專利名稱：抗昆蟲的水稻植物的制作方法
引言本發(fā)明涉及控制水稻昆蟲害蟲的方法，水稻昆蟲害蟲包括鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲；尤其選自以下一組的昆蟲二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，以及稻弄蝶；其中主要的是二化螟，白禾螟屬incertulas，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟；此方法涉及將本發(fā)明定義的Cry9C蛋白應(yīng)用于被保護(hù)的地區(qū)和植物。在本發(fā)明優(yōu)化的具體實(shí)施案例中，Cry9C蛋白是通過在水稻基因組中穩(wěn)定整合了一段編碼Cry9C蛋白的DNA的水稻植株進(jìn)行表達(dá)的。
本發(fā)明還涉及通過Cry9C蛋白的表達(dá)而具備抗水稻害蟲的水稻植株，涉及具有抗水稻害蟲活性的殺蟲劑組分，具體包括鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲；尤其包括選自以下一組的昆蟲二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，以及稻弄蝶；其中主要的是二化螟，白禾螟屬incertulas，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟，殺蟲成分包括Cry9C晶體，晶體蛋白，或其中作為活性組分的活性片斷。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用編碼由此處定義的殺蟲性的Cry9C蛋白的一段DNA序列，使水稻植物獲得抗昆蟲性。
蘇云金芽孢桿菌(“Bt”)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，它能在芽孢中產(chǎn)生晶體。組成晶體的蛋白質(zhì)已被證明具有抗昆蟲幼蟲的毒性。根據(jù)氨基酸的序列已經(jīng)對(duì)這些晶體蛋白及其相應(yīng)的基因進(jìn)行分類(Crifkmore等，1998)。Cry9C蛋白是一種殺蟲蛋白，最先是從蘇云金芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)的(Lambert等，1996)。由于表達(dá)Cry9C蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米具有令人感興趣的抗玉米昆蟲害蟲的活性，它已經(jīng)被成功的用于防止玉米地中的害蟲侵襲(Jansens等，1997)。對(duì)Cry9C蛋白及其變種以及它們?cè)趲追N植物中的表達(dá)產(chǎn)物的描述見PCT專利出版物WO 94/05771，WO 94/24264，WO 99/00407，以及美國(guó)專利5,885,571和5,861,543(其內(nèi)容并入本文作為參考文獻(xiàn)).
昆蟲害蟲是稻米生產(chǎn)的重要限制因素，并且在所有水稻生長(zhǎng)的環(huán)境都會(huì)發(fā)生。害蟲嚴(yán)重減少稻米產(chǎn)量，據(jù)報(bào)道在亞洲(除中國(guó)之外)由于害蟲造成的減產(chǎn)約為31.5％(Heinrichs，1994)。(ii)相關(guān)專業(yè)技術(shù)說明通過在植物中表達(dá)編碼蘇云金芽孢桿菌中的殺蟲性的Cry1Ab或Cry1Ac蛋白(e.g.，F(xiàn)ujimoto等，1993；Wunn等，1996；Wu等，1997；Ghareyazie等，1997；Nayak等，1997；和Cheng等，1998)，植物血凝素(Rao等，1998)或蛋白酶抑制劑(Xu等，1996；Duan等，1996)的基因，有幾種類型的水稻獲得了對(duì)一些有害的鱗翅目類水稻昆蟲害蟲的昆蟲抵抗力。從蘇云金芽孢桿菌中分離出的晶體蛋白，對(duì)鱗翅目類水稻昆蟲害蟲的的毒性成分已被評(píng)估為Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1F，Cry1G，及Cry2A蛋白(Karim等，1997；Lee等，1997b)。
為了防止或延遲持續(xù)暴露在表達(dá)了Bt蛋白的植物中的昆蟲害蟲的抗性形成，優(yōu)選具有不同來源的并在水稻植物含量較高的Bt蛋白，同時(shí)優(yōu)選在一株植物中對(duì)具有不同種作用方式抗性基因能夠進(jìn)行組合表達(dá)的Bt蛋白。本發(fā)明提供了表達(dá)Cry9C蛋白的新型水稻，該蛋白對(duì)相關(guān)水稻昆蟲害蟲產(chǎn)生了高劑量影響，并且形成了新品種的商品化的水稻植物，這一品種能夠更好地防御害蟲的侵害，同時(shí)防止和延遲害蟲中抗性的形成。
于九月20-24(1999)在泰國(guó)普吉召開的水稻生物技術(shù)國(guó)際計(jì)劃大會(huì)上，Cohen等發(fā)表了優(yōu)化Bt水稻高劑量附加防御抗性的管理策略(參見摘要25頁)。
在另一個(gè)本發(fā)明的具體實(shí)施案例中，在這類水稻植物的基因組中還包括一段DNA序列，它編碼的蛋白是選自如下一組蛋白Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1I，Cry1J，Cry2A，Cry6B，Cry3A，蛋白酶抑制劑，豇豆胰島素抑制劑，蛋白酶抑制劑II，半胱氨酸蛋白酶抑制劑，GNA植物血凝素，Xhenorhabdus或Photorhabdus spp.殺蟲蛋白，對(duì)草銨膦具有抗性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供一種方法用于獲得對(duì)以下幾組害蟲具有抗性的水稻植株及其后代1)鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，和或者水稻折葉蟲；2)選自以下一組的昆蟲包括二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，以及稻弄蝶；3)選自以下一組的昆蟲包括二化螟，白禾螟屬incertulas，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟；方法包括利用一段DNA序列轉(zhuǎn)化水稻，其中DNA序列是可在植物中表達(dá)的，且它編碼由SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列組成的蛋白的DNA序列；或者是能夠編碼由SEQ ID NO4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA序列。
本發(fā)明還提供一種方法用于生產(chǎn)對(duì)以下幾組害蟲1)鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，和或者水稻折葉蟲；2)選自以下一組的昆蟲包括二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，以及稻弄蝶；3)選自以下一組的昆蟲包括二化螟，白禾螟屬incertulas，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟，具有抗性的水稻植株和繁殖材料，如種子。方法包括利用一段DNA序列轉(zhuǎn)化水稻，其中DNA序列是可在植物中表達(dá)的，且它所編碼的蛋白包括由SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列；或者是能夠編碼包括SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA序列。
