本發(fā)明屬于醫(yī)用材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種采用鋅/銅二元離子注入醫(yī)用鈦材料的表面改性方法。
背景技術(shù)：
：鈦(ti)及其合金具有彈性模量低、機(jī)械性能強(qiáng)、耐腐蝕性和生物相容性好等特點(diǎn)，是硬組織植入體(如人工關(guān)節(jié)、骨創(chuàng)傷產(chǎn)品、脊柱矯形內(nèi)固定系統(tǒng)和牙種植體等)的首選材料。然而，現(xiàn)階段鈦合金植入體的平均壽命為10-15年，仍遠(yuǎn)不能滿足患者的要求。長期臨床跟蹤及研究發(fā)現(xiàn)：(1)骨再生能力差，與周圍組織結(jié)合不佳；(2)表面無持久抗菌性易導(dǎo)致術(shù)后細(xì)菌感染是影響植入體移植成功率和使用壽命的兩大關(guān)鍵問題(progressinmaterialsscience,2009,54:397-425)。近年來，抗生素濫用導(dǎo)致耐藥性問題日益凸顯，人們呼吁能夠減少對(duì)抗生素的依賴。大量研究表明，無機(jī)抗菌元素如銀、銅和鋅，可賦予其抗菌性且這種抗菌性具有廣譜和不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點(diǎn)(naturereviewsmicrobiology,2013,11:371-384)。由于適量鋅、銅對(duì)維持人體正常免疫功能具有重要作用，有利于減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，因此是更為理想的抗菌型試劑(americanjournalofclinicalnutrition,1998,68:447s-463s)。研究表明，微量元素如鋅攝入不足會(huì)阻礙骨骼生長，延緩骨骼發(fā)育，降低骨密度，容易引起骨質(zhì)疏松等疾病(bone,2010,46(3):732-741)，而適量的鋅補(bǔ)給對(duì)于骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)具有非常積極的作用，不但能夠加速成骨細(xì)胞的成熟和分化，促進(jìn)新骨的形成和重建，還能夠抑制破骨細(xì)胞坑的形成，降低破骨細(xì)胞的骨吸收活性(journalofnutritionalbiochemistry,2010,21(4):297-303)。目前，國內(nèi)外主要通過膳食鋅補(bǔ)充、鋅注射來討論鋅元素對(duì)成骨相關(guān)性能的影響。最近有研究報(bào)道，骨組織中血管生成與骨的形成作用是相互聯(lián)系的。中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院的廖二元教授和約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的曹旭教授合作研究發(fā)現(xiàn)破骨前體細(xì)胞分泌的血小板衍生因子(pdgf-bb)可通過內(nèi)皮祖細(xì)胞的募集促進(jìn)血管生成，在偶聯(lián)血管和骨形成過程中發(fā)揮了重要作用，最終提出了血管生成-成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞的“三元調(diào)控理論”，首次解釋了骨生成的新機(jī)制(naturemedicine,2014,20:1270-1278)。現(xiàn)階段研究表明，銅離子可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的上調(diào)表達(dá)和血管生成(americanjournalofpathology 1988,130(1):173-178)。除此之外，現(xiàn)階段鋅和銅的抗菌性研究還主要集中于游離納米顆粒產(chǎn)生自由基對(duì)細(xì)菌起到殺菌作用(acsnano,2012,6(6):5164-5173)。然而到目前為止，游離納米顆粒的安全性問題還未有定論，對(duì)細(xì)胞及生物系統(tǒng)具有潛在的危險(xiǎn)性(acsnano,2008,2(10):2121-2134)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)目前臨床使用鈦基種植體骨修復(fù)能力不足導(dǎo)致種植體與周圍組織整合性和血管形成有限，以及抗菌性差帶來的二次手術(shù)等技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種鈦表面改性方法以滿足醫(yī)用鈦材料所需的骨修復(fù)性能和抗菌性能的要求。