專利名稱：用于α－氧代醛合成的官能化固相支持物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于固相有機(jī)合成的官能化固相支持物，涉及制備這些支持物的方法及其應(yīng)用，特別是涉及α-氧代醛肽或α-氧合醛肽的合成或其他有機(jī)分子，如二羥乙酸的非肽性衍生物等的合成。
本發(fā)明還涉及α-氧代醛肽，涉及采用所述官能化支持物制備它們的方法和其應(yīng)用。特別是在制藥工業(yè)，例如在合成疫苗領(lǐng)域或通過化學(xué)連接獲得大分子的合成(由于采用化學(xué)選擇性反應(yīng)而偶聯(lián)幾個分子片段)，或創(chuàng)建產(chǎn)生微量滴定板或生物芯片(如DNA芯片)的組合庫等領(lǐng)域。
有機(jī)分子的自動化合成，特別是肽大分子的固相合成，是由Merrifield首先開發(fā)的。此合成反應(yīng)的一般模式如下將第一個N保護(hù)的氨基酸結(jié)合在一官能化的不溶性固相支持物上，末端氨基脫保護(hù)，延伸肽鏈(逐個偶聯(lián)不同的氨基酸)，N末端氨基酸可能脫保護(hù)。然后，從樹脂上切下多肽并同時脫去氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)。
已提議采用各種類型的不溶性固相支持物聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、多糖、酚醛樹脂、二氧化硅、多孔玻璃和聚丙烯酰胺；最常用的支持物是聚丙烯酰胺和聚苯乙烯，更具體的是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
為了有效和提供足夠的產(chǎn)量，固相支持物的合成取決于以下幾種因素官能化樹脂的選擇，氨基酸保護(hù)基團(tuán)的選擇，反應(yīng)條件的選擇以及可以被組合以獲得最終理想產(chǎn)物的不同肽的選擇。
然而，目前使用的樹脂不能直接產(chǎn)生該最終產(chǎn)物，例如從固相支持物的錨著官能團(tuán)上產(chǎn)生帶α-氧代醛官能團(tuán)的產(chǎn)物。就合成含有α-氧代醛官能團(tuán)的肽而言，慣常用的樹脂不能獲得α-氧代醛肽，而是得到前體形式，必須經(jīng)過后續(xù)的均相轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生所需的官能團(tuán)。
當(dāng)前，在水性或部分水性介質(zhì)中通過部分保護(hù)的或全部脫保護(hù)的肽片段(使用常規(guī)樹脂固相合成預(yù)先獲得)的化學(xué)連接，可得到大尺寸的肽結(jié)構(gòu)物。
該方法導(dǎo)致在兩種適當(dāng)官能化的肽片段之間形成酰胺、硫酯、硫醚、噻唑烷、肟或腙類型的共價鍵。尤其是噻唑烷、肟和腙鍵對制備具有醛基的肽是必須的。
GeoheganKF等人(BioconjugateChem.，1992.3.138-146)描述了以均相定時氧化N末端部位(存在β-氨基醇時)的絲氨酸或蘇氨酸獲得帶有N末端部位醛基的肽。得到的該N末端α-氧代醛基對其他肽片段的1，2-氨基硫醇基、羥氨基或肼官能團(tuán)反應(yīng)性高，因此使它們得以交聯(lián)。
該方法需要制備β-氨基醇及其純化，氧化和最后使產(chǎn)品與氧化試劑相分離。
美國專利5362852也描述了β-氨基醇的使用即均相定時氧化肽鏈中的2-羥氨基在該肽中產(chǎn)生α-氧代醛基，這是在N末端部位帶有一絲氨酸或一蘇氨酸的肽中或在已插入了一個羥基賴氨酸基團(tuán)的肽中產(chǎn)生α-氧代醛基的例子。
與此相似，國際專利PCT申請WO94/25071描述均相定時氧化N末端帶有一絲氨酸或蘇氨酸的肽，在此肽的所述N末端形成α-氧代醛基。所述肽采用Sasrin樹脂(由Bachem提供)以自動化方式合成。
關(guān)于產(chǎn)生C末端部位的醛基，目前僅有幾種方法，其中一些方法要求在C末端部位形成α-氨基醛基。產(chǎn)生的肽缺點(diǎn)是不穩(wěn)定，其他問題是差向立體異構(gòu)作用等。
J.P.TAM等人(Proc.Natl.AcadSci，1998年8月，95，9184-9189)提出合成C末端部位帶有糖醛基團(tuán)(-NH-CH2-CHO)的肽。所述的這種合成是不能實(shí)施的，因?yàn)橐笾苽湟婚g隔以及均相形成醛基。該固相只用于固相再熟化肽合成，此種合成不可能自動化，因?yàn)槠渥詈笠徊桨l(fā)生在均相中。
在上述國際PCT申請WO94/25071中描述了C末端部位α-氧代醛基的導(dǎo)入，但是所述官能團(tuán)不是與肽骨架直接連接，如所用的方法表明的那樣肽鏈?zhǔn)枪滔嗪铣傻?，采用了聚苯乙烯型樹脂，C末端插入一條五個賴氨酸的序列，將絲氨酸接枝到該肽N末端的α或賴氨酸側(cè)鏈的ε游離氨基上。將經(jīng)此修飾的肽與固相支持物相分離，以均相定時氧化使形成N末端和C末端賴氨酸側(cè)鏈的α-氧代醛基。
J.P.JAM等人(Proc.Natl.AcadSci，1998年8月，95，9184-9189)還描述了以類似方法在固相中獲得的肽的C末端插入一賴氨酸殘基，將一絲氨酸殘基接枝到該賴氨酸側(cè)鏈的氨基上，從支持物上切下肽，并定時均相氧化所述絲氨酸中的β-氨基醇，以獲得α-氧代醛基功能。
在所有這些方法中都通過均相產(chǎn)生醛基使肽官能化，然后將肽從固相支持物上切下來。
因此，顯然需要一種簡單而可自動化的方法合成含有α-氧代醛基的有機(jī)產(chǎn)物，例如，C末端帶有α-氧代醛基的肽，使用這類有機(jī)產(chǎn)物的目的，例如是作為酶的抑制劑，或作為藥物學(xué)或藥理學(xué)感興趣的產(chǎn)品，或在化學(xué)連接的構(gòu)架中帶有α-氧代醛基的肽，以制備結(jié)構(gòu)更復(fù)雜以及適合于實(shí)施這種方法的支持物。
本發(fā)明者因此給自己提出了以下任務(wù)，即提供一種適合于用α-氧代醛基官能化化學(xué)修飾有機(jī)分子的固相支持物，以及合成至少含有一個α-氧代醛基的化合物的方法，所述方法應(yīng)滿足以下要求-它必須能在一個步聚中，即在產(chǎn)物與固相支持物相分離的過程中，形成該α-氧代醛基；-將產(chǎn)物從固相支持物上裂解的步驟必須直接產(chǎn)生最終產(chǎn)物，亦即就肽合成而言，α-氧代醛肽是脫保護(hù)形式的；-該方法必須使用低成本試劑，并且效率好(產(chǎn)量高)、簡單和可以自動化。
因此本發(fā)明的目的是一種用于合成至少含有一個α-氧代醛基的化合物的官能化固相支持物。該支持物的特征是它對應(yīng)于以下分子式I 其中-S為固相支持物，至少其表面在水性或部分水性介質(zhì)中具有良好的溶劑化性能；-n和m可以相同或不同，為0或1；-當(dāng)n等于1時，Z為選自醚、硫醚、酯、胺、酰胺、磺酰胺、羥胺、肼、腙、噻唑烷、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲官能團(tuán)及其衍生物；-當(dāng)n等于0時，Z為選自酯、酰胺、N-?；u胺、肼、腙、肟和噻唑烷官能團(tuán)及其衍生物；-P1和P2可以相同或不同，或與它們相結(jié)合的氧原子一起形成一個環(huán)，代表氫原子或保護(hù)1、2位上羥基的官能團(tuán)，此時P1和P2選自-R1、-(CO)R1、-(CO)OR1、-(SO2)OR1、-SiR’R”R、縮醛基和十六烷醛基(cetal)官能團(tuán)；R，R’，R”和R代表線性、分枝狀、環(huán)狀、飽和或不飽和的1-18個碳原子的烷基、芳基或雜芳基；所述烷基、芳基或雜芳基可被一個或多個鹵原子，一個或多個氨基、羥基、烴氧基、芳氧基、烷硫基代芳硫基部分或全部取代，-A和B可以相同或不同，它們代表線性、分支狀或環(huán)狀，飽和或不飽和的碳鏈，含有1-18個碳原子和可能含有1-7個選自以下基團(tuán)的官能團(tuán)羰基官能團(tuán)、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基和雜芳基，A和/或B還可以含有1-16個雜原子，優(yōu)選1-16個氮或氧原子，并可被1-16個可受到適當(dāng)保護(hù)的羥基或氨基所取代，-A和/或B的至少一個碳原子可以被以下一官能團(tuán)所取代 其中，A’與A相同或不同；不同時，A’選自上面定義的其它A官能團(tuán)；和-X’選自-OR1、-NR’R”基團(tuán)，R、R’和R”為氫原子或如上所述定義的基團(tuán)。作為舉例和非限制性的例子有-合適的烷基是甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基、乙烯基、烯丙基或芐基；-合適的芳基(芳族環(huán))是苯基或羥甲苯基；-合適的雜芳基(芳族雜環(huán)化合物)是吡啶基、嘧啶基或吡嗪基；-合適的碳環(huán)是環(huán)戊基或環(huán)己基；-合適的雜環(huán)是哌嗪基；可取代所述烷基、芳基或雜芳基的鹵族原子，例如氟、氯或溴；合適的烴氧基，例如是甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、乙烯氧基和丙烯氧基(alloxy)；合適的芳氧基，例如是苯氧基或甲苯氧基類；合適的烷硫基例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、或乙烯硫基；合適的芳硫基例如是苯硫基或甲苯硫基。
作為舉例和非限制性例子，保護(hù)基P1和P2可以是如下基團(tuán)-當(dāng)P1和P2為-R1官能團(tuán)時，-R1可以是甲基、叔丁基、對甲氧基芐基、甲氧基甲基、芐氧甲基、對甲氧基芐氧甲基、對甲氧基苯氧甲基、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基甲基、三苯甲基、四氫吡喃基、愈創(chuàng)木酚基甲基等；-當(dāng)P1和P2為-(CO)R1官能團(tuán)時，-(CO)R1可以是乙?；?、苯甲酰基、對甲基苯甲?；?，新戊酰基等；-當(dāng)P1和P2為-(CO)OR1官能團(tuán)時，-(CO)OR1可以是-COOCH3、-COOC2H5、-COOCH2C6H5、9-芴基-甲氧基羰基等。
-當(dāng)P1和P2為-(SO2)OR1官能團(tuán)時，-(SO2)OR1可以是-(SO2)OCH3、-(SO2)OC2H5官能團(tuán)等；-當(dāng)P1和P2為-SiR’R”R”官能團(tuán)時，-SiR’R”R可以是三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等；-當(dāng)P1和P2為縮醛或十六烷醛(cetal)官能團(tuán)時，它們可以是亞芐基、異亞丙基等；-當(dāng)P1和P2與它們所結(jié)合的氧原子一起形成一個環(huán)時，該環(huán)可以是1，3，2-(dioxathiolane)二氧硫雜環(huán)烷；然而，應(yīng)清楚地理解任何羥基保護(hù)基團(tuán)都可用作P1或P2基團(tuán)，如Theodora.W.Greene和PeterG.M.Wuts在“有機(jī)合成中的保護(hù)基”，(1991，JohnWileyandSons.Inc出版)一書中所述。
令人驚奇的是，本發(fā)明這種官能化的支持物特別適合用來制備含有至少一個α-氧代醛基的化合物，并且這種制備無須事先合成醛。
另外，它們還具有許多優(yōu)點(diǎn)能在溫和條件下特異性地從支持物上裂解合成的化合物；與許多有機(jī)分子有相容性；如以下詳述可以重復(fù)循環(huán)使用最初的支持物。
按照所述，支持物S的一個較佳實(shí)施方案，其可選自以下物質(zhì)-多孔硼硅玻璃顆粒；-玻璃或硅制成的表面；按照所述支持物S的優(yōu)選實(shí)施例，它選自以下物質(zhì)-多孔硼硅玻璃顆粒；-玻璃或硅制的表面；-選自以下樹脂聚丙烯酰胺樹酯、聚丙烯酰胺一聚乙二醇樹酯、聚乙二醇-聚苯乙烯樹脂、交聯(lián)的乙氧基化物-丙烯酸酯樹脂和接枝了親水性分子的聚乙烯、聚苯乙烯或聚丙烯類樹脂。
這些樹脂可從商品市場上購得，商品名為Spar(聚丙烯酰胺類樹脂)、PEGA(聚丙烯酰胺-聚乙二醇類樹脂)、TentaGel、ArgoGel、NovaSyn、NovaGel(聚乙二醇-聚苯乙烯類樹脂)、Clear(交聯(lián)的乙氧基化物-丙烯酸酯樹脂)、Chiron、SynPhase-MD(接枝了甲基丙烯酸/二甲基丙烯酰胺酸共聚物的聚乙烯環(huán))、SynPhase-HM(接枝了甲基丙烯酸羥基乙酯的聚乙烯環(huán))等。
