專利名稱：生產(chǎn)抗凍蛋白的方法和生物體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)抗凍蛋白的方法。此外涉及用于此方法中的新生物體，由此獲得的新蛋白，以及這種新蛋白的組合物和用途。一方面，它涉及新生物體Marinomonas protea的培養(yǎng)；由此獲得的新抗凍蛋白；這種蛋白在控制冷凍方法中的用途，特別是在冷凍食品的生產(chǎn)中的用途；以及由此獲得的食品。
背景技術(shù)：
所謂的‘抗凍蛋白’(AFPs)有修飾冰晶生長(zhǎng)的特性。它們?cè)谧饔蒙喜煌诟?jiǎn)單的離子抗凍劑如常見的鹽。例如，水性的AFP溶液一般有一個(gè)低于其融點(diǎn)的冰點(diǎn)(滯后現(xiàn)象)。它們使冰晶在一定的溫度范圍穩(wěn)定，以及抑制重結(jié)晶。它們似乎幫助生物體在水的冰點(diǎn)附近的溫度中生存，因此發(fā)現(xiàn)于幾種不同的生物體。它們的特性給予它們一個(gè)潛在的使用范圍特別是在冷凍時(shí)食用的食品中，抑制重結(jié)晶和保持光滑的質(zhì)地。在只是為了保存才冷凍的食品，AFPs可以抑制在冷凍，儲(chǔ)存，轉(zhuǎn)運(yùn)，和解凍過(guò)程中重結(jié)晶，因此通過(guò)減少細(xì)胞破壞保存食品質(zhì)地，也通過(guò)減少水滴來(lái)減低營(yíng)養(yǎng)的丟失。(見Griffith，M.和Vanya Esart，K.Biotechnology Advances，13，pp375-402)。
已知多種的AFPs來(lái)源最常見的是魚和植物。一些細(xì)菌展現(xiàn)出抗凍特性(見Griffith等，supra，p382)。在一些情況下，已報(bào)道了細(xì)菌中抗凍蛋白的分離(例如XuH，Griffith M，Patten CL，et al.，Can J Microbiol44(1)64-73 Jan 1998)。
考慮到抵抗冷凍的生物體的優(yōu)勢(shì)，抗凍蛋白沒有更廣泛地分布在自然界和更易被發(fā)現(xiàn)是令人吃驚地。這也許是因?yàn)樯矬w有其他的方式克服這種問題。
反之，能幫助產(chǎn)生強(qiáng)壯，堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)的魚AFP有利于一些特殊的用途，RI活性但不產(chǎn)生堅(jiān)固結(jié)構(gòu)的AFP有其自己的，不同的優(yōu)勢(shì)。例如，可活躍地抑制儲(chǔ)存時(shí)冰重結(jié)晶的分子可以用來(lái)保持在儲(chǔ)存中冷凍產(chǎn)品光滑的質(zhì)地。對(duì)一些冷凍食品，如乳品冰淇淋，這種分子的應(yīng)用優(yōu)選不使產(chǎn)品過(guò)度地變硬。
因此對(duì)抗凍肽有一個(gè)要求，即在解凍和冷凍循環(huán)中有活性地抑制重結(jié)晶，以及能用來(lái)在儲(chǔ)存過(guò)程中保持食品產(chǎn)品的光滑質(zhì)地。合乎需要地，這些抗凍肽是熱穩(wěn)定的，由此它們能與經(jīng)巴氏消毒或滅菌的食品產(chǎn)品相摻合，同時(shí)它們保持其功能。
本發(fā)明(部分)建立的假設(shè)基礎(chǔ)是，如果細(xì)菌定居在一種通常低于水的正常冰點(diǎn)的液體水性環(huán)境在這種環(huán)境中(假定)AFPs可以是一種有效方式給細(xì)菌一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，它們是更可能使AFP蛋白進(jìn)化。
發(fā)明概述因此，在第一方面，本發(fā)明包括生產(chǎn)AFPs的方法，包括從水性低溫環(huán)境收集一種或更多的細(xì)菌樣品，培養(yǎng)細(xì)菌和從樣品中提取蛋白，檢測(cè)蛋白的抗凍特性，選擇有較高的抗凍特性的蛋白，以及生產(chǎn)足量的作為AFP食品添加劑的篩選蛋白。
發(fā)明進(jìn)一步包括由此方法獲得的新抗凍蛋白，它們?cè)谑称芳庸さ挠猛?，以及包含它們的食品組合物。發(fā)明詳述將參照附圖和序列標(biāo)識(shí)來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中序列編號(hào)1是一種來(lái)自Marinomonas protea的16S rRNA基因的DNA序列；序列編號(hào)2是一種來(lái)自假單胞菌屬物種(作為“分離菌20”被分離)的16S rRNA基因的DNA序列。
序列編號(hào)3是從Marinomonas protea分離的抗凍肽的N末端氨基酸序列。


圖1表示Marinomonas protea的16S rRNA序列(圖3)與普通海單胞菌的對(duì)應(yīng)序列的序列比對(duì)；圖2是把Marinomonas protea與其最近的種系發(fā)生親屬進(jìn)行比較的進(jìn)化系統(tǒng)樹。
圖3顯示分離菌20的16S rRNA序列(序列編號(hào)2，大寫)與Marinomonas protea 16S rRNA(序列編號(hào)1；小寫)的比對(duì)，有89.4％相似性。
圖4顯示分離菌20的16S rRNA序列(序列編號(hào)2)與它的最近的種系發(fā)生親屬類黃假單胞菌的比對(duì)，有99.4％相似性。
圖5是建立在比較分離菌20(序列編號(hào)2)和其最近親屬的16SrRNA序列基礎(chǔ)上的進(jìn)化系統(tǒng)樹。通過(guò)使用空位罰分為10的Clustal方法建立了多種序列比對(duì)。
圖6顯示在時(shí)間＝0(6A)和時(shí)間＝60分鐘(6B)時(shí)RI實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖7，8，9涉及實(shí)施例中所描述的Vickers硬度試驗(yàn)。
名詞抗凍肽和抗凍蛋白在本發(fā)明的內(nèi)容中可互換使用。這些名詞縮寫為AFP。
對(duì)于一種水性的低溫環(huán)境，我們表示一種環(huán)境，它主要包括一年中至少部分時(shí)間溫度低于0℃的水。我們優(yōu)選含鹽環(huán)境，例如含有足夠的鹽成分(鹽度)來(lái)顯著降低冰的冰點(diǎn)(例如降低0.2℃或更多)。鹽度可以多于或少于海水的鹽度(35ppt)。能夠收集細(xì)菌的優(yōu)選的環(huán)境是鹽湖(包括超鹽湖)，或者在這種湖里的位點(diǎn)。特別地，我們優(yōu)選從南極環(huán)境收集合適的細(xì)菌用于本發(fā)明。
南極洲的鹽湖通常是半對(duì)流湖或單對(duì)流湖。半對(duì)流湖有持久的化學(xué)和溫度分層的水柱。在表面有更冷的少鹽的水，深部有更溫暖多鹽的水。在南極洲這種湖在一年的大多時(shí)間被冰覆蓋，只有在夏天短暫地破冰而出。在南極洲單對(duì)流湖是高鹽湖，鹽分太多以至于不能在冬天完全被冰覆蓋。冰層像是熱毯子。沒有它，與空氣接觸的湖水冷到非常低的溫度。在冬天它們的水柱以溫度分層，冷水在表面，暖水在下面。在夏天分層打破，水柱有同一溫度。就半對(duì)流和單對(duì)流兩種南極湖來(lái)說(shuō)，在冬天有時(shí)水溫遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0℃。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及從上述南極洲湖，優(yōu)選從半對(duì)流湖或單對(duì)流湖分離的新細(xì)菌的培養(yǎng)物。