在另一個(gè)具體實(shí)施案例中，提供了控制以下幾組害蟲的方法1)鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，和或者水稻折葉蟲；2)選自以下一組的昆蟲包括二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，以及稻弄蝶；3)選自以下一組的昆蟲包括二化螟，白禾螟屬incertulas，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟，方法包括利用殺蟲劑量的蛋白質(zhì)與上述的害蟲進(jìn)行接觸，其中蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列或者包括SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，同時(shí)這一方法中還包括以下幾個(gè)步驟利用編碼上述蛋白質(zhì)的DNA序列轉(zhuǎn)化水稻，在稻田中培植含有上述DNA序列的上述植株及其后代。而且，本發(fā)明還提供通過以上任一種方法獲得的植株，種子和谷物。優(yōu)化具體實(shí)施案例的詳述本發(fā)明所提供的新型轉(zhuǎn)基因水稻植物，尤其是稻屬(Oryza)中的各種，優(yōu)選Oryza sativa，表明它們適合防止下列幾類害蟲的侵害鱗翅類具體包括鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲；較適合的二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，以及稻弄蝶，尤其是二化螟；最適合的包括禾草螟屬各種，刷須野螟屬各種，野螟屬各種，以及白禾螟屬各種中的昆蟲。通過在水稻中表達(dá)編碼Cry9C蛋白質(zhì)的DNA，可以得到這樣的轉(zhuǎn)基因水稻。利用本發(fā)明的植株能夠很好地控制鱗翅類水稻昆蟲害蟲，尤其是鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲；尤其是二化螟，三化螟，斜紋貪夜蛾，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，秘夜蛾屬unipuncta，禾草螟屬zacconius，以及稻縱卷葉野螟。還可以利用本發(fā)明的Cry9C蛋白控制其它相關(guān)的昆蟲害蟲，例如水稻蛀蟲米螟和其它的鱗翅目類貯藏害蟲。
在本發(fā)明優(yōu)化的具體實(shí)施案例中，Cry9C蛋白被用來控制水稻昆蟲害蟲，如二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬Polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，秘夜蛾屬unipuncta，禾草螟屬zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；優(yōu)選的是二化螟，三化螟，刷須野螟屬patnalis，和稻縱卷葉野螟。Cry9控制的優(yōu)選目標(biāo)是鱗翅目類水稻昆蟲，其中屬于此類的害蟲有水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲。
Cry9C可以按照傳統(tǒng)的方法從幾種Bt菌株中分離得到，或者通過重組表達(dá)得到，如PCT專利出版物WO 94/05771，WO 94/24264，WO 99/00407，以及美國(guó)專利5,885,571和5,861,543的描述。
此處引用的術(shù)語“Cry9C蛋白”是指包括SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列的殺蟲蛋白質(zhì)，或包括SEQID NO4所示序列中從氨基酸位點(diǎn)1到氨基酸位點(diǎn)625的氨基酸序列的殺蟲蛋白質(zhì)，以及保持殺蟲活性的這兩種蛋白的變體，如在PCT專利出版物WO 94/24264詳述的蛋白酶抗性的丙氨酸變體。這個(gè)術(shù)語包括晶體蛋白、前毒素或它們具有殺蟲效應(yīng)的形態(tài)，例如利用蛋白酶消化前毒素得到的毒素，或者具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中從位于氨基酸位點(diǎn)1和44之間的一個(gè)氨基酸位點(diǎn)到位于氨基酸位點(diǎn)658和666之間的一個(gè)氨基酸位點(diǎn)形成的氨基酸序列的一種蛋白質(zhì)，同時(shí)還包括融合蛋白或它的具有蛋白酶抗性的變異體。已知Cry9C蛋白的某些氨基酸可以被其它等價(jià)的氨基酸所替換，而且仍然保持了全部或某些殺蟲活性，參見參考文獻(xiàn)中的例如PCT專利出版物WO 99/00407。這些蛋白都包括在Cry9C蛋白范圍內(nèi)。本發(fā)明中最優(yōu)選的Cry9C蛋白形式是包含SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658之間的氨基酸序列的蛋白，或包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
此處引用的“cry9C DNA”是指編碼Cry9C蛋白的任何DNA序列，包括天然的，重組的，半合成的或合成的DNA序列，并且包括調(diào)節(jié)區(qū)域或不編碼氨基酸序列的其它區(qū)域，如內(nèi)含子、前導(dǎo)序列或尾隨序列、啟動(dòng)子和3′轉(zhuǎn)錄末端以及聚腺苷酰化序列?！癈ry9C編碼區(qū)”是指從起始密碼子開始到終止密碼子結(jié)束并且能夠編碼Cry9C蛋白的任何核苷酸序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，一些氨基酸密碼子可以用其它的密碼子替換而并不改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明中有關(guān)cry9C DNA的一個(gè)實(shí)施例是序列SEQ IDNO3所示的DNA。此處引用的“嵌合cry9C基因”是指由兩側(cè)連接調(diào)節(jié)元件的cry9C編碼區(qū)構(gòu)成的cry9C DNA，調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄末端序列及聚腺苷酰化序列，它們可以使Cry9C蛋白在植物，尤其是水稻植物的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)于應(yīng)用于此的其它的蘇云金芽孢桿菌的晶體蛋白或毒素片斷，用“Cry”來表示，如Crickmore等的描述(1998)。在Cry之后只使用一個(gè)數(shù)字和一個(gè)字母時(shí)，如Cry1B，表示所有的以所列的數(shù)字和字母開頭的相關(guān)序列，其中既包括前毒素也包括任何有殺蟲效應(yīng)的片斷，如經(jīng)蛋白酶處理得到的毒素(例如，“Cry1B”包括所有的Cry1B的形式如“Cry1Ba1”和“Cry1Bb1”)。
此處引用的對(duì)昆蟲具有“抵抗力”或“抗性”的植物，以及對(duì)昆蟲的侵染或侵襲具有“抵抗力”或“抗性”的植物，是指由人為作用，具體的是經(jīng)過本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化，或者噴灑本發(fā)明的殺蟲劑形成的植物，它們顯示出明顯增強(qiáng)了對(duì)昆蟲的控制能力，否則這些昆蟲將侵害此種植物。包括明顯增強(qiáng)了攝食抑制，生長(zhǎng)抑制或攝食植物的昆蟲的致死率。在本發(fā)明最優(yōu)選的具體實(shí)施案例中，本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性是指對(duì)昆蟲的完全防御能力，它可以通過由這類昆蟲對(duì)植物引起的較小的侵害來測(cè)定(例如，對(duì)蛀莖昆蟲來說，水稻的莖桿中沒有通道)，抗蟲性或者是指與沒有害蟲侵害的同樣條件下達(dá)到幾乎相同的產(chǎn)量。在最優(yōu)選的實(shí)施案例中，本發(fā)明水稻的抗蟲性是指在十天之內(nèi)，最好在5天之內(nèi)，殺死至少90％，優(yōu)選至少95％以本發(fā)明的Cry9C水稻為食的昆蟲。
本發(fā)明中，植物-可表達(dá)的DNA序列是能夠表達(dá)植物中的基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的一段DNA序列。在本發(fā)明最優(yōu)選的具體實(shí)施案例中，這一DNA序列包含調(diào)節(jié)元件，調(diào)節(jié)元件可以使被引進(jìn)植物基因組的編碼序列正確地轉(zhuǎn)錄并翻譯得到所需要的蛋白質(zhì)。具有代表性的，本發(fā)明的植物-可表達(dá)的DNA序列能夠在植物細(xì)胞尤其是水稻的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)。植物-可表達(dá)的DNA序列還可以包括其它的元件如3′轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷?；蛄谢騼?nèi)含子。
本文應(yīng)用的植物或植物細(xì)胞的“基因組”是指存在于植物或植物細(xì)胞中的全部遺傳物質(zhì)，包括但并不局限于線粒體、葉綠體和核DNA。本文應(yīng)用的在基因組中“穩(wěn)定整合”的DNA是指以能夠遺傳給植物后代的方式進(jìn)行整合的DNA，優(yōu)選的方式是將DNA整合到植物的基因組尤其是核DNA中。本文應(yīng)用的植物的“后代”是指植物的下一代，包括從一個(gè)植株獲得的種子、后代植株以及通過包括植物繁殖可獲自或取自植物的細(xì)胞、組織或完整植株，由它們可獲得具有相同或不同遺傳物質(zhì)的更多植株或下代。