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種醫(yī)用鈦基復(fù)合涂層，所述醫(yī)用鈦基復(fù)合涂層為在醫(yī)用鈦基材料表面注入鋅/銅二元離子形成的銅鋅離子注入層，其中在所述醫(yī)用鈦基復(fù)合涂層中，鋅元素以鋅化合物和/或單質(zhì)鋅和/或鋅合金的形式存在，銅元素以銅化合物和/或單質(zhì)銅和/或銅合金的形式存在。本發(fā)明將鋅元素和銅元素兩者引入到醫(yī)用鈦基材料表面可獲得所需的骨修復(fù)性能和抗菌性能，而且共注入鋅/銅二元離子，可將各個(gè)注入離子的注入量控制在生物安全范圍內(nèi)。較佳地，醫(yī)用鈦基表面鋅的原子百分比為40％以下，銅的原子百分比為10％以下。較佳地，銅和鋅元素的注入深度為0～100nm。本發(fā)明還提供了一種醫(yī)用鈦基材料的表面改性方法，包括：以純鋅和純銅作為陰極，采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜技術(shù)在醫(yī)用鈦基材料的表面注入鋅/銅二元離子，以促進(jìn)所述醫(yī)用鈦基材料對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖，上調(diào)成骨和成血管相關(guān)基因的表達(dá)，提高材料表面抗菌性。較佳地，所述等離子體浸沒離子注入/鍍膜(piii&d)技術(shù)工藝參數(shù)為：真空室真空度為5.0×10-2～6×10-5pa，注入電壓為5～80kv，高壓脈寬為0～5000μs，脈沖弧脈寬為0～5000μs，頻率為5～20hz，鋅注入時(shí)間為1～180分鐘，銅注入時(shí)間為1～180分鐘。較佳地，采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜技術(shù)在醫(yī)用鈦基表面注入鋅/銅二元離子的順序可為鋅/銅共注、先鋅后銅或先銅后鋅。較佳地，在注入之前先對(duì)所述醫(yī)用鈦基材料的表面進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括拋光處理和清洗處理，或者拋光清洗后再進(jìn)行噴砂處理。較佳地，所述醫(yī)用鈦基材料可為純鈦、鈦合金或氧化鈦涂層。本發(fā)明中醫(yī)用鈦基復(fù)合涂層的特征在于可通過調(diào)節(jié)工藝參數(shù)使鋅和銅的摻雜深度控制在材料淺表面；摻雜含量控制在一個(gè)離子釋放較低的生物安全范圍內(nèi)。細(xì)胞相容和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過本發(fā)明改性處理得到的鈦基材料對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，并能顯著上調(diào)成骨和成血管相關(guān)基因的表達(dá)。平板計(jì)數(shù)法和細(xì)菌sem形貌圖證實(shí)，經(jīng)過本發(fā)明處理得到的鈦基材料對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抗菌能力。經(jīng)過本發(fā)明改性處理得到的鈦基材料能夠有效提高植入體的骨整合性能、成血管性能和廣譜抗菌性能，有助于解決目前臨床上入體骨整合能力和抗菌性能不足的問題。附圖說明圖1是經(jīng)實(shí)施例1改性處理得到的鈦基材料與純鈦表面的掃描電鏡形貌對(duì)照?qǐng)D；圖2是經(jīng)實(shí)施例1改性鈦基材料表面鋅的高分辨xps譜圖；圖3是經(jīng)實(shí)施例1改性鈦基材料表面銅的高分辨xps譜圖；圖4是經(jīng)實(shí)施例1改性鈦基材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞增殖圖；圖5是經(jīng)實(shí)施例1改性鈦基材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成血管相關(guān)基因的調(diào)控圖；圖6是經(jīng)實(shí)施例1改性鈦基材料對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