本發(fā)明涉及一種具有抗蛋白吸附材料,特別是涉及一種利用可控接枝技術(shù)提高材料表面血液相容性的方法,是一種具有抗蛋白吸附材料表面的制備方法。
背景技術(shù):
生物相容性是指生物醫(yī)用材料與生物體之間的相互作用而產(chǎn)生的各種物理化學(xué)反應(yīng),是生物醫(yī)用材料最重要的特性之一,生物相容性的優(yōu)劣直接決定該材料是否能應(yīng)用于生物體。對于與血液接觸的材料來說,材料表面血液相容性較差,蛋白質(zhì)(如纖維蛋白原(Fg)、人血白蛋白(HSA)等)在材料表面的不可控的、非特異性的吸附會(huì)引起一系列不良反應(yīng),如凝血、溶血、血栓等現(xiàn)象。于是制備具有優(yōu)異血液相容性的材料表面顯得非常有意義。
目前用提高材料表面抗蛋白吸附能力的最為普遍的是PEG,然而PEG在一定環(huán)境中的降解性限制了其在很多領(lǐng)域的應(yīng)用。聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)是一種具有優(yōu)異水溶性、良好生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性的高分子聚合物,是由單體N‐乙烯基吡咯烷酮在一定條件下聚合而成,已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、食品、材料等領(lǐng)域。聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)已開始被廣泛應(yīng)用于制備優(yōu)異血液相容性的材料表面。于是利用其提高材料表面的抗蛋白吸附性能,改善材料表面血液相容性成為了研究的熱點(diǎn)。目前研究人員采用的現(xiàn)有的這些修飾方法可以將聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)接枝于材料表面,但都不能控制接枝密度和接枝鏈長,因而無法研究這兩個(gè)因素對聚乙烯基吡咯烷酮改善基材抗蛋白非特異性吸附性能的影響,然而上述兩個(gè)因素被認(rèn)為是影響著材料抗蛋白非特異性吸附性能的重要因素。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,提供一種利用可控接枝技術(shù) 提高材料表面血液相容性的方法,該方法可控制接枝密度和接枝鏈長。
本發(fā)明先合成巰基化聚乙烯基吡咯烷酮,利用該巰基與金的化學(xué)反應(yīng),將聚合物接Au表面,提高材料表面抗蛋白吸附性能,制備具有優(yōu)異血液相容性材料表面。
可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合采用的RAFT試劑SC(Z)S-R,R基團(tuán)末端含有羧基,其結(jié)構(gòu)式為:
既含氨基又含巰基的化合物NH2(CH2)nSH的結(jié)構(gòu)式為:其中該化合物的n取值如何界定;n=1‐6。
食人魚洗液(piranha溶液);巰基化聚乙烯基吡咯烷酮(HS-PVP)
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種利用可控接枝技術(shù)提高材料表面血液相容性的方法,包括如下步驟:
1)將單體NVP、RAFT試劑和溶劑乙腈置于容器中,加入引發(fā)劑AIBN,混合均勻;
2)進(jìn)行液氮除氧,在60-80℃的恒溫油浴中反應(yīng),經(jīng)過5-48h聚合后,放入液氮驟冷終止反應(yīng);產(chǎn)物加入無水乙醚進(jìn)行沉淀;沉淀產(chǎn)物放在常溫真空干燥箱至恒重,得到PVP-COOH;
3)將PVP-COOH、DCC和NHS混合;在氮?dú)夥諊孪蚧旌衔镏屑尤敫稍锏亩燃淄椋诒l件下反應(yīng)0.5-3h;