本文應(yīng)用的“加工谷物”是指利用一種或幾種加工方法處理過的谷物，尤其是被用于飼料和食品的加工谷物。谷物的加工過程包括但不限于研磨、粉碎、半熟化、脫皮等。來自本發(fā)明水稻Cry9C蛋白的加工和未加工谷物，以及谷物中所包含的本發(fā)明的嵌合基因，都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施案例中，Cry9C蛋白與其它的殺蟲蛋白相結(jié)合，提供了更好防御相關(guān)水稻害蟲的能力，同時(shí)防止和延遲昆蟲的抗性形成。優(yōu)選的蛋白選自以下一組蛋白Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1I，Cry1J，Cry2A，Cry6B，Cry3A，蛋白酶抑制劑如豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI，Xu等，1996)，蛋白酶抑制劑II(pinII，Duan等，1996)或半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Irie等，1996)，GNA植物血凝素(Galanthus nivalis agglutinin，Rao等，1998)，Xhenorhabdus或Photorhabdus spp殺蟲蛋白如Bowen等(1998)ffrench-Constant和Bowen。(1999)，PCT專利出版物WO 98/08388，WO 99/03328，WO 95/00647，WO 97/17432，WO 98/05212，或WO 98/08932中的描述，或?qū)λ竞οx具有殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌或蠟狀芽孢桿菌衍生蛋白，主要針對(duì)的水稻害蟲包括水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲；具體是針對(duì)禾草螟屬各種，野螟屬各種，刷須野螟屬各種，白禾螟屬各種，更具體是針對(duì)二化螟，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟，及三化螟。在優(yōu)化的具體實(shí)施案例中，Cry9C蛋白主要通過在轉(zhuǎn)基因水稻中的聯(lián)合表達(dá)，與至少一種選自以下的蛋白相結(jié)合或者這些蛋白質(zhì)中的活性成分相結(jié)合Cry1Ab，Cry1B，Cry2A，Cry1C(優(yōu)選Cry1Ca4)。
而且，為了篩選轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞和/或使田間植物具有對(duì)除草劑的抗性，優(yōu)選編碼具有抗草銨膦蛋白的DNA序列，因此包含這種蛋白的植物細(xì)胞或植物可以在草銨膦分子的有毒濃度中進(jìn)行正常生長(zhǎng)，具體包括來自吸水鏈霉菌或綠色產(chǎn)色鏈霉菌的phosphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶，如在PCT專利出版物WO 87/0569，美國(guó)專利US5,561,236和US5,276,268中的描述。
為了在大腸桿菌，其它細(xì)菌或植物中表達(dá)Cry9C蛋白，可以在DNA的兩側(cè)引入適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，這一操作可以利用眾所周知的方法(Stanssens等，1989；White等，1989)通過定點(diǎn)突變來完成。
另外，由于Cry9C蛋白可以結(jié)合在與昆蟲腸膜上的Cry1A型Bt蛋白不同的受體上，這一點(diǎn)可用于將表達(dá)Cry9C蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻和表達(dá)一種在靶昆蟲中具有與Cry9C蛋白不同結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，如Cry1A或Cry2A蛋白的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行交配。同樣，可以利用cry9C DNA和編碼在靶昆蟲中具有與Cry9C蛋白不同結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的DNA，如cry1A DNA包括截短的具有殺蟲效應(yīng)的Cry1Ab5蛋白，進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化，以便獲得能夠表達(dá)這兩種昆蟲控制蛋白的轉(zhuǎn)基因植物或其后代。編碼cry1A蛋白質(zhì)的DNA，可以從任意的已經(jīng)在植物包括在水稻或玉米中成功表達(dá)的，并且能夠編碼由Crickmore等人列出的Cry1A中的任一種蛋白質(zhì)的DNA序列中篩選得到(1998(關(guān)于其全長(zhǎng)序列，可參見引用的參考文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)的編號(hào)))包括但不限于這些蛋白質(zhì)的殺蟲片斷，優(yōu)選這個(gè)DNA序列編碼的Cry1Ab或Cry1Ac蛋白，尤其是Hofte等人的Cry1Ab5蛋白(1986)或它具有殺蟲性的片斷。在美國(guó)專利US5,866,784中已經(jīng)報(bào)道了幾種方法用于獲得至少兩種植物的Bt毒素的組合表達(dá)，這些方法包含在本發(fā)明的研究范圍內(nèi)。
可以將cry9C基因，優(yōu)選的是cry9C嵌合基因，按照傳統(tǒng)的方式穩(wěn)定地插入到水稻細(xì)胞的核基因組中，這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以按照傳統(tǒng)的方式得到再生并產(chǎn)生抗害蟲的轉(zhuǎn)化的水稻植株及其后代(種子和下一代)。在這一點(diǎn)上，根癌土壤桿菌中的卸載(disarmed)Ti質(zhì)粒，由于包含具有殺蟲相應(yīng)的cry9C基因組分，它可以被用來轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，然后利用PCT專利發(fā)表的WO 92/09696中描述的方法，從轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)化的水稻植株。利用土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化所優(yōu)選的組織包括但不局限于成熟的種子-衍生的愈傷組織，未成熟的胚芽-衍生的愈傷組織，及未成熟的胚芽。在與土壤桿菌共培養(yǎng)之前，使這些組織受傷，并且利用乙酰丁香酮或如PCT專利WO 98/37212中描述的其它的植物苯酚化合物，進(jìn)行前誘導(dǎo)。優(yōu)選的Ti質(zhì)粒載體每一個(gè)都包含Ti質(zhì)粒DNA的cry9C嵌合基因，它位于邊緣序列之間，或至少位于右端邊緣序列的左側(cè)。當(dāng)然，其它類型的載體也可以被用來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植株，采用的方法包括直接基因轉(zhuǎn)移(如在EP 0,233,247中的描述)，花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如在EP 0,270,356，PCT WO 85/01856，及美國(guó)專利US4,684,611中的描述)，植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如在EP 0,067,553和美國(guó)專利US4,407,956中的描述)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如在美國(guó)專利US4,536,475中的描述)，以及其它的方法包括Shimanoto等(1989)和Datta等(1990)的水稻轉(zhuǎn)化法，和用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的不同方法，如在PCTWO 93/21335和WO 92/09696中的描述。任何已知的用于轉(zhuǎn)化水稻的方法都適合用于獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻。所得到的轉(zhuǎn)基因水稻可以按照傳統(tǒng)的植物養(yǎng)植方法用來生產(chǎn)更多的具有相同特征的轉(zhuǎn)基因水稻，或者將cry9C基因引入其它的水稻變異體或相關(guān)的植物品種。優(yōu)選的水稻包括稻屬的各個(gè)種的植株，尤其是Oryza sativa，優(yōu)選的是日本(japonica)，印度(indica)或爪哇(javanica)品種的水稻，無論是在土壤，水，高地，rainfed低地，深水，漂浮生長(zhǎng)的水稻，還是可灌溉的水稻。從轉(zhuǎn)化的水稻植物獲得的種子，包含cry9C基因，它是作為穩(wěn)定的基因組的插入成分存在于核、線粒體或葉綠體的基因組中。轉(zhuǎn)化水稻的細(xì)胞可以按照傳統(tǒng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)，生產(chǎn)出具有殺蟲效應(yīng)的Cry9C蛋白。
