，在直至種子形成期的延長的時間內(nèi)監(jiān)測轉(zhuǎn)基因煙草植株中的3株(#4、#5和#34)。有可能當(dāng)所述植株繼續(xù)發(fā)育時，所述植株可能不能夠維持這類高水平的pHBA葡糖苷。然而，如圖6中所示，情況不是這樣。當(dāng)所述植株變老時，其葉片pHBA葡糖苷含量顯著增加。例如，在轉(zhuǎn)化體#5中，當(dāng)在將所述植株轉(zhuǎn)移至土壤中后1周、5周、11周和13周分析時，總pHBA葡糖苷水平為總干重的0.5％、1.6％、7.2％和10％。13周的數(shù)值代表比用TP-UbiC獲得的結(jié)果幾乎增加20倍，相當(dāng)于在相連的葡萄糖分子的質(zhì)量進行校正后pHBA含量約為4.5％。盡管有這些非常高水平的次級代謝物，但所述轉(zhuǎn)基因煙草植株看來完全正常，在形態(tài)上與野生型植株不可區(qū)分。
為了跟蹤外源基因的命運和下一代中pHBA積累的相關(guān)表型，選擇轉(zhuǎn)化體#34進行進一步分析。作為13周齡的原代轉(zhuǎn)化體，該植株的pHBA葡糖苷含量為總干重的8％(圖6)。如實施例10中所述，當(dāng)通過自花受粉獲得的種子在卡那霉素存在下萌發(fā)并檢查所述抗生素抗性表型的分離時，觀察到1(敏感性)∶4(抗性)的比率。這提示在基因組的單一位置上發(fā)生了所述選擇標(biāo)記與TP-CPL的整合，而不是卡那霉素抗性分離比將為1∶15的雙基因座事件。理論上，卡那霉素抗性植株由以2∶1的比率存在的兩個群體-雜合群體和純合群體組成。假定沒有共抑制，則預(yù)期純合植株的CPL酶活性兩倍于雜合植株，也許積累甚至更高水平的pHBA葡糖苷。為了解決這一問題，讓卡那霉素抗性幼苗中的5株(在下文稱為#34A-34E)生長為成熟植株，，并分析其CPL酶活性和pHBA葡糖苷。在所述植株15周齡時取樣，該項研究的結(jié)果示于以下表I中。
表I植株34CPL酶活性總pHBA-葡糖苷姊妹株 (pkat/mg蛋白) (干重百分比)34A 9274.834B 9915.934C 1048 5.034D 7845.034E 3563.2正如所預(yù)期的，所有卡那霉素抗性的幼苗也表現(xiàn)出CPL酶活性并且積累pHBA葡糖苷。因此，人工融合蛋白TP-CPL的基因穩(wěn)定地傳遞給下一代。盡管所檢查的植株數(shù)少，但看來是兩個不同的群體。子代中的4株(例如#34A-34D)的CPL酶活性非常相似，從每mg蛋白784-1,048pkat不等。注意到該組的平均CPL活性(例如938pkat/mg)比當(dāng)檢查活煙草植株時用TP-UbiC獲得的最佳數(shù)值(Siebert等，Plant Physiol.112811-819(1996))高約4.5倍。同樣這4株姊妹株也具有相當(dāng)水平的pHBA葡糖苷。平均值約為5.2％的干重，所述數(shù)值非常聚集(例如4.8％-5.9％)。
相反，其中1株植株(例如#34E)的CPL酶活性和pHBA葡糖苷的水平非常低。雖然使得我們推測這株姊妹株為雜合體，而其它4株植株為純合體，但得出這個結(jié)論還是為時太早。首先，根據(jù)獲得的所述卡那霉素抗性表型的分離模式，預(yù)期僅1/3的所述植株為純合的，而不是所觀察到的所述群體的80％。第二，可以想象，具有雙倍的多拷貝所述性狀基因的純合狀態(tài)可能導(dǎo)致共抑制，產(chǎn)生自相矛盾的低水平的CPL酶活性和pHBA葡糖苷。目前正在進行實驗，以嘗試解決這一問題。無論如何，有趣的是注意到，在第二代植株中pHBA葡糖苷的積累水平與原代轉(zhuǎn)化體的不完全一樣。
實施例13TP-CPL的蛋白酶加工在體內(nèi)發(fā)生在預(yù)測的切割住點如圖7所示，表達人工融合蛋白TP-CPL的轉(zhuǎn)基因煙草植株的全葉片提取物僅含有一種與針對純化重組大腸桿菌CPL的抗血清交叉反應(yīng)的多肽。此外，通過SDS-PAGE測量，在野生型植株中不存在的所述交叉反應(yīng)多肽的大小，比導(dǎo)入煙草中的原始融合蛋白小得多。事實上，看來恰好與純化的重組ΔTP-CPL共遷移，所述純化的重組ΔTP-CPL為TP-CPL的預(yù)測葉綠體切割產(chǎn)物(實施例4)，也是體外葉綠體輸入實驗后觀察到的放射性條帶(實施例5)。雖然如此，為了提供從所述人工融合蛋白中所述葉綠體靶向序列的除去在體內(nèi)的確發(fā)生在預(yù)測的切割位點的明確證明，從得自煙草轉(zhuǎn)化體#34獲得的葉片組織純化所述蛋白，并且通過Edman降解測定其N末端氨基酸殘基。
用研缽和研棒，用含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1％β-巰基乙醇、1mM苯基甲磺酰氟和75mg/ml聚乙烯聚吡咯烷酮的冰冷溶液(研磨緩沖液)將葉片組織(6.9g濕重)勻漿。除非另有說明，所有后續(xù)步驟均在0-4℃下進行，將葉片提取物離心30分鐘(40,000xg)除去不溶性物質(zhì)，在所得的上清液中補充固體(NH4)2SO4至終濃度為80％(w/v)。將溶液溫和攪拌30分鐘，然后以20,000xg離心10分鐘，以沉淀大多數(shù)蛋白質(zhì)。棄去上清液，將所得的沉淀重懸于2.0ml無聚乙烯聚吡咯烷酮但補充8％(v/v)甘油的研磨緩沖液中，通過Bio-Rad(Bradford)蛋白質(zhì)測定測量，蛋白質(zhì)濃度為14.3mg/ml。
