專利名稱:表面修飾硼酸基團(tuán)的納米磁性材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬無機(jī)材料和分析技術(shù)領(lǐng)域,涉及納米材料,具體涉及一種表面修飾硼酸 基團(tuán)的納米磁性材料及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
眾所周知,蛋白質(zhì)組成具有多樣性和可變性,即在同一物種的不同細(xì)胞中或同一 細(xì)胞在不同時(shí)期,其蛋白質(zhì)組成都是在不斷變化的,造成蛋白質(zhì)組成異常復(fù)雜。同時(shí) 由于蛋白質(zhì)存在翻譯后修飾,所以一個(gè)mRNA往往對應(yīng)多個(gè)蛋白質(zhì),也就是說,蛋白質(zhì) 的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于基因的數(shù)量,蛋白質(zhì)在大小、相對豐度、酸堿度和疏水性方面差異很 大,尤其對于翻譯后修飾蛋白,種類很多,豐度又常常很低,但卻往往是生物體生命 活動(dòng)的關(guān)鍵物質(zhì)。近年來,翻譯后修飾蛋白的分析與鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)和 難點(diǎn)內(nèi)容之一。因此要從分子水平上,深入研究生命過程的規(guī)律,探索生命現(xiàn)象的奧 秘,必須對一些具有重要生理功能的翻譯后修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行分析監(jiān)測,這對目前的分 析技術(shù)和手段不能不說是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
糖基化是蛋白的翻譯后修飾中非常重要的一種。在真核生物細(xì)胞中,寡糖鏈與蛋 白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸以多種形式的共價(jià)鍵連接,構(gòu)成糖蛋白的糖肽鏈。糖蛋白是許 多生物過程的基本物質(zhì),包括細(xì)胞的生長、信息傳導(dǎo)、免疫、病變和感染反應(yīng)等過程, 它也可以作為一些疾病的標(biāo)記物質(zhì)。隨著人類基因組計(jì)劃的完成以及蛋白組計(jì)劃的發(fā) 展,糖基化蛋白質(zhì)組的研究也受到了廣泛重視。研究顯示,由于在質(zhì)譜中糖蛋白和糖 肽的電離比較困難,糖基化蛋白和肽鏈的信息很容易被非糖基化蛋白、肽段干擾或覆 蓋,糖蛋白的特異性分離成為糖蛋白分析中的重要環(huán)節(jié),為了得到完整的糖基化位點(diǎn), 糖鏈結(jié)構(gòu)等信息,需要特異性強(qiáng),高效簡便的糖蛋白、糖肽分離方法。目前最常用的 分離方法有常規(guī)色譜和電泳分離法,以及特異性的凝集素色譜、酰肼或硼酸材料輔助 等分離方法。常規(guī)的色譜和電泳分離可以減輕生物樣品的復(fù)雜程度,但并不能特異性 分離糖基化蛋白和肽鏈。凝集素色譜只對某種結(jié)構(gòu)的糖鏈可以起一定的分離作用;酰肼基團(tuán)可以與經(jīng)氧化的糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定鍵合,但反應(yīng)不可逆,鍵合的糖蛋白和糖肽不易洗 脫下來進(jìn)行分析。而硼酸由于在堿性條件下普遍性地與糖結(jié)構(gòu)生成比較穩(wěn)定的共價(jià)鍵, 在酸性條件下又可以可逆地將完整的糖蛋白或糖肽洗脫下來,所以成為比較理想的糖 蛋白分離方法。近年來,納米材料以其發(fā)展快速和應(yīng)用潛力而被越來越多地應(yīng)用于在 蛋白質(zhì)組學(xué)分析中。有研究成功地將沸石納米粒子應(yīng)用于痕量肽段的富集,但是該方 法需要高速離心分離樣品和沸石混合物,操作相對繁瑣。因此發(fā)展一種簡單便捷而又 有效的分離富集糖蛋白和糖肽的方法成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要方面。