4)加入巰基乙胺,常溫下避光反應(yīng)6-18h;將溶劑蒸發(fā)干凈,得到粗制樣品;
5)將步驟4)得到的粗制樣品溶于水,在避光下使用去氧水透析,然后冷凍干燥得到HS-PVP;
6)將金片表面利用piranha溶液進(jìn)行處理;
7)以乙醇為溶劑,溶解所述HS-PVP,得HS-PVP溶液;
8)將HS-PVP溶液置于PE管中,放入步驟6)得到的金片,使金片與巰基間進(jìn)行化學(xué)吸附反應(yīng);
9)將步驟8)的金片取出,利用去離子水和乙醇充分清洗,得到具有優(yōu)異血液相容性材料表面。
為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的,優(yōu)選地,所述RAFT試劑與單體NVP的摩爾比為1:20-1:500。
優(yōu)選地,所述引發(fā)劑AIBN與RAFT試劑的摩爾比為1:2-1:20。
優(yōu)選地,所述PVP-COOH、DCC與NHS的摩爾比為1:1:1.2-1:4:4.8。
優(yōu)選地,以每克PVP-COOH計(jì),所述二氯甲烷的用量為2-20ml。
優(yōu)選地,所述PVP-COOH與巰基乙胺摩爾比為1:1-1:3。
優(yōu)選地,所述透析時(shí)間為12-48h,每隔2-4h換一次水;所述液氮除氧的次數(shù)為3-5次。
優(yōu)選地,所述piranha溶液中雙氧水與濃硫酸的體積比為3:7,處理時(shí)間為5-15分鐘。
優(yōu)選地,所述HS-PVP(巰基化聚乙烯基吡咯烷酮)的濃度為1mg-50mg/ml。
優(yōu)選地,所述金片與巰基間進(jìn)行化學(xué)吸附反應(yīng)的時(shí)間為0.5-3小時(shí),溫度為25-37℃,反應(yīng)中氧含量低于2ppm,且避光。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下優(yōu)點(diǎn):
(1)本發(fā)明制備具有優(yōu)異血液相容性材料表面,抗蛋白吸附性能和生物相容性能優(yōu)異;
(2)本發(fā)明制備的具有優(yōu)異血液相容性材料表面具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性,不易降解;
(3)本發(fā)明制備的具有優(yōu)異血液相容性材料表面可以抑制95%的人血白蛋白和約85%的纖維蛋白原在其表面的粘附。
(4)本發(fā)明可以控制接枝分子的接枝鏈長,可以得到不同接枝分子量修飾的材料表面。
附圖說明
圖1‐1為空白金面XPS測試C譜圖
圖1‐2為空白金面XPS測試N譜圖;
圖1‐3為空白金面XPS測試O譜圖;
圖2‐1為實(shí)施例1中PVP修飾后金面XPS測試C譜圖;
圖2‐2為實(shí)施例1中PVP修飾后金面XPS測試N譜圖;
圖2‐3為實(shí)施例1中PVP修飾后金面XPS測試O譜圖;
圖3‐1為實(shí)施例1人血白蛋白HSA吸附量測試結(jié)果圖;
圖3‐2為實(shí)施例2人血白蛋白HSA吸附量測試結(jié)果圖;
圖3‐3為實(shí)施例3人血白蛋白HSA吸附量測試結(jié)果圖;
圖4‐1為實(shí)施例1纖維蛋白原Fg吸附量測試結(jié)果圖;
圖4‐2為實(shí)施例2纖維蛋白原Fg吸附量測試結(jié)果圖;
圖4‐3為實(shí)施例3纖維蛋白原Fg吸附量測試結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
為了更好理解本發(fā)明,下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地說明,但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例子表示的范圍。