我們進(jìn)一步提供產(chǎn)生抗凍蛋白的海單胞菌屬物種的純細(xì)菌培養(yǎng)物，所述細(xì)菌培養(yǎng)物的16S rRNA基因序列與生物體Marinomonasprotea中的對(duì)應(yīng)序列(序列編號(hào)1)表現(xiàn)出至少90％和優(yōu)選95％的同源性。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生抗凍蛋白的假單胞菌屬物種的純細(xì)菌培養(yǎng)物，所述細(xì)菌培養(yǎng)物的16S rRNA序列與序列編號(hào)2的基因序列表現(xiàn)出至少90％和優(yōu)選至少95％的序列同源性。上述的培養(yǎng)在執(zhí)行發(fā)明的方法過(guò)程中可獲得。
本發(fā)明的方法包括4個(gè)階段一種或更多細(xì)菌樣品的收集；培養(yǎng)細(xì)菌和蛋白提??；蛋白的檢測(cè)和選擇；以及蛋白的生產(chǎn)。1.樣品收集在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)菌樣品從水性低溫環(huán)境中收集。如前面所指出的，“低溫”環(huán)境表示一年中至少部分時(shí)間中形成冰的環(huán)境。這種環(huán)境在高緯度和高經(jīng)度或兩者兼有時(shí)存在。我們優(yōu)選收集來(lái)自鹽環(huán)境，尤其是鹽水湖的細(xì)菌。特別優(yōu)選的環(huán)境在南極洲發(fā)現(xiàn)，可以包括半對(duì)流湖或單對(duì)流湖。這種湖包括有多種特性，例如溫度和鹽濃度的位點(diǎn)，細(xì)菌樣品可以從許多這種位點(diǎn)收集，用于隨后的實(shí)驗(yàn)室研究。2.蛋白提取每種細(xì)菌樣品在適當(dāng)條件下培養(yǎng)，由此生產(chǎn)抗凍蛋白，蛋白從液體培養(yǎng)基中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法提取，例如通過(guò)細(xì)胞離心，沉淀和在緩沖液中用玻璃球渦旋。3.蛋白檢測(cè)步驟2中提取的蛋白通過(guò)檢測(cè)其抗凍特性分類。有多種適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。我們優(yōu)選使用重結(jié)晶抑制試驗(yàn)如下面更詳細(xì)的描述。它測(cè)量了蛋白存在時(shí)當(dāng)儲(chǔ)存在冷凍條件下時(shí)冰晶大小增加的傾向。通過(guò)使用此試驗(yàn)，可以篩選在其存在下重結(jié)晶和晶體生長(zhǎng)停止或減少的有效AFP蛋白。
有抗凍特性的蛋白定義為，在實(shí)施例所定義的重結(jié)晶分析中優(yōu)選表現(xiàn)出在最大為1mg/ml的濃度下冰晶生長(zhǎng)為6um或更少的蛋白。4.蛋白生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的方法選擇的蛋白大量被生產(chǎn)，用于AFP食品添加劑。這可以多種方式進(jìn)行。例如，最初用來(lái)獲得蛋白的方法(細(xì)菌培養(yǎng)后提取蛋白)可以按比例增加。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件(溫度，培養(yǎng)基，等)和細(xì)菌選擇進(jìn)行試驗(yàn)，產(chǎn)量可增加?？梢詮募?xì)菌分離編碼選擇的AFP的DNA序列，將其引入表達(dá)盒，在不同宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白。
在一種優(yōu)選方法中，使含有蛋白的分離菌接受熱處理如巴氏消毒或滅菌，以便滅活有活性的細(xì)菌和可能影響已形成的抗凍肽的蛋白如蛋白酶。
因此本發(fā)明的一個(gè)非常重要的特點(diǎn)是分離的AFPs優(yōu)選耐熱。如果不能通過(guò)熱處理來(lái)滅活蛋白酶，在許多情況下需要使用化學(xué)的蛋白酶抑制劑，它們大多數(shù)是有毒的，因此不適合在食品中使用。
令人吃驚地，前面指出的由南極洲來(lái)源分離的蛋白是熱穩(wěn)定的，盡管它們天然的，原始的環(huán)境非常冷。
本

發(fā)明內(nèi)容
中熱穩(wěn)定蛋白定義為在巴氏消毒處理后，保持熱處理前蛋白抗凍活性的至少50％，優(yōu)選至少80％的蛋白。
最優(yōu)選地，在滅菌處理后保持活性。
另一方面，本發(fā)明涉及一種表現(xiàn)抗凍特性的蛋白，通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或從上面指出的培養(yǎng)物分離。
更具體地，本發(fā)明包括有抗凍特性的新蛋白marinomonin。進(jìn)一步包括具有抗凍特性的marinomonin的異構(gòu)體和衍生物，如糖基化的形式。
這些顯示抗凍特性的蛋白最優(yōu)選是熱穩(wěn)定的。
如實(shí)施例中所示，由Marinomonas protea分離的抗凍肽顯示Ala-Glu-Gly-Ser-Thr-Gly/Val-Asp-Val-Tyr-Gln-Asn-Ile-Gln-Tyr-Ala-Gly-(序列編號(hào)3)的N末端氨基酸序列。優(yōu)選地，衍生物N末端氨基酸序列與上面給出的16肽序列表現(xiàn)出至少75％，更優(yōu)選85％以及特別優(yōu)選至少95％的同源性。
有抗凍特性的序列編號(hào)3的氨基酸序列的異構(gòu)體和衍生物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括核酸序列，特別是編碼本發(fā)明新蛋白的DNA。這些容易根據(jù)前面所示的蛋白序列得到。
在另一優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及編碼序列編號(hào)3的氨基酸序列的核酸序列。
本發(fā)明的方法包括在一定條件下培養(yǎng)含編碼本發(fā)明的marinomonin或另一種抗凍蛋白的DNA序列的生物體，生產(chǎn)marinomonin或抗凍蛋白，以及回收這種蛋白。
一種適用于本發(fā)明的此種生物體是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌Marinomonasprotea。培養(yǎng)這種生物體的適當(dāng)?shù)臈l件和培養(yǎng)基在實(shí)施例中指出。
可能發(fā)現(xiàn)其他生物體含編碼marinomonin的DNA，可能證實(shí)其可以用于本發(fā)明的方法。另一選擇是使用一種遺傳學(xué)上轉(zhuǎn)化的含編碼marinomonin或其類似物的抗凍蛋白的DNA序列的生物體，該序列處于適于使其在被轉(zhuǎn)化生物體內(nèi)產(chǎn)生抗凍蛋白的基因啟動(dòng)子的控制下。編碼抗凍蛋白的DNA序列可以插入適當(dāng)表達(dá)的載體中，載體包含在恰當(dāng)條件下，轉(zhuǎn)錄和翻譯成要求蛋白所必要的元件，包括合適的序列方向、正確的讀框、適當(dāng)?shù)陌邢蚝捅磉_(dá)序列。制造適當(dāng)?shù)妮d體，和使用它們來(lái)轉(zhuǎn)化許多不同種類的生物體的方法，在本領(lǐng)域中是眾所周知的。適合執(zhí)行本發(fā)明方法的遺傳學(xué)上轉(zhuǎn)化的生物體也形成了發(fā)明的另一方面。
