專利名稱：：獲得組織蛋白質(zhì)組文庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獲得組織蛋白質(zhì)組文庫的方法，其用于制備"真實(shí)"表達(dá)的蛋白質(zhì)的代表性文庫，以及用于過表達(dá)給定組織中存在的大量轉(zhuǎn)錄物(mRNA)。
背景技術(shù)：
：來源于植物任何部分的細(xì)胞可再生出完整植物，而脊推動(dòng)物細(xì)胞缺乏此能力。僅僅新形成的受精卵具有這樣的發(fā)育形成完整生物體的能力。研究人員試圖克隆哺乳動(dòng)物，但獲得的成功率很低，因?yàn)橥ㄟ^將生長停滯的成年體細(xì)胞核移植進(jìn)成熟卵母細(xì)胞而進(jìn)行的哺乳動(dòng)物克隆仍然處于開發(fā)階段，尚不清楚這一過程的基礎(chǔ)是什么技術(shù)和生物學(xué)因素，也不清楚是什么技術(shù)和生物學(xué)因素對其有限制(Solter,2000)。脊推動(dòng)物的繁殖包括多組復(fù)雜的分化事件，其導(dǎo)致發(fā)育成完全成熟的動(dòng)物。哺乳動(dòng)物克隆最近的成功表明生長停滯的正常體細(xì)胞核在被移植到去除了核的成熟卵母細(xì)胞中之后能夠發(fā)育成為完全成熟的動(dòng)物(Campbelletal.，1996和Wilmutetal,1997)。這些研究提示使得已分化的核去分化以及重編程之必要和充分的因素存在于成熟卵母細(xì)胞的卵質(zhì)中，這些研究開啟了研究復(fù)雜過程(如核重編程、印跡(imprinting),胚胎分化和發(fā)育)的新途徑(Coleman,2002和TsunodaandKato，2002)。此技術(shù)的可能應(yīng)用包括農(nóng)場動(dòng)物的繁殖性克隆和用于自體干細(xì)胞移植的治療性克隆(Campbelletal"2001和Westhusinetal"2001)。為了在哺乳動(dòng)物克隆中達(dá)到更高的成功率，必須在分子水平上理解核重編程、胚胎分化和發(fā)育。存在于卵母細(xì)胞中的母體來源蛋白質(zhì)和mRNA已被認(rèn)為協(xié)助受精卵重編程、分化和發(fā)育，然而這些過程所需的其它因子必需轉(zhuǎn)錄自受精卵核(Liebetal"1998,Paynton，1998和Ryabova，1994)。在實(shí)踐中，倫理和實(shí)際原因使得只可獲得毫克量的哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和早期胚胎組織，這不足以分離、鑒定和表征存在于這些組織中的潛在目的蛋白。人類目前主要的健康疾病之一是各種人體組織肺瘤，其導(dǎo)致非受控的細(xì)胞分裂。研究人員已竭盡全力從腫瘤所含分子的角度去了解、分類和定義肺瘤狀況(Wulfkuhleetal.，2003)，其中使用DNA微陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)方法。這些研究的目標(biāo)是鑒定出可用于腫瘤治療的診斷、預(yù)后和治療用途的生物標(biāo)志物(Amatscheketal.，2004和Vaibhavetal.,2005)。來自癌癥患者的腫瘤組織樣品的可用性非常有限，它們幾乎不足以分離/鑒定出作用于這些疾病的目的蛋白質(zhì)，特別是低豐度蛋白質(zhì)。由于上述原因，構(gòu)建了來自可獲得組織的cDNA文庫，使用微陣列方法分析了這些文庫中存在的轉(zhuǎn)錄物。微陣列對靶標(biāo)組織和相關(guān)對照組織cDNA文庫中存在的轉(zhuǎn)錄物水平進(jìn)行定量，以得到所述靶標(biāo)組織中表達(dá)的重要基因。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是參與大多數(shù)生物學(xué)過程的功能性分子，所以對參與生理功能的蛋白質(zhì)直接進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)-功能研究可能是更有利的。