然后，用PD-10凝膠過濾柱(Pharmacia Biotech Inc)，將一等份上述樣品(0.5ml)交換為緩沖液Q(實施例2)。在樣品完全進入樹脂后，柱子用2.2ml緩沖液Q洗滌一次，棄去流出液。在加入另外1.1ml相同緩沖液后，收集在外水體積中洗脫的物質(zhì)。然后將全部樣品上樣至于室溫用緩沖液Q平衡的MonoQ HR5/5柱。柱子用相同緩沖液以1.0ml/min的流速展開，從樣品注射時開始，收集各流分(每個流分1.0ml)。用針對純化重組大腸桿菌CPL的抗血清，通過蛋白質(zhì)印跡分析鑒定含有TP-CPL的葉綠體切割產(chǎn)物的流分。實際上所有交叉反應(yīng)物質(zhì)都在流分#3和#4中被洗脫出來，如前所述，僅用所述抗血清檢測到的種類與純化的重組ΔTP-CPL共遷移。合并柱流分#3和#4，補充7.5％甘油、0.3M NaCl和0.01％Tween 20(Bio-Rad cat.#170-6531)，用Centricon 10(Amicon)將其濃縮至約200μl的終體積。然后將全部樣品上樣至于室溫用50mM Tris-HCl(pH7.2)、0.3M NaCl和0.01％Tween20預(yù)平衡的7.5×600mm TSK G3000SW凝膠過濾柱(TOSOH Corp.)。柱子用同一緩沖液以1.0ml/min(25℃)展開，將在21.5-23min之間洗脫的、含有真正TP-CPL葉綠體切割產(chǎn)物的流分合并在一起，用Microcon 10(Amicon)濃縮至55μl的終體積。經(jīng)濃縮的物質(zhì)用樣品緩沖液以1∶1稀釋，并且通過SDS-PAGE分析，以評價純化度。盡管在考馬斯藍染色的凝膠中也顯然有許多其它條帶，但所述TP-CPL葉綠體切割產(chǎn)物是與其它污染物很好分離的一種主要的蛋白種類。對應(yīng)于該條帶的所述多肽N末端分析(在電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜和6個循環(huán)的Edman降解之后)證實在預(yù)測的切割位點，例如在圖1中所示的Cys-Met接點，發(fā)生了所述人工融合蛋白的蛋白酶加工。根據(jù)這一觀測結(jié)果和實施例4中敘述的酶活性數(shù)據(jù)，可以推斷，在表達TP-CPL的煙草植株的葉綠體中負責(zé)將分支酸轉(zhuǎn)化為pHBA的多肽是在其N末端連接有5個額外氨基酸殘基、具有完全活性的CPL變異體。
實施例14表達TP-CPL的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的產(chǎn)生和分析將人工融合蛋白TP-CPL導(dǎo)入擬南芥中，測定pHBA葡糖苷水平。采用可利用的方案(Meyer等(1994)Science 2641452-1455)，通過電穿孔將攜帶CaMV35S-CPL表達盒(例如TP-CPL-pZBL1)的二元載體轉(zhuǎn)化到攜帶非致癌型(disarmed)Ti(毒性)質(zhì)粒pMP90(Koncz，C.和Schell，J.(1986)Mol.Gen.Genet.204383-396)的根癌農(nóng)桿菌菌株C58 C1 Rif(也稱為菌株GV3101)中。采用已發(fā)表的真空深入技術(shù)方案(Clough S.J.，Bent A.F.(1998)Plant J.16(6)735-43)，用攜帶具有CPL表達構(gòu)建體的二元載體的MP90菌株轉(zhuǎn)化具有野生型fahl-2(Chapple等，Plant Cell41413-1424(1992))，sngl-1(Lorenzen等，Plant Physiology 1121625-1630(1996))遺傳背景的擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態(tài)型Columbia植株。在無菌條件下，在標(biāo)準(zhǔn)植物生長培養(yǎng)基上，用卡那霉素(50μg/ml)來選擇，鑒定轉(zhuǎn)基因幼苗。將卡那霉素抗性幼苗轉(zhuǎn)移至土壤中，并且在土壤/珍珠巖(soil/perlite)混合物中，以12小時光照/12小時黑暗光周期、以100Em-2s-1、于18℃(黑暗)和21℃(光照)培育。通過這種方法，產(chǎn)生一個得自獨立轉(zhuǎn)化事件的301株原代轉(zhuǎn)化體的群體。在轉(zhuǎn)移至土壤后6周，如下所述用反相HPLC分析轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的pHBA葡糖苷。
將新鮮切下的葉片材料在50％MeOH(5μl/mg濕重)中勻漿，所得提取物通過低速離心澄清。然后，將一等份葉片提取物上樣至Nova-Pak C18柱(60?？讖?，4μm粒徑)，使用含1.5％磷酸的乙腈梯度(6％-48％)。pHBA酚型和酯型葡糖苷通過254nm的UV吸收來檢測，用從真正的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)獲得的消光系數(shù)(參見實施例8)來定量。在分析的272株轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，239株(或約88％)含有可檢測水平的兩種葡萄糖綴合物，并且這些綴合物以大約等量存在。最佳過量生產(chǎn)者的總pHBA葡糖苷含量為10.73％干重，這與采用同一構(gòu)建體用煙草觀察到的最高水平非常相似。整個轉(zhuǎn)基因擬南芥植株群體的平均值為3.35％(+/-0.13％)；括號中的數(shù)字為平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
