專利名稱：用于核酸固相合成的接頭和載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于核酸固相合成的接頭，攜帶該接頭的用于固相合成的載體和利用該載體的核酸制備方法。
背景技術(shù)：
對(duì)于核酸如DNA、RNA等等的化學(xué)合成，廣泛采用利用亞磷酰胺法的固相合成工藝。在固相亞磷酰胺法中，通常通過以下步驟合成核酸。首先，將待合成核酸3’末端的核苷通過3’_0H基團(tuán)與切割接頭(如琥珀酰基)形成酯鍵，以便首先在用于固相合成的載體上攜帶核苷(核苷接頭)。然后，將攜帶核苷接頭的用于固相合成的載體置于反應(yīng)柱中，然后將反應(yīng)柱設(shè)置在自動(dòng)化核酸合成儀上。其后，根據(jù)自動(dòng)化核酸合成儀的合成程序通常在反應(yīng)柱中進(jìn)行包括以下步驟的合成反應(yīng):
(1)用酸如三氯乙酸/二氯甲烷溶液等等對(duì)帶保護(hù)的核苷的5’ -OH基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)的步驟；
(2)在活化劑(四唑等等)存在的情況下用脫保護(hù)的5’-OH基團(tuán)偶聯(lián)核苷亞磷酰胺(核酸單體)的步驟；
(3)用乙酸酐等等為未反應(yīng)的5’-OH基團(tuán)加帽的步驟；和
(4)用含水碘等等氧化亞磷酸鹽的步驟。通過重復(fù)合成循環(huán)，促進(jìn)從3’末端至5’末端方向的寡核苷酸延伸反應(yīng)，合成具有期望序列的核酸。最后，用氨水、甲胺溶液等等水解切割接頭，以從用于固相合成的載體切割合成的核酸(非專利文獻(xiàn)I)。如上述，當(dāng)進(jìn)行以上提及的合成時(shí)，必需預(yù)先經(jīng)由切割接頭在用于固相合成的載體上攜帶將在3’末端的核苷(原材料)。而且，3’末端會(huì)隨著期望合成的核酸的序列而變化。在DNA寡核苷酸的情況下，dA、dG、dC、dT這四種是必要的，在RNA的情況下，rA、rG、rC、rU這四種也是必要的。為了合成經(jīng)修飾的寡核苷酸，先前攜帶經(jīng)修飾的核苷的用于固相合成的載體是必要的，這使得工藝變得復(fù)雜。為了解決上述問題，已經(jīng)開發(fā)了攜帶通用接頭的用于固相合成的載體(通用載體)作為接頭，以連接固相載體和原材料，替代目前為止通常使用的核苷-琥珀酰接頭等等。利用通用載體，與用于期望合成的核酸的3’末端的核苷或者核苷酸的種類無關(guān)，所述方法包括在與常規(guī)自動(dòng)化核酸合成相同的步驟中使核苷亞磷酰胺反應(yīng)以位于3’末端以啟動(dòng)合成，和在合成期望的核酸后，通過與常規(guī)方法類似的方法從用于固相合成的載體切割所述核酸。如上所述制備攜帶各種核苷-接頭的用于固相合成的載體不是必需的。提出了一些通用載體，其為期望待合成的核酸的3’末端提供羥基(專利文獻(xiàn)1-4和非專利文獻(xiàn)2和3)。這些通用載體的結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)相鄰碳原子，一個(gè)碳原子與-OH基團(tuán)連接成為核酸合成的起點(diǎn)，另一個(gè)碳原子與基團(tuán)(例如-OH基團(tuán)，-NH2基團(tuán)，-SH基團(tuán))連接在除去保護(hù)基團(tuán)后成為親核基團(tuán)。當(dāng)在核酸合成后通過氨水等等切割核酸時(shí)，這些親核基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)也被解離以攻擊3’末端磷，磷酸基團(tuán)被從3’末端切割以形成環(huán)磷酸酯。全部都用于合成在3’末端具有羥基的核酸。在3’末端具有羥基的核酸是非常有用的，因?yàn)樗谏I(lǐng)域如核酸藥物等方面被廣泛要求。鑒于這樣的情況，期望能夠合成在5’末端或者3’末端具有羥基的核酸的通用接頭和攜帶該接頭的通用載體。文獻(xiàn)列表 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn) 1:US-B-5681945 專利文獻(xiàn) 2:US-B-6653468 專利文獻(xiàn) 3:W02005/049621 專利文獻(xiàn) 4:US-A-2005/0182241 非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1:Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2000)3.1.1-3.1.28
非專利文獻(xiàn) 2:Bio Techniques, 22, 752-756 (1997)
非專利文獻(xiàn) 3:Tetrahedron，57，4977_4986 (2001)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題
本發(fā)明目的是提供能夠合成在3’末端具有羥基的核酸的通用接頭，攜帶該接頭的通用載體，和利用該通用載體合成核酸的方法。特別地，本發(fā)明目的是提供用于固相合成的載體，其能夠通用地以高純度合成在3’末端具有羥基的核酸，其不需要具有預(yù)先攜帶的經(jīng)修飾的核苷的用于固相合成的載體，即使在合成經(jīng)修飾的寡核苷酸時(shí)。解決問題的手段 因此，本發(fā)明提供以下。[I]用于核酸固相合成的接頭，包括由下式代表的化合物
權(quán)利要求
1.用于核酸固相合成的接頭，包括由下式代表的化合物
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接頭，其中L1和L2中至少一個(gè)可以被連接至載體而用于核酸固相合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的接頭，其中X1和X2是二甲氧基三苯甲基。
4.用于核酸固相合成的載體，其具有由下式代表的結(jié)構(gòu)
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其中L1是琥珀?；?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的載體，其中L1和L2是琥珀?；?。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的載體，其中X1和X2是二甲氧基三苯甲基。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的載體，其中Sp是由多孔性合成聚合物顆?；蚨嗫仔圆Ａьw粒組成的固相載體。
9.產(chǎn)生核酸的方法，包括在根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的載體上進(jìn)行核酸合成反應(yīng)的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)生方法，其中通過固相亞磷酰胺方法進(jìn)行所述核酸合成反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠合成在3'末端具有羥基的核酸的通用接頭，攜帶該接頭的通用載體，和使用該通用載體合成核酸的方法。本發(fā)明提供了用于核酸固相合成的接頭，所述接頭包含通過下式表示的化合物其中每個(gè)符號(hào)如說明書中所定義。
文檔編號(hào)C40B40/06GK103224502SQ20131003543
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月30日
發(fā)明者塚本真幸, 鈴木紀(jì)尊, 早川芳宏, 前田惠里, 森健二郎, 味吞憲二郎 申請(qǐng)人:日東電工株式會(huì)社, 國(guó)立大學(xué)法人名古屋大學(xué)