精子芯片的制作方法
【專利摘要】提供一種制備高通量男性不孕相關(guān)的人類精子芯片的技術(shù)和方法。收集5例已婚已育男性自愿捐精者、以及60例臨床診斷為男性不孕（排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素）患者自愿捐精者的精液，待精液自然液化后收集固定精子細(xì)胞、脫水透明、浸蠟。利用組織芯片儀制備精子石蠟芯、精子石蠟塊陣列，石蠟切片制備精子芯片。結(jié)合免疫組化、分子原位雜交等實(shí)驗(yàn)分子研究技術(shù)，所制備的精子芯片可用于導(dǎo)致人類男性不孕的精子基因或功能缺陷等的研究。
【專利說明】精子芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物芯片領(lǐng)域，涉及一種用于制備微陣列精子芯片的生物芯片及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物芯片是指包被在硅片、尼龍膜等固相支持物上的高密度組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸、糖類以及其他生物組分的高通量微陣列。利用高通量生物芯片，通過特異性分子雜交及染色技術(shù)，對受檢樣本進(jìn)行檢測，可準(zhǔn)確、快速獲取大量的分子檢測信息。目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)分子診斷、以及生物抗體靶向藥物篩查和驗(yàn)證等領(lǐng)域。
[0003]人類精子是承載人類繁衍生息重任的男性生殖細(xì)胞，本質(zhì)上屬于單細(xì)胞生物體。人類精子基因或功能缺陷是不孕癥的直接原因之一。一項研究不孕的臨床薈萃分析(超過20個研究小組)發(fā)現(xiàn)，由于男性精子/精液異常導(dǎo)致不孕者，占二位，25%。其他原因診斷依次為:排卵障礙27%、輸卵管異常22%、不明原因的不孕17%、子宮內(nèi)膜異位癥5%、其他如免疫學(xué)不孕4%。
[0004]作為生物芯片家族成員之一，目前尚沒有人類精子芯片制備技術(shù)及應(yīng)用的產(chǎn)品、專利及文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明旨在提供一種制備高通量男性不孕相關(guān)的人類精子芯片的技術(shù)和方法。所制備的精子芯片可用于導(dǎo)致人類男性不孕的精子基因或功能缺陷等的研究。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的。收集5例已婚已育男性自愿捐精者、以及60例臨床診斷為男性不孕(排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精液，待精液自然液化后收集固定精子細(xì)胞、脫水透明、浸蠟。利用組織芯片儀制備精子石蠟芯、精子石蠟塊陣列，石蠟切片制備精子芯片。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1是精子陣列空心石蠟塊蠟?zāi)５氖疽鈭D:其中，1:為5例已婚已育男性自愿捐精者的精子石蠟芯預(yù)留的石蠟孔；2:為60例男性不孕(排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精子石蠟芯預(yù)留的石蠟孔。所有孔徑為1mm，孔間距為1mm。
[0008]圖2是精子陣列石蠟塊的示意圖:其中，1:為5例已婚已育男性自愿捐精者的精子石蠟芯柱；2:為60例男性不孕(排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精子石蠟芯柱。精子石蠟芯柱直徑為1_，精子石蠟芯柱間距為1_。
[0009]圖3是精子芯片的示意圖:其中，1:為5例已婚已育男性自愿捐精者的精子石蠟芯片，同時也可整體作為本精子芯片的定判斷位點(diǎn)；2 --為60例男性不孕(排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精子石蠟芯片。精子石蠟芯片點(diǎn)直徑為1_，精子石蠟芯片點(diǎn)間距為1mm。3:為精子芯片固相載體(粘附載玻片)上的磨沙標(biāo)記區(qū)域?！揪唧w實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例:在充分知情的基礎(chǔ)上，自愿捐精者簽署知情同意書。收集5例已婚已育男性自愿捐精者以及60例男性不孕(排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精液，制備精子芯片。