將Cry9C DNA插入水稻細(xì)胞的基因組，使插入的DNA位于啟動(dòng)子的下游(即3′端)，并且受啟動(dòng)子的控制，啟動(dòng)子可以指導(dǎo)植物細(xì)胞中的DNA表達(dá)。這一操作優(yōu)選在植物細(xì)胞基因組中插入cry9C嵌合基因來完成。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括花椰菜花葉病毒分離物CM 1841(Gardner等，1981)，CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)中的強(qiáng)組成型35S啟動(dòng)子(“35S promoters”)；泛蛋白家族的啟動(dòng)子(如，Christensen等的玉米泛蛋白啟動(dòng)子，1992，參見Cornejo等，1993)；gos2啟動(dòng)子(Pater等，1992)；emu啟動(dòng)子(Last等，1990)；水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子如Zhang等描述的啟動(dòng)子(1991)；TR1′啟動(dòng)子和TR2′啟動(dòng)子(“TR1′啟動(dòng)子”和“TR2′啟動(dòng)子”是各自獨(dú)立的)，它們各自驅(qū)動(dòng)T-DNA中的1′和2′基因的表達(dá)(Velten等，1984)?；蛘?，還可以利用非組成型的啟動(dòng)子，但是它們對(duì)植物的一種或幾種組織或器官(如，葉子，莖，木髓和/或根組織)具有特異性，使得插入的9C基因部分只能在特定的組織或器官中表達(dá)。例如，具有殺蟲效應(yīng)的cry9C基因部分能夠在水稻的葉片和莖中進(jìn)行選擇性的表達(dá)，或通過在花粉中沒有活性的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)。其它的啟動(dòng)子包括光-誘導(dǎo)的啟動(dòng)子如水稻的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因的啟動(dòng)子，或另一種植物如豌豆的此基因的啟動(dòng)子，如在專利US 5,254,799中的描述。其它可選擇使用的啟動(dòng)子是表達(dá)可以誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(如，由于攝食昆蟲，溫度或化學(xué)因素造成的傷害引起的誘導(dǎo))。當(dāng)然，任何已知的能夠在水稻尤其是葉子和莖中高度表達(dá)的啟動(dòng)子，都可以用于本發(fā)明。
將Cry9C DNA插入水稻細(xì)胞的基因組，使插入的基因部分位于基因組的適當(dāng)?shù)?′末端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)(即轉(zhuǎn)錄形成和聚腺苷?；盘?hào))的上游(即5′端)。這一操作優(yōu)選在植物細(xì)胞基因組中插入cry9C嵌合基因來完成。優(yōu)選的聚腺苷酰化和轉(zhuǎn)錄形成信號(hào)包括章魚肉堿合成酶基因(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)中的這兩種信號(hào)，這兩種基因在轉(zhuǎn)化水稻植株中作為3′-非轉(zhuǎn)錄DNA序列。
Cry9C DNA可作為雜合基因被隨意地插入植物基因組中(Vaeck等，1987)，并受到與選擇性標(biāo)記基因相同的啟動(dòng)子的控制，因此植物能夠表達(dá)同時(shí)保持兩種蛋白質(zhì)活性的融合蛋白。這樣，可通過提高培養(yǎng)基中選擇性標(biāo)記試劑的濃度篩選出高表達(dá)的Cry9C蛋白。
本發(fā)明還提供了一種方法用于制備抗以下害蟲的水稻鱗翅目類昆蟲，尤其是二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，秘夜蛾屬unipuncta，禾草螟屬zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；優(yōu)選的是禾草螟屬各種，野螟屬各種，刷須野螟屬各種，以及白禾螟屬；最優(yōu)選的是二化螟，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟，和三化螟。這個(gè)方法的特點(diǎn)是利用編碼Cry9C蛋白的DNA序列，以已知的步驟轉(zhuǎn)化水稻。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，利用編碼Cry9C蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)化水稻所產(chǎn)生的植株可以抵抗鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲的侵害。
本發(fā)明的另一具體實(shí)施案例，提供了一種用于生產(chǎn)水稻及其繁殖材料如種子的方法，它們能夠抗選自以下一組昆蟲的侵害二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，秘夜蛾屬unipuncta，禾草螟屬zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；優(yōu)選的是禾草螟屬各種，野螟屬各種，刷須野螟屬各種，以及白禾螟屬；最優(yōu)選的是二化螟，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟，和三化螟，方法包括利用編碼Cry9C蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再生產(chǎn)出包含有上述DNA序列的植株和繁殖材料。在優(yōu)選的具體實(shí)施案例中，提供的方法用于生產(chǎn)水稻及其繁殖材料如種子，它們可以抵抗鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲的侵害，方法包括利用編碼Cry9C蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再生產(chǎn)出包含有上述DNA序列的植株和繁殖材料。
本發(fā)明還提供了控制以下害蟲的方法鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲；特別是二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，秘夜蛾屬unipuncta，禾草螟屬zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；優(yōu)選的是禾草螟屬各種，野螟屬各種，刷須野螟屬各種，以及白禾螟屬；最優(yōu)選的是二化螟，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟，和三化螟；方法包括利用殺蟲劑量的Cry9C蛋白與上述的害蟲進(jìn)行接觸。在最優(yōu)選的具體實(shí)施案例中，通過在田間播種、栽培或耕作轉(zhuǎn)化水稻以表達(dá)Cry9C蛋白進(jìn)行這種接觸。這種情況下，只有試圖以水稻為食的水稻害蟲才受到Cry9C蛋白的影響。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施案例中，可以將含有殺蟲效應(yīng)劑量的Cry9C蛋白的組合物播灑在水稻上，以使這些害蟲與Cry9C蛋白相接觸。這種組合物的常規(guī)配方，是利用Cry9C蛋白作為活性組分，加上適當(dāng)?shù)妮d體，稀釋液，乳化劑和/或分散劑(如Bernhard和Utz的描述，1993)。殺蟲的組合物可以配制成濕潤(rùn)的粉末，丸劑，顆粒或塵粒，或利用水或無水溶劑制成液體配方如泡沫，凝膠，懸浮液，濃縮液等。在這些組合物中Cry9C蛋白的濃度取決于配方的屬性和最終的應(yīng)用方式。通常，可利用本發(fā)明的殺蟲組合物來保護(hù)水稻田，使用一次可以持續(xù)1至2周抵抗鱗翅目類昆蟲的侵害。為了更深度的防護(hù)(如，整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié))，在使用噴灑組合物的情況下，應(yīng)該定期的使用附加用量的組合物。Bt細(xì)胞或晶體，晶體蛋白，前毒素，毒素，以及具有殺蟲效應(yīng)的前毒素的組分和其它的殺蟲劑，還有殺真菌劑，殺蟲劑，除草劑和化肥，能夠與Cry9C一起使用，可以獲得額外的好處。通常，組合物中Cry9C蛋白的濃度占配方總重量的至少0.1％到100％，更常用的濃度占配方總重量0.15％到0.8％。