實(shí)施例1
一種利用可控接枝技術(shù)提高材料表面血液相容性的方法,包括如下步驟:
(1)稱量單體NVP(4ml,0.0371mol),RAFT試劑(0.2402g,6×10-4mol),4ml溶劑乙腈置于安培瓶中,最后加入0.028g引發(fā)劑AIBN,混合均勻,對安培瓶進(jìn)行液氮除氧三次,在70℃的恒溫油浴中反應(yīng),反應(yīng)15h,將安培瓶放入液氮驟冷終止反應(yīng);
(2)將步驟(1)安培瓶中的產(chǎn)物加入無水乙醚進(jìn)行沉淀;放在常溫真空干燥箱至恒重,得到的PVP-COOH樣品;
(3)稱取樣品1g PVP-COOH、0.1212g DCC和0.0744g NHS置于兩口燒瓶中,在氮?dú)夥諊录尤?ml干燥的二氯甲烷,在冰水浴條件下反應(yīng)1h,然后加入0.0445g巰基乙胺,常溫下避光反應(yīng)12h,將溶劑蒸發(fā)干凈,得到粗制樣品;
(4)將步驟(3)得到的粗制樣品溶于水,在避光下使用去氧水透析,然 后冷凍干燥得到樣品HS-PVP1;
(5)將1×1cm金片表面放入食人魚洗液(piranha溶液)進(jìn)行處理;
(6)取10ml乙醇,溶解20mg的HS-PVP1;
(7)取5ml配制好的HS-PVP1溶液置于PE管中,將步驟(5)得到的直徑1cm金片放入,放置150min后取出,利用去離子水和乙醇充分清洗,得到具有抗蛋白吸附的、優(yōu)異血液相容性的材料表面。
本發(fā)明采用型號為Axis UltraDCD的X射線光電子能譜(XPS)對聚乙烯基吡咯烷酮自組裝前后的金片表面進(jìn)行元素組成和含量的分析。X射線光電子能譜測試結(jié)果以C 1s(284.6eV)為基準(zhǔn)對譜圖進(jìn)行校準(zhǔn),利用avantage軟件對C、N、S元素進(jìn)行擬合譜圖。
如圖1-1、圖1-2、圖1-3,圖2-1、圖2-2和圖2-3為實(shí)施例1的XPS測試圖,HS-PVP自組裝于Au表面后,其表面元素含量發(fā)生明顯變化,元素所處的化學(xué)環(huán)境也會(huì)發(fā)生明顯變化,其中,圖1-1、圖1-2、圖1-3為空白樣的測試結(jié)果,空白樣的表面N和S元素,C元素只有一種結(jié)合狀態(tài);圖2-1、圖2-2和圖2-3為改性后的材料表面測試結(jié)果圖,發(fā)現(xiàn)HS-PVP改性后的材料表面出現(xiàn)了N和S元素,且C元素出現(xiàn)三種結(jié)合狀態(tài)。對比圖1-1、圖1-2、圖1-3,圖2-1、圖2-2和圖2-3結(jié)果表明HS-PVP1可成功接枝于材料表面。
可通過石英晶體微天平(QCM-D)研究聚乙烯基吡咯烷酮自組裝金片后的材料表面對蛋白(人血漿白蛋白和人纖維蛋白原)吸附行為得到的結(jié)果;其中蛋白濃度為1mg/ml PBS溶液,吸附量是通過QCM-D測試得到的F變化以及軟件擬合得到。人體血液含有多種蛋白,其中人血清白蛋白的含量最多,當(dāng)材料與人體血液接觸時(shí),人血清白蛋白和纖維蛋白原在材料表面的吸附對血栓的形成有著重要影響,因而人體血液白蛋白(HSA)和纖維蛋白原(Fg)是研究材料血液相容性的常用蛋白。
空白樣為Au,HS-PVP接枝修飾后的材料為Au-PVP,圖3-1和圖4-1分別為通過石英晶體微天平(QCM-D)測試得到的材料(Au和Au-PVP)表面對人體血液白蛋白(HSA)和纖維蛋白原(Fg)的吸附量柱狀圖。從測試結(jié)果可以看出,PVP成功修飾于材料表面,且相比空白樣,改性后的材料表面可以 減少95.32%的人血白蛋白和84.76%的纖維蛋白原在其表面的粘附。細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,99.51%的細(xì)胞可以存活。
從圖3-1和圖4-1中可以看出,相比空白樣Au,改性后的材料表面可以明顯地減少人血白蛋白和纖維蛋白原在其表面的粘附。