總之，這些結(jié)果清楚地證明，本發(fā)明的嵌合蛋白-TP-CPL不僅能夠在煙草中產(chǎn)生高水平的pHBA葡糖苷，而且也能夠在其它植物種中產(chǎn)生高水平的pHBA葡糖苷。
序列表<110>納幕爾杜邦公司(E.I.du Pont de Nemours and Company)<120>在綠色植物中高水平地生產(chǎn)對羥基苯甲酸<130>BC1015 PCT<140><141><160>16<170>MICROSOFT OFFICE 97<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1ctactcattt catatgtcac accccgcgtt aa 32<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2catcttacta gatctttagt acaacggtga cgcc 34<210>3<211>495<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物的描述大腸桿菌(E.coli)<400>3atgtcacacc ccgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgct attgtaaaga gatccctgcc 60ctggatccgc aactgctcga ctggctgttg ctggaggatt ccatgacaaa acgttttgaa 120cagcagggaa aaacggtaag cgtgacgatg atccgcgaag ggtttgtcga gcagaatgaa 180atccccgaag aactgccgct gctgccgaaa gagtctcgtt actggttacg tgaaattttg 240ttatgtgccg atggtgaacc gtggcttgcc ggtcgtaccg tcgttcctgt gtcaacgtta 300agcgggccgg agctggcgtt acaaaaattg ggtaaaacgc cgttaggacg ctatctgttc 360acatcatcga cattaacccg ggactttatt gagataggcc gtgatgccgg gctgtggggg 420cgacgttccc gcctgcgatt aagcggtaaa ccgctgttgc taacagaact gtttttaccg 480gcgtcaccgt tgtac 495<210>4<211>165<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物的描述大腸桿菌(E.coli)<400>4Met Ser His Pro Ala Leu Thr Gln Leu Arg Ala Leu Arg Tyr Cys Lys1 5 10 15Glu Ile Pro Ala Leu Asp Pro Gln Leu Leu Asp Trp Leu Leu Leu Glu20 25 30Asp Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly Lys Thr Val Ser Val35 40 45Thr Met Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn Glu Ile Pro Glu Glu50 55 60Leu Pro Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu65 70 75 80Leu Cys Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Val Val Pro85 90 95Val Ser Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Lys Leu Gly Lys100 105 110Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp115 120 125Phe Ile Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp Gly Arg Arg Ser Arg130 135 140Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro145 150 155 160Ala Ser Pro Leu Tyr165<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5ctactcactt agatctccat ggcttcctct gtcatttct39<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>6catcttactc atatgccaca cctgcatgca gc 32<210>7<211>684<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成CPL<400>7atggcttcct ctgtcatttc ttcagcagct gttgccacac gcagcaatgt tacacaagct 60agcatggttg