一種抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物防治肥的制備領(lǐng)域，具體涉及一種抗黑果枸杞病理真菌的生物肥 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr)屬于前科枸杞屬，為多棘刺灌木，多分枝，枝 條堅(jiān)硬，常呈之字形彎曲，白色，分布于中國西北和歐洲中亞。黑果枸杞味甘、性平，富含蛋 白質(zhì)、枸杞多糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素等多種營養(yǎng)成分，特別是含有豐富的黑 果色素--天然原花青素（OPC)，其OPC含量超過藍(lán)莓（黑果枸杞含OPC3690mg/100g;藍(lán) 莓含0PC330~3380mg/100g)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的OPC含量最高的天然野生植物。原花青素 OPC是最有效的天然水溶性自由基清除劑，其功效是VC的20倍、VE的50倍，屬天然的水溶 性花色甙黃酮類。黑果枸杞被收載于《四部醫(yī)典》、《晶珠本草》等藏藥經(jīng)典著作中，被譽(yù)為 "軟黃金"。
[0003] 危害黑果枸杞主要病害有黑果病、根腐病等病理性真菌。植物病理真菌主要存在 于土壤中，在植物生長中感染植物，引起植物病害、造成生產(chǎn)損失。因此，要從生物防治的角 度消除植物真菌病害，殺滅或抑制土壤中的病理真菌至關(guān)重要，而使用具有生物防治功效 的生物肥是實(shí)現(xiàn)這一目的的有效途徑。在各種生物肥中，長久以來我國應(yīng)用的都是無芽孢 菌類。但是無芽孢菌抗逆性低，對于干燥高溫的抵抗能力差，所以當(dāng)制成液體或者吸附劑時 穩(wěn)定性不高。生物肥發(fā)展的新趨勢應(yīng)是大力發(fā)展抗逆性高、能夠長期穩(wěn)定生存的芽孢桿菌。 特別是芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種抗真菌物質(zhì)，對植物病原菌有顯著抑制作用，并且對人畜無 害，也不會污染環(huán)境，將在防治植物真菌病害中起重要作用。
[0004] 芽孢桿菌形態(tài)上呈直或者近直的桿狀，好氧或者兼性厭氧，革蘭氏陽性，在特定環(huán) 境條件下能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子。芽孢桿菌在植物中廣泛定殖，被認(rèn)為是公認(rèn)的食品級安 全微生物（generallyregardedassafety,GRAS)?？莶菅勘U菌是一種典型的芽孢桿菌， 產(chǎn)生抗菌蛋白、多肽類物質(zhì)、脂類物質(zhì)及beta葡聚糖酶等抗菌物質(zhì)，特別是beta葡聚糖酶 等水解酶類與其抗植物病理真菌能力有密切關(guān)系，因?yàn)檎婢?xì)胞壁的組成是葡聚糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制備方法，通過將產(chǎn)beta葡 聚糖酶的枯草芽孢桿菌（CICC10339)融入黑果枸杞天然菌群中，制成能夠通過生物防治 途徑有效抑制殺滅黑果枸杞病理真菌的生物肥（即抗黑果枸杞病理真菌的生物肥）。
[0006] 一種抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的方法，包括以下步驟：
[0007] 1)將枯草芽孢桿菌（CICC10339)進(jìn)行培養(yǎng)，制成密度109~10 1(lCfu/mL的高密度 菌懸液；
[0008] 2)將黑果枸杞健康枝條剪成小段進(jìn)行堆肥，堆肥過程中噴施步驟1)中的高密度 菌懸液，堆肥結(jié)束后進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)發(fā)酵后得到抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