原則上，任何生物體可以用這種方式進(jìn)行修飾，產(chǎn)生需要的蛋白，例如，細(xì)菌，酵母菌，植物，或植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)菌，酵母菌和植物或植物細(xì)胞體系一般是優(yōu)選的。
也可以提供適當(dāng)?shù)倪m于產(chǎn)生本發(fā)明的AFPs遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化的生物體，它們本身是有用的，因?yàn)樗鼈兊目顾獌瞿芰?qiáng)。這特別適合植物可以是谷類如小麥或玉米或雙子葉植物如黃豆，西紅柿或萵苣。這些植物也形成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的抗凍肽能方便地用于一些產(chǎn)品，優(yōu)選用于已被冷凍或打算冷凍的食品中。這些食品的例子是冷凍食品如蔬菜，調(diào)味汁，湯，點(diǎn)心，奶制品和冷凍的甜品，甜品包括果汁冰糕，冰糕，格蘭尼它冰糕，冷凍果凍和含奶的冷凍甜點(diǎn)如冰淇淋，冷凍的酸奶或乳蛋糕，果汁牛奶凍和冰奶。優(yōu)選的食品是冷凍蔬菜和冷凍甜品，如冰淇淋，冰糕。如果使用干混合物或濃縮物，濃度可以更高，以保證最終冷凍產(chǎn)品中的水平在要求的范圍內(nèi)。優(yōu)選的AFP水平是終產(chǎn)品重量的0.00005到0.3％，特別是0.0001到0.2％。
沒有必要加入高純化形式的AFP可以加入含AFP的組合物，例如一種產(chǎn)生AFP的生物體的提取物。
本發(fā)明的冷凍甜品能通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒óa(chǎn)生。優(yōu)選地，配方的所有成分冷凍前在或環(huán)境溫度或更高溫度完全地被混合在一起。在冷凍甜點(diǎn)中固體(如糖，脂肪，調(diào)味品)水平適當(dāng)?shù)乇徽{(diào)整到終產(chǎn)品重量的至少3％，通常10到70％，特別是40到70％。
現(xiàn)在通過(guò)下面的非限制性實(shí)施例闡明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1從南極洲湖的多個(gè)位點(diǎn)收集19種分離菌。發(fā)現(xiàn)兩種產(chǎn)生抗凍蛋白(見下面表1)，即分離菌196和分離菌20。這些細(xì)菌分別從Ace湖和Club湖分離。Ace湖是半對(duì)流湖Club湖是單對(duì)流湖。兩種細(xì)菌均從接近湖的表面分離。分離菌196從冰/水交界分離。分離菌20從遠(yuǎn)離湖邊的水柱的頂端50cm分離。下面是兩個(gè)湖的更多細(xì)節(jié)Ace湖表面為半成性-18ppt鹽度隨深度增加到34ppt。
冰覆蓋每年的10-11個(gè)月半對(duì)流湖-化學(xué)和溫度分層Club湖高鹽(250ppt)沒有冰覆蓋單對(duì)流湖-冬天溫度上分層夏天水柱混合分離菌培養(yǎng)分離菌接種入200ml的胰胨豆胨培養(yǎng)液(Oxoid)中。
分離菌196(Marinomonas protea)也在200ml海鹽培養(yǎng)液和200ml 1/2海鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
胰胨豆胨培養(yǎng)液[“TSB”]酪蛋白的胰液消化物(Oxoid) 11.3g/L大豆的木瓜蛋白酶消化物 2g/L磷酸氫二鉀 1.7g/L葡萄糖 1.7g/LNaCl3.3g/LpH 7.3+/-0.2海鹽培養(yǎng)液[“SSB”]海鹽(Sigma)40g/L蛋白胨(BDH)5g/L酵母提取物(Merck) 2g/L海水培養(yǎng)液[“SWB”]‘Instant Ocean’ 38g/L(Aquarium Systems，法國(guó))酵母提取物(Merck) 1g/L蛋白胨(BDH)1g/L
1/2海水培養(yǎng)液[“1/2SWB”]‘Instant Ocean’ 19g/L(Aquarium Systems，法國(guó))酵母提取物(Merck)1g/L蛋白胨(BDH) 1g/L所有的培養(yǎng)物在15℃孵育直到明顯的混濁(這需要2-6天，取決于每種培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率)。然后所有培養(yǎng)物在5℃冷休克4天。也產(chǎn)生200ml大腸桿菌培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照。這是菌株W3110。其在搖瓶中的Lauria-Bertani[“LB”]培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
LB培養(yǎng)基 Bacto-胰蛋白胨 10g/LBacto-酵母提取物 5g/LNaCl 10g/L調(diào)整到PH7.0蛋白提取下面的步驟給出提取細(xì)胞總蛋白的方法。
1.通過(guò)離心從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。使用帶有固定角JA-14轉(zhuǎn)子的Beckman低溫離心機(jī)。樣品在4℃的恒溫下，10,000rpm(15,300g)速度離心10分鐘。仔細(xì)去除上清液，留下沉淀物。
2.沉淀物在1ml 10mM Tris/HCL緩沖液(PH7.0)中重懸。使用步驟1的同樣的離心條件再沉淀。仔細(xì)去除上清液，留下沉淀物。
3.沉淀物然后在1ml蛋白提取緩沖液(見下文)中重懸，然后在冰里保存5分鐘以便允許細(xì)胞裂解。重懸的沉淀物然后在一個(gè)厚壁瓶子內(nèi)使用Sanyo Soniprep150在15A超聲處理30秒。
4.然后將超聲處理了的混合物轉(zhuǎn)移回離心管，按步驟1中描述的進(jìn)行離心。上清液被移去并在-20℃冷凍直到需要使用時(shí)。
蛋白提取緩沖液25mM Tris/HCL(PH7.0)1mM EDTA1mM PMSF(Sigma)2μg/mL胃蛋白酶抑制素A(Sigma)Splat測(cè)定下面的步驟是用來(lái)觀察通過(guò)每種蛋白提取物達(dá)到的冰重結(jié)晶抑制水平的方法。它是Byass等描述的測(cè)定的改進(jìn)。[Unilever WO-A-98/04148]。
1.配制60％的蔗糖溶液。20μl每種蛋白提取物的樣品與20μl蔗糖溶液混合。然后將這些混合物裝在1.5mlEppendorf管內(nèi)。30％蔗糖/蛋白提取物溶液在MSE Micro Centaur DesK top微離心機(jī)中離心10秒鐘，確保所有液體在管底部混合。
2.將5μl上面得到的溶液放在2個(gè)圓形的直徑為16mm的蓋玻片之間，蓋玻片上以防水筆寫下提取物數(shù)量。然后吸干。
3.然后在蓋玻片內(nèi)滴入已預(yù)冷到-70℃(使用干冰)的2，2，4--三甲基戊烷。將它們?cè)谄渲羞^(guò)冷2分鐘。
4.在一個(gè)預(yù)冷的浴器充入3/4容積的2，2，4-三甲基戊烷，2，2，4--三甲基戊烷使用一個(gè)Haake C水浴循環(huán)器和兩個(gè)Haake溫度控制單位(PG40和F4)預(yù)冷到-6℃。