cacctttcac tggtctcaaa tcttcagcca ctttccctgt tacaaagaag 120caaaaccttg acatcacttc cattgctagc aatggtggaa gagttagctg catgcaggtg 180tggcatatgt cacaccccgc gttaacgcaa ctgcgtgcgc tgcgctattg taaagagatc 240cctgccctgg atccgcaact gctcgactgg ctgttgctgg aggattccat gacaaaacgt 300tttgaacagc agggaaaaac ggtaagcgtg acgatgatcc gcgaagggtt tgtcgagcag 360aatgaaatcc ccgaagaact gccgctgctg ccgaaagagt ctcgttactg gttacgtgaa 420attttgttat gtgccgatgg tgaaccgtgg cttgccggtc gtaccgtcgt tcctgtgtca 480acgttaagcg ggccggagct ggcgttacaa aaattgggta aaacgccgtt aggacgctat 540ctgttcacat catcgacatt aacccgggac tttattgaga taggccgtga tgccgggctg 600tgggggcgac gttcccgcct gcgattaagc ggtaaaccgc tgttgctaac agaactgttt 660ttaccggcgt caccgttgta ctaa684<210>8<211>227<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成CPL<400>8Met ala Ser Ser Val Ile Ser Ser Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Asn1 5 10 15Val Thr Gln Ala Ser Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Ser20 25 30Ala Thr Phe Pro Val Thr Lys Lys Gln Asn Leu Asp Ile Thr Ser Ile35 40 45Ala Ser Asn Gly Gly Arg Val Ser Cys Met Gln Val Trp His Met Ser50 55 60His Pro Ala Leu Thr Gln Leu Arg Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Ile65 70 75 80Pro Ala Leu Asp Pro Gln Leu Leu Asp Trp Leu Leu Leu Glu Asp Ser85 90 95Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly Lys Thr Val Ser Val Thr Met100 105 110Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn Glu Ile Pro Glu Glu Leu Pro115 120 125Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu Leu Cys130 135 140Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Val Val Pro Val Ser145 150 155 160Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Lys Leu Gly Lys Thr Pro165 170 175Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp Phe Ile180 185 190Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp Gly Arg Arg Ser Arg Leu Arg195 200 205Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro Ala Ser
210 215 220Pro Leu Tyr225<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>9ctactcattt gaagactgca tgcaggtgtg gcat 34<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>10catcttactg tcgactttag tacaacggtg acgc 34<210>11<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>11ctactcattt ggccagctct gtcatttctt cagcagc 37<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>12catcttaeta gatctttagt acaacggtga c 31<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>13cccgggggta