[0011]1.1精液收集:收集5例已婚已育男性自愿捐精者以及60例男性不孕(排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素)患者的精液約1ml。
[0012]1.2精子固定:待精液自然液化后加入10倍精液體積的精子固定溶液，充分混勻，室溫固定I小時。
[0013]1.3脫水包埋:離心收集精子，中性PBS緩沖液洗滌精子2次。酒精梯度脫水后，脫脂透明，離心收集處理好的精子。將精子加入50ul預(yù)熱融化的石蠟中，混勻。冷卻固定成精子石蠟塊。
[0014]1.4精子蠟芯:利用組織芯片制備儀石蠟芯取樣器，鉆取直徑為1mm的精子蠟芯。
[0015]1.5受體蠟?zāi)?制備空白石蠟塊，利用組織芯片制備儀定位鉆取孔徑為Iml的空心受體蠟?zāi)?，如附圖1。
[0016]1.6精子陣列:依照精子芯片的設(shè)計，將總共65例精子石蠟芯逐一安放到空心受體蠟?zāi)Ｖ邢鄳?yīng)的空白孔位點(diǎn)，以陣列表面齊平為基準(zhǔn)，如附圖2。
[0017]1.7陣列融合:將精子陣列置于干燥箱中，調(diào)節(jié)干燥箱溫度與時間，確保所有精子石蠟芯與受體蠟?zāi)３浞秩诤锨揖邮炐静灰莆蛔冃巍?br> [0018]1.8石蠟切片:利用石蠟切片機(jī)切片制作石蠟切片，片厚4um。將石蠟切片平鋪與粘附載玻片上，如附圖3。在載玻片標(biāo)記區(qū)`域作好標(biāo)記。
[0019]1.9精子芯片制作完畢。結(jié)合免疫組化、分子原位雜交等實(shí)驗(yàn)分子研究技術(shù)，所制備的精子芯片可用于導(dǎo)致人類男性不孕的精子基因或功能缺陷等的研究。
【權(quán)利要求】
1.一種精子芯片的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 第一步，精液收集。收集已婚已育男性自愿捐精者以及男性不孕(排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精的精液約lrnl。 第二步，精子固定。待精液自然液化后加入10倍精液體積的精子固定溶液，充分混勻，室溫固定I小時。 第三步，脫水包埋。離心收集精子，中性PBS緩沖液洗滌精子2次。酒精梯度脫水后，脫脂透明，離心收集處理好的精子。將精子加入50ul預(yù)熱融化的石蠟中，混勻。冷卻固定成精子石蠟塊。 第四步，精子蠟芯。利用組織芯片制備儀石蠟芯取樣器，鉆取直徑為1mm的精子蠟芯。 第五步，受體蠟?zāi)?。制備空白石蠟塊，利用組織芯片制備儀定位鉆取孔徑為1mm的空心受體蠟?zāi)＃￡嚵袃?nèi)孔間距為1mm。 第六步，精子陣列。依照精子芯片的設(shè)計，將精子石蠟芯逐一安放到空心受體蠟?zāi)Ｖ邢鄳?yīng)的空白孔位點(diǎn)，以陣列表面齊平為基準(zhǔn)。 第七步，陣列融合。將精子陣列置于干燥箱中，調(diào)節(jié)干燥箱溫度與時間，確保所有精子石蠟芯與受體蠟?zāi)３浞秩诤锨揖邮炐静灰莆蛔冃巍? 第八步，石蠟切片。利用石蠟切片機(jī)切片制作石蠟切片，片厚4um。將石蠟切片平鋪與粘附載玻片上。在載玻片標(biāo)記區(qū)域作好標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人類精子芯片的制備方法，其特征在于:所述精子芯片包含已婚已育男性自愿捐`精者以及男性不孕(排除輸精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精的精子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人類精子芯片的制備方法，其特征在于:精子經(jīng)過脫水包埋處理后，直接用于精子石蠟芯的制備。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人類精子芯片的制備方法，其特征在于:精子芯片為矩形陣列組成，精子石蠟芯片點(diǎn)直徑為(但不限于)1mm，也可為1.5mm、或2mm等不同規(guī)格，精子石蠟芯片點(diǎn)間距為(但不限于)1mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人類精子芯片的制備方法，其特征在于:以已婚已育男性自愿捐精者的精子作為陽性對照，同時也可作為該張精子芯片的定位判斷點(diǎn)。
【文檔編號】C40B50/06GK103866402SQ201210533770
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月12日
【發(fā)明者】郜恒駿, 張可浩, 張新, 朱華玉, 張明飛, 馬小慧, 顏虹 申請人:泰州醫(yī)藥城博奧邦科生物科技有限公司