磁性聚合物微球以其易于表面修飾、溶液分散性好以及靈敏的磁場感應(yīng)性為其應(yīng) 用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析中痕量肽段的分離富集方面提供了可能。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、特異性好,能對糖蛋白和糖肽進(jìn)行分離富 集的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米磁性材料。
本發(fā)明的另一目的是提供上述納米磁性材料的制備方法。 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述納米磁性材料的應(yīng)用。
本發(fā)明合成了四氧化三鐵磁性聚合物微球,進(jìn)而合成了新型的表面修飾硼酸基團(tuán) 的磁性聚合物材料。利用該磁性聚合物材料作為吸附劑,進(jìn)行低豐度糖蛋白和糖肽的 分離富集以及MALDI-TOF/MS直接分析,從而解決了樣品的分析困難;也為磁性聚合物 微球的應(yīng)用開辟了新的途徑。
本發(fā)明首先采用水熱法合成胺基修飾的四氧化三鐵磁性納米材料,然后分別與己 二酰氯、3-氨基苯硼酸反應(yīng),制得其結(jié)構(gòu)如下式所示的表面修飾硼酸基團(tuán)的磁性納米 粒子
-B卿2
其中M為帶有氨基的四氧化三鐵納米粒子。
本發(fā)明通過下述方法和步驟制備所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的磁性材料:(1)用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵的超順磁性納米粒子
采用FeCl3 6H20為原料,以80-90mL乙二醇為分散體系,添加無水乙酸鈉,1, 6-己二胺,反應(yīng)溫度為195-200°C,反應(yīng)時(shí)間為4-6小時(shí),生成表面帶有氨基的磁性納米 粒子,其粒徑是20—100 nm;
(2)首先,將由步驟(l)合成的FeA氨基磁性微球反復(fù)用去離子水洗滌,除去 水溶性雜質(zhì),最后將產(chǎn)物真空干燥得到黑色粉末;其次,對Fe3(X氨基磁性微球進(jìn)行表 面修飾,先將磁球表面用己二酰氯修飾取干燥的兩頸瓶,加入無水氯仿,稱取干燥 的FeA氨基磁性微球粉末,得到納米粒子的分散液;將兩頸瓶置于冰水浴中密封攪拌 20-30分鐘,保持冰水浴,向瓶中滴入己二酰氯,繼續(xù)密封攪拌4-5小時(shí);然后通過酰 氯在磁球上接3-氨基苯硼酸,先在磁鐵輔助下用無水氯仿洗去未反應(yīng)的己二酰氯,再 加入無水氯仿分散;在分散液中加入3-氨基苯硼酸粉末,機(jī)械攪拌5-6小時(shí),停止攪 拌,在磁鐵輔助下用丙酮和水洗掉多余的3-氨基苯硼酸,并收集合成好的磁性納米材 料,40-5(TC烘干備用。
本發(fā)明的表面修飾硼酸基團(tuán)的磁性材料合成方法簡單有效,制得的磁性材料具有 很好的磁場感應(yīng)性,作為微吸附劑,比表面積大,特異性強(qiáng),可對生物體中具有的糖 基化蛋白和肽段進(jìn)行特異性分離富集,該固定硼酸基團(tuán)的磁性納米材料可直接放入肽 段中,無需特殊處理,絡(luò)合到磁性納米材料上后,無需離心分離,采用簡單磁場作用 即可實(shí)現(xiàn)糖蛋白和糖肽的特異性分離富集。
本發(fā)明的表面修飾硼酸基團(tuán)的磁性材料的合成及應(yīng)用為生物體中低豐度糖蛋白、 肽段的特異性分離富集提供了新的方法,并擴(kuò)展了磁性納米材料的實(shí)際應(yīng)用,在生物 分析研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
圖1為表面修飾硼酸基團(tuán)的磁性納米粒子的合成方法圖示。
圖2為水熱法合成的表面修飾氨基的Fe304磁性納米粒子的透射電鏡圖(a)和掃描電鏡圖(b),圖中顯示它具有很好的均一性和分散性。
圖3為氨基磁性鈉米粒子(a)與用氨基苯硼酸修飾的氨基磁性鈉米粒子(b)紅 外圖對比,在(b)中,出現(xiàn)了明顯的C-B振動(dòng)峰(1376cm-0的峰的,并且可看到3000 左右苯的振動(dòng)峰,證實(shí)本發(fā)明成功地在磁性鈉米粒子表面鍵和了氨基苯硼酸。
圖4為表面修飾硼酸的磁性納米材料對標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白(去唾液酸胎球蛋白)酶解肽 溶液的處理效果,對比(a)未處理;(b)處理后(圖上*標(biāo)示糖肽)可知該材料可以 很好地特異性分離糖肽,并且對低豐度糖肽有明顯的富集效果。