)菌平板圖；圖7是經(jīng)實(shí)施例2改性鈦基材料的元素深度分布圖譜；圖8是經(jīng)實(shí)施例2改性鈦基材料的腐蝕電位圖；圖9是經(jīng)實(shí)施例2改性鈦基材料對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的sem形貌圖；圖10是經(jīng)實(shí)施例2改性鈦基材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞骨架形貌圖；圖11是經(jīng)實(shí)施例3改性鈦基材料對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的sem形貌圖；圖12是經(jīng)實(shí)施例3改性鈦基材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞粘附圖。具體實(shí)施方式以下通過下述實(shí)施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，下述實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。本發(fā)明提供一種醫(yī)用鈦表面改性方法以及由此獲得的醫(yī)用鈦基復(fù)合涂層以滿足醫(yī)用鈦材料所需的骨修復(fù)性能和抗菌性能的要求。所述醫(yī)用鈦基復(fù)合涂層為在醫(yī)用鈦基材料表面注入鋅/銅二元離子形成的銅鋅離子注入層，其中在所述醫(yī)用鈦基復(fù)合涂層中，鋅元素以鋅化合物和/或金屬鋅和/或鋅合金的形式存在，銅元素以銅化合物和/或金屬銅和/或銅合金的形式存在。醫(yī)用鈦基表面鋅的原子百分比不超過40％，銅的原子百分比不超過10％。在此范圍內(nèi)的改性鈦基材料具有較好的細(xì)胞相容性、抗菌性和成血管性能。以下示例性地說明改性方法。本發(fā)明采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜技術(shù)(piii&d)在醫(yī)用鈦基材料的表面注入鋅/銅二元離子進(jìn)行改性，以促進(jìn)所述醫(yī)用鈦基材料對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖，并上調(diào)成骨和成血管相關(guān)基因的表達(dá)。在注入之前，可對(duì)鈦基材料表面進(jìn)行預(yù)處理。其中，所述的鈦基材料可為純鈦、鈦合金或氧化鈦涂層。所述預(yù)處理可為鈦基材料表面拋光、清洗、干燥等處理。作為一個(gè)示例，將10mm×10mm×1mm的純鈦片經(jīng)過拋光處理后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈，每次10分鐘。所述預(yù)處理還可為對(duì)鈦基材料表面拋光、清洗、干燥等處理后再進(jìn)行噴砂。作為一個(gè)示例，將10mm×10mm×1mm的純鈦片經(jīng)過拋光處理后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈，每次10分鐘。對(duì)鈦片進(jìn)行噴砂處理，將其表面磨成具有微米粗糙度的結(jié)構(gòu)層。再用hcl/h2so4混酸在60℃對(duì)噴砂樣品進(jìn)一步處理8h。所述預(yù)處理還可為對(duì)鈦基材料表面拋光、清洗、干燥等處理后再進(jìn)行直流脈沖等離子提電解氧化工藝處理制備tio2涂層。作為一個(gè)示例，將10mm×10mm×1mm的純鈦片經(jīng)過拋光處理后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈，每次10分鐘。所采用的電解液由0.1mol/l醋酸鈣和0.05mol/l甘油磷酸鈉組成。采用的參數(shù)為：恒流模式、固定頻率為800hz，占空比10％，處理時(shí)間約4分鐘，電流密度16.5a/dm2，終止電壓為420v。本發(fā)明可以純鋅和純銅作為陰極，采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜(piii&d)技術(shù)在預(yù)處理后鈦基材料表面注入鋅/銅二元離子，得到所述醫(yī)用鈦基復(fù)合涂層(銅鋅離子注入層)。其中，注入的順序可為先鋅后銅、先銅后鋅或鋅銅共注中的一種。