文獻(xiàn)中已才艮道了構(gòu)建來自組織的cDNA文庫的方法(Ravassardetal.，1997)和通過微陣列分析這些文庫中所存在的轉(zhuǎn)錄物的方法(GltnaneandRimm,2004)。這些分析僅僅針對排列在微陣列片上的基因確定了相對于適當(dāng)對照組織cDNA文庫的轉(zhuǎn)錄物的相對豐度。這意味著微陣列不能提供對所述微陣列片之外基因的各個(gè)轉(zhuǎn)錄物(mRNA)特別是未知轉(zhuǎn)錄物的身份和豐度。盡管基因是遺傳物質(zhì)的功能性單位，但通過由所述基因的mRNA表達(dá)的各種蛋白質(zhì)實(shí)際上負(fù)責(zé)各種細(xì)胞過程。從這一角度來看，直接研究自組織中所存在mRNA翻譯的蛋白質(zhì)可能對于理解它們的細(xì)胞功能是更為有利的。生物系統(tǒng)的功能分子是自細(xì)胞中所存在mRNA翻譯的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能研究是理解參與和調(diào)節(jié)細(xì)胞過程之通路所必需的?？赏ㄟ^常規(guī)純化技術(shù)從組織中分離蛋白質(zhì)，其中一方面組織中具體蛋白質(zhì)的可獲得性以及另一方面組織自身的可獲得性不受限制。絕大多數(shù)時(shí)候，鑒定組織自身中存在的所有蛋白質(zhì)是非常困難的，這是由于許多重要蛋白質(zhì)的豐度較低，即使在所述組織的供應(yīng)不受限制時(shí)也是如此。一些重要組織如卵母細(xì)胞、早期胚胎、來自患者的癌/組織樣品等的可獲得量非常有限。因此，這些組織中存在的目的轉(zhuǎn)錄物必須被擴(kuò)增、克隆，表達(dá)、鑒定和純化蛋白，然后才有可能進(jìn)行它們結(jié)構(gòu)和功能的研究。如果開發(fā)出可過表達(dá)這些組織中所有轉(zhuǎn)錄物的技術(shù)，那么至少能夠鑒定這些組織中所表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄物。目前的后基因組時(shí)代為蛋白質(zhì)組水平上的研究提供了更好的機(jī)會(huì)。最近在基因的功能性評估上的創(chuàng)新包括微陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種有力的技術(shù)具有提供這樣機(jī)會(huì)的所有潛力。最近被賦予了自動(dòng)高通量能力的蛋白質(zhì)組學(xué)能夠分析/鑒定甚至大量的蛋白質(zhì)，即使在蛋白質(zhì)存在水平相當(dāng)?shù)偷那闆r下也如此。蛋白質(zhì)組學(xué)使用了二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2DPAGE)以解析蛋白庫，還使用了單個(gè)蛋白質(zhì)的凝膠內(nèi)酶消化以產(chǎn)生肽混合物，以及使用了基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlight,MALDI-TOF)以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋(PeptideMassFingerprint,PMF)數(shù)據(jù)。PMF數(shù)據(jù)作為蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫被保存并進(jìn)行交流，其提供了關(guān)于所述組織蛋白質(zhì)表達(dá)鐠的信息(Hochstrasseretal.，2002)。2DPAGE是唯一已經(jīng)驗(yàn)證的可用于定量比較細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體蛋白質(zhì)錯(cuò)變化的方法(Nordhoffetal.，2001andMannetal.，2001)。由上所述，需要開發(fā)用于構(gòu)建過表達(dá)組織中存在的所有轉(zhuǎn)錄物之cDNA表達(dá)文庫的技術(shù)，其可用于鑒定在特定生理?xiàng)l件下組織中表達(dá)的重要因子。