合適的玻璃表面，例如是顯微鏡載玻片。
本發(fā)明較佳的式I支持物中，例如，S是聚丙烯酰胺-聚乙二醇類樹脂；m和n為1，B是-(CH2)2-CO-NH-鏈，Z是酰胺官能團(tuán)，A是-CO-NH-(CH2)3-鏈，P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)官能團(tuán)，和X’代表-NH-(CH2)3-NH2鏈。
本發(fā)明另一個較佳的式I支持物中，例如，S是聚丙烯酰胺-聚乙二醇類或聚乙二醇-聚苯乙烯類樹脂，m和n代表O，Z是酰氨基，P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基，和X’代表甲氧基。
本發(fā)明對應(yīng)于分子式I另一個較佳的式1支持物中，S如以上所定義，m為1，n為0，Z是酰胺官能團(tuán)，P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基，X’為甲氧基，和B為以下基團(tuán) 本發(fā)明對應(yīng)于式I的另一較佳的式I支持物中，S如以上所定義，m和n為1，Z是酰氨基，P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基，B是-(CH2)2-CO-NH-基團(tuán)，A為以下基團(tuán) 以及X’為以下基團(tuán) 本發(fā)明對應(yīng)于式I的另一較佳的式I支持物中，S如以上所定義，m為0，n為1，Z是氨基甲酸酯基，P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基，X’為甲氧基，以及A為以下基團(tuán) 本發(fā)明對應(yīng)于以下分子式的另一較佳的式I支持物 其中，S如以上所定義，n＝0，m＝1，Z是酰胺官能團(tuán)，X’為甲氧基，P1和P2一起形成異亞丙基，以及B是以下基團(tuán) 本發(fā)明對應(yīng)于以下分子式的另一較佳的式I支持物 其中，S如以上所定義，n＝0，m＝1，Z是酰胺官能團(tuán)，X’為甲氧基，P1和P2一起形成異亞丙基，以及B為以下基團(tuán) 本發(fā)明式I支持物可有利地用作固相支持物來合成α-氧代醛肽或至少含一個α-氧代醛基而官能化的其他有機(jī)分子，如二羥乙酸的衍生物。
本發(fā)明式I支持物也可用來合成寡核苷酸，特別是寡脫氧核苷酸，或合成至少含一個α-氧代醛基而官能化的脂質(zhì)，所采用的熟知技術(shù)的描述可參見，例如“寡核苷酸的合成，實(shí)用方法”(1984年M.J.GAIT編，IRLPress，WashingtonD.C.)。本發(fā)明的式1化合物還可用于肽或蛋白質(zhì)的自動化方式固相合成，其描述可參見，例如R.C.SheppardComp.Org.Chem，1979，5，352-355和R.B.MerrifieldScience，1986年4月18日，232，341-347。在這種合成中，應(yīng)如已知的那樣恰當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)氨基酸的側(cè)鏈。
本發(fā)明還涉及制備上述式I支持物的方法，所述方法的特征在于其包括將-具有式S-(B)m-Y的官能化固相支持物，其中B、S和m如上所定義，Y為親核基團(tuán)，B可被至少一種其他Y官能團(tuán)(與式S-(B)m-Y所示官能團(tuán)相同或不同)所取代。除了式S-(B)m-Y所示官能團(tuán)外，在此情況下所述固相支持物是多官能化的。
-與選自酒石酸環(huán)酐或其衍生物之一的化合物，以及式II化合物 其中，n、A、P1、P2和X’如以上所定義，X為親電子基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，按照本發(fā)明的含義，“親核”意味著具有一對自由電子的基團(tuán)，即供電子基團(tuán)。“親電子”意味具有低能量空分子軌道的基團(tuán)，其能與親核基團(tuán)的自由電子對相互反應(yīng)，即電子接受基團(tuán)。
另外，當(dāng)n＝1時，Y可以是親電子基團(tuán)，X可以是親核基團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明所述方法的一個優(yōu)選形式實(shí)施方案，合適的親電子基團(tuán)(即n＝0時的X基團(tuán)和n＝1時的X基團(tuán)或Y基團(tuán))宜選自以下官能團(tuán)-當(dāng)n＝1時-CR2R3Cl、-CR2R3Br、-CR2R3I、-CR2R3OSO2R4、-CHO、-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、-SO2OR2、-SOOCl、琥珀酰亞胺酯、磺基琥珀酰亞胺酯、經(jīng)親電子激活劑轉(zhuǎn)化的-COO-、-N＝C＝O(異氰酸酯)、-N＝C＝S(異硫氰酸酯)、-O-CO-OR2、-O-CO-Im，-O-COCl、-NR2-COCl和-NR2-CO-Im，其中Im是可能被取代的下式咪唑基團(tuán)。 其中R2、R3和R4可以相同或不同，為氫原子、或含有1-18個碳原子的線性、分支狀或環(huán)狀、飽和或不飽和烷基，或芳基和雜芳基，所述烷基、芳基和雜芳基可被一個或多個氨基、羥基、烴氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基部分或全部取代。
-當(dāng)n＝0時-CHO、-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、經(jīng)親電子激活劑轉(zhuǎn)化的-COO-，R2為以上n＝1時所述的基團(tuán)。
親電子激活劑是一種能與羧酸根-COO-反應(yīng)而賦予其親電子性質(zhì)的物質(zhì)，這種物質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如參見B.M.Trost和I.Fleming編著的“綜合性有機(jī)合成，Comprehensiveorganicsynthesis”，PergamonPress，1991，1-9卷。
按照所述方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)n＝0或n＝1時，合適的親核基團(tuán)(即n＝0時的Y基團(tuán)和n＝1時的X基或Y基團(tuán))宜選自以下官能團(tuán)-OH、-SH、-COO-、-NHR5、-CONR5NH2、-N[R5(CO)]NH2、-N[R5O(CO)]NH2、-N[R5NH(CO)]NH2、-SO2NH2、-SO2NR5NH2、-ONH2、-(CO)ONH2和-C(NHR5)-CR5R6-SH，R5和R6具有與上述親電子基團(tuán)中所定義的R2至R4基團(tuán)相同的含意。
根據(jù)式1支持物制備方法的一個優(yōu)實(shí)施方案，在n＝0和X＝-COOR2，以及R2＝H時，該基團(tuán)可能起著親核和親電子基團(tuán)雙重作用。在n＝0和X＝-COOH時，X可以是親核基團(tuán)，Y是親電子基團(tuán)。例如，如果X＝-COOH和Y＝-NHR5，X起親電子基團(tuán)作用。另一方面，如X＝-COOH和Y＝-CR2R3Cl，-CR2R3Br，-CR2R3I或-CR2R3OSO2R4，那么X起親核基團(tuán)作用。
這樣固相支持物S-(B)m-Y與環(huán)狀酒石酸環(huán)酐或其衍生物的反應(yīng)，或與式II化合物的反應(yīng)使得可能獲得本發(fā)明式I的支持物。取決于所選擇的X和Y官能團(tuán)，可形成不同的Z基團(tuán)。作為舉例和非限制性實(shí)例有
-Z官能團(tuán)＝＝醚(硫醚或胺)，可通過X＝-OH(-SH或-NHR5)與Y＝-CR2R3Cl、-CR2R3Br、-CR2R3I或-CR2R3OSO2R4(例如對甲苯磺酸鹽或甲磺酰鹽)反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝酯(或酰胺)可通過X＝-OH(或-NHR5)與Y＝-COOR2、-COF、-COCl或COBr反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝磺酰胺，可通過X＝＝-NHR5與Y＝-SO2OR2或-SOOCl反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝羥胺或羥胺衍生物如N-?；u胺或N，O-?；u胺鍵，可通過X＝-ONH2或-(CO)ONH2與Y＝＝-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、-SO2OR2或-SOOCl反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝肼或肼衍生物，可通過X＝-CONR5NH2、、-N[R5(CO)]NH2、-N[R5O(CO)]NH2、-N[R5NH(CO)]NH2或-SO2NR5NH2與Y＝-COOR2、-COF、-COCl、COBr、SO2OR2或-SOOCl反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝腙或其衍生物(例如磺酰腙)，可通過X＝-CONR5NH2與Y＝-CHO反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝噻唑烷，可在X＝-C(NHR5)-CR5R5-SH和Y＝-CHO之間形成；-Z官能團(tuán)＝＝肟，可通過X＝-ONH2和Y＝-CHO之間的反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝碳酸酯(-O-CO-O-)可通過X＝-O-CO-OR2，-O-CO-Im或-O-COCl和Y＝-OH之間的反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝氨基甲酸酯(-NR2-CO-O-)，可通過X＝-NR2-COCl，-NR2-CO-Im或異氰酸酯和Y＝-OH之間的反應(yīng)而形成；或通過X＝-O-CO-OR2，-O-CO-Im或-O-COCl和Y＝-NHR5之間的反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝硫代氨基甲酸酯(-NR2-CS-O-)，可通過X＝異硫氰酸酯和Y＝-OH之間的反應(yīng)而形成；-Z官能團(tuán)＝＝脲，可通過X＝-NR2-CO-Im，-NR2-CO-Im或異氰酸酯和Y＝-NHR5之間的反應(yīng)而形成；-Z基團(tuán)＝＝硫脲，可通過X＝異氰酸酯和Y＝-NHR5之間反應(yīng)而形成；根據(jù)制備本發(fā)明分子式I支持物方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述酒石酸的環(huán)酐或其衍生物是＝二-O-苯甲酰酒石酸酐或二乙酰酒石酸酐；根據(jù)制備本發(fā)明分子式I支持物方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)P1和P2為氫原子，而具有分子式S-(B)m-Y的固相支持物與式II化合物反應(yīng)時，可以在具有式S-(B)m-Y的固相支持物與式II化合物反應(yīng)后而在本發(fā)明式I支持物用于合成含有至少一個α-氧代醛基的化合物之前，在1，2位上引入含保護(hù)性羥基的非氫原子的P1和P2基團(tuán)，即羥基保護(hù)基；根據(jù)本發(fā)明方法另一優(yōu)選實(shí)施方案，式II化合物為酒石酸或其衍生物。在這種情況下，當(dāng)式II的基團(tuán)A為使-OP2基團(tuán)的α位上包含羥基時，固相支持物S-(B)m-Y與式II化合物之間的反應(yīng)相當(dāng)于酒石酸或酒石酸衍生物接枝到固相支持物S-(B)m-Y上。