cctaaagaag gagtgcgtcg aag 33<210>14<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>14gatatcaagc tttctagagt cgacatcgat ctagtaacat agatga 46<210>15<211>62<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成CPL<400>15Met Ala Ser Ser Val Ile Ser Ser Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Asn1 5 10 15Val Thr Gln Ala Ser Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Ser20 25 30Ala Thr Phe Pro Val Thr Lys Lys Gln Asn Leu Asp Ile Thr Ser Ile35 40 45Ala Ser Asn Gly Gly Arg Val Ser Cys Met Gln Val Trp His50 55 60<210>16<211>170<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成CPL<400>16Met Gln Val Trp His Met Ser His Pro Ala Leu Thr Gln Leu Arg Ala1 5 10 15Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Ile Pro Ala Leu Asp Pro Gln Leu Leu Asp20 25 30Trp Leu Leu Leu Glu Asp Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly35 40 45Lys Thr Val Ser Val Thr Met Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn50 55 60Glu Ile Pro Glu Glu Leu Pro Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp65 70 75 80Leu Arg Glu Ile Leu Leu Cys Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly85 90 95Arg Thr Val Val Pro Val Ser Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu100 105 110Gln Lys Leu Gly Lys Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser115 120 125Thr Leu Thr Arg Asp Phe Ile Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp130 135 140Gly Arg Arg Ser Arg Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr145 150 155 160Glu Leu Phe Leu Pro Ala Ser Pro Leu Tyr165 170
權(quán)利要求
1.一種在綠色植物中生產(chǎn)對羥基苯甲酸的方法，所述方法包括a)提供一種綠色植物，所述綠色植物具有內(nèi)源分支酸源并且含有具有以下結(jié)構(gòu)的分支酸丙酮酸裂合酶表達盒P-T-C-D-CPL其中P為適合于驅(qū)動分支酸丙酮酸裂合酶基因表達的啟動子；T為編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核酸分子；C為編碼Rubisco葉綠體轉(zhuǎn)運肽切割位點的核酸分子；D為編碼Rubisco葉綠體轉(zhuǎn)運肽供體多肽N末端部分的約4-20個連續(xù)氨基酸的核酸分子；和CPL為編碼成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白的核酸分子；其中P、T、C、D和CPL中的每個有效連接，使得所述盒的表達導(dǎo)致一種嵌合蛋白的翻譯，所述嵌合蛋白包含與成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白N末端融合的葉綠體靶向序列；b)培育所述植物，其培育條件使得所述嵌合蛋白可被表達并且被轉(zhuǎn)運至葉綠體，以供將分支酸轉(zhuǎn)化為對羥基苯甲酸葡糖苷和對羥基苯甲酸衍生物；c)從所述植物中回收對羥基苯甲酸和對羥基苯甲酸衍生物；和d)將所述對羥基苯甲酸葡糖苷和對羥基苯甲酸衍生物加工為游離對羥基苯甲酸。
2.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述Rubisco轉(zhuǎn)運肽來源于選自以下的植物大豆、油菜、向日葵、棉花、玉米、煙草、苜蓿、小麥、大麥、燕麥、高粱、水稻、擬南芥屬(Arabidopsis)、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麥、亞麻和禾本科牧草。