等離子體浸沒離子注入/鍍膜(piii&d)技術(shù)工藝參數(shù)可為：真空室真空度為5.0×10-2～6×10-5pa，注入電壓為5～80kv，高壓脈寬為0～5000μs，脈沖弧脈寬為0-5000μs，頻率為5～20hz，鋅注入時(shí)間為1～180分鐘，銅注入時(shí)間為1～180分鐘。作為一個(gè)示例，以純鋅和純銅作為陰極，按照鋅銅共注的注入順序，采用的等離子體浸沒離子注入/鍍膜(piii&d)技術(shù)(工藝參數(shù)為：本底真空度為5.0×10-3pa，注入電壓為15kv，高壓脈寬為500μs，脈沖弧脈寬為800μs，頻率為5hz，鋅銅注入時(shí)間為60分鐘)在預(yù)處理后鈦基材料表面注入鋅/銅二元離子，得到所述鈦基復(fù)合涂層。參見圖1所示，發(fā)明的改性方法獲得的鈦基復(fù)合涂層基本保持純鈦的表面結(jié)構(gòu)，即、本發(fā)明的改性方法基本不影響材料表面微結(jié)構(gòu)。又參見圖2、3可知，在改性鈦表面，鋅元素以氧化鋅的形式存在，銅元素以氧化銅和單質(zhì)銅的形式存在。銅離子和/或鋅離子的注入深度為0～100nm，這樣可控制元素?fù)诫s含量在一個(gè)比較小的濃度范圍內(nèi)，使改性材料具有良好的生物安全性。下面進(jìn)一步例舉實(shí)施例以詳細(xì)說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個(gè)示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。實(shí)施例1將10mm×10mm×1mm的純鈦片經(jīng)過拋光處理后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈，每次10分鐘。采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜技術(shù)，將鋅和銅按鋅銅共注的方式(zn+cu-piii)注入鈦基體，所得鈦基復(fù)合涂層中離子注入深度為0～70nm。鈦表面鋅的原子百分比為9.78％，銅的原子百分比為2.56％。其具體的工藝參數(shù)見表1所示：表1鋅/銅二元離子注入?yún)?shù)注入電壓(kv)15高壓脈寬(μs)500鋅銅共注時(shí)間(分鐘)60脈沖弧脈寬(μs)800頻率(hz)5真空度5.0×10-3圖1是經(jīng)本實(shí)施例改性處理得到的鈦基材料與純鈦表面的掃描電鏡形貌對(duì)照?qǐng)D，內(nèi)插圖為高倍電鏡圖。由圖1可見：經(jīng)本實(shí)施例改性處理得到的鈦基材料與改性前的純鈦表面相比，沒有顯著改變。圖2是經(jīng)本實(shí)施例改性處理得到的鈦基材料表面鋅的高分辨xps譜圖。圖3是經(jīng)本實(shí)施例改性處理得到的鈦基材料表面銅的高分辨xps譜圖。由圖2和圖3可表明：鋅在改性處理得到的鈦基材料表面以氧化鋅的形式存在，銅在改性處理得到的鈦基材料表面主要以cuo(962.2ev,941.7ev,933.8ev)和單質(zhì)銅(953.6ev)的形式存在。實(shí)施例2將10mm×10mm×1mm的純鈦片經(jīng)過拋光處理后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈，每次10分鐘。采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜技術(shù)，將鋅和銅按鋅銅共注的方式(zn+cu-piii)注入鈦基體，所得鈦基復(fù)合涂層中離子注入深度為0～70nm。鈦表面鋅的原子百分比為0.91％，銅的原子百分比為0.04％。其具體的工藝參數(shù)見表2所示：表2鋅/銅二元離子注入?yún)?shù)實(shí)施例3將10mm×10mm×1mm的純鈦片經(jīng)過拋光處理后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈，每次10分鐘。采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜技術(shù)，將鋅和銅按先銅后鋅共注的方式(zn+cu-piii)注入鈦基體，所得鈦基復(fù)合涂層中離子注入深度為0～100nm。鈦表面鋅的原子百分比為26.33％，銅的原子百分比為0.01％。