圖5為表面修飾硼酸的磁性納米材料蛋白質(zhì)混合溶液的分離結(jié)果,
其中,(a)蛋白混合溶液由血清白蛋白(非糖基化蛋白,BSA)和辣根過氧化物酶 (糖蛋白,服P)組成,經(jīng)材料處理后僅可看到HRP的條帶;
(b)蛋白混合溶液由肌紅蛋白(非糖基化蛋白,MY0)和核糖核酸酶B (糖蛋白, RNB)組成,經(jīng)材料處理后僅可看到RNB的條帶;
圖中標(biāo)示的糖蛋白在經(jīng)過材料處理后均得到純化,證實(shí)本發(fā)明材料對蛋白混合溶 液也有明顯的特異性分離效果。
具體實(shí)施例方式
通過下述實(shí)施例對本發(fā)明所提供的超順磁性的表面修飾氨基硼酸的磁性材料進(jìn)行 糖蛋白、糖肽的分離富集分析過程的進(jìn)一步說明。
實(shí)施例l表面修飾Cu"的磁性材料的合成
表面修飾Cu2+的磁性材料的合成通過下述步驟 用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵的超順磁性納米粒子
采用3. 0克FeC13 6H20為原料,以80_90mL乙二醇為分散體系,添加6-12克無 水乙酸鈉,10-20克1,6-己二胺,反應(yīng)溫度為195-200°C,反應(yīng)時(shí)間為4-6小時(shí),生成 表面帶有氨基的磁性納米粒子,其粒徑是20—100 nm;
將由步驟(l)合成Fe^氨基磁性微球反復(fù)用去離子水洗滌以除去水溶性雜質(zhì),最 后將產(chǎn)物以40-50'C真空干燥得到黑色粉末;其次,對Fe304氨基磁性微球進(jìn)行表面修 飾,先將磁球表面用己二酰氯修飾。取干燥的100mL兩頸瓶,加入25-30mL無水氯仿, 稱取100毫克干燥的Fe304氨基磁性微球粉末,得到納米粒子的分散液;將兩頸瓶置于冰水浴中密封攪拌20-30分鐘,保持冰水浴,向瓶中滴入0. 2-0. 3mL己二酰氯,繼 續(xù)密封攪拌4-5小時(shí);然后通過酰氯在磁球上接3-氨基苯硼酸,先在磁鐵輔助下用無 水氯仿洗去未反應(yīng)的己二酰氯,再加入25-30mL無水氯仿分散。在分散液中加入 300-500毫克3-氨基苯硼酸粉末,機(jī)械攪拌5-6小時(shí),停止攪拌,在磁鐵輔助下用丙 酮和水洗掉多余的3-氨基苯硼酸,并收集合成好的磁性納米材料,40-5(TC烘干。
使用該材料進(jìn)行分離富集前,稱取10-20毫克烘干的納米材料黑色粉末,將其分 散在lmL去離子水中備用。
實(shí)施例2表面修飾Cu2+的磁性材料用于肽段富集
(1) 蛋白溶液酶解
取100Pg去唾液酸胎球蛋白溶于50 mM NH4HC03溶液中(pH 8),濃度為50ng W-l, 經(jīng)過IO mM的二硫蘇糖醇變性(60 ° C, 30 min) , 100 mM碘乙酰胺烷基化(37 ° C, 45 min),胰蛋白酶37。 C過夜酶解,酶解液置于_80° C冰箱冷凍待用。
(2) 肽段的分離富集
將lOOptL濃度為5 ng叱-1的糖蛋白酶解液與約100ng磁性納米材料在持續(xù)震蕩 下反應(yīng)90分鐘,反應(yīng)體系為pH約8. 5的NH4HC03溶液。然后將反應(yīng)后鍵和了糖肽的 材料用pH約8. 5的NH4HC03溶液沖洗2-3次,每次20化。吸干沖洗溶液,用10化三 氟乙酸的20%乙腈溶液洗脫(三氟乙酸濃度0.5-5%,洗脫時(shí)間l小時(shí))。最后將l化洗 脫液與基質(zhì)一起點(diǎn)到靶板上,待干后進(jìn)行MALDI-MS分析。未經(jīng)材料分離濃縮處理的原 酶解WL也同樣進(jìn)行MS分析作為對比。以上實(shí)驗(yàn)過程都在室溫下進(jìn)行。
(3) MALDI-MS的檢測
依序分別將1 L DHB基質(zhì)(12. 5mg/ml的DHB溶于0. 1% (v/v) TFA and 20% (v/v) 乙腈溶液),luL樣品點(diǎn)于MALDI靶板上,待靶板上的點(diǎn)樣液干燥、結(jié)晶后,將靶板 放進(jìn)質(zhì)譜儀,進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜測定。MALDI-TOF MS質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)在MALDI-QIT-TOF MS (AXIMA QIT; Shimadzu/Kratos, Manchester, UK)上完成;激光器波長337 nm,激光 脈沖頻率10Hz,正離子模式下檢測。