在逆轉(zhuǎn)錄為cDNA之后對來自有限量可用組織的mRNA庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增將促進(jìn)構(gòu)建總cDNA文庫并表達(dá)整個(gè)文庫以分離和鑒定所述文庫中存在的重要的和低豐度的轉(zhuǎn)錄物。作為簡單的微生物，細(xì)菌(大腸桿菌co//))廣泛用于過表達(dá)多種蛋白質(zhì)(Panda,2003)。細(xì)菌是自主分裂的細(xì)胞，在合適誘導(dǎo)物的存在下其表達(dá)作為質(zhì)?？寺∮谄渲械幕?。因此我們預(yù)期，即使在cDNA庫克隆于其中時(shí)細(xì)菌也將it^達(dá)蛋白質(zhì)，并有助于從文庫中所有克隆的轉(zhuǎn)錄物過量產(chǎn)生蛋白質(zhì)。因?yàn)楦咄康鞍踪|(zhì)組學(xué)方法已經(jīng)可用，所以有可能對在這些文庫中過表達(dá)的大量蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。在細(xì)胞和組織中進(jìn)行對所有蛋白質(zhì)的分離和鑒定使得蛋白質(zhì)組水平上的研究成為可能，這可拓展我們對于生命基本過程所涉及機(jī)制的認(rèn)識。通過克隆和表達(dá)整個(gè)cDNA文庫構(gòu)建組織蛋白質(zhì)組文庫的現(xiàn)有方法與用于鑒定所述文庫中表達(dá)的新因子的蛋白質(zhì)組學(xué)分析相結(jié)合，給出了這些方法在蛋白質(zhì)組研究中的潛在應(yīng)用，特別是當(dāng)組織可獲得性是蛋白質(zhì)分離/鑒定的重要限制時(shí)。通過將組織的cDNA庫克隆到表達(dá)載體的所有三個(gè)讀碼框中以獲得組織蛋白質(zhì)組文庫的理論基礎(chǔ)如果我們將任意組織的cDNA庫克隆進(jìn)表達(dá)載體(讀碼才醫(yī)a、b或c)，三分之一所克隆的轉(zhuǎn)錄物應(yīng)該自動(dòng)的位于正確的表ii框內(nèi)，因?yàn)橹挥腥N表達(dá)框。通過將相同cDNA庫克隆進(jìn)其余的兩種框，剩下的三分之二克隆也可被置于正確的表達(dá)框中。通過將克隆到表達(dá)載體的讀碼框a、b和c中的質(zhì)粒庫合并，我們使所有組織轉(zhuǎn)錄物以所有蛋白質(zhì)的正確表達(dá)框處于所述文庫之中。在誘導(dǎo)之后，這些文庫應(yīng)表達(dá)(見后文)所有的所述組織cDNA以產(chǎn)生細(xì)胞總蛋白質(zhì)，因此所述文庫被稱為"組織蛋白質(zhì)組文庫"。關(guān)于未克隆進(jìn)正確表達(dá)讀碼框(即4m讀碼框)中的cDNA發(fā)生了什么，這是個(gè)問題。一共只有64個(gè)三聯(lián)密碼子，其中3個(gè)是終止密碼子。可算出每21個(gè)正常密碼子有一個(gè)終止密碼子，這應(yīng)為這些密碼子在所克隆cDNA的M表達(dá)框中出現(xiàn)的頻率。這是因?yàn)樯锵到y(tǒng)確保終止密碼子不出現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)錄物的編碼區(qū)中?？紤]到氨基酸的平均質(zhì)量是115Da，克隆進(jìn)^m表達(dá)框的轉(zhuǎn)錄物應(yīng)以約21個(gè)氨基酸的肽被截?cái)?，其?yīng)具有(21x115=)~2.42kDa的質(zhì)量。即使終止密碼子出現(xiàn)的頻率降低300%，這些截?cái)嚯囊仓挥衺9.66kDa的質(zhì)量。因此組織蛋白質(zhì)組文庫(如上文所述通過將組織cDNA庫克隆ii4達(dá)栽體的所有三個(gè)讀碼框來構(gòu)建)中表達(dá)的所有質(zhì)量值>10kDa的蛋白質(zhì)在理論上應(yīng)該是生理蛋白質(zhì)，而4^:框表達(dá)的蛋白質(zhì)應(yīng)被截?cái)喈a(chǎn)生<10kDa的肽。