5.蓋玻片從過(guò)冷過(guò)程移走，直接放入-6℃浴器30分鐘允許重結(jié)晶。
6.然后當(dāng)蓋玻片在-6℃浴器內(nèi)時(shí)，在一個(gè)Leitz Dialux20 EB載物臺(tái)上使用EF L20/0.30 160/0-2物鏡進(jìn)行觀察。
7.觀測(cè)到的晶體的形狀，大小和密度與使用下面描述的Splat評(píng)分系統(tǒng)測(cè)定的AFP活性水平有關(guān)。
Splat評(píng)分觀測(cè)到的晶體形態(tài)+++++非常小，非常稠密的晶體。
++++ 小的，不稠密；或小的，很稠密，有一些中等大小的晶體。
+++ 小的，不稠密的，有中-大的晶體；或小-中等大小，不稠密的晶體。
++ 中或大的晶體，有一些小晶體+大的，圓的稀疏的晶體(即30％蔗糖對(duì)照)[分離菌要有實(shí)際用途需要+++或以上的評(píng)分]splat測(cè)定結(jié)果在表1中顯示表1

表1中的結(jié)果顯示，在被調(diào)查的南極洲細(xì)菌的19種分離菌里，只有分離菌196和分離菌20產(chǎn)生具有有意義量AFP的蛋白。分離菌196是Marinomonas protea，如下面所進(jìn)一步描述的。實(shí)施例2分離菌196的收集細(xì)菌在96年6月31日從南極洲(68°28’S，78°11’E)Ace湖的冰/水交界分離。樣品由在湖的最深點(diǎn)通過(guò)冰(1600mm厚)鉆洞收集。來(lái)自冰/水交界的核心下部的片段融化在瓊脂上。該物質(zhì)被命名為分離菌196。分離菌196的生長(zhǎng)特性在10℃的半強(qiáng)度海水瓊脂中孵育3到5天后形成的分離菌196的菌落是沒有色素沉著的(奶油色)，光滑，凸面，圓形帶有完整的邊緣，大小從直徑小于0.5mm到1.5mm不等。在胰胨豆胨瓊脂上的菌落是淺褐色的，黏液樣和播散的，直徑2-5mm。分離菌是嗜冷的，在溫度＜0到約25℃之間生長(zhǎng)(最佳生長(zhǎng)在15-22℃)，在30℃不生長(zhǎng)。細(xì)菌在需氧和微需氧的條件下生長(zhǎng)，但在無(wú)氧時(shí)不生長(zhǎng)。它不需要海水來(lái)生長(zhǎng)，但能耐受高達(dá)70％的NaCl。在60-70％NaCl中生長(zhǎng)的細(xì)胞包括直桿和球形細(xì)胞，這些細(xì)胞比在低鹽培養(yǎng)基中的細(xì)胞看上去更皺和具有更多鋸齒。不同種類培養(yǎng)基中的典型生長(zhǎng)曲線在圖1和2中顯示。生物體分類分析分離菌196的16S rRNA的種系發(fā)生分離菌的鑒定建立在16S rRNA分析的基礎(chǔ)上。獲得了16S rRNA基因的接近完整的(1,485bp)序列，從核苷酸位置18伸展到1530(大腸桿菌相當(dāng)?shù)臄?shù)目)，見圖3。對(duì)公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種進(jìn)行的16S rRNA分析顯示它代表一種海單胞菌屬的新物種(在proteobacteria門的gamma--3亞綱)，與普遍海單胞菌(該屬的物種)有74.7％一致性。兩個(gè)序列間的匹配在圖4中顯示。提議(Prof.HansG.Truper，pers.comm.)使用名稱Marinomonas protea sp.nov.(pro’t e.a.Gr.n.Proteos，希臘神話的海洋之神的名稱，它能夠表現(xiàn)為許多種外形，M.L.fem.adj.protea，多形態(tài)的)。該細(xì)菌在1999年2月9日已被保藏在英國(guó)國(guó)立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，Aberdeen，編號(hào)為41006。
此研究中產(chǎn)生的16S rRNA序列被保藏在GenBank中。序列相似性百分比在表1中給出。使用PHYLIP(3.57c版)確定的進(jìn)化系統(tǒng)樹在圖5中顯示。它使用幾乎完整的16S rRNA序列，比較Marinomonasprotea與其最近的種系發(fā)生親屬以及三種其他的海冰分離菌被鑒定為海單胞菌物種(M.Brown，pers.comm)的。使用最大可能性方法(Felsenstein，1981)構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹。分離菌20的16S rRNA種系發(fā)生分析分離菌20的分析發(fā)現(xiàn)它是假單胞菌的一種物種。更明確地，發(fā)現(xiàn)分離菌20與類黃假單胞菌有99.4％的相似值。此株保藏在布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏單位NCIMB，Aberdeen，蘇格蘭，編號(hào)為NCIMB41076。實(shí)施例3總細(xì)胞蛋白提取分離菌196的細(xì)菌培養(yǎng)物(2L)在15℃液態(tài)培養(yǎng)基(胰胨豆胨培養(yǎng)液)中生長(zhǎng)直到混濁。培養(yǎng)物無(wú)菌吸入無(wú)菌NalgeneTM通用瓶中。在5℃以4,200xg離心12分鐘收集(Sorvall Dupont Econospin)。沉淀物在1ml冰冷的10mM Tris緩沖液(Tris[羥甲基]氨基-甲烷)/HCl(PH7.0)中重懸。細(xì)胞被沉淀10分鐘。然后沉淀或者被儲(chǔ)存在-20℃過(guò)夜，或者立即提取蛋白。沉淀在1ml冰冷的天然提取緩沖液(NEB，由25mM Tris/HCl(PH7.0)，1mM EDTA，1mM PMSF和0.1mM胃蛋白酶抑制素A組成)中重懸。Tris緩沖液作為生化緩沖液起作用，EDTA是螯合劑，對(duì)金屬蛋白酶有活性，PMSF是絲氨酸蛋白酶抑制劑，胃蛋白酶抑制素A抑制蛋白酶。對(duì)每種重懸的沉淀，加入兩種體積的酸(70％HCl)洗過(guò)的玻璃珠(1.5ml 425-600μm直徑的珠子和0.5ml 3mm直徑的珠子，均購(gòu)自Sigma)，或足以在珠子表面產(chǎn)生粘的附著的細(xì)胞懸浮物外殼。珠子是酸洗過(guò)的，以便阻止渦旋時(shí)從玻璃中釋放堿，因?yàn)檫@將可能破壞細(xì)胞的堿敏感成分。然后將混合物在冰中渦旋數(shù)個(gè)1分鐘時(shí)間，每次間隔1分鐘。每個(gè)樣品重復(fù)8次，其后將另外的1ml的冰冷NEB加入珠子，再渦旋使細(xì)胞懸浮物能進(jìn)入溶液。細(xì)胞留在冰上5分鐘來(lái)允許玻璃珠沉降，將裂解物轉(zhuǎn)移到1ml無(wú)菌、冰冷的Eppendorf管并離心(Beckman MSE，12,000xg，5℃，5分鐘)，從而分離細(xì)胞壁和沒有破裂的細(xì)胞，以及偶然被轉(zhuǎn)移了的一些玻璃珠。上清液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的、冰冷的Eppendorf管中并再次離心，除去一些可能干擾RI測(cè)定的其它的細(xì)胞碎片。將上清液吸入2個(gè)冰冷的，標(biāo)記的Eppendorfs中，在-20℃儲(chǔ)存直到進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例4細(xì)菌抗凍蛋白對(duì)冰晶形態(tài)的影響通過(guò)在-6℃下顯微鏡檢查總細(xì)胞蛋白提取物來(lái)評(píng)估來(lái)自分離菌196的抗凍蛋白(實(shí)施例3中獲得)對(duì)冰晶形態(tài)的影響。