實(shí)施例3表面修飾硼酸基團(tuán)的磁性材料用于糖蛋白的分離
取2pL糖蛋白(1Pg叱-1),和2叱非糖蛋白(Wg叱-l)混合,在pH約8. 5的
8溶液中以實(shí)驗(yàn)例2的條件與納米材料反應(yīng),所得洗脫液與未處理的原對照溶液一起進(jìn) 行12WSDS-聚丙烯酸電泳分離。所得膠條銀染顯色后進(jìn)行掃描并分析。
權(quán)利要求
1、表面修飾硼酸基團(tuán)的納米磁性材料,其特征在于,具有下式的結(jié)構(gòu)其中,M為帶有氨基的四氧化三鐵納米粒子。
2、 一種如權(quán)利要求1所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米磁性材料的制備方 法,其特征在于,首先采用水熱法合成胺基修飾的四氧化三鐵磁性納米材料,然后分別與己二酰氯、3-氨基苯硼酸反應(yīng),生成表面修飾硼酸基團(tuán)的磁性納米材料。
3、 按權(quán)利要求2所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米磁性材料的制備方法,其 特征在于包括如下步驟(1)用水熱法合成表面帶有氨基的四氧化三鐵的超順磁性納米粒子采用FeCl3*6H20為原料,以乙二醇為分散體系,添加無水乙酸鈉,1,6-己二胺,反應(yīng)溫度為195-200°C,反應(yīng)時(shí)間為4-6小時(shí),生成表面帶有氨基的磁 性納米粒子;(2)首先,將由步驟(l)合成的Fe304氨基磁性微球用去離子水洗滌,除去 水溶性雜質(zhì)后,將產(chǎn)物以40-5(TC真空干燥得到黑色粉末;其次,對Fe304氨基磁性微球進(jìn)行表面修飾,先將磁球表面用己二酰氯修飾 取干燥的兩頸瓶,加入無水氯仿,取干燥的Fe304氨基磁性微球粉末,得納米粒 子的分散液;將兩頸瓶置于冰水浴中密封攪拌20-30分鐘,保持冰水浴,向瓶中 滴入己二酰氯,繼續(xù)密封攪拌4-5小時(shí);然后通過酰氯在磁球上接3-氨基苯硼 酸先在磁鐵輔助下用無水氯仿洗去未反應(yīng)的己二酰氯,再加入無水氯仿分散; 在分散液中加入3-氨基苯硼酸粉末,機(jī)械攪拌5-6小時(shí),在磁鐵輔助下用丙酮 和水洗掉多余的3-氨基苯硼酸,收集合成所得的磁性納米材料,40-50'C烘干備 用。
4、 按權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于步驟(l)制得的表面帶有氨 基的磁性納米粒子其粒徑是20—100 nm。
5、 權(quán)利要求1的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米磁性材料在制備特異性分離富集 糖蛋白和糖肽制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬無機(jī)材料和分析技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種表面修飾氨基苯硼酸的磁性材料及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明先合成表面富含氨基的四氧化三鐵的磁性納米材料,采用氨基苯硼酸對其進(jìn)行表面化學(xué)修飾。本發(fā)明的合成方法簡單有效,制得的磁性材料具有很好的磁場感應(yīng)性,作為微吸附劑,比表面積大,特異性強(qiáng),可直接放入肽段中,無需特殊處理,絡(luò)合到磁性納米材料上后,無需離心分離,采用簡單磁場作用即可實(shí)現(xiàn)糖蛋白和糖肽的特異性分離富集。該材料在蛋白組學(xué)等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C01G49/06GK101684005SQ200810200779
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日
發(fā)明者寧 姚, 姚國平, 張祥民, 鄧春暉 申請人:復(fù)旦大學(xué)