用石英晶體微天平(QCM-D)測試HS-PVP在材料表面的接枝過程。,石英晶體微天平(QCM)的核心是石英晶體傳感器。當(dāng)傳感器兩端施加電壓時(shí),石英晶體會(huì)在共振頻率處引發(fā)一個(gè)小的剪切振動(dòng)。如果在晶體表面即樣品表面上吸附一層物質(zhì),晶體的振動(dòng)就會(huì)減弱,并且這種振動(dòng)的減弱或者頻率的降低隨著薄膜的厚度和密度變化。即當(dāng)芯片表面有物質(zhì)吸附時(shí),芯片的頻率會(huì)降低,即表面晶體表面質(zhì)量變化導(dǎo)致頻率變化得到Δf,Δf曲線表示樣品表面質(zhì)量變化。
在以乙醇作為基線的情況下,當(dāng)通入含HS-PVP的乙醇溶液后Δf曲線出現(xiàn)明顯變化,大概在30min處出現(xiàn)轉(zhuǎn)折,Δf變化均變緩慢,自組裝時(shí)間為150min時(shí),Δf基本達(dá)到平衡,而在150min后通入乙醇,出現(xiàn)比較大幅度的上升,對應(yīng)的Δf分別為-19.67Hz,-21.69Hz,-24.59Hz,這表明HS-PVP溶液接觸Au表面時(shí),在Au表面同時(shí)存在HS-PVP的自組裝及其物理吸附兩個(gè)過程,通入乙醇后Δf的變化可能是由于表面一些只是物理吸附在Au表面的HS-PVP被乙醇沖刷帶走而導(dǎo)致;10min后Δf曲線重新達(dá)到平衡狀態(tài),HS-PVP已比較牢固地接枝于材料表面。由于接枝前后通入的液體是一致的,通入可以溶解HS-PVP的溶劑后,Δf曲線重新達(dá)到平衡狀態(tài),即HS-PVP接枝于材料的質(zhì)量達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài),通過良溶劑沖洗,也無法使其從樣品表面脫落,說明以當(dāng)前條件下,HS-PVP接枝于材料表面,且無法沖洗使其脫落,可說明HS-PVP已比較牢固地接枝于材料表面。
利用QTools軟件擬合得到HS-PVP1在乙醇溶液中接枝于材料表面的質(zhì)量約為2.03μg/cm2。說明了HS-PVP在材料表面的接枝過程,隨著時(shí)間的變化,HS-PVP接枝于材料表面的質(zhì)量也會(huì)隨著變化。目的是展現(xiàn)HS-PVP在材料表面的接枝過程中質(zhì)量變化過程。2.03μg/cm2是通過石英晶體微天平(QCM0-D)自帶軟件QTools擬合得到的,該值說明HS-PVP接枝于材料表面的接枝密度。
實(shí)施例2
一種利用可控接枝技術(shù)提高材料表面血液相容性的方法,其步驟如下:
(1)稱量單體NVP(4ml,0.0371mol),RAFT試劑(0.1201g,3×10-4mol),4ml溶劑乙腈置于安培瓶中,最后加入0.014g引發(fā)劑AIBN,混合均勻,對燒瓶進(jìn)行液氮除氧三次,在80℃的恒溫油浴中反應(yīng),反應(yīng)24h,將安培瓶放入液氮驟冷終止反應(yīng);
(2)將步驟(1)燒瓶中的產(chǎn)物加入無水乙醚進(jìn)行沉淀;放在常溫真空干燥箱至恒重,得到的PVP-COOH樣品;
(3)稱取樣品1g PVP-COOH、0.0606g DCC和0.0372g NHS置于兩口燒瓶中,在氮?dú)夥諊录尤?0ml干燥的二氯甲烷,在冰水浴條件下反應(yīng)1h,然后0.0225g巰基乙胺,常溫下避光反應(yīng)12h,將溶劑蒸發(fā)干凈,得到粗制樣品;
(4)將步驟(3)得到的粗制樣品溶于水,在避光下使用去氧水透析,然后冷凍干燥得到最終樣品HS-PVP2;
(5)將1×1cm金片表面放入食人魚洗液進(jìn)行處理15min;
(6)取10ml乙醇,溶解30mg的HS-PVP2;