其具體的工藝參數(shù)見表2所示：表3鋅/銅二元離子注入?yún)?shù)銅注入電壓(kv)15高壓脈寬(μs)500銅注入時(shí)間(分鐘)60脈沖弧脈寬(μs)800鋅注入電壓(分鐘)5頻率(hz)5鋅注入時(shí)間(分鐘)60真空度5.0×10-3實(shí)施例4將10mm×10mm×1mm的純鈦片經(jīng)過拋光處理后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈，每次10分鐘。對(duì)鈦片進(jìn)行噴砂處理，將其表面磨成具有微米粗糙度的結(jié)構(gòu)層。用hcl/h2so4混酸在60℃對(duì)噴砂樣品進(jìn)一步處理8h。然后采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜技術(shù)對(duì)噴砂酸處理后的鈦按照先銅后鋅的方式注入。鈦表面鋅的原子百分比為0.52％，銅的原子百分比為0.31％。由于微納結(jié)構(gòu)表面粗糙度較大，無法準(zhǔn)確測量其元素注入深度，結(jié)合離子注入工藝的特點(diǎn)和所使用的參數(shù)，預(yù)估離子注入深度約為0～100nm。本實(shí)施例所采用的注入?yún)?shù)與實(shí)施例2接近，同樣具有良好的生物學(xué)性能。其具體的工藝參數(shù)見表4所示：表4鋅/銅二元離子注入?yún)?shù)注入電壓(kv)30高壓脈寬(μs)500銅注入時(shí)間(分鐘)60鋅注入時(shí)間(分鐘)30脈沖弧脈寬(μs)500頻率(hz)5實(shí)施例5將10mm×10mm×1mm的純鈦片經(jīng)過拋光處理后，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈，每次10分鐘。利用直流脈沖等離子體電解氧化工藝處理，使鈦片表面形成5～10μm厚度的tio2涂層。所采用的電解液由0.1mol/l醋酸鈣和0.05mol/l甘油磷酸鈉組成。 采用的參數(shù)為：恒流模式、固定頻率為800hz，占空比10％，處理時(shí)間約4分鐘，電流密度16.5a/dm2，終止電壓為420v。鈦表面鋅的原子百分比為0.34％，銅的原子百分比為0.04％。采用等離子體浸沒離子注入/鍍膜技術(shù)對(duì)電解氧化后的氧化鈦涂層按照先鋅后銅的方式注入，所得鈦基復(fù)合涂層中離子注入深度約為0～100nm。本實(shí)施例所采用的注入?yún)?shù)與實(shí)施例2接近，同樣具有良好的生物學(xué)性能。其具體的工藝參數(shù)見表5所示：表5鋅/銅二元離子注入?yún)?shù)注入電壓(kv)30高壓脈寬(μs)500鋅注入時(shí)間(分鐘)60銅注入時(shí)間(分鐘)30脈沖弧脈寬(μs)500頻率(hz)5實(shí)施例5對(duì)經(jīng)上述實(shí)施例1改性處理得到的鈦材料進(jìn)行細(xì)胞相容性測試。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rbmscs)由中國科學(xué)院干細(xì)胞資源庫提供，用含10％fbs和1％雙抗(青霉素/鏈霉素)的α-mem在37℃、5％co2氣氛條件下培養(yǎng)。將尺寸為10mm×10mm×1mm的樣品放入24孔板中，將rbmscs以1×104/ml的密度種植于樣品表面。培養(yǎng)1、4和7天后，將alamarblue溶液加入24孔板，隨后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。利用酶標(biāo)儀在570nm和600nm波長下測試其吸光度，根據(jù)試劑說明書，計(jì)算細(xì)胞增殖，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見(zn-piii表示鋅單獨(dú)注入鈦，cu-piii表示銅單獨(dú)注入鈦，兩者注入?yún)?shù)均與鋅/銅共注相同)，經(jīng)本實(shí)施例改性處理得到的鈦比改性前的純鈦以及純鈦單獨(dú)注入鋅和銅更有利于促進(jìn)細(xì)胞增殖，具有更好的細(xì)胞相容性。實(shí)施例6對(duì)經(jīng)上述實(shí)施例1改性處理得到的鈦材料進(jìn)行成骨和成血管相關(guān)基因表達(dá)的測試。將3個(gè)尺寸為20mm×20mm×1mm的樣品放在6cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞以1x105的密度接種，每隔3天換液，培養(yǎng)7或14天后，利用trizol提取樣品表面細(xì)胞的rna。