酒石酸的這類衍生物的非限制性例子有-酒石酸鹽(鈉鹽，鋰鹽)-二苯甲?；剖?二對甲苯?；剖?二異丙基酒石酸-二新戊酰酒石酸-二乙酰基酒石酸-間位酒石酸-菊苣苷酸(cichorinicacid)-tartralinicacid-4-氟-tartrani licacid-4-氯-tartranilicacid-4-甲基-tartranil icacid-4-硝基-tartranilicacid-酒石酸-單-N-辛胺-N-(2，4-二氯苯基)-2，3-二羥基琥珀酰胺酸-2，3-二乙酸基-N-[1-(1-萘基)乙基]琥珀酰胺酸-4-乙酸基-2，5-二氧-四氫呋喃-3-基乙酸酯-3，4-二羥-2，5-二氧四氫呋喃二對-甲苯甲酸酯-酒石酸二甲酯-酒石酸二乙酯-酒石酸二丁酯-酒石酸二叔丁酯-酒石酸二異丙酯-二琥珀酰亞氨酒石酸-二磺基琥珀酰亞氨酸
-二異戊酒石酸-酒石酸二芐酯-3-吡碇甲基酒石酸-2，3-O-異亞丙基酒石酸二甲酯-2，3-O-亞芐基酒石酸二甲酯-2，3-O-(1-苯基亞乙基)酒石酸二甲酯-2，3-O-異亞丙基酒石酸二乙酯-2，3-O-亞芐基酒石酸二甲酯-O，O’-雙(三甲基甲硅烷基)酒石酸二異丙酯-二酒石酸苯基丙醇氨-二酒石酸煙堿醇酯-1，3，2-二氧硫烷4，5-二羧酸二甲酯-2苯基-1，3-二氧烷4，5-二羧酸二乙酯-2苯基-1，3-二氧烷4，5-二羧酸鹽二甲酯-2，3-二羥基琥珀酸二芐酯-2，3-二羥基琥珀酸二[2-氧-2-(4-三氟甲基)苯基]乙酯當(dāng)固相支持物S(B)m-Y與酒石酸環(huán)酐(或其衍生物之一)或式II化合物之間發(fā)生反應(yīng)時，以及當(dāng)式II化合物是酒石酸(或其衍生物之一)的酯時，所述環(huán)酐或所述酯可在與所述固相支持物反應(yīng)前經(jīng)歷水解或皂化反應(yīng)，其目的是產(chǎn)生能與官能化固相支持物反應(yīng)的游離酸官能團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案，式II化合物可選自以下物質(zhì)粘酸(半乳糖二酸)，糖酸，葡糖二酸(其中X’＝-OH，n＝1，A＝-CH(OH)-CH(OH)-，X＝-COOH，P1＝P2＝H，這三種酸在它們各自的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)上不同)，它們的鹽(鉀鹽，鈉鹽)和它們的衍生物。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案，所述方法包括使-具有式H2N-(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-S的官能化固相支持物，其中S定義如前，-與2，3-O-異亞丙基酒石酸二甲酯反應(yīng)；根據(jù)本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案，所述方法包括使-具有式H2N-(CH2)3-NH-CH2-CO-NH-S的官能化固相支持物，其中S定義如前，-與2，3-O-異亞丙基酒石酸二甲酯反應(yīng)；本發(fā)明還涉及具有如下分子式III的支持物 其中S、B、A、n、m、Z、P1和P2定義如上，Y’為一有機(jī)成分。
較佳的，Y’為一種化合物，或由選自脂、核苷酸(可被取代或不被取代)和氨基酸的幾種化合物形成的鏈(可含有脂)。一般講，Y’為脂、寡核苷酸、肽、擬肽等。Y’可含有一種或多種類型的上述化合物，Y’也可是均聚物或雜聚物。
借助于能提供氨基酸、脂、核苷酸等接枝到支持物上的官能團(tuán)的適當(dāng)試劑，經(jīng)對-COX’官能團(tuán)的化學(xué)修飾或衍生后，可從式I支持物獲得式III支持物。例如，可設(shè)想將二胺、二醇或氨基醇接枝到COX’官能團(tuán)上，支持物上具有導(dǎo)入的氨基或游離醇基就能合成修飾的肽。
可從本發(fā)明式I支持物獲得上述式III支持物，例如可參見以下描述“固相有機(jī)反應(yīng)”四面體報(bào)告編號394，Tetrahedron，1996，52，4527-4554和“固相有機(jī)反應(yīng)II”四面體報(bào)告編號418，Tetrahedron，1997，53，5643-5678。
上述式III支持物可用于保存合成的產(chǎn)品，使所述產(chǎn)品在使用時與支持物分離，同時形成α-氧代醛基。
本發(fā)明還涉及合成至少含有一個α-氧代醛基的有機(jī)化合物的方法，其特征在于，此方法在固相中進(jìn)行，包括以下步驟-制備上述式I支持物，所述制備按上述方法進(jìn)行；-可能的話，衍生改變式I支持物的X’基團(tuán)以導(dǎo)入一官能團(tuán)，使能在上述有機(jī)化合物Y’的支持物上進(jìn)行制備；-固相制備化合物Y’；-如果P1和P2不是氫原子，對根據(jù)上述式III支持物受P1和P2保護(hù)的1，2位上的兩個羥基脫保護(hù)；-定期固相氧化，和-分離產(chǎn)生的、至少由一個α-氧代醛基而官能化的產(chǎn)物。
式I支持物的X’基團(tuán)的衍生化步驟宜包括接枝一個聯(lián)氨，二元醇或氨基醇。
關(guān)于受P1和P2保護(hù)的1，2位上的兩個羥基的脫保護(hù)可能步驟，可在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的條件下進(jìn)行。例如，見“有機(jī)合成中的保護(hù)基”，ThedoraW.Greene和PeterG.M.Wuts，1991，JohnWiley和Sons股份有限公司，或“綜合有機(jī)合成”，B.M.Trost和I.Fleming編，PergamonPress，1991，第1-9卷。
根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方案，二元醇-1，2的脫保護(hù)在酸性介質(zhì)中(較佳在三氟乙酸中)進(jìn)行。
如果P1和P2為縮醛基、十六烷醛基，-SiR’R”R、叔丁基、三苯甲基、四氫呋喃基、甲氧基甲基時，非限制性例子在酸性介質(zhì)中脫保護(hù)是適宜的。
當(dāng)用本發(fā)明式I支持物合成的產(chǎn)物是肽或蛋白質(zhì)時，該脫保護(hù)步驟可能同時脫去所述肽或所述蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一優(yōu)選形式的實(shí)施方案，二元醇-1，2(1，2位上的羥基)的脫保護(hù)發(fā)生在堿性介質(zhì)中進(jìn)行，當(dāng)P1和P2為-(CO)R1酯基團(tuán)時，在堿性介質(zhì)中脫保護(hù)是適宜的。
脫保護(hù)步驟產(chǎn)生具有以下分子式IV所示產(chǎn)物 宜用過碘酸鈉在水/乙酸溶劑中進(jìn)行定時氧化，例如參見L.Zhang等人在Pro.Natl.Acad.Sci.1998，95，9184-9189中的描述。當(dāng)借助本發(fā)明式I支持物合成的產(chǎn)物是肽或蛋白質(zhì)時，這類溶劑可使所述肽增溶。采用水/乙酸溶劑也解釋了為什么選自本發(fā)明式I支持物的固相支持物S應(yīng)具有良好的溶解性能是重要的。
然而，可采用其他混合溶劑來進(jìn)行定時氧化步驟。如果采用本發(fā)明式I支持物來合成含有甲硫氨酸的肽，可在檸檬酸/甲醇/二甲硫緩沖液中進(jìn)行定時氧化，當(dāng)用本發(fā)明式I支持物來合成衍生加入了脂肪酸鏈的肽時，可在叔丁醇/乙酸/水混合液中進(jìn)行定時氧化。
定時氧化式IV產(chǎn)物的結(jié)果是形成了含有α-氧代醛基而官能化的產(chǎn)物Y’，以及形成了具有以下分子式V的固相支持物OHC-(A)n-Z-(B)m-S(V)其中，S，B，A，Z，n和m如上所定義。
憑借上述固相氧化步驟，本發(fā)明方法以特別優(yōu)良方式，從支持物上釋放產(chǎn)物同時該產(chǎn)物在支持物上的錨著點(diǎn)形成α-氧代醛官能團(tuán)。當(dāng)支持物上合成的產(chǎn)物為肽時，在脫保護(hù)的肽上進(jìn)行的固相定時氧化步驟同時使肽從支持物上釋放下來，無需進(jìn)行其他均相脫保護(hù)步驟，并在該肽錨著于支持物的點(diǎn)上形成α-氧代醛基，這可能涉及所述肽或其側(cè)鏈的終止。
然后，通過例如過濾步驟，接著用高效液相色譜法，以原先已知技術(shù)分離如此形成的含α-氧代醛基的官能化產(chǎn)物。
關(guān)于上述式V固相支持物，以再使用的觀點(diǎn)上看，其優(yōu)點(diǎn)是可以再循環(huán)或再生，即可與適當(dāng)?shù)脑噭┓磻?yīng)產(chǎn)生上述本發(fā)明式I支持物，如以下所詳述。
本發(fā)明還涉及具有如下特征的肽，在所述肽N末端以外某位置含有至少一個α-氧代醛基，及不以酰胺鍵與賴氨酸或鳥氨酸側(cè)鏈的氨基結(jié)合，它們可按上述方法獲得。
這樣的肽可有利地用于化學(xué)連接反應(yīng)中。
本發(fā)明還涉及合成有機(jī)化合物庫的方法，其特征在于，此方法包括-提供具有分子式S-(B)m-Y的多種固相支持物表面，其中B、S、Y和m如以上所定義；-使它們與選自酒石酸環(huán)酐或其衍生物的化合物和式II化合物反應(yīng) 其中n、A、P1、P2、X’和X定義如上，以獲得可用于合成含α-氧代醛基的化合物的支持物；-使得到的支持物與有機(jī)分子混合物反應(yīng)，如上所述關(guān)于從式I支持物得到式III支持物；和-獲得有機(jī)化合物庫。
所述有機(jī)分子與上述支持物反應(yīng)，例子見“Thecombinatorialindex”，1998，AcademicPress，London中所述。
所述有機(jī)分子可能是氨基酸、核苷酸或脂類，獲得的有機(jī)化合物是肽、寡核苷酸或脂質(zhì)。
本發(fā)明還涉及有機(jī)化合物庫，其特征在于是根據(jù)上述方法獲得的。
該化合物庫的有機(jī)化合物可從不溶性支持物上分離得到以便以后使用于如上述關(guān)于合成含α-氧代醛基的有機(jī)合物的方法中。
本發(fā)明還涉及選自酒石酸環(huán)酐或其衍生物之一的化合物和式II化合物的用途 其中，n、A、P1、P2和X’及X與上面關(guān)于固相支持物衍生化所定義的相同，所述固相支持物至少其表面在水性或部分水性介質(zhì)中具有良好的溶劑化性能，得到的支持物可用于固相合成含有至少一個α-氧代醛基的化合物。
至少其表面在水性或部分水性介質(zhì)中具有良好溶劑化性能的所述固相支持物，優(yōu)選對應(yīng)于分子式S-(B)m-Y的支持物，S、B、m和Y定義如上。
酒石酸環(huán)酐或其衍生物之一，優(yōu)選二-O-苯甲酰酒石酸酐或二乙酰酒石酸酐。
式II化合物優(yōu)選其A基團(tuán)在OP2基團(tuán)的α位包含一羰基以及A基團(tuán)為酒石酸或酒石酸衍生物。
另外，式II化合物選自包括粘酸、糖酸、葡糖二酸、它們的鹽和衍生物的家族。
本方法的另一內(nèi)容是制備在固相支持物上的診斷試劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟-將用上述方法獲得的含有至少一個α-氧代醛基的有機(jī)化合物連接到適當(dāng)官能化的微量滴定板上-獲得其上共價固定了所述有機(jī)化合物的微量滴定板。
獲得的試劑可用于開發(fā)免疫試劑或藥理試驗(yàn)。
所述有機(jī)化合物宜為肽、寡核苷酸或脂質(zhì)。
所述微量滴定板，優(yōu)點(diǎn)是官能化，這樣使所述有機(jī)化合物能與肟、噁唑烷或腙鍵相連。
本發(fā)明另一內(nèi)容是獲得生物芯片的方法，其特征在于，該方法包括接枝用上述方法獲得的含有至少一個α-氧代醛基的寡核苷酸到固相支持物的步驟。
在這樣獲得的生物芯片中，寡核苷酸共價固定于固相支持物。
這些生物芯片使得追蹤基因表達(dá)(按Science，1995，270，467-470提出的概念)成為可能。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一個優(yōu)秀實(shí)施方案，所述固相支持物是玻璃或硅制成的表面。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)秀實(shí)施方案，所述生物芯片是AND芯片。
除了上述內(nèi)容，本發(fā)明還包括其它內(nèi)容，這將從以下描述、并參考本發(fā)明支持物的實(shí)施例和本發(fā)明α-氧代醛基合成方法的實(shí)施例、以及附圖呈現(xiàn)出來。附圖如下

圖1和圖2，合成本發(fā)明式I支持物的步驟。
圖3，用本發(fā)明支持物合成的肽3-6和肽9，以及用常規(guī)固相技術(shù)合成的肽10，12和14。