(7)取5ml配制好的HS-PVP溶液置于PE管中,將步驟(5)得到的直徑1cm金片放入,放置150min后取出,利用去離子水和乙醇充分清洗,得到具有抗蛋白吸附的、具有優(yōu)異血液相容性的材料表面。
圖3‐2和圖4‐2為材料表面對人體血液白蛋白(HSA)和纖維蛋白原(Fg)的吸附量柱狀圖,圖3‐2和圖4‐2的測試方式與實(shí)施例1相同。只是實(shí)施例2使用了另一種分子量的HS‐PVP(HS‐PVP2)。從圖3‐2和圖4‐2測試結(jié)果可以看出,PVP成功修飾于材料表面,且相比空白樣,改性后的材料表面可以減少88.31%的人血白蛋白和78.97%的纖維蛋白原在其表面的粘附。
實(shí)施例3
一種利用可控接枝技術(shù)提高材料表面血液相容性的方法,其步驟如下:
(1)稱量單體NVP(4ml,0.0371mol),RAFT試劑(0.0601g,1.5×10-4mol),4ml溶劑乙腈置于安培瓶中,最后加入0.010g引發(fā)劑AIBN,混合均勻,對燒瓶進(jìn)行液氮除氧三次,在80℃的恒溫油浴中反應(yīng),反應(yīng)36h,將安培瓶放入 液氮驟冷終止反應(yīng);
(2)將步驟(1)燒瓶中的產(chǎn)物加入無水乙醚進(jìn)行沉淀;放在常溫真空干燥箱至恒重,得到的PVP-COOH樣品;
(3)稱取樣品1g PVP-COOH、0.0303g DCC和0.0186g NHS置于兩口燒瓶中,在氮?dú)夥諊录尤?0ml干燥的二氯甲烷,在冰水浴條件下反應(yīng)1h,然后0.0113g巰基乙胺,常溫下避光反應(yīng)24h,將溶劑蒸發(fā)干凈,得到粗制樣品;
(4)將步驟(3)得到的粗制樣品溶于水,在避光下使用去氧水透析,然后冷凍干燥得到最終樣品HS-PVP3;
(5)將1×1cm金片表面放入食人魚洗液進(jìn)行處理15min;
(6)取10ml乙醇,溶解50mg的HS-PVP3;
(7)取5ml配制好的HS-PVP3溶液置于PE管中,將步驟(1)得到的直徑1cm金片放入,放置150min后取出,利用去離子水和乙醇充分清洗,得到具有抗蛋白吸附的、優(yōu)異血液相容性的材料表面。
圖3‐3和圖4‐3為材料表面對人體血液白蛋白(HSA)和纖維蛋白原(Fg)的吸附量柱狀圖,圖3‐3和圖4‐3的測試方式與實(shí)施例1相同。與實(shí)施例1相似,本實(shí)施例3使用了另一種分子量的HS‐PVP(HS‐PVP3)。從測試結(jié)果可以看出,PVP成功修飾于材料表面,且相比空白樣,改性后的材料表面可以減少81.21%的人血白蛋白和75.23%的纖維蛋白原在其表面的粘附,且細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,98%的細(xì)胞可以存活。
本發(fā)明控制接枝密度是通過控制HS-PVP與材料表面的接觸時(shí)間實(shí)現(xiàn),而控制接枝鏈長則是通過控制HS-PVP的分子量實(shí)現(xiàn),不同的分子量接枝于材料表面得到不同分子量聚乙烯基吡咯烷酮修飾的材料表面。
表1
表1是實(shí)施例1-3所用的HS-PVP的分子量以及分子量分布,說明本發(fā)明可以通過制備不同的分子量的樣品進(jìn)行接枝實(shí)驗(yàn)來控制接枝分子(即接枝鏈)的長度。
圖3-1、圖3-2、圖3-3、圖4-1、圖4-2和圖4-3為不同接枝分子量修飾的材料表面對人血白蛋白和纖維蛋白原的吸附性能柱狀圖,從這些圖可以明顯看出經(jīng)過HS‐PVP修飾的材料表面對蛋白的吸附量相比于空白樣Au明顯減少,達(dá)到75%以上,對人血白蛋白和纖維蛋白原的非特異性吸附明顯減少,表明制備的樣品具有優(yōu)異的血液相容性。
從實(shí)施例1‐3可以說明本發(fā)明可以控制接枝分子的接枝鏈長,可以得到不同接枝分子量修飾的材料表面,并且制備的材料表面可以有效抑制人血白蛋白和纖維蛋白原在其表面的粘附,使其具有優(yōu)異的血液相容性。