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒transcriptorfirst-strandcdnasynthesiskit(roche)將rna按照說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將得到的cdna模板按照lightcycler480sybrgreenimaster(roche)操作說明書加入檢測體系，使用rochelightcycler480ii全自動(dòng)熒光定量pcr系統(tǒng)進(jìn)行real-timepcr反應(yīng)，結(jié)果如圖5所示。如圖5所示(zn-piii表示鋅單獨(dú)注入鈦，cu-piii表示銅單獨(dú)注入鈦，兩者注入?yún)?shù)均與鋅/銅共注相同)，與純鈦、單獨(dú)鋅或者銅注入樣品相比，zn+cu-piii在第7天和14天 均上調(diào)本實(shí)驗(yàn)所觀察基因的表達(dá)水平，alp(p<0.001)、col-i(p<0.01)、ocn(p<0.05)、bmp-2(p<0.05)、vegf(p<0.001)和hif-1α(p<0.01)，且此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單獨(dú)鋅注入和銅注入的樣品相比，單獨(dú)鋅注入的樣品對(duì)成骨相關(guān)基因的促進(jìn)作用更為顯著，而單獨(dú)銅注入的樣品對(duì)成血管基因的促進(jìn)作用更為顯著，而zn+cu-piii能同時(shí)促進(jìn)成骨和成血管基因的表達(dá)，表明兼具良好的成骨性能和成血管性能。實(shí)施例7對(duì)經(jīng)上述實(shí)施例1改性處理得到的鈦材料進(jìn)行抗菌性能測試。將保存的細(xì)菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)從-80℃取出，分別利用lb和tsb培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇。待細(xì)菌復(fù)蘇后，用生理鹽水將菌液稀釋至107cfu/ml，并取出100μl滴于樣品表面，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后生理鹽水將樣品表面菌液沖洗下來，并分別稀釋10倍、100倍及1000倍；再分別取稀釋好的菌液100μl置于營養(yǎng)瓊脂板上，用玻璃棒推均勻(每種稀釋倍數(shù)菌液推三塊瓊脂板)，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后，觀察瓊脂板上菌落數(shù)，結(jié)果如圖6所示。如圖6所示(zn-piii表示鋅單獨(dú)注入鈦，cu-piii表示銅單獨(dú)注入鈦，兩者注入?yún)?shù)均與鋅/銅共注相同)，相比于純鈦、單獨(dú)的鋅注入或銅注入樣品，鋅/銅二元注入樣品上的菌落數(shù)有較大程度的下降，表現(xiàn)出更高的抗菌效率。實(shí)施例8對(duì)經(jīng)上述實(shí)施例2改性處理得到的鈦材料進(jìn)行xps深度圖譜測試。xps測試時(shí)，儀器條件如下：alkα激發(fā)源，真空室氣壓小于2×10-6pa，濺射速度為6.456nm/min，用xpspeak4.1軟件分析處理結(jié)果，結(jié)果如圖7所示。如圖7所示，鋅和銅的原子百分比含量在鈦表面注入層呈現(xiàn)高斯分布，注入深度約為70nm。在表面(～0nm)的原子百分比含量較低，分別為0.91％(zn)和0.04％(cu)，而在30-40nm深度，zn和cu元素的原子百分比含量較高，約為5％。實(shí)施例9對(duì)實(shí)施例2改性處理得到的鈦基材料與純鈦、純鈦單獨(dú)注入鋅和單獨(dú)注入銅樣品進(jìn)行耐腐蝕性測試：工作電極為檢測樣品，對(duì)電極為石墨棒，參比電極為甘汞電極，利用電化學(xué)工作站進(jìn)行耐腐蝕性測試，測試電壓為-0.8～-0.1v，如圖8所示。由圖8可見(zn-piii表示鋅單獨(dú)注入鈦，cu-piii表示銅單獨(dú)注入鈦，兩者注入?yún)?shù)均與鋅/銅共注相同)，鋅入的改性樣品相對(duì)于鈦腐蝕電位改變不明顯，而銅注入和鋅/銅共注的樣品，相對(duì)于鈦，腐蝕電位向正向偏移。鋅/銅共注的樣品相對(duì)于鈦偏移的更多，表明鋅/銅共注的鈦材料腐蝕性能增強(qiáng)。