圖4，肽18，為經(jīng)脂肪酸修飾的肽，含有α-氧代醛基，所述肽用本發(fā)明支持物合成。
圖5，肽19，聚賴氨酸類型的由8個氯乙?；鸵粋€α-氧合酰醛基而官能化的肽，所述肽用本發(fā)明支持物合成。
圖6，肽20，聚賴氨酸類型的由16個氯乙?；鸵粋€α-氧合酰醛基而官能化的肽，所述肽用本發(fā)明支持物合成。
圖7和圖8，用本發(fā)明肽進(jìn)行腙類的化學(xué)聯(lián)接反應(yīng)。
圖9，用本發(fā)明肽進(jìn)行噻唑烷類的化學(xué)聯(lián)接反應(yīng)。
圖10，用本發(fā)明肽進(jìn)行肟類的化學(xué)聯(lián)接反應(yīng)。
圖11，用本發(fā)明支持物合成的帶有末端α-氧代醛基的肽21。
然而，應(yīng)清楚地理解，給出的這些實(shí)施例只是為了闡述本發(fā)明的目的，不以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1從氨基-PEGA樹脂和(+)-2，3-O-異亞丙基-D-酒石酸二甲酯合成本發(fā)明分子式I支持物圖1總結(jié)了此合成中的不同步驟。
45分鐘內(nèi)將2ml(9.16mmol)的(+)-2，3-O-異亞丙基-D-酒石酸二甲酯(由ACROS提供)1，以下稱為IPT，加入到10ml(120mmol)的1，3-二氨基丙烷中。室溫?cái)嚢?小時30分鐘后，減壓蒸發(fā)除去過量的1，3-二氨基丙烷，分離得到化合物IPT-1，其核磁共振和紅外分析如下RMN1H300MHz(DMSO-d6，TMS)8.19(t，2H，j＝5.5Hz，CONH)，4.46(s，2H，COCH)，3.15(m，4HCH2NHCO)，2.50(m，4H，CH2NH2)，1.48(q，4H，j＝6.6Hz，NHCH2CH2)，1.39(s，6H，(CH3)2C).RMN13C75MHz(DMSO-d6，TMS)171.5，111.5，77.6，39.0，36.4，32.6，26.2.IR(cm-1)3356.8，2940.3，1660.7，1537.6，1084.6。
化合物IPT-1的元素分析如下C49.67％，H9.14％，N18.08％，O22.84％。
用電霧化質(zhì)譜儀分析化合物IPT-1，得到值302.2，符合該化合物的質(zhì)量。
繼續(xù)進(jìn)行如下將0.4mmol的氨基-PEGA樹脂2(0.4mmol/g，Novabiochem)浸泡在最小體積(9.6ml)的二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在697微升(4.0mmol)的二異丙基乙胺(DIEA)和2mlDMF)存在下加入400.3mg(4.0mmol)的琥珀酸酐。得到的支持物3用DMF洗滌(2分鐘，2次)，三氯甲烷洗滌(2分鐘，2次)和用NMP洗滌(2分鐘，2次)。
將1209mg(40mmol)的化合物IPT-1溶于1mlNMP中，加到上面獲得的用最小體積NMP浸泡的支持物3中。然后一步加入265.4mg(0.6mmol)六氟磷酸苯丙三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-磷鎓鹽(BOP)，攪拌該混合物1小時。產(chǎn)生的支持物4用DMF洗滌(4次2，分鐘)，二氯甲烷洗滌(2次，2分鐘)和用乙醚洗滌(2次，2分鐘)，然后真空干燥。
如此獲得本發(fā)明式1支持物，其中S為氨基-PEGA樹脂，m和n為1，B為-(CH2)2-CO-NH-鏈，Z是酰胺官能團(tuán)，A是-CO-NH-(CH2)3-鏈，P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基，X’為-NH-(CH2)3-NH2鏈。
通過S-(B)m-Y支持物與式II化合物的反應(yīng)獲得該支持物，定義如上。式II化合物中Y＝-COOH和X＝-NH2。
實(shí)施例2從氨基-PEGA樹脂和(+)-2，3-O-異亞丙基-D-酒石酸二甲酯合成本發(fā)明另一分子式I支持物圖2總結(jié)了此合成中的不同步驟。
室溫下將7.2微升(0.4mmol)水加入到873微升的(+)-2，3-O-異亞丙基-D-酒石酸二甲酯(由ACROS提供)中。然后在此溶液中加入59.8微升(0.4mmol)的1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十～7-烯(DBU)，攪拌所得的混合物1小時，獲得混合物5。
用二氯甲烷配的5％DIEA和DMF洗滌0.1mmol氨基-PEGA樹脂(0.4mmol/g，Novabiochem)。用最小體積的DMF浸泡該樹脂，然后加入支持物5，以及溶于1mlDMF中的177mg(0.4mmol)BOP試劑(在化合物5中產(chǎn)生羧基的親電子活化劑)。攪拌40分鐘后，用DMF(4次，2分鐘)和二氯甲烷(2次，2分鐘)洗滌所得的支持物6。
如此獲得本發(fā)明式1支持物，其中S為氨基-PEGA樹脂，m和n為0，Z是酰胺官能團(tuán)，P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基，X’為甲氧基，通過S-(B)m-Y支持物與式II化合物反應(yīng)獲得。其中式II化合物定義如上，Y＝-NH2和X＝-COO-由親電子活化劑(BOP)轉(zhuǎn)化而生成。
肼(聯(lián)氨)的優(yōu)點(diǎn)是可接枝到-COX’官能團(tuán)上，在支持物上誘生一自由氨基而使得能合成修飾的肽。
為此目的，加入以最小體積DMF浸泡的支持物6和溶于1ml中的1.0g(7.7mmol)1，7-二氨基庚烷。攪拌1小時后，用DMF(5次，2分鐘)、二氯甲烷(2次，2分鐘)和乙醚(2次，2分鐘)洗滌所產(chǎn)生的支持物7，然后真空干燥。
實(shí)施例3從氨甲基-Novagel和Argogel-NH2樹脂和(+)-2，3-O-異亞丙基-D-酒石酸二甲酯合成本發(fā)明另外二個分子式I支持物。
所用方法類似實(shí)施例2中所述。
用5％DIEA(以CH2Cl2配)溶液中和氨甲基-Novagel樹脂(0.76nmol/g，由Novabiochem出售的第一種樹脂)和Argogel-NH2樹脂(0.4mmol/g，由ArgonautTechnologies出售的第二種樹脂)，然后在最小體積的DMF中膨脹。
將4.8mmolDBU(717.8微升)一步加入含48mmol(+)-2，3-O-異亞丙基-D-酒石酸二甲酯(10.47ml)和4.8mmol水(86.4微升)的溶液中。攪拌1小時后將一半溶液倒入0.6mmol的氨甲基-Novagel樹脂(0.76mmol/g)中，另一半倒入0.6mmol的Argogel-NH2樹脂(0.41mmol/g)中。
對于每一種樹脂，一步加入溶于6mlDMF的1.06g(2.4mmol)BOP作第一次交聯(lián)(45分鐘)和12ml作第二次交聯(lián)(45分鐘)。樹脂然后用DMF(4次，2分鐘)和二氯甲烷(2次，2分鐘)洗滌，再用Ac2O/DIEA/CH2Cl2(10％/5％/85％)處理10分鐘。
如此獲得本發(fā)明式I支持物，其中S是Novagel樹脂或Argogel樹脂，m和n為0，Z是酰胺官能團(tuán)，P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基，X’為甲氧基。
如實(shí)施例2所述，聯(lián)氨的優(yōu)點(diǎn)是可接枝到支持物的-COX’官能團(tuán)上。為此目的，將7.70M的1，3-二氨基丙烷DMF溶液(3ml)加入支持物中，攪拌1小時后，支持物用DMF(5次2分鐘)、二氯甲烷(2次，2分鐘)和乙醚(2次，2分鐘)洗滌，然后減壓干燥。通過紫外分光光度分析測定支持物的電荷。用20％哌啶DMF液交聯(lián)Fmoc-Gly-OH和脫保護(hù)后釋放出富烯-哌啶加成。以本發(fā)明的氨甲基-Novagel樹脂基支持物時，電荷為0.34mmol/g；以本發(fā)明Argogel-NHz樹脂基支持物時的電荷為0.23mmol/g。
實(shí)施例4用本發(fā)明支持物合成C末端含有-氧代醛基的肽圖3顯示用本發(fā)明支持物合成的肽3-6和肽。
a)固相肽合成分別用實(shí)施例1所述支持物4和實(shí)施例2所述支持物6(0.2mmol/g)合成了肽3-5和肽9。
肽合成用AplliedBiosystem431A合成儀以自動化方式進(jìn)行，按照Fields，G.B.等人Int.J.Pept.Protein，1990，35，161所述方法。
用Fmoc(9-芴基甲氧羰基)保護(hù)的氨基酸由Propeptide公司(Vert-Le-Petit，F(xiàn)rance)提供，側(cè)鏈保護(hù)官能團(tuán)如下Arg(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫呋喃-6-磺?；?，Asn(三苯甲基)，Asp(叔丁基)，Gln(三苯甲基)，Lys(叔丁氧基羰基，也稱為Boc)，Ser(叔丁基)，Thr(叔丁基)，Tyr(叔丁基)。
以0.1mmol支持物進(jìn)行合成，每一交聯(lián)步驟使用10當(dāng)量活化氨基酸。肽3和肽9采用一次交聯(lián)，其他肽交聯(lián)氨基酸二次。
一次或二次聯(lián)后重新開始合成前，進(jìn)行殘余氨基加帽，以防止產(chǎn)生缺失肽。為此，通過與含7.5mMN-羥基苯并三唑(HOBt)的Ac2O/DIEA/N-甲基吡咯烷酮(NMP)混合物以4.75/2.25/91.5(體積比)反應(yīng)，用乙酰基封閉氨基。
當(dāng)肽合成完成時，如需要(肽3，5和肽9在它們的末端含乙?；被?通過與上述混合物反應(yīng)而乙酰化肽的末端。
以實(shí)施例1所述支持物4的0.1mmol(0.2mmol/g)人工合成了肽6。每一次交聯(lián)步驟使用10當(dāng)量的活化氨基酸，以溶于DMF的混合物HBTU/HOBt/DIEA(10當(dāng)量/10當(dāng)量/30當(dāng)量)(HBTUH-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)-亞甲基]-N-甲基甲烷鎓N-氧化物六氟磷酸鹽；HOBtN-羥基苯并三唑；DIEA二異丙基乙胺)活化氨基酸。然后用乙?；忾]交聯(lián)步驟中未起反應(yīng)的氨基(與10/5/85體積比的Ac2O/DIEA/CH2Cl2混合液反應(yīng))。對F-moc--Ala-OH和Fmoc-L-Lys(Boc)-OH行一次交聯(lián)(1小時)。F-moc-L-Lys(Fmoc)-OH連接二次。用二異丙基碳二亞胺(2當(dāng)量，以DMF配)活化30分鐘將氯乙酸(2當(dāng)量)連接二次。
b)脫保護(hù)并從支持物上切下固相合成肽的脫保護(hù)如下所述在固相上進(jìn)行-對于肽3、4、6和9，采用10ml三氟乙酸/水/苯甲醚混合液(95/2.5/2.5，體積比)、室溫2小時。
-對于肽5，采用10ml三氟乙酸/水/三異丙基硅烷混合液(95/2.5/2.5，體積比)、室溫3小時。
然后用二氯甲烷(4次，2分鐘)和乙醚(2次，2分鐘)洗滌支持物，減壓干燥。
脫保護(hù)步驟包括肽的氨基酸側(cè)鏈脫保護(hù)和本發(fā)明式III支持物鄰接羥基(1和2位)的脫保護(hù)，從而形成本發(fā)明的式IV化合物(去除了P1和P2的保護(hù)基團(tuán))。
c)固相的定時氧化將干燥形式(以上步驟b)的其上結(jié)合著脫保護(hù)肽的支持物0.1mmol浸泡于5ml水/乙酸混合液(2/1體積比)中15分鐘。然后再一步加入溶于2ml水/乙酸混合液(5/1體積比)的128.3mg(6當(dāng)量)的過碘酸鈉。此步驟同時形成C末端-氧代醛基和從支持物上切下肽。
攪拌2分鐘后，過濾支持物，用6ml水洗滌二次，各1分鐘。然后將該溶液倒入200微升乙二醇中并注入HyperprepC18型反向高效液相色譜(RP-HPLC)柱(購自Interchim.Monlucon，F(xiàn)rance)中。用含0.05％三氯乙酸的水/乙腈線性梯度洗脫液純化肽。
肽3，4，6和9直接凍干，經(jīng)RP-HPLC純化后得率分別為38.0％，26.0％、30.1％和32.9％。
關(guān)于肽5，凍干前加入500mg(+)-D-甘露糖醇(Sigma)，目的是避免肽凝聚現(xiàn)象。
通過氨基酸定量分析測定了肽5的含量(3.3％)，方法是110℃用6N/HCl苯酚10/1混合液完全水解24小時后用茚三酮檢測。肽5得率為6.1％。