本發(fā)明也提供了一種生產(chǎn)加工和未加工水稻谷粒的方法，包括在田間種植本發(fā)明的Cry9C水稻，并收獲及處理種子，獲得加工和未加工水稻谷粒。本發(fā)明中經(jīng)轉(zhuǎn)化或處理過的水稻植株的產(chǎn)量獲得提高。
可以利用已經(jīng)建立的程序測(cè)定抗以下昆蟲的蛋白毒性鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻折葉蟲，二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，秘夜蛾屬unipuncta，禾草螟屬zacconius，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶。適用于本發(fā)明的測(cè)定方法是用含有蛋白(確定濃度)的溶液浸濕一層水稻種子或葉片。然后將幼蟲放在種子或葉片上，放置一定時(shí)間之后，計(jì)算死亡的幼蟲的數(shù)目并對(duì)存活的幼蟲進(jìn)行稱重。在同一次測(cè)試中，設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照樣品以便測(cè)定同一條件下的背景死亡率和標(biāo)準(zhǔn)的幼蟲生長(zhǎng)狀況。利用加上了或加進(jìn)了蛋白質(zhì)的人造食物或加上了蛋白質(zhì)的水稻種子或水稻葉片可以進(jìn)行相似的試驗(yàn)，如Lee等(1997a)或Theunis等(1998)的描述。按照常規(guī)操作，選用合適的對(duì)照如以體外試驗(yàn)的一段切割的莖或一個(gè)完整的植株檢驗(yàn)系統(tǒng)作為對(duì)照體系，可以測(cè)定表達(dá)了本發(fā)明蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)昆蟲的毒性，如Nayak等(1997)或Ghareyazie等(1997)的描述。
可以在水稻田里捕捉水稻害蟲并可以按照已知的方法進(jìn)行養(yǎng)殖(參見如Kamano和Sato，1985，二化螟的養(yǎng)殖)對(duì)于白禾螟屬的incertulas種，例如，可以應(yīng)用Yannian等(1998)描述的養(yǎng)殖方法。鱗翅目類水稻昆蟲害蟲的分類學(xué)可以通過此領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行測(cè)定，參見，如Barrion和Litsinger(1994)。
本發(fā)明中用于控制以下害蟲的方法鱗翅類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲，或者水稻leaffolders；特別是選自以下一組的昆蟲二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，秘夜蛾屬unipuncta，禾草螟屬zacconius，Hereitogrammalicarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，稻弄蝶；優(yōu)選的是禾草螟屬各種，Cnaphalocrocis spp，刷須野螟屬各種，以及白禾螟屬；最優(yōu)選的是二化螟，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟，和三化螟；優(yōu)選包括將殺蟲劑量的Cry9C蛋白施用(例如，噴灑或在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá))到受保護(hù)的田地或地區(qū)。受保護(hù)的田地或地區(qū)可以包括，例如，昆蟲害蟲的棲息地，水稻生長(zhǎng)的田間?；?qū)⒁N植水稻的地區(qū)。
下列實(shí)施例用于說明本發(fā)明，而不意味限制本發(fā)明的范圍。
在說明書和實(shí)施例中涉及的序列表如下序列表SEQ ID NO1-自然發(fā)生的Cry9C蛋白和cry9C DNA序列SEQ ID NO2-SEQ ID NO1所示的Cry9C蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO3-在水稻中進(jìn)行表達(dá)的cry9C DNA和Cry9C氨基酸序列
SEQ ID NO4-SEQ ID NO3所示的Cry9C蛋白的氨基酸序列在實(shí)施例中除非另有說明，所用制備和操作重組DNA的方法按照下列文獻(xiàn)描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行Sambrook等，分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning-A Laboratory Manual)，第二版(Second Ed)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY(1989)，Ausubel等卷1和卷2分子生物學(xué)現(xiàn)行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，現(xiàn)行方法(CurrentProtocols)USA。用于植物分子生物學(xué)的材料和方法的描述參見由BIOS科學(xué)出版有限公司(UK)和Blackwell科學(xué)出版社(UK)聯(lián)合出版的植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology Labfax)，R.R.D.Croy著。
利用水稻葉的浸沾試驗(yàn)，檢驗(yàn)水稻折葉蟲、稻縱卷葉野螟、刷須野螟屬patnalis種，將易受折葉影響的各種水稻葉子用來測(cè)定純化的Cry9Ca(R164K)蛋白(LC50)(一種Cry9Ca蛋白，在它的氨基酸序列中164位點(diǎn)的精氨酸被賴氨酸取代，因此增加了對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性)的半致死濃度。將葉片胞浸泡在0，0.025，0.1，0.39，1.56，6.25，25及100微克/ml一系列濃度的經(jīng)胰蛋白酶-處理的Cry9C(R164K)活性毒素浴液中。所有的稀釋溶液都用含有0.01％Triton X-100無菌蒸餾水來制備，葉片風(fēng)干30分鐘后，放置于培養(yǎng)皿中并在每種濃度的樣品中加入10條新生幼蟲，每種濃度使用五片葉子，一個(gè)葉片代表一次重復(fù)，在侵染96個(gè)小時(shí)之后統(tǒng)計(jì)死亡率。利用田間試驗(yàn)/農(nóng)業(yè)研究管理軟件(ARM version 6.0.2；Gylling DataManagement(GDM)，1999)通過最小概率方差方法(Probit-Least SequareMethod)計(jì)算半致死濃度(LC50)。
對(duì)于稻縱卷葉野螟，LC50的值是0.956微克/ml(置信界限在95％置信度0.64-1.52微克/ml)，對(duì)于刷須野螟屬patnalis種，LC50值是1.230微克/ml(置信界限在95％置信度0.82-1.92微克/ml)。因此Cry9C蛋白對(duì)水稻折葉蟲，稻縱卷葉野螟和刷須野螟屬patnalis種具有較高的毒性。利用對(duì)蛀莖昆蟲敏感的各種水稻的葉鞘，通過水稻的浸沾試驗(yàn)檢測(cè)斑紋蛀莖昆蟲和二化螟，將葉鞘浸泡在一系列胰蛋白酶-處理的Cry9C(R163k)活性毒素的稀釋溶液中，測(cè)定了五個(gè)濃度，陰性對(duì)照是0微克/ml Cry9Ca蛋白，所有的稀釋溶液都用含有0.01％Triton X-100無菌蒸餾水來制備，葉鞘風(fēng)干后，將其放置于培養(yǎng)皿中，并在每一個(gè)濃度的樣品中加入五條新生幼蟲，96小時(shí)候后統(tǒng)計(jì)死亡率，生物檢測(cè)重復(fù)10次。利用田間試驗(yàn)/農(nóng)業(yè)研究管理軟件(ARM version 6.0.2；Gylling Data Management(GDM)，1999)通過最小概率方差方法計(jì)算半致死濃度(LC50)。LC50的值是6.44微克/ml(95％置信度，置信界限5.74-7.23)，因此可以發(fā)現(xiàn)Cry9C蛋白對(duì)斑紋蛀莖昆蟲具有較高毒性。
將天然的Cry9Ca蛋白(SEQ ID ND2)施用于以上昆蟲得到相似的結(jié)果。