實(shí)施例10對(duì)實(shí)施例2改性處理得到的鈦基材料與純鈦、純鈦單獨(dú)注入鋅和單獨(dú)注入銅樣品的抗菌性能進(jìn)行測定。將保存的細(xì)菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)從-80℃取出，分別利用lb和tsb培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇。待細(xì)菌復(fù)蘇后，用生理鹽水將菌液稀釋至107cfu/ml，并取出100μl滴于樣品表面，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。pbs清洗后，用2.5％的戊二醛固定，并利用梯度乙醇(30％，40％，50％，75％，90％，95％，100％)和六甲基二硅氮烷脫水干燥，干燥后進(jìn)行sem觀察，如圖9所示。由圖9可見(zn-piii表示鋅單獨(dú)注入鈦，cu-piii表示銅單獨(dú)注入鈦，兩者注入?yún)?shù)均與鋅/銅共注相同)，與單獨(dú)鋅注入或銅注入的樣品上完整的細(xì)菌形態(tài)相比，鋅/銅共注入的鈦表面會(huì)造成細(xì)菌細(xì)胞壁嚴(yán)重破損，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物流出，細(xì)菌死亡。實(shí)施例11對(duì)實(shí)施例2改性處理得到的鈦基材料與純鈦、純鈦單獨(dú)注入鋅和單獨(dú)注入銅樣品的細(xì)胞粘附性能進(jìn)行測試。樣品滅菌后，將密度為3×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液1ml接種于樣品表面，培養(yǎng)1、4和24小時(shí)后，pbs清洗樣品2遍，分別利用4％多聚甲醛(pfa)進(jìn)行固定，tritonx-100進(jìn)行通透，1％bsa封閉，用fitc-phalloidin對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖10所示。由圖10可見(zn-piii表示鋅單獨(dú)注入鈦，cu-piii表示銅單獨(dú)注入鈦，兩者注入?yún)?shù)均與鋅/銅共注相同)，細(xì)胞在純鈦表面培養(yǎng)1小時(shí)基本上未鋪展，而鋅注入、銅注入和鋅/銅共注表面上細(xì)胞鋪展的比純鈦表面要好；培養(yǎng)4和24小時(shí)后，細(xì)胞在所有鈦基材料表面均鋪展良好，相比較而言，鋅/銅共注的鈦表面更有利于細(xì)胞的鋪展。實(shí)施例12對(duì)實(shí)施例3改性處理得到的鈦基材料和純鈦的抗菌性能進(jìn)行測定。將保存的細(xì)菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)從-80℃取出，分別利用lb和tsb培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇。待細(xì)菌復(fù)蘇后，用生理鹽水將菌液稀釋至107cfu/ml，并取出100μl滴于樣品表面，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。pbs清洗后，用2.5％的戊二醛固定，并利用梯度乙醇(30％，40％，50％，75％，90％，95％，100％)和六甲基二硅氮烷脫水干燥，干燥后進(jìn)行sem觀察，如圖11所示。由圖11可見，與純鈦上完整的細(xì)菌形態(tài)相比，鋅/銅共注入的鈦表面會(huì)造成細(xì)菌細(xì)胞膜破損，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物流出，細(xì)菌死亡。實(shí)施例13對(duì)實(shí)施例3改性處理得到的鈦基材料和純鈦的細(xì)胞粘附性能進(jìn)行測試。樣品滅菌后，將密度 為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液1ml接種于樣品表面，培養(yǎng)1、4和24小時(shí)后，pbs清洗樣品2遍，加入10％培養(yǎng)液體積的prestoblue試劑，進(jìn)一步培養(yǎng)30分鐘，然后取100μl測試其熒光強(qiáng)度(ex:560nm，em:590nm)，結(jié)果如圖12所示。由圖12可見，細(xì)胞在鋅/銅注入樣品上的細(xì)胞粘附與純鈦相比沒有顯著變化，具有較好的細(xì)胞相容性。當(dāng)前第1頁12