實(shí)施例5合成末端含有-氧代醛基官能化的肽，所述肽含有甲硫氨酸用實(shí)施例1所述支持物4按實(shí)施例4所述方法固相制備了以下肽AcKYML-NH-(CH2)3-NH-CO-CHO氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)分別是賴氨酸為Boc基團(tuán)，酪氨酸為-O-叔丁基。
用10ml三氟乙酸/水/乙二硫醇(EDT)/三異丙基硅烷混合液(94/2.5/2.5/1，體積比)室溫下進(jìn)行2小時固相脫保護(hù)。
然后如實(shí)施例4所述用二氯甲烷和乙醚洗滌支持物，真空干燥，再進(jìn)行定時氧化步驟。由于存在甲硫氨酸，肽的定時氧化需要防止此氨基酸被氧化(形成甲硫氨酸亞砜的危險)的特殊條件采用接近中性的pH和二甲硫，后者先于甲硫氨酸被氧化從而起保護(hù)作用。
為了定時氧化和從支持物上切下肽，取270mg干燥支持物置于反應(yīng)器內(nèi)，加入5.4ml檸檬酸鈉緩沖液(pH6)、5.4ml甲醇和0.9mlMe2S(二甲硫)。
15分鐘后一步加入溶于2ml檸檬酸緩沖液的63.18mg(6當(dāng)量)過碘酸鈉。攪拌15分鐘，再加入同樣量的過碘酸鈉。攪拌15分鐘后，將上清液迅速加到0.36g乙二醇中。
立即以pH6.0的5.4ml檸檬酸緩沖液、5.4ml甲醇和0.9mlMe2S重處理回收支持物以同樣方法用過碘酸鈉處理。重復(fù)此程序10次。
以RP-HPL純化后，分離得到肽，得率15.3％。
實(shí)施例6合成C末端含α-氧代醛基而官能化的肽18(圖4)，所述肽經(jīng)脂肪酸修飾。
用實(shí)施例1所述獲得的本發(fā)明式4支持物進(jìn)行肽合成。采用以DMF膨脹的410mg支持物4(0.2mmol/g，或0.082mmol)，連續(xù)洗滌三次，每次2分鐘。除非另作說明，所有反應(yīng)在室溫進(jìn)行。
·導(dǎo)入第一個賴氨酸。
將76.8mgFmoc-Lys(Boc)-OH(0.164mmol，或2當(dāng)量)，25.1mgHOBt(0.164mmol，或2當(dāng)量)和62.2mgHBTU(0.164mmol或2當(dāng)量)加入一試管并溶于1mlDMF中再加入115微升DIEA(0.656mol或8當(dāng)量)。攪拌1分鐘后，將所得的活化的溶液置于支持4上，攪拌1小時后，用DMF淋洗支持物3次，2分鐘，再用二氯甲烷洗3次，2分鐘。用Kaiser定量試驗(yàn)(Anal.Biochem，1970，34，595)(陰性)和TNBS試驗(yàn)(Anal.Biochem，1976，71，260-264)(陰性)評價反應(yīng)性氨基的消失情況。
一旦反應(yīng)性氨基消失，用NMP淋洗支持物3次，2分鐘，加入大大過量的20％哌啶NMP液將Fmoc官能團(tuán)脫保護(hù)。支持物用NMP洗3次，2分鐘，用CH2Cl2洗3次，2分鐘。用Kaiser定量試驗(yàn)評價脫保護(hù)的質(zhì)量(陽性)。
·導(dǎo)入酪氨酸支持物用DMF洗3次，2分鐘。將75.4mg的Fmoc-Tyr(叔丁基)-OH(0.164mmol或2當(dāng)量)，25.1mg的HOBt(0.164mmol或2當(dāng)量)和62.2mg的HBTU(0.164mmol，或2當(dāng)量)加入一試管中，溶于1mlDMF中，以上述引入賴氨酸同樣的方法進(jìn)行。
·導(dǎo)入另一個賴氨酸支持物用DMF洗3次2分鐘，將96.9mg的Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(0.164mmol，2當(dāng)量)，25.1mg的HOBt(0.164mmol，2當(dāng)量)和62.2mg的HBTU(0.164mmol，2當(dāng)量)加入一試管，溶于1mlDMF中。以上述引入第一個賴氨酸的同樣方法進(jìn)行。
·肽的脂肪酸修飾用DMF/CH2Cl2混合液(50/50體積比)洗滌其上合成有Lys-Tyr-Lys的支持物3次2分鐘，將84.1mg棕櫚酸(0.328mmol，4當(dāng)量)加入一試管溶于500微升的50/50DMF/CH2Cl2混合液中。將50.2mgHOBt(0.328mmol，4當(dāng)量)和124.4mgHBTU(0.328mmol，4當(dāng)量)加入另一試管，溶于1ml50/50DMF/CH2Cl2中。混合此二試管內(nèi)容物，攪拌1分鐘，然后加入230微升DIEA(1.312mmol，16當(dāng)量)，攪拌1分鐘后將得到的活化液體置于支持物上，攪拌1小時，用50/50DMF/CH2Cl2混合液洗滌支持物3次2分鐘。在同一試管中再次加入溶于1ml50/50DMF/CH2Cl2的84.1mg棕櫚酸(0.328mmol，4當(dāng)量)和146mgPyBrop(六氟磷酸溴-三吡咯烷鏻鹽)(0.328mmol，4當(dāng)量)。另將173.5微升DIEA(0.984mmol，12當(dāng)量)溶于1ml50/50DMF/CH2Cl2中?；旌隙?分鐘，將所得溶液置于支持物上，攪拌1小時后，支持物用50/50DFM/CH2Cl2混合液洗3次2分鐘，然后用CH2Cl2洗三次2分鐘。用TMBS試驗(yàn)評價反應(yīng)性氨基的消失情況。
·獲得肽18將以上操作得到的支持物真空干燥過夜，在其上加20ml的三氟乙酸、水和三異丙基硅烷混合液(95/2.5/2.5體積比)。攪拌2分鐘，除去三氟乙酸/水/三異丙基硅烷混合液，重新加20ml該混合液到支持物上。攪拌20分鐘后，支持物用CH2Cl2洗3次2分鐘，真空干燥過夜。
用叔丁醇洗滌112mg干燥支持物(0.224mmol)2次2分鐘。將28.9mg過碘酸鈉(0.135mmol，6當(dāng)量)溶于200微升水中，加入200微升33％乙酸水溶液和200微升叔丁醇。將得到的液體加到支持物上。
攪拌15分鐘后，將已沉積在支持物上的溶液引入一含80微升乙二醇的試管中，用600微升的33％水/乙酸合液在水/叔丁醇中(1/1/1體積比)，洗滌支持物。再將得到的液體引入含乙二醇的試管中，沉淀得到肽18(圖4)將該試管放置-20℃有利于沉淀，用33％水/乙酸/叔丁醇(1/1/1體積比)200微升洗滌沉淀。將所得溶液再放置于-20℃以引起產(chǎn)物沉淀，然后離心?；厥盏某恋碚贾С治锷闲纬傻漠a(chǎn)物總量的50％。用4ml叔丁醇/甲醇混合液(50℃)洗滌支持物6次后，以該抽提混合液冷沉淀，抽提其余產(chǎn)物，抽提總得率為79％。用112mg(0.224mmol)支持物分離得到20.1mg純產(chǎn)物18，[M+Na]+計(jì)算值1048；實(shí)測值1048。
實(shí)施例7即8價的肽19(圖5)，稱為聚賴氨酸型、8個氯乙?；?個-氧代醛基官能化的肽，所述肽用本發(fā)明的支持物合成肽19由實(shí)施例1獲得的0.1mmol(0.2mmol)支持物4手工合成。所有氨基酸(每一支持物自由氨基10當(dāng)量)用以DMF配置的HBTU/HOBt/DIEA(10當(dāng)量/10當(dāng)量/30當(dāng)量)活化。每一交聯(lián)步驟后肽用Ac2O/DIEA/C2H2Cl2混合液10/5/85(體積)乙?；τ贔moc--Ala-OH和Fmoc-L-Lys(Boc)-OH交聯(lián)一次(1小時)，而Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH均連接二次(1小時)，一次用二異丙基碳二亞胺(32當(dāng)量)活化連接氯乙酸(64當(dāng)量)二次。
室溫下用10mlTFA/水/苯甲醚(95/2.5/2.5體積比)給官能化的肽固相脫保護(hù)2小時，然后用二氯甲烷(4次，2分鐘)和乙醚(2次，2分鐘)洗滌支持物，減壓干燥。
支持物(0.1mmol)用5ml水/乙酸(2/1體積)膨脹15分鐘后用128.33mg溶于2ml水/乙酸(5/1體積)的過碘酸鈉進(jìn)行定時氧化，并一步加到支持物上。攪拌懸液2分鐘，過濾支持物并用6ml水洗(2次，1分鐘)。合并濾液加入200微升乙二醇以終止氧化反應(yīng)。
在C18Hyperprep柱(15×300mm)上用RP-HPLC純化產(chǎn)物。用0-50％線性梯度的洗脫液B純化支持物100分鐘，流速3ml/分，測定215nm吸光值。
洗脫液A含0.05％體積TFA的水洗脫液B含0.05％體積TFA的乙腈/水(4/1體積)直接收集純化組分并凍干，獲得45mg純化的肽19，得率23.5％。
實(shí)施例8合成16價的肽20(圖6)，即聚賴氨酸型、以16個氯乙酰基和1個-氧代醛基官能化的肽，所述肽用本發(fā)明的支持物合成肽20由實(shí)施例2獲得的0.1mmol支持物6(0.2mmol/g)合成并按實(shí)施例2所述方案用聯(lián)氨官能化，所用聯(lián)氨為1，3-二氨基丙烷。
交聯(lián)氨基酸所用活化試劑是.HBTU、HOBt和DIEA，每次交聯(lián)時每個氨基所用當(dāng)量數(shù)將在下面給出。
在加入支持物前活化1分鐘。Fmoc基團(tuán)的脫保護(hù)用20％哌啶NMP液進(jìn)行(5分鐘1次和20分鐘1次)，每一交聯(lián)步驟后進(jìn)行Kaiser試驗(yàn)和TNBS試驗(yàn)以核查反應(yīng)性-NH2基團(tuán)的消失。
第一次交聯(lián)用10當(dāng)量Fmoc-Ala-OH/HBTU/HOBt(312mg/136mg/379.5mg)和12當(dāng)量DIEA(210微升，以NMP配)。反應(yīng)50分鐘后洗滌支持物去除過量的試劑，進(jìn)行Kaiser試驗(yàn)以核查自由-NH2基團(tuán)的消失。
第二次交聯(lián)Fmoc-Lys-Boc-OH(4當(dāng)量，或187.4mg)HOBt/HBTU/DIEA當(dāng)量數(shù)4/4/12(54.4mg/151.4mg/210微升)反應(yīng)時間50分鐘第三次交聯(lián)Fmoc-Lys-Fmoc-OH(4當(dāng)量，或236.3mg)HOBt/HBTU/DIEA當(dāng)量數(shù)4/4/12(54.4mg/151. 4mg/210微升)反應(yīng)時間50分鐘第四次交聯(lián)Fmoc-Lys-Fmoc-OH(4當(dāng)量，或473mg)HOBt/HBTU/DIEA當(dāng)量數(shù)4/4/12(109mg/303.6mg/420微升)反應(yīng)時間50分鐘第五次交聯(lián)Fmoc-Lys-Fmoc-OH(2.5當(dāng)量，或590mg)HOBt/HBTU/DIEA當(dāng)量數(shù)2.5/2.5/7.5(136mg/379.5mg/579微升)反應(yīng)時間50分鐘第六次交聯(lián)Fmoc-Lys-Fmoc-OH(2.5當(dāng)量，或1.18g)HOBt/HBTU/DIEA當(dāng)量數(shù)2.5/2.5/7.5(272mg/759mg/1 158微升)反應(yīng)時間50分鐘氯乙酸(每-NH2基8當(dāng)量)的交聯(lián)用二異丙基碳二亞胺作為活化劑進(jìn)行二次。
室溫下用10mlTFA/水/苯甲醚(95/2.5/2.5體積比)進(jìn)行支持物和氨基酸的脫保護(hù)2小時，然后用二氯甲烷和乙醚洗滌支持物，減壓干燥。
支持物用5ml水/乙酸(2/1體積)膨脹15分鐘后，用128mg溶于2ml水/乙酸(5/1體積)的過碘酸鈉進(jìn)行定時氧化。反應(yīng)2分鐘后，過濾支持物并用6ml水洗2次。收集濾液加入200微升乙二醇以終止氧化反應(yīng)。
在C18Hyperprep柱(15×200mm)上以RP-HPLC純化產(chǎn)物。用0-50％線性梯度的洗脫液B洗脫100分鐘，流速3ml/分，測定215nm吸光值。
洗脫液A含0.05％體積TFA的水洗脫液B含0.05％體積TFA的乙腈/水(4/1體積)收集純化組分并凍干，獲得71mg純化的肽20，得率20％。
實(shí)施例9化學(xué)連接產(chǎn)生本發(fā)明C末端含有-氧代醛基而官能化的肽1) 肽10，12，和14的合成這些肽見圖3。
●肽10和14的合成在4-甲基-二苯甲基胺聚苯乙烯樹酯(0.57mmol反應(yīng)性氨基/每克樹脂，AppliedBiosystem，F(xiàn)osterCity，US)上制備肽10和14，按照R.B.Merrified在J.Am.Chem.Soc；1963，85，2149和Science，1986，232，341上描述的方法(Boc/芐基方法)。自動肽合成儀是431AAppliedBiosystem(FosterCity，USA)，該儀器執(zhí)行Int.J.Pept.ProteinRes；1992，40，180描述的方法。