在利用新生幼蟲進(jìn)行的相似的昆蟲葉片浸沾攝食試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)Cry1Ca4蛋白對(duì)水稻切根蟲，斜紋貪夜蛾種(LC50019μg/ml(置信界限在95％置信度0.02-0.62)具有較高的毒性，選擇Cry1Ca4溶液的一系列濃度(0.1，0.39，1.56，6.25，25及100μg/ml無菌水，加入0.01％Triton X-100)用于檢測(cè)斜紋貪夜蛾種新生幼蟲的活性。將穿孔(直徑6cm)蓖麻葉浸泡于Cry1C溶液并風(fēng)干，再將處理過的葉片放置于配有潮濕濾紙墊的培養(yǎng)皿中，并且在每一個(gè)重復(fù)樣品中用10新生幼蟲進(jìn)行侵襲。培養(yǎng)96小時(shí)之后，測(cè)定死亡率。S.litura新生幼蟲是通過一天內(nèi)產(chǎn)生的同一批卵在25℃(+/-1℃)下進(jìn)行孵化得到的，以確保孵化的同一性。利用其它的Cry1Ca蛋白進(jìn)行此試驗(yàn)可以得到相似的結(jié)果。
利用Cry9Ca(R164K)毒性蛋白片斷對(duì)斜紋貪夜蛾種進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，在葉浸沾試驗(yàn)的幾次重復(fù)試驗(yàn)中得到的結(jié)果是LC50的值是19.63μg/ml(95％置信度，置信界限12.61-33.55)因此，對(duì)于水稻切根蟲，斜紋貪夜蛾種，Cry1C和Cry9C都是具有較高毒性的蛋白。實(shí)施例2利用cry9C嵌合基因轉(zhuǎn)化水稻可以利用Deblaere等(1985，1987)描述的載體系統(tǒng)進(jìn)行水稻植株的轉(zhuǎn)化。載體系統(tǒng)包含一個(gè)土壤桿菌的菌株和兩個(gè)質(zhì)粒組分1)一個(gè)中間克隆載體，和2)一個(gè)非致癌Ti-質(zhì)粒。
中間克隆載體實(shí)質(zhì)上是從pGSC1700(Cornelissen andVandewiele，1989)衍生得到，它包含一個(gè)人造的T區(qū)，由pTiB6S3中的TL-DNA的左側(cè)和右側(cè)邊界序列及可以使嵌合基因插入到T-DNA邊界的重復(fù)序列之間的多接頭克隆位點(diǎn)構(gòu)成。插入到T-DNA邊界的重復(fù)序列之間的T-DNA編碼兩個(gè)基因，即一個(gè)嵌合棒基因和一個(gè)嵌合cry9C基因。嵌合棒基因，提供對(duì)草銨膦或phpsphinothricin的抗性，它是由CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等，1985)控制的吸水鏈霉菌(PCT專利出版WO 87/05629)的phpsphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的編碼區(qū)，CaMV35S3′轉(zhuǎn)錄末端和聚腺苷?；瘏^(qū)(Mogen等，1990)所組成的。嵌合棒基因可以用作選擇性標(biāo)記，并且提供了對(duì)于施用于田間的以草銨膦作為活性組分的商品化除草劑的抗性。嵌合cry9C基因是由CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等，1985)控制的SEQ IDNO3的編碼區(qū)，兩側(cè)連接CaMV35S的3′轉(zhuǎn)錄末端和聚腺苷?；瘏^(qū)(Mogen等，1990)組成。
受體土壤桿菌菌株載有一個(gè)非致癌性(卸載)Ti質(zhì)粒，它是將Ti質(zhì)粒中的T-DNA刪除而保留了正常的病毒轉(zhuǎn)移基因。這個(gè)質(zhì)粒也具有一個(gè)同源區(qū)，可以與中間克隆載體形成共合體。中間載體在大腸桿菌中構(gòu)建，通過包含一個(gè)載有轉(zhuǎn)移協(xié)助質(zhì)粒的大腸桿菌的三親株交配，將中間載體轉(zhuǎn)移到受體根癌土壤桿菌菌株(Van Haute等，1983，Deblaere等，1987)。所獲得的土壤桿菌菌株中的T-DNA的結(jié)構(gòu)可以通過DNA印跡雜交進(jìn)行測(cè)定(Deblaere等，1985)。
利用土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，將中間克隆載體轉(zhuǎn)移到水稻基因組的位于T-DNA邊界重復(fù)序列之間的DNA片斷。將源自日本和印度的水稻栽培變種的未成熟胚胎或愈傷組織，切成小塊，作為轉(zhuǎn)化的靶組織，采用的技術(shù)參見PCT專利WO 92/09696的描述。將這一組織與土壤桿菌共培養(yǎng)，然后將草銨膦添加到水稻組織培養(yǎng)基中，篩選出被轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞。
將生長(zhǎng)在草銨膦上的Calli轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基，當(dāng)水稻苗生出根和芽之后，將它轉(zhuǎn)移到土壤中置于溫室進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化作用可以通過phosphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)，應(yīng)用于葉片的草銨膦，以及定量ELISA，PCR和DNA印跡分析等方法進(jìn)行鑒定。植株開花后進(jìn)行自受粉，成熟以后收獲種子。
也可以通過對(duì)受傷的致密的胚胎發(fā)生的愈傷組織進(jìn)行電穿孔獲得Cry9C轉(zhuǎn)化株，如美國(guó)專利US5,679,558的描述。除上述的嵌合基因，還可以構(gòu)建其他的嵌合cry9C基因在水稻中進(jìn)行表達(dá)，包括不同的可在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子如泛蛋白和gos2啟動(dòng)子(Christensen等，1992，dePater等，1992)。利用上述的土壤根菌轉(zhuǎn)化程序，這些嵌合基因也可以被用來轉(zhuǎn)化水稻。
可以利用DNA印跡方法對(duì)具有單拷貝的整合在水稻基因組的cry9c嵌合基因的水稻植株進(jìn)行篩選，利用ELISA試驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡對(duì)葉片和莖中的Cry9C蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析。檢測(cè)由成功轉(zhuǎn)化的植株的種子長(zhǎng)成的植株中Cry9C蛋白的表達(dá)和抗蟲性。按照以上的方法，利用嵌合cry9C基因也可以對(duì)印度型水稻植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，當(dāng)把轉(zhuǎn)化的植株轉(zhuǎn)移到溫室之后，評(píng)估植株的轉(zhuǎn)化效果和昆蟲抗性。
將上述的Cry9C印度型水稻種系與一個(gè)由能夠編碼截短的Cry1Ab5蛋白(具有Hofte等的氨基酸序列從氨基酸位點(diǎn)2到616，以甲硫氨酸和丙氨酸開始)的嵌合基因轉(zhuǎn)化的印度型水稻種系進(jìn)行交配，以提高植物對(duì)昆蟲的抗性，并且防止和延遲昆蟲抗性的形成。如上所述，編碼截短的Cry1Ab5蛋白的嵌合基因中包含泛蛋白和gos2啟動(dòng)子，可以利用這個(gè)基因獲得Cry1Ab5-表達(dá)的水稻植株。按照以上的說明，同樣可以利用能夠編碼Cry1Ca4蛋白活性組分并在植物中表達(dá)的嵌合基因轉(zhuǎn)化水稻。實(shí)施例3表達(dá)Cry9C的日本型轉(zhuǎn)化水稻的昆蟲抗性從利用35S-cry9C嵌合基因轉(zhuǎn)化的實(shí)施例2中的日本型水稻獲得的具有ELISA陽性的抗鱗翅目類水稻害蟲殺蟲活性和抗除草劑活性的T1后代植株，對(duì)它們的評(píng)估最初是通過在溫室中記錄攝食這類植株的二化螟幼蟲生長(zhǎng)速率和死亡率來進(jìn)行。將所得的結(jié)果與攝食未經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻品種Chiyonishiki葉片的幼蟲的生長(zhǎng)速率和死亡率進(jìn)行比較。
在兩次溫室試驗(yàn)中，完成四個(gè)轉(zhuǎn)化(ROS-012-2805，-2401，-2702，-3703是已經(jīng)被證實(shí)表達(dá)了Cry9C蛋白的轉(zhuǎn)化植株)和一個(gè)陰性對(duì)照，Chiyonishiki水稻，評(píng)估它們對(duì)二化螟的抗性。將轉(zhuǎn)化的水稻品系在溫室中進(jìn)行播種，待長(zhǎng)出第四片葉子時(shí)，在植株上噴灑草銨膦以區(qū)分非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株。