可清楚的見到六邊形冰晶，一些是延長(zhǎng)的。實(shí)施例5蛋白純化和序列信息有活性的蛋白的純化使用AKTATM蛋白純化系統(tǒng)上的反相層析(RPC)，跟著使用SMARTM系統(tǒng)上的凝膠排阻層析(SephadexR 75，或S75)(均為PharmaciaBiotech)從實(shí)施例3中產(chǎn)生的粗提取物分離命名為marinomonin的細(xì)菌抗凍蛋白。來(lái)自每種分離方法的有活性的片段在10％雙丙烯酰胺SDS凝膠中電泳獲得的條帶在分子量約38KDa附近。序列信息將38KDa蛋白條帶電印跡到PVDF膜上，進(jìn)行N端測(cè)序。獲得下面的16氨基酸序列，第6個(gè)氨基酸產(chǎn)生甘氨酸或纈氨酸的不確定結(jié)果(黑體區(qū)表示用于設(shè)計(jì)寡核苷酸探針的序列區(qū)域)Ala-Glu-Gly-Ser-Thr-Gly/Val-Asp-Val-Tyr-Gln-Asn-Ile-Gln-Tyr-Ala-Gly(序列編號(hào)3)數(shù)據(jù)庫(kù)同源性檢索序列同源性檢索使用新AFP蛋白的N末端序列，采用FASTA檢索對(duì)SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)執(zhí)行，后者包括所有已公開的AFP序列。序列匹配是隨機(jī)的，其中相似性適于廣泛的生物體，既有細(xì)菌也有真核生物，且相似性不是特別高。而且，在蛋白序列之間的同源性不是定位在數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白的N末端，而是中間序列這減少了在蛋白序列和此新蛋白的N末端序列之間任意真正同源性的可能性。實(shí)施例6使產(chǎn)生AFP的微生物具有實(shí)際用途的兩個(gè)重要要求是它的培養(yǎng)能容易地按比例增加和AFP活性是穩(wěn)定。例如，對(duì)熱變性的易感性使得在制造過(guò)程經(jīng)巴氏消毒的食品原料如冰淇淋中使用AFP更困難。在“搖瓶”(9升刻度)中培養(yǎng)Marinomonas protea分離菌196(Marinomonas protea)在18個(gè)含500ml無(wú)菌的海鹽培養(yǎng)液(海鹽(Sigma)40g/L；蛋白胨(Fisher)5g/L；酵母提取物(Difco)2g/L)的1L的Erlenmeyer瓶中培養(yǎng)。將100μl已有的M.protea培養(yǎng)物無(wú)菌地接種到瓶中。使培養(yǎng)物在Sanyo孵育器中在15℃靜止地生長(zhǎng)7天。培養(yǎng)物在15℃下2天后顯示出混濁的征象。在第7天孵育器溫度被調(diào)整到4℃，并在此溫度再保持7天來(lái)誘導(dǎo)抗凍蛋白(AFP)的產(chǎn)生。
在4℃冷誘導(dǎo)7天后，來(lái)自9L培養(yǎng)物的細(xì)胞通過(guò)重復(fù)離心收集到6個(gè)無(wú)菌的300ml容器中。在Sorvall Instruments RC5C離心機(jī)中使用Sorvall F16/250固定角轉(zhuǎn)子在7000rpm 4℃離心20分鐘。隨著每次離心步驟上清液被棄去，加入另外的培養(yǎng)物并重復(fù)離心。以此方式，沉淀物被聚集在6個(gè)容器中直到收獲9L培養(yǎng)物。將6個(gè)容器和相應(yīng)的沉淀物儲(chǔ)存在-80℃直到需要進(jìn)行蛋白提取和SPLAT檢測(cè)。從9L培養(yǎng)物進(jìn)行蛋白提取和對(duì)AFP活性進(jìn)行splat檢測(cè)沉淀物在10ml冰冷的10mM Tris/HCl(PH7.0)中通過(guò)柔和的重懸進(jìn)行洗滌。取1ml重懸細(xì)胞裝入Epphendorf管中在微離心機(jī)(MSEMecroCentaur)中以13,000rpm進(jìn)行離心5分鐘?！跋礈焐锨逡骸北槐Ａ?，用于通過(guò)SPLAT測(cè)定檢驗(yàn)AFP活性。沉淀的細(xì)胞(約0.2g)重懸在800ul的冰冷的提取緩沖液(50mM Tris/HCl，PH7.0)和200μlSigma提供的細(xì)菌蛋白酶抑制劑混合物中。[此混合物包括對(duì)絲氨酸，半胱氨酸，天門冬氨酸，金屬蛋白酶和氨基肽酶的抑制有廣泛特異性的蛋白酶抑制劑混合物。它包含4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟化物(AEBSF)，胃蛋白酶抑制素-A，反式-環(huán)氧琥珀酰-L-亮氨酰-酰胺(4-胍基)丁烷(E-64)，苯丁抑制素，和EDTA鈉]。將樣品渦旋轉(zhuǎn)然后放在冰中，此過(guò)程被重復(fù)共8次。然后離心樣品，“提取物上清液”被保留，用于通過(guò)SPLAT測(cè)定檢驗(yàn)AFP。
SPLAT活性

實(shí)施例7通過(guò)在8℃冷休克培養(yǎng)物進(jìn)行AFP誘導(dǎo)為使AFP生產(chǎn)容易按比例增加，冷休克在不同溫度范圍有效是重要的。例如，在8℃以下的溫度操作發(fā)酵罐是困難的。因此，為了能夠在發(fā)酵罐中按比例的增加生產(chǎn)，通過(guò)在8℃或以上的溫度冷休克誘導(dǎo)AFP的表達(dá)必須是可能的。這個(gè)實(shí)施例顯示Marinomonas protea培養(yǎng)物能夠被誘導(dǎo)在8℃表達(dá)AFP。
分離菌196(Marinomonas protea)在含500ml無(wú)菌的海鹽培養(yǎng)液(海鹽(Sigma)40g/L；蛋白胨(Fisher)5g/L；酵母提取物(Difco)2g/L)的1L Erlenmeyer瓶中培養(yǎng)。燒瓶以100μl已有的M.protea培養(yǎng)物無(wú)菌地進(jìn)行接種。培養(yǎng)物在Sanyo孵育器中在15℃靜止地生長(zhǎng)7天。培養(yǎng)物在15℃培養(yǎng)2天后顯示出混濁的征象。在第7天，培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)設(shè)定為8℃的Conviron孵育器中，此溫度保持另外7天來(lái)誘導(dǎo)抗凍蛋白(AFP)產(chǎn)生。
隨后的7天在8℃冷誘導(dǎo)，收獲M.protea培養(yǎng)物并通過(guò)SPLAT測(cè)定檢驗(yàn)AFP活性。通過(guò)反復(fù)離心500ml培養(yǎng)物被收集到一個(gè)50ml的容器中。在Sorvall Instrument RC5C離心機(jī)中使用Sorvall SS34轉(zhuǎn)子在4℃下以9000rpm離心5分鐘。在每次離心步驟后，棄去上清液，另外的培養(yǎng)物被加入并重復(fù)離心。以此方式將沉淀物聚集到容器中直到收獲500ml培養(yǎng)物。得到的細(xì)胞沉淀物重0.9g。
0.9g的沉淀細(xì)胞輕柔地在1ml冰冷提取緩沖液(25mM Tris/HCl，PH7.0)和0.5mL由Sigma提供的細(xì)菌蛋白酶抑制劑混合物(見實(shí)施例6)中重懸。樣品被渦旋，然后放在冰上，此過(guò)程重復(fù)共8次。樣品然后在Sorvall Instrument RC5C離心機(jī)中使用Sorvall SS34轉(zhuǎn)子在18000rpm離心10分鐘，“提取上清液”使用0.2μm濾器過(guò)濾并保留進(jìn)行SPLAT活性鑒定(見表)。