Propeptide(Vert-Le-petitFrance)提供Boc官能團(tuán)保護(hù)的氨基酸，側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)如下①Arg(對-甲苯磺?；?，②Asp(O-環(huán)己基)，③Asn(三苯甲基)，④Lys(2-氯芐氧基羰基)，⑤Gln(三苯甲基)，⑩Ser(O-苯甲基)，⑥Tyr(2-溴芐氧基-羰基)，⑨His(二硝基苯基)，⑦Glu(O-環(huán)己基)，Cys(對甲基苯甲基)，Trp(甲酰基)，⑧Asn(三苯甲基)。
對于肽10，將擬用N-氨基化試劑N-Boc-3-(4-氰基苯基)oxaziridine(BCPO)修飾的賴氨酸引入FranceBiochem(Meudon，F(xiàn)rance)提供的Boc-L-Lys(Fmoc)-OH。在裝配氨基酸后用以DMF配置的20％哌啶混合液去除Fmoc基團(tuán)。N-氨基化方法采用AppliedBiosystem431A自動化合成儀，見(TetrahedronLetters，1996，37，7259-7262和J.PeptideRes，1998，52，180-184)所述。
用液體氟化氫(HF)以下述比例干燥支持物/HF/對甲酚/對甲苯硫酚(1g/10ml/0.75g/0.25g)0℃作用1小時30分使肽10脫保護(hù)和從支持物上分離。然后0℃減壓除去氫氟酸，并以200ml冷乙醚沉淀粗肽，離心得到沉淀，溶于水/乙酸混合液中然后凍干。
在Hyperprep柱上以RP-HPLC純化粗肽，用含0.05％三氟乙酸的水/乙腈液線性梯度洗脫。肽10得率為16％。用電霧化質(zhì)譜獲得其質(zhì)量為2330.6。
對于肽14，用哌啶/DMF混合液(1/10體積比)洗滌支持物3小時除去位于固相上的色氨酸上的甲?；?。將肽14接枝到支持物上，然后用DMF及乙醚洗滌，真空干燥。
用干燥支持物/HF/對甲酚/對甲苯硫酚混合物(1.5g/10ml/0.75g/0.25g)0℃作用1小時30分進(jìn)行最后的脫保護(hù)并從支持物上切下肽，乙醚沉淀粗肽，離心，然后溶于水/乙酸混合液(3/1體積比)中，最后凍干。用MachereyNagel(Paris，F(xiàn)rance)提供的15×300mmNucleosiC18柱，以提純肽10同樣方法進(jìn)行RP-HPLC純化。肽14得率為44.6％，用等離子體解吸質(zhì)譜(plasmadesorptionmass)測得其質(zhì)量為1823.3。
●BocNHNHCH2COOH官能團(tuán)的合成將31.36g(0.144mmol)的Boc2O加到溶于130ml水/乙醇混合液(1/1體積)的15.80ml(0.131mmol)N-甲基嗎啉和20g(0.131mmol)鹽酸肼基乙酸乙脂(ethylhydrazinoacetatehydrochloride)中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物24小時，然后于15分鐘內(nèi)加入氫氧化鈉11.5g(0.288mmol)。攪拌3小時45分后將混合物以100ml水稀釋并用氯化鈉飽和，用檸檬酸鈉調(diào)節(jié)pH至3.0。
用乙醚抽提得到的水性溶液(8次50ml)，收集連次的抽提物，用水洗(2次50ml)，用磷酸三鈉干燥并減壓濃縮。
以叔丁基甲基醚/甲醇混合液(10/1體識)重結(jié)晶獲得的粗產(chǎn)物，得到12.2g白色固體(得率為43％)，元素分析為C44.52％，H7.69％，N15.02％和O33.57％。該產(chǎn)物的RMN1H分析如下(300MHz，MeOH-d4)1.44(叔丁基)，4.06(CH2CO)。
●肽12的合成用0.25mmolRinkAmide樹脂(0.47mmol/g，F(xiàn)ranceBiochem，Meudon，Drance)，即4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-甲基)-苯氧基樹脂，以制備肽3-5和9(實(shí)施例4)相同方式制備了肽12。
用溶于DMF的BOP/DIEA混合物(4當(dāng)量/12當(dāng)量)將4當(dāng)量預(yù)合成的BocNHNHCH2COOH接枝到肽的N-末端。
從支持物上分離肽12，用10ml三氟乙酸/苯硫基甲烷/水混合液(95/5/5體積)脫保護(hù)2小時30分。將含脫保護(hù)肽的混合液逐滴加入200ml冷乙醚中，離心沉淀，重懸于水/乙酸混合液(9/1體積比)中，然后凍干。
用15×300mmC18Hyperprep柱以RP-HPLC純化粗肽。用含0.05％TFA的10-40％線性梯度的洗脫液B進(jìn)行100分鐘洗脫(洗脫液B水/CH3CN(1/4體積比)；洗脫液A含0.05％TFA的水)，流速3ml/分。測定215nm吸光值。
凍干前用0.1MTris緩沖液將含肽12組分的pH調(diào)節(jié)到達(dá)6.8。
如肽5那樣測定，獲得的固相(537.9mg)含20.9％的肽12，因此得率為28.5％。
2)肽10和肽3之間的腙型連接(圖7)將實(shí)施例4獲得的11.2mg(3.7mol)肽10和3.2mg(4.2mol)肽3室溫溶于2.25ml檸檬酸/磷酸緩沖液(pH6.0)和560l二甲基亞砜中。48小時后，用15×300mmC18Hypreperp柱以RP-HPLC純化混合物。凍干后得到6.6mg肽11，即得率48.8％。
3)肽12和肽14之間的腙型連接(圖8)將實(shí)施例4獲得的15.65mg(2.08mol)肽12和5.87mg(4.15mol)肽4溶于1.5ml檸檬酸磷酸緩沖液(pH6.0)中，48小時后如2)所述用RP-HPLC純化混合物。凍干后得到6.2mg肽13，得率47.0％。
圖7和圖8顯示可以實(shí)現(xiàn)兩肽片段之間的腙型化學(xué)連接，得率良好，一個片段(圖7肽10和圖8肽12)其N-末端含一肼基，而另一片段(圖7肽3和圖8肽4)其C-末端含一-氧代醛基，該官能團(tuán)通過在本發(fā)明支持物上肽的合成而引入。
4)肽14和肽4之間的噻唑烷型連接(圖9)在氮?dú)庀逻M(jìn)行反應(yīng)。將6mg(2.29mol)的肽14溶于680l1/1(體積)的NMP和檸檬酸/磷酸緩沖液(pH5.1)中，加入溶于48.3l前述緩沖液的328g(1.15mol)鹽酸三(2-羧乙基)-膦，然后加入6.49mg(5.58mol)溶于680l緩沖液/NMP(1/1體積比)的肽4，室溫拌混合物1小時，37℃2放置20小時。
如2)所述用RP-HPLC純化混合物，凍干后獲得4.8mg肽15，得率53.7％。
圖9顯示在本發(fā)明支持物上進(jìn)行肽合成獲得的C末端含有-氧代醛基的肽可化學(xué)鍵合于N-末端含半胱氨酸殘基(-氨基硫羥基)的肽，在兩個片段之間形成噻唑烷鍵，得率良好。
5)肽16和肽4之間的肟型連接(圖10)●肽16的合成用Boc/苯甲基法從0.5mmol的tBoc-Leu-OCH2-PAM樹脂(667mg，電荷0.75mmol/g)合成該三肽，用TFA/CH2Cl2混合液(1/1體積比，30分鐘)脫去亮氨酸的保護(hù)后，用HBTU/DIEA(756mg，4當(dāng)量/1044l，12當(dāng)量)將氨基酸Boc-L-Tyr(2-溴苯甲氧羰基)-0H(988.4mg，4當(dāng)量，單交聯(lián))和Boc-Lys(2-氯苯甲氧羰基)-OH(428.3mg，4當(dāng)量，雙交聯(lián))活化1分鐘，加入用最小體積NMP溶劑化的該樹脂中，將Boc-HN-O-CH2-CO2H(191.2mg，2當(dāng)量)和BOP(440mg，2當(dāng)量)加入用最小體積NMP溶劑化的該樹脂中。一步加入DIEA(500l，6當(dāng)量)并室溫?cái)嚢钁乙?5分鐘。
用HF/對甲酚(10ml/0.2g/0.2g)0℃度處理30分鐘，進(jìn)行此肽的脫保護(hù)并從支持物(0.8g)上切下，蒸發(fā)氫氟酸后，殘余物懸浮于TFA中，過濾，將濾液逐滴加入到冷乙醚中。離心沉淀，在20×300mmC18Hyperprep柱上進(jìn)行RP-HPLC純化。洗脫液A含0.05％TFA的水；洗脫液B含0.05％TFA的異丙醇/水(3/2)。0-10％梯度洗脫液B洗脫150分鐘，流速1ml/分，測215nm吸光值。
●化學(xué)連接將實(shí)施例4獲得的肽43.53mg溶于200l水中，加入溶于pH4.6，1.2ml乙酸鈉/乙酸緩沖液(混合510l 0.2M乙酸與492l 0.2M乙酸鈉并用水加到2ml)的3.25mg肽16。
反應(yīng)24小時后，如2)所述用RP-HPLC純化肽17，凍干后，獲得4.0mg肽17，得率78.13％。
圖10顯示通過在本發(fā)明支持物上進(jìn)行的肽合成獲得的C-末端含-氧代醛基的肽可化學(xué)鍵合于N-末端含羥胺官能團(tuán)的肽，導(dǎo)致兩肽片段之間形成肟鍵。
實(shí)施例10在本發(fā)明支持物用于合成含有-氧代醛基的有機(jī)化合物后再循環(huán)使用該支持物在本發(fā)明合成至少含一個-氧代醛基的有機(jī)化合物的過程中進(jìn)行的定時氧化還在固相支持物上產(chǎn)生醛基，即式V產(chǎn)物OHC-(A)n-Z-(B)m-S (V)在該實(shí)施例中描述了末端含氨基的支持物的再生，在基團(tuán)-(A)n-Z-(B)m是酰氨基(-CO-NH-)時，即如果固相支持物在定時氧化后對應(yīng)于式VI化合物時OHC-CO-NH-S (VI)-氧代醛基通過還原性氨基化可產(chǎn)生一個或多個氨基，例如，式VI產(chǎn)物可與溶于甲醇的NH4Br/NaCNBH3反應(yīng)，產(chǎn)生以下式VII產(chǎn)物
H2N-CH2-CO-NH-S (VII)也可能式V產(chǎn)物與溶于甲醇的NaCNBH3/1，3二氨基丙烷混合液(或另一具有式H2N-(CH2)a-NH2的二胺)反應(yīng)，產(chǎn)生以下式VIII產(chǎn)物H2N-(CH2)a-NH-CH2-CO-NH-S (VIII)后一種情況，采用伯二胺有可能在再生的支持物上產(chǎn)生一個伯氨基和一個仲氨基，二者使該支持物的電荷增至二倍。采用仲二胺可能在支持物上產(chǎn)生一個叔氨基和一個仲氨基，使該支持物起初的電荷受到保存。
上述還原性氨基化反應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可參見下文”Reductionbythealumino-andborohydridesinorganicsynthesis”，J.Seyden-Oenne，1991，VCHPublishersInc./Lavoisier，NewYork。
一旦完成還原性氨基化，可如上所述使獲得的產(chǎn)物(產(chǎn)物VII或產(chǎn)物VIII)與式II化合物反應(yīng)再生本發(fā)明的式I支持物。
例如，如果用NH4Br/NaCNBH3或用仲二胺進(jìn)行還原性氨基化，還原產(chǎn)物如式VII化合物與式II化合物反應(yīng)產(chǎn)生以下支持物 如果用伯二胺，例如用具有式H2N-(CH2)3-NH2的二胺進(jìn)行還原性氨基化，還原產(chǎn)物如式VIII化合物(其中a＝3)與式II化合物反應(yīng)產(chǎn)生以下支持物 這些實(shí)施例表明了用本發(fā)明支持物獲得的C-末端含有-氧代醛基的本發(fā)明肽在化學(xué)連接中的用途。
實(shí)施例11用本發(fā)明支持物合成含有-氧代醛基而官能化的寡核苷酸所用支持物相應(yīng)于上述式I，其中n＝m＝0，P1和P2為CH3CO-乙?；琗’為-OH基團(tuán)，Z為酰胺鍵，S是硼硅玻璃。通過使酒石酸衍生物(其1，2位置的羥基受乙酰基保護(hù))與含氨基官能化的硼硅玻璃反應(yīng)獲得這樣的支持物，硼硅玻璃的官能化用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行，例如見以下描述“Oligonucleotidessynthesisapracticalapproach”，1984，M.J.GAIT編，IRLPress，WashingtonD.C.。所用的酒石酸衍生物例如是二乙?；剖狒?環(huán)酐)或其位置1，2的羥基受乙?；Ｗo(hù)而由BOP活化的酒石酸。