當(dāng)植株開始分蘗時(shí)，連續(xù)兩天對(duì)植株進(jìn)行侵染，每一植株使用一個(gè)卵塊。分別在侵染20-35天和70天以后，植株的蟲害程度以0(即沒有蟲害)到3(即嚴(yán)重蟲害)這樣的等級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)。只有在植株抽穗之前，侵染才能重復(fù)進(jìn)行。在侵染44-52天以后，評(píng)價(jià)對(duì)莖的外部所受蟲害。侵染70天以后，解剖植株并計(jì)算含有昆蟲隧道的莖的數(shù)量。Chiyonishiki植株的受蟲害程度達(dá)到2.5-3.0級(jí)，證明生長(zhǎng)階段的害蟲侵染是成功的并且未轉(zhuǎn)化植株受到具有較高程度的蟲害。這一結(jié)論同樣適用于抽穗前階段的侵染，因?yàn)榇蟛糠諧hiyonishiki對(duì)照植株顯示出二化螟的隧道。經(jīng)過生長(zhǎng)階段侵染之后，轉(zhuǎn)化水稻品系中的三種，即ROS12-2805，-2401，-2702表現(xiàn)出很低的受蟲害程度，其中最大的植株蟲害等級(jí)為0.25。
所有轉(zhuǎn)基因Cry9C水稻植株顯示出的有隧道的莖的數(shù)量低于Chiyonishiki對(duì)照植株。受評(píng)估的轉(zhuǎn)化品系之一的ROS12-3703，完全沒有受蟲害并且莖桿根本沒有隧道存在。
與攝食未轉(zhuǎn)化植株的葉片的禾草螟屬幼蟲相比，攝食能夠表達(dá)Cry9C蛋白的轉(zhuǎn)化水稻植株的幼蟲具有明顯地較高的死亡率。而且，含有較高濃度Cry9C蛋白的植株比含有較低濃度的植株能夠更好的防御害蟲。在獨(dú)立的昆蟲毒性試驗(yàn)中，表達(dá)高含量Cry9C蛋白的轉(zhuǎn)基因Cry9C植株能夠很好的抑制其它的用于試驗(yàn)的昆蟲如鱗翅目類水稻蛀莖昆蟲和水稻折葉蟲，尤其是三化螟，刷須野螟屬patnalis以及稻縱卷葉野螟的侵害。
轉(zhuǎn)化植株也能夠被用來獲得對(duì)其它害蟲的抗性其它的鱗翅目類如水稻弄蝶，大螟，斜紋貪夜蛾種，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，或稻弄蝶。實(shí)施例4表達(dá)Cry9C的印度型轉(zhuǎn)化水稻的昆蟲抗性從利用Pgos2-cry9C或Pubi-cry9C嵌合基因轉(zhuǎn)化的實(shí)施例2中的印度型水稻獲得的具有ELISA陽性的抗鱗翅目類水稻害蟲殺蟲活性和抗除草劑活性的T1后代植株，對(duì)它們的評(píng)估最初是通過在溫室中記錄攝食這類植株的三化螟和稻縱卷葉野螟的幼蟲生長(zhǎng)速率和死亡率來進(jìn)行。將所得的結(jié)果與攝食未經(jīng)轉(zhuǎn)化的同一印度水稻品種的葉片的幼蟲的生長(zhǎng)速率和死亡率進(jìn)行比較。
在溫室試驗(yàn)中，七個(gè)轉(zhuǎn)化的水稻品系(已經(jīng)被證實(shí)是表達(dá)了Cry9C蛋白的轉(zhuǎn)化植株，參見附表1)和一個(gè)未轉(zhuǎn)化的陰性對(duì)照，印度型水稻，評(píng)估它們對(duì)三化螟和稻縱卷葉野螟的抗性。將轉(zhuǎn)化的水稻品系在溫室中進(jìn)行播種，移植并且待長(zhǎng)出第四片葉子時(shí)，在植株上噴灑草銨膦以區(qū)分非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株。
在田間采集三化螟的幼蟲，使它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室里長(zhǎng)成成蟲，并采集它們的卵塊。
移植4-5周后，每一個(gè)植株的分蘗以三化螟的五個(gè)卵塊或幼蟲進(jìn)行侵染。侵染20-35天之后通過統(tǒng)計(jì)分蘗出現(xiàn)死心的數(shù)目相對(duì)于植株分蘗的總數(shù)目來記錄植株受三化螟侵害的程度，分蘗出現(xiàn)死心是植株受蛀莖昆蟲侵害的典型特征。在記錄了蟲害率之后，解剖植株并測(cè)定受蟲害植株上的回收幼蟲的數(shù)量(結(jié)果參見以下的附表1)。未轉(zhuǎn)化的印度型水稻植株具有較高受蟲害等級(jí)(分蘗總數(shù)的50-100％出現(xiàn)死心)，證明生長(zhǎng)階段的害蟲侵染是成功的并且未轉(zhuǎn)化植株受到較高程度的蟲害，對(duì)于受蟲害的植株，每一植株可以回收2-4只幼蟲。
經(jīng)過生長(zhǎng)階段侵染之后，轉(zhuǎn)化水稻品系中的三種，即ROS045-01001，ROS046-00401，ROS048-00207表現(xiàn)出很低的受蟲害程度，在所有植株的分蘗總數(shù)中每一個(gè)品系僅有1-2個(gè)分蘗出現(xiàn)死心。其它的品系完全防御受到三化螟的侵害。
移植6-8周后，每一個(gè)植株的分蘗以稻縱卷葉野螟的五個(gè)卵塊或幼蟲進(jìn)行侵染。利用從0(沒有蟲害)到9(整個(gè)植株干枯)這樣的等級(jí)統(tǒng)計(jì)植株受稻縱卷葉野螟的侵害程度。在記錄了蟲害率之后，解剖植株并測(cè)定受蟲害植株上的回收幼蟲的數(shù)量(結(jié)果參見以下的附表1)。
未轉(zhuǎn)化的印度型水稻植株達(dá)到8級(jí)的較高受蟲害程度，證明生長(zhǎng)階段的害蟲侵染是成功的并且未轉(zhuǎn)化植株受到較高程度的蟲害，對(duì)于受蟲害的植株，每一植株可以回收9-11只幼蟲。
經(jīng)過生長(zhǎng)階段侵染之后，所有轉(zhuǎn)化品系顯示出1-2級(jí)的很低的受蟲害比率，表明它們能夠完全防止受到稻縱卷葉野螟的侵害。一些輕微的侵害是正常的，因?yàn)槔ハx需要通過消化水稻植株的物質(zhì)材料才能體驗(yàn)Cry9C蛋白的毒性。
因此，通過這些溫室植株侵染試驗(yàn)證實(shí)，同攝食未轉(zhuǎn)化植株的鱗翅目類幼蟲相比，攝食能夠表達(dá)Cry9C蛋白的轉(zhuǎn)化水稻植株的鱗翅目類幼蟲具有明顯地較高的死亡率。
不用說，本發(fā)明并不局限于上述的水稻植株和具體被應(yīng)用的Cry9C蛋白。另外，本發(fā)明也包括Cry9C蛋白的任一種突變體或變異體，它們保持或提高了對(duì)鱗翅目類昆蟲害蟲的殺蟲活性，如具有Cry9C蛋白的基本氨基酸序列并且保持Cry9C蛋白的基本殺蟲活性的一種蛋白質(zhì)(例如，一種殺蟲性蛋白與含有SEQ ID NO2或4所示序列或其中的殺蟲效應(yīng)的片斷的蛋白質(zhì)至少具有90％的氨基酸序列同一性，較好的至少具有95％的同一性，其中的殺蟲性是針對(duì)二化螟和三化螟種)。而且，本發(fā)明也不局限于上述列舉的水稻植株，還包括任意的水稻品種，雜交，自交或原種品系。而且任何易受到以下昆蟲侵害的植株都包括在本發(fā)明之內(nèi)，作為利用編碼Cry9C蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的優(yōu)選的靶目標(biāo)，昆蟲包括二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patanalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬polychrysus，南美稻白螟，小蔗桿草螟，草地夜蛾，秘夜蛾屬unipuncta，禾草螟屬zacconius，和稻弄蝶，尤其是二化螟，能夠應(yīng)用本發(fā)明的方法控制這些昆蟲的植株還包括但不局限于其它的禾本科植物，如水燕麥，甘蔗，高粱，小麥，小米，單主寄生的水稻和印度玉米。本發(fā)明還提供一種方法用于保護(hù)除水稻之外的植物免受上述昆蟲的侵害，這一方法包括利用編碼Cry9C蛋白的DNA轉(zhuǎn)化植物，或者將Cry9C蛋白施用于這些植物。
本發(fā)明中利用編碼殺蟲效應(yīng)的Cry9C蛋白的DNA對(duì)水稻細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化并不局限于通過應(yīng)用根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒來完成。用于水稻轉(zhuǎn)化的其它已知的技術(shù)，例如通過脂質(zhì)體，電穿孔或基因槍轟擊進(jìn)行的直接基因轉(zhuǎn)移，或利用基于植物病毒或花粉的載體系統(tǒng)，可以用于以cry9C嵌合基因?qū)λ具M(jìn)行轉(zhuǎn)化。表達(dá)可以在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻植株細(xì)胞中進(jìn)行，其中cry9C被整合在基因組，尤其是核基因組中，或者也可以在短暫轉(zhuǎn)化的水稻植株細(xì)胞中進(jìn)行。
可以確信用于轉(zhuǎn)化水稻并使得水稻表達(dá)足夠的Cry9C蛋白的任何方法，都能夠被用于開發(fā)抗昆蟲性的水稻植株。在這一點(diǎn)上，應(yīng)該首選在個(gè)植株中表達(dá)至少兩種非組成型結(jié)合Bt蛋白，如Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1C或Cry1B再加上Cry9C蛋白，以防止和延遲昆蟲抗性的形成。表1