實(shí)施例8由Marinomonas protea提取的AFP的熱穩(wěn)定性從Marinomonas protea的培養(yǎng)物中制備含AFP的提取物，基本上如實(shí)施例6中描述的。將25μl的等分物(總共5個(gè))放入500μl的Eppendorf管中并檢測(cè)熱穩(wěn)定性。將4個(gè)管子放入沸水浴中。每個(gè)管子進(jìn)行不同時(shí)間的熱處理分別為1，2，5，或15分鐘。第5個(gè)管子作為對(duì)照，不進(jìn)行熱處理。在熱處理后，將所有管子立即放入冰中，然后使用splat測(cè)定檢驗(yàn)AFP活性。
沸水浴后SPLAT活性

由于從Marinomonas protea提取的AFP能不被煮沸破壞，因此適用于制造過(guò)程需巴氏消毒的食品原料。例如，冰淇淋“混合物”在冷卻和冰凍前一般應(yīng)保持在82℃25秒進(jìn)行巴氏消毒。這個(gè)實(shí)施例顯示由Marinomonas protea提取的AFP能經(jīng)受此種巴氏消毒的方法而不失去AFP活性。實(shí)施例9為從Marinomonas protea分離AFP，優(yōu)選的方法描述如下。a)培養(yǎng)細(xì)胞按前面的實(shí)施例6所描述的方法(15℃生長(zhǎng)和4℃誘導(dǎo))產(chǎn)生10升培養(yǎng)物。細(xì)胞通過(guò)離心收獲并保存在-80℃直到需要。b)蛋白提取細(xì)胞在提取緩沖液(20mM Tris，10mM EDTA，PH7.1)中重懸，然后使用Sanyo Soniprep15探針在振幅12μ以超聲處理10次，每次15秒，間隔45秒。在超聲操作過(guò)程提取物放在冰/乙醇浴中避免提取物過(guò)熱。c)熱處理滅活蛋白酶將提取物置于沸水浴中4.5分鐘。測(cè)量樣品的溫度，發(fā)現(xiàn)達(dá)到73℃。我們已發(fā)現(xiàn)這是滅活樣品中蛋白酶的非常有效的方法，同時(shí)殺死樣品中大部分或全部細(xì)菌(Marinomonas protea)。d)從細(xì)胞碎片分離AFP提取物在Sorval離心機(jī)(SS-34轉(zhuǎn)子)中以16,000rpm在4℃離心1小時(shí)除去細(xì)胞碎片。發(fā)現(xiàn)AFP存在于上清液中。e)除去剩下的能存活的細(xì)菌對(duì)許多冷凍的食品，如冰淇淋，保證除去所有能存活的細(xì)菌是重要的。這保證了產(chǎn)品和設(shè)備能夠保持高衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)本發(fā)明中AFP的制劑，我們已發(fā)現(xiàn)這可以通過(guò)微量過(guò)濾獲得。在這個(gè)實(shí)施例中，上面(d)中描述的上清液用Nalgene0.2μm滅菌單位過(guò)濾。濾液以無(wú)菌試管收集并在-80℃儲(chǔ)存直到需要。f)質(zhì)量保證-整個(gè)過(guò)程中AFP活性和可存活細(xì)胞的測(cè)量在過(guò)程中的每一步，提取物以splat測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。也檢測(cè)提取物細(xì)菌細(xì)胞的存在。使用包含來(lái)自Sigma的胰胨豆胨瓊脂的培養(yǎng)皿(40g稀釋在1L中)。樣品在培養(yǎng)皿上畫成環(huán)狀或用涂布器(50ul)鋪成平板并且在15℃孵育7天。樣品是N1重懸于提取物緩沖液中的細(xì)胞(Splat評(píng)分++++)。
N2在提取物緩沖液中，經(jīng)超聲處理后的細(xì)胞(Splat評(píng)分+++++)。
N3在提取物緩沖液中，經(jīng)超聲處理并煮沸4分鐘30秒后的細(xì)胞(Splat評(píng)分+++++)。
N4離心1小時(shí)并在0.2μ滅菌單位中過(guò)濾的N3(Splat評(píng)分+++++)。

√在培養(yǎng)皿中存在菌落×沒有菌落結(jié)論此方法產(chǎn)生的AFP是A)有活性，B)沒有能存活的細(xì)胞，C)沒有有毒性的化學(xué)物質(zhì)。實(shí)施例10這個(gè)實(shí)施例中證實(shí)了通過(guò)使用“重結(jié)晶抑制(RI)測(cè)定”如何測(cè)定向食品原料加入的含AFP的溶液量。RI測(cè)定是定量的，但它也是費(fèi)時(shí)的，要求特殊的設(shè)備。測(cè)量冰重結(jié)晶抑制的測(cè)定先前已經(jīng)由Jarman等描述。(WO 99/37782)。在此實(shí)施例中，使用下面給出的步驟。RI測(cè)定步驟包含來(lái)自Marinomonas protea的含AFP的溶液用蔗糖晶體調(diào)整到30wt％的蔗糖水平。將3μl的一滴樣品放置到22mm的蓋玻片上。
然后將一個(gè)16mm直徑的蓋玻片放在上面，然后將200g的重物放在樣品上以保證一致的玻片厚度。蓋玻片的邊緣以clearnail清漆封閉。玻片放在由Linkam THM600控溫顯微鏡載物臺(tái)上。載物臺(tái)很快冷卻到(每分鐘50℃)-40℃來(lái)產(chǎn)生大量小晶體。載物臺(tái)溫度然后很快升到(每分鐘50℃)-6.0℃并保持在此溫度。使用Leitz Ortholux II顯微鏡在-6.0℃觀察到冰相。采用偏振光條件連同Lambda板來(lái)增強(qiáng)冰晶的對(duì)比度。在T＝0和T＝60分鐘記錄圖像并使用圖像分析軟件(AnalySIS，Soft-Imaging Software GmbH，D48153，Munster，Hammerstrasse，89德國(guó))進(jìn)行分析。晶體生長(zhǎng)的計(jì)算如下。
在特定時(shí)間通過(guò)捕獲群體的圖像(使用上面提到的設(shè)備)測(cè)定一群冰晶的平均大小，然后選擇包含至少200個(gè)冰晶的圖像的一個(gè)區(qū)域。每個(gè)晶體的最長(zhǎng)的直徑通過(guò)在其周圍畫圖并使用圖像分析軟件計(jì)算最長(zhǎng)直徑來(lái)測(cè)定。
每種RI試驗(yàn)進(jìn)行3次(因此至少600個(gè)冰晶的圖像)。表中的數(shù)據(jù)記錄了平均冰晶生長(zhǎng)(即在零時(shí)和60分鐘后平均冰晶直徑不同)。可信限按平均95％的置信區(qū)間計(jì)算。
為了找出樣品稀釋多少仍可有效抑制冰的重結(jié)晶，進(jìn)行了對(duì)Marinomonas AFP制劑的幾種稀釋。在實(shí)踐條件中如果一個(gè)上述的稀釋液或制劑的樣品導(dǎo)致在RI測(cè)定中冰晶生長(zhǎng)為3μm或更少，我們認(rèn)為AFP制劑或AFP制劑的稀釋液有效抑制冰的重結(jié)晶。RI測(cè)定結(jié)果平均晶體生長(zhǎng)通過(guò)分析1200個(gè)晶體的圖像來(lái)測(cè)定。
圖6A和6B說(shuō)明典型的冰晶圖像，只是顯示了被捕獲和分析的圖像的種類。