將獲得的支持物再用BOP作為活化基團(tuán)用二氨基丙烷官能化。按以下參考文獻(xiàn)使寡核苷酸鍵合于所得的支持物“Oligonucleotidessynthesisapracticalapproach”，1984，M.J.GAIT編，IRLPressWashingtonD.C，“Curretprotocolinmolecularbiology”，1994，JohnWiley&Sons.，sections2.11.1-2.11.25。
例如，通過氨基甲酸酯鍵連接第一個脫氧核苷酸堿基使以上獲得的支持物與光氣反應(yīng)(在支持物上產(chǎn)生異氰酸基)，然后與脫氧核苷酸反應(yīng)，該脫氧核苷酸的糖5’位的羥基用二甲氧三苯甲基保護(hù)，該脫氧核苷酸通過其3’位的羥基被結(jié)合在支持物上。該脫氧核苷酸的堿基受到?；绫郊柞；蚣谆?2-丙?；谋Ｗo(hù)。
逐步依次進(jìn)行多個脫氧核苷酸堿基的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)DNA的固相合成。類似地，可按相同方法進(jìn)行RNA合成，然后以適當(dāng)方法，如用叔丁二甲基甲硅烷基保護(hù)糖2’位的羥基。
合成完成時，以堿性介質(zhì)(如氫氧化銨)處理除去本發(fā)明支持物的P1和P2基團(tuán)。這種處理同時使寡核苷酸堿基脫保護(hù)。如實(shí)施例4所述的固相定時氧化步驟能使寡核苷酸(DNA或RNA)獲得-氧代醛基而官能化。對于合成RNA，上述以堿性介質(zhì)處理先于例如用Bu4N+，F(xiàn)-使糖2’位羥基脫保護(hù)的步驟。
實(shí)施例12用本發(fā)明支持物合成以-氧代醛基官能化的肽以及這些肽作為診斷試劑的用途1)制備本發(fā)明支持物用干電荷等于0.3mmol/g和濕電荷(在甲醇中)為0.06mmol/g的PEGA氨基樹脂制備。樹脂用量為25.1g或1.5mmol。用二氯甲烷洗三次，用溶于二氯甲烷的0.5％DIEA洗三次，然后用DMF洗三次。將樹脂浸泡在最小體積的DMF中。
在108微升水(6mmol)中加入13.11ml(69.54mol)的(+)-2，3-O-異亞丙基酒石酸二甲酯，再加入897微升的DBU。室溫?cái)嚢杌旌衔?小時，然后加到上述制備的樹脂中。攪拌30秒后，加入3122mg(6mmol)PyBOP(苯丙三唑基-1-基-氧-三-吡咯烷-膦六氟磷酸鹽)。將反應(yīng)液于攪拌下室溫效果40分鐘。樹脂用DMF洗4次，用二氯甲烷洗4次。獲得與實(shí)施例2制備的支持物6相同的本發(fā)明式I支持物。
將4，7，10-三氧雜-1，13-十三碳二胺(TTD)接枝到該支持物的末端以在其表面導(dǎo)入游離氨基，使便于以后的肽合成。為此，將支持物浸泡在最小體積的DMF中，然后加入6.61mlTTD(30mmol，是PEGA氨基樹脂初始量的20倍)。攪拌1小時后，支持物用DMF洗5次，用二氯甲烷洗2次，用乙醚洗2次，然后真空干燥。在Fmoc-Gly-OH與已知量的支持物交聯(lián)后用UV分光法測定的分析哌啶/二苯并富烯加成物，獲得的支持物具有電荷0.18mmol/g。
2)合成-氧代醛基官能化的肽在Pioneertrade-mark(PerceptiveBiosystem)的肽合成儀上，在用以上Fmoc/叔丁基方法制備的固相支持物上合成了具有以下序列的肽AVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)如下(tBu叔丁基，Trt；三苯甲基；Boc叔丁氧基羰基；Pbf2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?，Arg(Pbf)，Asn(Trt)，Asp(OtBu)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，His(Trt)，Ser(tBu)，Thr(tBu)，Trp(Boc)，Lys(Boc)，Tyr(tBu)。
用0.555g支持物進(jìn)行肽合成。采用10倍過量氨基酸并用溶于DMF的HOBt/HBTU(0.5M)活化。每個氨基酸進(jìn)行二次交聯(lián)，然后加帽。
肽合成一旦完成，用TFA/水/苯甲醚混合物(95/2.5/2.5)在支持物上將末端含伯氨基的肽脫保護(hù)。用二氯甲烷(3次，2分鐘)和乙醚(2次，2分鐘)洗滌支持物，真空干燥。
按以下步驟進(jìn)行定時切割產(chǎn)生末端-氧代醛基將支持物懸浮于5ml乙酸中，加入6當(dāng)量NaIO4，攪拌5分鐘，加100微升乙醇胺，攪拌1分鐘。
回收含末端-氧代醛基的肽21(圖11)，在G10Sephadex柱(60cm×2.5cm)上純化，層析條件如下-溶劑5％乙酸-溶劑流速0.7ml/分
-泵速30rpm-肽的測定波長為240nm。
凍干對應(yīng)于該肽的層析組分，在C18柱上進(jìn)行制備性RP-HPLC純化此肽，層析條件如下-靜止相C18Nucleosil-流動相含0.05％TFA的水，0-80％的線性梯度乙腈，-溫度60℃-流動相流速3ml/分-肽de測定波長為215nm。
凍干對應(yīng)于該肽的層析組分，并鑒定。在C18-VYDAC柱上進(jìn)行分析性HPLC，用上述相同溶劑洗脫，驗(yàn)證該肽的均一性。通過用HCl6N/苯酚(10/1)混合液全部酸水解和在BIOIon20等離子體(plasma)分光光度計(jì)(由BioIonAB，Upsala，Sweden提供)上記錄質(zhì)譜，測定氨基酸組成以證實(shí)此肽身份(質(zhì)量計(jì)算值2605g/mol，實(shí)測值2605g/mol)。
3)用此肽制備ELISA型診斷試劑在潮濕環(huán)境下用以上合成的肽(0.1ml，濃度0.5l/ml，以0.1M，pH5.5乙酸鈉緩沖液配制)包被微量滴定板孔(Carbo-bindNewYork.USA)1小時。
在自動洗滌機(jī)中用含1.8％NaCl的、pH7.4的0.01M磷酸緩沖液(PBS)洗滌各孔三次，用全奶粉(每孔加0.2ml用PBS配的2.5％奶粉)封閉多余的結(jié)合位點(diǎn)，37℃溫育60分鐘。
用含0.05％吐溫20的PBS(PBS-T緩沖液，購自Sigma)洗三次后，用含2.5％全奶和0.5％吐溫20的PBS以1∶50稀釋待測人血清。取稀釋血清在含有上述合成肽21的孔中37℃溫育120分鐘。
用PBS-T洗4次后，加入用含0.5％吐溫20和2.5％全奶的PBS緩沖液作1∶1000稀釋的過氧化物酶-羊抗人IgG-A-M(PasteurDiagnosis)交聯(lián)物37溫育60分鐘。
用PBS-T洗4次后用底物0.1ml二鹽酸鄰苯二胺和H2O2(pH5.5，0.05M，以檸檬酸緩沖液配)室溫暗處30分鐘檢測結(jié)合于固定在支持物上Ig的偶聯(lián)抗體的過氧化物酶活性。
加入H2SO22N(25l)停止反應(yīng)，用多通道自動讀數(shù)儀(Mr5000，Dynatech)參考空白孔記錄492nm吸光值。
用陰性EBV(Epstein-BarrVirus)樣品的平均值A(chǔ)492+3個標(biāo)準(zhǔn)差作為ELISA試驗(yàn)的域值。第二種表達(dá)結(jié)果的方法是計(jì)算比值R[A492陽性血清]/[均值A(chǔ)492+3個標(biāo)準(zhǔn)差)陰性血清]，R比值大于1的血清作為陽性。
在Carbo-Bind微量滴定板上進(jìn)行ELISA試驗(yàn)得到的結(jié)果列于表1。用非共價常規(guī)微量滴定板(Nunc，Maxisorp，Rocksilde，Denmark)進(jìn)行同樣的這些試驗(yàn)。兩種試驗(yàn)的R值比較顯示其上共價交聯(lián)了肽的Carbo-Bind微量滴定板(可以固定肽)提高了陽性血清的信號并降低了陰性血清的信號以及降低了本底燥音。
表權(quán)利要求
1.用于合成含有至少一個α氧代醛基的化合物的官能化固相支持物，該支持物的特征在于，它相應(yīng)于以下分子式I 其中-S為固相支持物，至少其表面在水性或部分水性介質(zhì)中具有良好的溶劑化性能；-n和m可以相同或不同，為0或1；-當(dāng)n等于1時，Z為選自醚、硫醚、酯、胺、酰胺、磺酰胺、羥胺、肼、腙、噻唑烷、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲官能團(tuán)及其衍生物；-當(dāng)n等于0時，Z為選自酯、酰胺、N-?；u胺、肼、腙、肟和噻唑烷官能團(tuán)及其衍生物；-P1和P2可以相同或不同，或與它們相結(jié)合的氧原子一起形成一個環(huán)，代表氫原子或保護(hù)1、2位上羥基的官能團(tuán)，此時P1和P2選自-R1、-(CO)R1、-(CO)OR1、-(SO2)OR1、-SiR’R”R、縮醛基和十六烷醛基(cetal)官能團(tuán)；R，R’，R”和R代表線性、分枝狀、環(huán)狀、飽和或不飽和的1-18個碳原子的烷基、芳基或雜芳基；所述烷基、芳基或雜芳基可被一個或多個鹵原子，一個或多個氨基、羥基、烴氧基、芳氧基、烷硫基代芳硫基部分或全部取代，-A和B可以相同或不同，它們代表線性、分支狀或環(huán)狀，飽和或不飽和的碳鏈，含有1-18個碳原子和可能含有1-7個選自以下基團(tuán)的官能團(tuán)羰基官能團(tuán)、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基和雜芳基，A和/或B還可以含有1-16個雜原子，優(yōu)選1-16個氮或氧原子，并可被1-16個可受到適當(dāng)保護(hù)的羥基或氨基所取代，-A和/或B的至少一個碳原子可以被以下一官能團(tuán)所取代 其中，A’與A相同或不同；不同時，A’選自上面定義的其它A官能團(tuán)；和-X’選自-OR1、-NR’R”基團(tuán)，R、R’和R”為氫原子或如上所述定義的基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的支持物，其特征在于，所述固相支持物S選自-多孔硼硅玻璃顆粒，-玻璃或硅制成的表面，-選自以下的樹酯聚丙烯酰胺樹酯、聚丙烯酰胺-聚乙二醇樹酯、聚乙二醇-聚苯乙烯樹酯、交聯(lián)的乙氧基化物-丙烯酸酯樹酯和接枝了親水性分子的聚乙烯、聚苯乙烯或聚丙烯類樹酯。
3.如權(quán)利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于-S是聚丙烯酰胺-聚乙二醇類樹酯，-m和n為1，-B是-(CH2)2-CO-NH-鏈，-Z是酰胺基團(tuán)，-A是-CO-NH-(CH2)3-鏈，-P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基團(tuán)，和-X’為-NH-(CH2)3-NH2鏈。
4.如權(quán)利要求1或2所述的式1支持物，其特征在于-S為聚丙烯酰胺-聚乙二醇或聚乙二醇-聚苯乙烯樹脂，-m和n為0，-Z為酰胺基團(tuán)，-P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基團(tuán)，-X’為甲氧基。
5.如權(quán)利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于-S如權(quán)利要求1或2所定義，-m為1，-n為0，-Z為酰胺基團(tuán)，-P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基團(tuán)，-X’為甲氧基，B為以下基團(tuán)
6.如權(quán)利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于-S如權(quán)利要求1或2所定義，-m和n為1，-Z為酰胺基團(tuán)，-P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基團(tuán)，-B為-(CH2)2-CO-NH基團(tuán)，-A為以下基團(tuán) -X’為以下基團(tuán)。
7.如權(quán)利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于-S如權(quán)利要求1或2所定義，-m為0，-n為1，-Z為氨基甲酸酯基團(tuán)，-P1和P2一起形成異亞丙基保護(hù)基團(tuán)，-X’為甲氧基，和-A為以下基團(tuán)