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序列表<110>阿溫提斯作物科學(xué)公司<120>抗昆蟲的水稻<130>9CRICE<140><141><160>4<170>專利版本2.0<210>1<211>3474<212>DNA<213>蘇云金芽孢桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(3474)<400>1atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat48Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His1 5 10 15tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac96Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg144Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met35 40 45aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att192Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile50 55 60agt ggt aga gat gca gtt cag act gcg ctt act gtt gtt ggg aga ata240Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile65 70 75 80ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata gtg agt ttt tat288Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr85 90 95caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg 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1.抗鱗翅目類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲或水稻折葉蟲的水稻植株，它具有一段穩(wěn)定整合在基因組并可在植物中表達(dá)的DNA序列，此DNA序列編碼的蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
2.抗選自以下一組昆蟲的水稻植株，昆蟲包括二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬Polychrysus，南美稻白螟，小蔗稈草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，和稻弄蝶；水稻植株中具有一段穩(wěn)定整合在基因組并可在植物中表達(dá)的DNA序列，此DNA序列編碼的蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
3.抗二化螟，三化螟，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟的水稻植株，它具有一段穩(wěn)定整合在基因組并可在植物中表達(dá)的DNA序列，此DNA序列編碼的蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1至3所述的任一種植株的種子、谷物和加工后的谷物，它們具有一段編碼上述蛋白的DNA序列。
5.如權(quán)利要求4所述的加工后的谷物，它是經(jīng)過粉碎、研磨、脫皮和/或半熟化得到的谷物。
6.如權(quán)利要求1至3所述的任一種植株，在它的基因組中含有一段DNA序列，此DNA編碼的蛋白質(zhì)是選自以下一組蛋白質(zhì)Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1I，Cry1J，Cry2A，Cry6B，Cry3A，蛋白酶抑制劑，豇豆胰蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑II，半胱氨酸蛋白酶抑制劑，GNA植物血凝素，Xhenorhabdus或Photorhabdus spp中的殺蟲蛋白，和具有草銨膦de抗性的蛋白質(zhì)。
7.一種用于獲得抗鱗翅目類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲或水稻折葉蟲的水稻植株及其后代的方法，它包括利用可在植物中表達(dá)的，編碼具有SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的一段DNA序列轉(zhuǎn)化水稻植株。
8.一種用于獲得抗選自以下一組昆蟲的水稻植株及其后代的方法二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬Polychrysus，南美稻白螟，小蔗稈草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，和稻弄蝶，它包括利用可在植物中表達(dá)的，編碼具有SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者具有SEQ IDNO4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的一段DNA序列轉(zhuǎn)化水稻植株。
9.一種用于獲得抗二化螟，三化螟，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟的水稻植株及其后代的方法，它包括利用可在植物中表達(dá)的，編碼具有SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的一段DNA序列轉(zhuǎn)化水稻植株。
10.一種用于控制鱗翅目類水稻蛀莖昆蟲，水稻弄蝶，水稻切根蟲，水稻粘蟲，水稻棘球絳蟲或水稻折葉蟲的方法，包括利用殺蟲劑量的具有SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)與上述昆蟲進(jìn)行接觸。
11.一種用于控制選自以下一組昆蟲的方法二化螟，三化螟，大螟，稻縱卷葉野螟，Hereitogramma licarisalis，稻螟蛉，稻眼蝶，刷須野螟屬patnalis，刷須野螟屬exigua，刷須野螟屬ruralis，稻三點(diǎn)水螟，稻白禾螟，斜紋貪夜蛾，禾草螟屬Polychrysus，南美稻白螟，小蔗稈草螟，草地夜蛾，美洲粘蟲，禾草螟屬zacconius，和稻弄蝶的方法，包括利用殺蟲劑量的具有SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)與上述昆蟲進(jìn)行接觸。
12.一種用于控制二化螟，三化螟，刷須野螟屬patnalis，稻縱卷葉野螟的方法，包括利用殺蟲劑量的具有SEQ ID NO2所示序列中從氨基酸位點(diǎn)44到氨基酸位點(diǎn)658的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)與上述昆蟲進(jìn)行接觸。
13.如權(quán)利要求10至12所述的任一種方法，其中所述的接觸包括利用編碼上述蛋白質(zhì)的一段DNA序列轉(zhuǎn)化水稻植株，以及在田間培植具有上述DNA序列的上述植株及其后代。
14.利用如權(quán)利要求7至9所述的任一種方法獲得的具有上述可在植物中表達(dá)的DNA序列的植株及其后代。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的水稻植物,以及通過施用Cry9C蛋白控制鱗翅目水稻昆蟲包括水稻折葉蟲、水稻蛀基昆蟲、水稻切根蟲、水稻粘蟲、水稻棘球絳蟲的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,該施用是通過在水稻植物中表達(dá)Cry9C蛋白實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C07K14/195GK1375009SQ00812979
公開日2002年10月16日 申請(qǐng)日期2000年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月17日
發(fā)明者F·米切爾斯, S·簡(jiǎn)森斯, H·庫(kù)馬, D·洛博, J·薩姆森 申請(qǐng)人:阿溫提斯作物科學(xué)公司