結(jié)果顯示AFP制劑稀釋10倍仍可有效抑制冰重結(jié)晶。因此，此制劑的1∶10的稀釋液(＝10％)可用于實(shí)施例11所示的冷凍食品原型。實(shí)施例11冰糕樣品的制備為制備冰糕，制作三種液體預(yù)混合物A)20％蔗糖水溶液(陰性對(duì)照；沒有根據(jù)本發(fā)明)B)包含來(lái)自海單胞菌的AFP的20％蔗糖水溶液。AFP在預(yù)混合物中已被稀釋到一個(gè)濃度，該濃度將產(chǎn)生大約1.9μm的RI值。此處為1∶10或10％稀釋液-RI數(shù)據(jù)見實(shí)施例10。
因此，預(yù)混合物B有下面的組成成分 重量％蔗糖 20.00AFP制劑(在水性的緩沖液中) 10.00水70.00C)含WO-A-97/02343中描述的魚III型AFP HPLC 12的20％蔗糖水溶液。AFP在預(yù)混合物中稀釋到一個(gè)濃度，該濃度將產(chǎn)生約2.9μm的RI值。硬度的測(cè)定按如下方法用每種組合物(A，B，C)制備冰糕的長(zhǎng)方形條(10mm×55mm×95mm)。每種組合物在Gelato Chef 2000(Magimix UKLtd)冰淇淋制造器中冷凍到-3.5℃?；旌衔镛D(zhuǎn)移到先前已冷卻到-30℃，內(nèi)部大小10mm×55mm×95mm的硅酮橡膠造型機(jī)。然后制備物在脫模前在-30℃被冷卻1小時(shí)并在硬度檢測(cè)前在-25℃儲(chǔ)存，使用Vickers硬度試驗(yàn)。維氏硬度維氏硬度試驗(yàn)是一項(xiàng)壓痕試驗(yàn)，其涉及將一錐形壓頭推入物質(zhì)表面并且記錄作為尖端位移函數(shù)的外力。測(cè)量在壓痕負(fù)荷循環(huán)及去負(fù)荷循環(huán)過(guò)程中的力和位移。試驗(yàn)描述于“Handbook of Plastics TestMaterials”Ed.R.P.Brown，Pub.George Godwin Limited，TheBuilder Group，1-3Pemberton Row，F(xiàn)leet Street，London，1981。維式錐形是工程工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(Bsi 427，1990).它有136°的頂角。硬度測(cè)量為Hv＝Fmax/A其中Hv是維氏硬度，F(xiàn)max是最大外力(見圖7)，A是留在物質(zhì)表面壓痕的投影面積。面積A通過(guò)假設(shè)壓痕有與形成它的壓頭一樣的幾何形狀，即維氏錐形來(lái)測(cè)量，因此投影面積能從圖8中di所給的壓痕深度判斷。
A＝24.5di2強(qiáng)度和模數(shù)的測(cè)定按如下方法用每個(gè)組合物(A，B，c)制備冰糕的幾個(gè)(10或更多)細(xì)條(50mm×10mm×2mm)隨后被制備為。精確地刻制一個(gè)硅酮橡膠模，產(chǎn)生50mm×10mm×2mm的內(nèi)部大小。將模放在一片醋酸纖維上緊壓以產(chǎn)生水密封。每種組合物使用高準(zhǔn)確度的微吸量管吸入一個(gè)此種模中，趕走所有氣泡。將第二片醋酸纖維素在充滿的模的頂端鋪開，再次趕走所有氣泡。通過(guò)在-30℃將整個(gè)組件在兩個(gè)氮?dú)饫鋮s的模塊之間放置2分鐘冷凍組合物。此后移走模，在-20℃平衡。通過(guò)移去上面的醋酸纖維素片，隨后移去硅酮橡膠模來(lái)脫膜，然后倒轉(zhuǎn)下層并揭開，露出冰糕條。在使用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)強(qiáng)度和模數(shù)前將這些細(xì)條儲(chǔ)存在-25℃。三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)?zāi)軌虿捎脧澢囼?yàn)測(cè)定凍冷甜品的大量機(jī)械特性，如楊氏模數(shù)(表觀的)和抗彎強(qiáng)度。在彎曲試驗(yàn)中，當(dāng)測(cè)量外力和試樣偏時(shí)時(shí)使試樣變形。為冷凍甜品設(shè)定的概要數(shù)據(jù)在圖8中顯示。彈性模數(shù)通過(guò)這個(gè)曲線的最初線性部分的斜率測(cè)定。適合所有種類固體的普遍試驗(yàn)在“Biomechanics materials.A practical”Ed.J.F.V.Vincent，Pub.IRL Press，Oxford University Press，WaltonStreet，Oxford，1992和“Handbook of Plastics Test materials”Ed.R.P.Brown，Pub.George Godwin Limited，The BuilderGroup，1-3Pemberton Row，F(xiàn)leet Street，London，1981中描述。在這個(gè)特別的應(yīng)用中，在設(shè)定在-20℃的控溫箱中，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)適于評(píng)估冰糕條(50mm×10mm×2mm；象上述制備)。檢測(cè)涉及將每個(gè)條放在2個(gè)分開30mm的支持物上，從上支持物中心施加壓力到條的表面(圖9)。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中記錄在彎曲中施加的力和動(dòng)觸點(diǎn)的位移。移動(dòng)支持物的下降速度是每分鐘10mm。
物質(zhì)的表觀彈性模數(shù)由以下公式給出E＝斜率·S3/4BD3其中斜率在圖8中顯示，S是在試驗(yàn)條下支持觸點(diǎn)之間的跨距(距離)，B是條的寬度，D是條的厚度。這些試驗(yàn)中跨距(S)是30mm。參考圖8，在三點(diǎn)彎曲條件下物質(zhì)的強(qiáng)度如下；бu＝3·FmaxS/2BD2其中бu是彎曲強(qiáng)度，F(xiàn)max是記錄的最大力。機(jī)械特性試驗(yàn)的結(jié)果三種不同冰糕組合物的結(jié)果如下。數(shù)據(jù)記錄為10次測(cè)量的平均值。就硬度試驗(yàn)而言，對(duì)一個(gè)冰糕棒(10m×55mm×95mm)進(jìn)行10次測(cè)量。就強(qiáng)度和模數(shù)而言，對(duì)10個(gè)獨(dú)立的冰糕細(xì)條(50mm×10mm×2mm)的每一個(gè)進(jìn)行一次測(cè)量。

令人吃驚地，結(jié)果顯示含海單胞菌AFP的樣品不是硬的或易碎的，盡管魚AFP和海單胞菌AFP從它們的RI活性方面來(lái)說(shuō)加入的水平類似。