[0009] 本發(fā)明中，將黑果枸杞健康枝條剪成小節(jié)堆肥，使所制備生物肥中的菌群即為健 康黑果枸杞植株本身天然菌群，此菌群與黑果枸杞植株協(xié)同進(jìn)化生長，形成了互益共生體 系，對病害真菌有一定生物防治作用。進(jìn)一步地，將能夠產(chǎn)beta葡聚糖酶的枯草芽孢桿菌 (CICC10339)加入堆肥中，顯著加強(qiáng)對黑果枸杞病害真菌的生物防治作用。枯草芽孢桿菌 (CICC10339)由于產(chǎn)beta葡聚糖酶，對黑果枸杞植株纖維有良好分解作用，為堆肥發(fā)酵過 程所必須，故能夠充分融入到堆肥菌群中穩(wěn)定持久地增殖。如同乳酸菌對于動物的益生作 用，抑制殺滅植物病理真菌的微生物可以稱之為植物益生菌。本發(fā)明所制備生物肥中，枯草 芽孢桿菌（CICC10339)即是黑果枸杞益生菌，對黑果枸杞病理真菌有顯著生物防治作用。
[0010] 步驟1)中，枯草芽孢桿菌（CICC10339)采用現(xiàn)有技術(shù)，來自中國工業(yè)微生物菌 種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號院6號樓；保藏日期為2007 年，菌種保持編號為10339?？莶菅挎邨U菌（CICC10339)可以向中國工業(yè)微生物菌種保藏 管理中心購買。
[0011] 將枯草芽孢桿菌（CICC10339)進(jìn)行培養(yǎng)，包括：枯草芽孢桿菌（CICC10339)的出 發(fā)密度為1〇6~1〇7個/mL，接種至液體培養(yǎng)基中接種量為1%~5%，33°C~39°C振蕩培養(yǎng) 20~28h，至菌液密度為109~10 1(lcfu/mL的高密度菌懸液。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選，將枯草芽孢桿菌（CICC10339)進(jìn)行培養(yǎng)，包括：枯草芽孢桿菌（CICC 10339)的出發(fā)密度為106~10 7個/mL，接種至液體培養(yǎng)基中接種量為2%~3%，36°C~ 37°C振蕩培養(yǎng)22~26h，至菌液密度為109~10 1(lCfu/mL的高密度菌懸液。
[0013] 所述的液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，包括以下組分：
[0014] 葡萄糖 11~17g; 牛肉膏 20~30g; 磷酸二氫鉀 1.5~3.5g; 花生餅粉 7~13g; 調(diào)節(jié)pH=6.5~7.5〇
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，包括以下組分：
[0016] 葡萄糖 14g; 牛肉膏 25g; 磷酸二氫鉀 2.45g; 花生餅粉 l〇g; 調(diào)節(jié)pH=7.0。
[0017] 液體培養(yǎng)基在121°C滅菌20min。
[0018] 步驟2)中，堆肥過程中噴施步驟1)中的高密度菌懸液，包括：在堆肥內(nèi)部溫度達(dá) 到30°C~34°C時，噴施步驟1)中的高密度菌懸液，繼續(xù)堆肥，待堆肥內(nèi)部溫度達(dá)到41°C~ 45 °C時堆肥結(jié)束。
[0019] 堆肥過程中噴施步驟1)中的高密度菌懸液，包括：在堆肥內(nèi)部溫度達(dá)到32°C時， 噴施步驟1)中的高密度菌懸液，繼續(xù)堆肥，待堆肥內(nèi)部溫度達(dá)到43°C時堆肥結(jié)束。
[0020] 步驟2)中，堆肥結(jié)束后，將堆肥攪拌攤涼。所述的發(fā)酵采用自然狀態(tài)下發(fā)酵。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] 本發(fā)明中，將黑果枸杞健康枝條剪成小節(jié)堆肥，使所制備生物肥中的菌群即為健 康黑果枸杞植株本身天然菌群，此菌群與黑果枸杞植株協(xié)同進(jìn)化生長，形成了互益共生體 系，對病害真菌有一定生物防治作用。
[0023] 枯草芽孢桿菌（CICC10339)產(chǎn)beta葡聚糖酶，強(qiáng)力破壞病理真菌細(xì)胞壁，對病理 真菌有顯著抑制殺滅作用。如同乳酸菌對于動物的益生作用，抑制殺滅植物病理真菌的微 生物可以稱之為植物益生菌。本發(fā)明所制備生物肥中富含的枯草芽孢桿菌（CICC10339) 即