3.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動子選自35S啟動子、胭脂堿合酶啟動子、章魚堿合酶啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶啟動子和葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動子。
4.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述分支酸丙酮酸裂合酶由SEQID NO3中所示核酸序列編碼。
5.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述包含與所述成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白的N末端融合的葉綠體靶向序列的嵌合蛋白，具有SEQ ID NO8中所示的氧基酸序列。
6.一種權(quán)利要求5的方法，其中將所述包含與所述成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白的N末端融合的葉綠體靶向序列的嵌合蛋白，加工為SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列。
7.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述pHBA葡糖苷按植物生物量的干重計以至少2％的對羥基苯甲酸葡糖苷的濃度產(chǎn)生。
8.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述對羥基苯甲酸葡糖苷按植物生物量的干重計以至少10％的對羥基苯甲酸葡糖苷的濃度產(chǎn)生。
9.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述含有分支酸丙酮酸裂合酶表達盒的綠色植物選自大豆、油菜、向日葵、棉花、玉米、煙草、苜蓿、小麥、大麥、燕麥、高粱、水稻、擬南芥屬、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麥、亞麻和禾本科牧草。
10.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述對羥基苯甲酸按植物生物量的干重計以高于4.5％pHBA的濃度產(chǎn)生。
11.一種分支酸丙酮酸裂合酶表達盒，所述表達盒包含一種嵌合基因，所述嵌合基因具有與編碼具有SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的分支酸丙酮酸裂合酶的核酸分子有效連接的、編碼具有SEQ IDNO15中所示氨基酸序列的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基葉綠體靶向序列的核酸分子。
12.一種權(quán)利要求11的分支酸丙酮酸裂合酶表達盒，其中所述嵌合基因編碼SEQ ID NO8中所示的多肽。
13.一種包含權(quán)利要求11的CPL表達盒的植物。
14.權(quán)利要求13的植物，所述植物選自大豆、油菜、向日葵、棉花、玉米、煙草、苜蓿、小麥、大麥、燕麥、高粱、水稻、擬南芥屬、甜菜、甘蔗、canola、小米、菜豆、豌豆、黑麥、亞麻和禾本科牧草。
15.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含與具有SEQ ID NO8中所示氨基酸序列的成熟分支酸丙酮酸裂合酶蛋白N末端融合的葉綠體靶向序列。
16.一種分離的核酸片段，所述核酸片段編碼一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含與具有SEQ ID NO15中所示氨基酸序列的成熟CPL蛋白的N末端融合的葉綠體靶向序列。
17.一種權(quán)利要求16的分離核酸片段，所述核酸片段具有SEQ IDNO7中所示的序列。
18.權(quán)利要求15的葉綠體切割產(chǎn)物，所述切割產(chǎn)物具有SEQ IDNO16中所示的氨基酸序列。
19.一種核酸片段，所述核酸片段編碼權(quán)利要求18的經(jīng)加工的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用獨特的表達盒在綠色植物中高水平地生產(chǎn)pHBA。所述表達盒包含一個與能夠在高等植物中驅(qū)動蛋白表達的合適啟動子有效連接的分支酸丙酮酸裂合酶(CPL)編碼序列。另外，所述CPL盒包含編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽、其天然切割位點和與CPL的N末端融合的所述轉(zhuǎn)運肽供體蛋白一小部分的序列。所述葉綠體靶向序列使外源蛋白靶向葉綠體區(qū)室，有助于其被攝入到該細胞器中。所述切割位點對于所述轉(zhuǎn)運肽是唯一的，在該位點切割所述盒編碼的嵌合蛋白釋放出一種新型多肽，所述新型多肽具有全酶活性，包含成熟CPL酶和所述轉(zhuǎn)運肽供體的一小部分。
文檔編號C07K19/00GK1444656SQ01813598
公開日2003年9月24日 申請日期2001年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月2日
發(fā)明者K·梅耶, D·E·范迪克, P·V·維塔寧 申請人:納幕爾杜邦公司