序列表序列表序列編號(hào)15’GTTAGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGGGAGCTTGCTCCTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAGGAATCTGCCTAGTAGAGGGGGACAACATGTGGAAACGCATGCTAATACCGCATACGCCCTGAGGGGGAAAGGAGGGGACTCTTCGGAGCCTTCCGCTATTAGATGAGCCTGCGTGAGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTCTAACTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGGGGTGAGGAAGGGTGATAGGTTAATACGTTATCATCTTGACGTTAGCCCCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACYGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTCGGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAATGGCACCCGATACTGGCTAGCTAGAGTATGGTAGAGGGGTGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGACACCCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGTTGTAATGACTTAGTGGCGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACAGAACATTTGAGAGATCAGATGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTATTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTTTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAGAGGGCTGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCACAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGATTGCTCCAGAAGTAGCTAGCTTTAACCCTTCGGGATGGCGGTTACCACGGAGTGGTCAATGACTGGGGTTGAAGTCTACGCG-’3
序列編號(hào)21 5′GCCCTTCTC AGATTGAACG CTGGCGGCAG GCCTAACACA TGCAAGTCGA51 GCGGTAGAGA GAAGCTTGCT TCTCTTGAGA GCGGCGGACG GGTGAGTAAT101 GCCTAGGAAT CTGCCTGGTA GTGGGGGATA ACGTTCGGAA ACGGACGCTA151 ATACCGCATA CGTCCTACGG GAGAAAGCAG GGGACCTTCG GGCCTTGCGC201 TATCAGATGA GCCTAGGTCG GATTAGCTAG TTGGTGAGGT AATGGCTCAC251 CAAGGCGACG ATCCGTAACT GGTCTGAGAC GATGATCAGT CACACTGGAA301 CTGAGACACG GTCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGGA351 CAATGGGCGA AAGCCTGATC CAGCCATGCC GCGTGTGTGA AGAAGGTCTT401 CGGATTGTAA AGCACTTTAA GTTGGGAGGA AGGGTTGTAG ATTAATACTC451 TGCAATTTTG ACGTTACCGA CAGAATAAGC ACCGGCTAAC TCTGTGCCAG501 CAGCCGCGGT AATACAGAGG GTGCAAGCGT TAATCGGAAT TACTGGGCGT551 AAAGCGCGCG TAGGTGGTTT GTTAAGTTGG ATGTGAAATC CCCGGGCTCA601 ACCTGGGAAC TGCATTCAAA ACTGACTGAC TAGAGTATGG TAGAGGGTGG651 TGGAATTTCC TGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGATATAGGA AGGAACACCA701 GTGGCGAAGG CGACCACCTG GACTAATACT GACACTGAGG TGCGAAAGCG751 TGGGGAGCAA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGATG801 TCAACTAGCC GTTGGAAGCC TTGAGCTTTT AGTGGCGCAG CTAACGCATT851 AAGTTGACCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGTTAAAACT CAAATGAATT901 GACGGGGGCC CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT CGAAGCAACG951 CGAAGAACCT TACCAGGCCT TGACATCCAA TGAACTTTCT AGAGATAGAT1001 TGGTGCCTTC GGGAACATTG AGACAGGTGC TGCATGGCTG TCGTCAGCTC1051 GTGTTGTGAA ATGTAAGGGC-3′
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)抗凍肽的方法，包括從水性低溫環(huán)境收集一種或更多的細(xì)菌樣品，培養(yǎng)細(xì)菌并從樣品中提取蛋白，檢測(cè)蛋白的抗凍特性，選擇有抗凍特性的蛋白，以及生產(chǎn)所選蛋白，其含量足夠用作AFP食品添加劑。
2.產(chǎn)生抗凍蛋白的海單胞菌屬物種的純細(xì)菌培養(yǎng)物，所述細(xì)菌培養(yǎng)物的16S rRNA基因序列與生物體Marinomonas protea中相應(yīng)的序列(序列編號(hào)1)表現(xiàn)出至少90％，優(yōu)選95％的同源性。
3.產(chǎn)生抗凍蛋白的假單胞菌屬物種的純細(xì)菌培養(yǎng)物，所述細(xì)菌培養(yǎng)物的16S rRNA序列與序列編號(hào)2的基因序列表現(xiàn)出至少90％，優(yōu)選至少95％的序列同源性。
4.表現(xiàn)抗凍特性的蛋白，由權(quán)利要求1的方法獲得或從權(quán)利要求2或3的培養(yǎng)物中分離。
5.權(quán)利要求4的蛋白，該蛋白是熱穩(wěn)定的。
6.表現(xiàn)抗凍活性并且N端氨基酸序列與序列編號(hào)3的氨基酸序列有至少75％的序列同源性的蛋白。
7.序列編號(hào)3的氨基酸序列的異構(gòu)體和衍生物，具有抗凍特性。
8.編碼序列編號(hào)3的氨基酸序列的核酸序列。
9.包含權(quán)利要求4-7的任意一項(xiàng)的表現(xiàn)抗凍特性的蛋白的食品。
10.權(quán)利要求9的食品，其中該食品選自冷凍蔬菜和冷凍甜品如冰淇淋。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備一種新的抗凍肽的方法和由水性低溫環(huán)境中的細(xì)菌，如Marinomonas protea以及一種新的假單胞菌屬物種獲得的肽。這些抗凍肽可以適當(dāng)?shù)負(fù)饺肜鋬鍪称樊a(chǎn)品如冷凍蔬菜和冷凍甜品如冰淇淋。
文檔編號(hào)C07K14/195GK1434859SQ00819030
公開日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2000年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月15日
發(fā)明者M·J·貝里, A·格里菲斯斯, P·J·希爾, J·萊布爾尼－帕里, S·V·米爾斯 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司