8.如權(quán)利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于其對應(yīng)于以下分子式
9.如權(quán)利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于其對應(yīng)于以下分子式
10.如上面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的式I支持物的制備方法，其特征在于，該方法包括使-具有分子式S-(B)m-Y的官能化固相支持物，其中B、S和m如上面權(quán)利要求任一項(xiàng)所述，Y為親核基團(tuán)，B可被至少一個除了式S-(B)m-Y中所代表的外與式S-(B)m-Y代表的相同或不同的其他Y官能團(tuán)所取代，此時所述固相支持物是多官能化的；-與選自酒石酸環(huán)酐或其衍生物的化合物和式II化合物反應(yīng)； 其中，n、A、P1、P2和X’如前面權(quán)利要求任一項(xiàng)所定義，X為親電子基團(tuán)。
11.如權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于當(dāng)n＝1時，所述的基團(tuán)Y代表親電子基團(tuán)，所述的基團(tuán)X代表親核基團(tuán)。
12.如權(quán)利要求10或11所述的制備方法，其特征在于，合適的親電子基團(tuán)選自以下基團(tuán)-當(dāng)n＝1時，-CR2R3Cl、-CR2R3Br、-CR2R3I、-CR2R3OSO2R4、-CHO、-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、-SO2OR、，-SOOCl、琥珀酰亞胺酯、磺基琥珀酰亞胺酯、親電子活化劑轉(zhuǎn)化的-COO-、-N＝C＝O(異氰酸酯)、-N＝C＝S(異硫氰酸酯)、-O-CO-OR2、-O-CO-Im、-O-COCl、-NR2-COCl和-NR2-CO-Im；其中Im代表可被取代的下式咪唑基 其中R2、R3和R4可相同或不同，為氫原子；線性、分枝狀或環(huán)狀，飽和或不飽和的1-18個碳原子的烷基、或芳基或雜芳基，所述烷基、芳基和雜芳基可以被一個或多個鹵原子，一個或多個氨基、羥基、烴氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基部分或完全取代；-當(dāng)n＝0時，-CHO、-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、親電子活化劑轉(zhuǎn)化的-COO-；R2是如上所述當(dāng)n＝1時的基團(tuán)。
13.如權(quán)利要求10或11所述的制備方法，其特征在于合適的親核基團(tuán)選自以下官能團(tuán)當(dāng)n＝0或n＝1時-OH、-SH、-COO-、-NHR5、-CONR5NH2、-N[R5(CO)]NH2、-N[R5O(CO)]NH2、-N[R5NH(CO)]NH2、-SO2NH2、-SO2NR5NH2、-ONH2、-(CO)ONH2和-C(NHR5)-CR5R6-SH，R5和R6與權(quán)利要求12所定義的R2-R4基團(tuán)相同。
14.如權(quán)利要求10至12任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)n＝0，X＝-COOR2，而R2＝H時，所述官能團(tuán)X＝-COOR2可起親電子基團(tuán)和親核基團(tuán)兩部分作用。
15.如權(quán)利要求10至14任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)式11化合物中，P1和P2為氫原子時，在具有式S-(B)m-Y的固相支持物與式II化合物反應(yīng)后和采用如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的式I支持物合成含有至少一個α氧代醛基的化合物之前，可以在1，2位上引入氫原子以外的P1和P2基團(tuán)，作為羥基的保護(hù)基。
16.如權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，式II化合物為酒石酸或酒石酸衍生物。
17.如權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，式II化合物選自粘酸、糖二酸、葡糖二酸，它們的鹽和它們的衍生物。
18.如權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，該方法包括使-具有分子式H2N-(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-S的官能化固相支持物，其中S如權(quán)利要求10所定義，-與2，3-O-異亞丙基酒石酸二甲酯反應(yīng)。
19.如權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，該方法包括使-具有分子式H2N-(CH2)3-NH-CH2-CO-NH-S的官能化固相支持物，其中S如權(quán)利要求10所定義，-與2，3-O-異亞丙基酒石酸二甲脂反應(yīng)。
20.具有以下分子式III的支持物 其中，S、B、A、n、m、Z、P1和P2如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所定義，Y’是有機(jī)化合物。
21.如權(quán)利要求20所述的式III支持物，其特征在于，Y’為一化合物或由選自脂、核苷酸和氨基酸的幾種化合物形成的鏈所述核苷酸，可被取代或不取代，氨基酸可含有脂。
22.如權(quán)利要求20或21所述的式III支持物，其特征在于，它獲自用適當(dāng)試劑化學(xué)修飾如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的式I支持物的-COX’官能團(tuán)，該適當(dāng)試劑提供了一官能團(tuán)使在該支持物上可制備化合Y’。
23.如權(quán)利要求22所述的支持物，其特征在于，所述適當(dāng)試劑是聯(lián)氨、二元醇或氨基醇。
24.合成含有至少一個α-氧代醛基的有機(jī)化合物的方法，其特征在于，所述方法在固相中進(jìn)行并包括以下步驟-制備如權(quán)利要求1-9之一所定義的式I支持物，所述制備按權(quán)利要求10-19任一項(xiàng)方法進(jìn)行；-可能的話，衍生處理所述式I支持物的基團(tuán)X’以引入一個可在該支持物上制備權(quán)利要求20或21所定義的化合物Y’的基團(tuán)；-固相制備化合物Y’；-如果P1和P2不是氫原子，脫去如權(quán)利要求20所述式III化合物1，2位上受P1和P2保護(hù)的兩個羥基的保護(hù)基；-定時固相氧化；和-分離所形成的至少含一個α氧代醛基的官能化的產(chǎn)物。
25.如權(quán)利要求24所述的制備方法，其特征在于，所述式I支持物基團(tuán)X’的衍生處理包括接枝聯(lián)氨，二元醇或氨基醇。
26.如權(quán)利要求24或25所述的制備方法，其特征在于，1，2位兩個羥基的脫保護(hù)在酸性介質(zhì)中，優(yōu)選在三氟乙酸存在下進(jìn)行。
27.如權(quán)利要求24或25所述的制備方法，其特征在于，1，2位兩個羥基的脫保護(hù)在堿性介質(zhì)中進(jìn)行。
28.如權(quán)利要求24-27任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，定時化氧化在過碘酸鈉存在下進(jìn)行。
29.一類肽，其特征在于，它們含有在位于其N末端以外位置且不包含在酰胺鍵中的至少一個α-氧代醛基，及在賴氨酸或鳥氨酸側(cè)鏈上含有胺官能團(tuán)；而且，它們按權(quán)利要求24-28任一項(xiàng)所定義的制備方法獲得。
30.如權(quán)利要求29所述的肽在化學(xué)連接反應(yīng)中的應(yīng)用。
31.合成一種有機(jī)化合物庫的方法，其特征在于，該方法包括-提供具有式S-(B)m-Y的多個固相支持物表面，其中B、S、Y和m如權(quán)利要求10-19任一項(xiàng)所述，-使它們與選自酒石酸環(huán)酐或其衍生物的化合物和分子式II化合物反應(yīng)； 其中，n、A、P1、P2、X’和X如權(quán)利要求10-19任一項(xiàng)所定義，以獲得可用于合成含α-氧代醛基化合物的支持物；-使獲得的該支持物與混合的有機(jī)分子反應(yīng)；和-獲得有機(jī)化合物庫。
32.如權(quán)利要求31所述的制備方法，其特征在于，所述有機(jī)分子是氨基酸、核苷酸和脂類。
33.一種有機(jī)化合物庫，其特征在于，它通過采用權(quán)利要求31或32所述方法獲得。
34.選自酒石酸環(huán)酐或其衍生物之一的化合物和式II化合物的用途 其中，n、A、P1、P2、X’和X如權(quán)利要求10-19任一項(xiàng)所定義，對固相支持物的衍生化處理使至少其表面在水性或部分水性介質(zhì)中具有良好的溶劑化性能，這樣得到的支持物能用于固相合成含有至少一個α-氧代醛基的化合物。
35.如權(quán)利要求34所述的用途，其特征在于，至少其表面在水性或部分水性介質(zhì)中具有良好溶劑化性能的所述固相支持物，相應(yīng)于分子式S-(B)m-Y，其中S、B、m和Y如權(quán)利要求10-19任一項(xiàng)所定義。
36.如權(quán)利要求34或35所述的用途，其特征在于所述酒石酸環(huán)酐或其衍生物之一是二-O-苯甲?；?酒石酸酐或二乙酰基-酒石酸酐。
37.如權(quán)利要求34或35所述的用途，其特征在于式II化合物為酒石酸或酒石酸衍生物。
38.如權(quán)利要求34或35所述的用途，其特征在于式II化合物選自粘酸、糖二酸、葡糖二酸，它們的鹽或它們的衍生物。
39.制備在固相載體上的診斷試劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟-制備如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所定義的式I支持物并按權(quán)利要求10-19任一項(xiàng)進(jìn)行所述制備；-可能的話，衍生處理式I支持物的基團(tuán)X’，以引入一個允許在該支持物上制備權(quán)利要求20或21所定義的化合物Y’的官能團(tuán)；-將權(quán)利要求24-28任一項(xiàng)所述方法獲得的含有至少一個α-氧代醛基的有機(jī)化合物連接到已適當(dāng)官能化的微量滴定板上；-獲得其上共價固定有所述有機(jī)化合物的微量滴定板。
40.如權(quán)利要求39所述制備方法，其特征在于，所述產(chǎn)物是肽、寡核苷酸或脂類。
41.如權(quán)利要求39或40所述制備方法，其特征在于，通過肟、噻唑烷或腙鍵進(jìn)行所述有機(jī)化合物的所述連接。
42.獲得一種生物芯片的制備方法，其特征在于，該方法包括接枝含有至少一個α-氧代醛基的寡核苷酸的步驟，該寡核苷酸用權(quán)利要求24-28任一項(xiàng)的制備方法在固相支持物上獲得。
43.如權(quán)利要求42所述的制備方法，其特征在于所述固相支持物是玻璃或硅制成的表面。
44.如權(quán)利要求42或43所述制備方法，其特征在于，所述芯片是DNA芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于合成含有至少一個α－氧代醛基的化合物的官能化固相支持物、其制備方法和用途,特別是制備有機(jī)化合物庫、診斷試劑、微量滴定板和生物芯片,如DNA芯片。本發(fā)明還涉及合成含有至少一個α－氧代醛基的有機(jī)化合物的方法和用所述方法獲得的α－氧代醛肽。
文檔編號C07K1/04GK1356968SQ0080906
公開日2002年7月3日 申請日期2000年4月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月21日
發(fā)明者O·梅爾尼克, J－S·弗魯查特, L·布雷爾, H·格拉斯－馬西 申請人:里爾巴斯德研究所, 中央科學(xué)研究中心