蛋白質(zhì)組學(xué)通常利用10-15%二維聚丙烯酰胺亂歐來解析質(zhì)量范圍為10-100kDa的蛋白質(zhì)，并且只有此范圍的蛋白質(zhì)可在這些^中被解析。因此，組織蛋白質(zhì)組文庫中所有過表達(dá)的并且在這些凝膠中解析的蛋白質(zhì)應(yīng)該是天然生理蛋白質(zhì)。細(xì)菌是自主分裂的細(xì)胞，其在適當(dāng)誘導(dǎo)物存在下表達(dá)作為質(zhì)粒克隆于細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄物。因此，我們預(yù)期，即4吏在cDNA庫克隆于其中時(shí)細(xì)菌也將it^達(dá)蛋白質(zhì)，并幫助過量產(chǎn)生所克隆轉(zhuǎn)錄物的整個(gè)文庫，特別是因?yàn)槲覀儍H誘導(dǎo)所述文庫幾個(gè)(2-3)小時(shí)。因?yàn)榧?xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)大小范圍很大，并且因?yàn)樗鼈儧]有區(qū)分自身轉(zhuǎn)錄物和克隆于質(zhì)粒栽體中轉(zhuǎn)錄物的能力，所以它們會(huì)表達(dá)所述蛋白質(zhì)，而不管克隆于其中的cDNA的大小。由上所述，構(gòu)建和表達(dá)組織蛋白質(zhì)組文庫得到了一種誘人的方法及潛在的策略，以在僅僅一次試驗(yàn)中表達(dá)組織的甚至未知蛋白的所有cDNA，這還有助于使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究所有表達(dá)的蛋白質(zhì)。另外，蛋白質(zhì)組學(xué)具有分析和鑒定蛋白質(zhì)的能力，而不論所分析的蛋白質(zhì)是全長的還是截?cái)嗟?。周此，此技術(shù)可用于鑒定新蛋白質(zhì)，即使被克隆并表達(dá)的是cDNA的截?cái)喈a(chǎn)物(參見操作方案)或者從細(xì)菌中純化蛋白質(zhì)的過程中產(chǎn)生部分降解的10-100kDa蛋白質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容構(gòu)建cDNA文庫可實(shí)現(xiàn)對組織中存在的所有轉(zhuǎn)錄物(mRNA)進(jìn)行譜分析，并且可通過如微陣列的技術(shù)對它們進(jìn)行分析。但是每個(gè)轉(zhuǎn)錄物編碼一個(gè)特定蛋白質(zhì)，其僅M將每個(gè)轉(zhuǎn)錄物克隆i^達(dá)載體的正確框內(nèi)，在合適宿主(如細(xì)菌/酵母)中表達(dá)并且進(jìn)行蛋白純化之后才可被鑒定和研究。此艱巨任務(wù)的第一步是鑒定組織中存在的所有/新的轉(zhuǎn)錄物，然而目前還沒有明確且一步到位的方法。因?yàn)橛腥齻€(gè)克隆框，并且有一個(gè)是正確的表達(dá)框，所以克隆cDNA庫導(dǎo)致每個(gè)轉(zhuǎn)錄物被克隆進(jìn)哪個(gè)框、哪個(gè)克隆^達(dá)都是不確定的，并且產(chǎn)生了在4^讀碼框中表達(dá)轉(zhuǎn)錄物的問題，這導(dǎo)致非生理/假想蛋白的翻譯。能自動(dòng)將組織的所有轉(zhuǎn)錄物克隆進(jìn)正確表達(dá)框的方案也還不存在。但是，將組織的所有cDNA轉(zhuǎn)錄物克隆進(jìn)正確讀碼框并表達(dá)以及純化所表達(dá)的蛋白是非常有利的，其使得在通過電泳或色鐠技術(shù)對它們進(jìn)行解析之后實(shí)現(xiàn)了對它們的鑒定。這些方法還會(huì)有助于鑒定稀有組織(如來自患者的臨床樣品、卵母細(xì)胞和早期胚胎)中存在的所有(包括低豐度)的轉(zhuǎn)錄物。我們開發(fā)了一種新的克隆方法，并解釋了在表達(dá)載體的所有三種讀碼框中成功表達(dá)組織中存在的所有轉(zhuǎn)錄物以得到組織蛋白質(zhì)組文庫的原理。因此，本發(fā)明涉;sjit獲得組織蛋白質(zhì)組文庫新方法的描述，所述文庫it^i^定組織中存在的所有轉(zhuǎn)錄物(mRNA)。組織中存在的目的轉(zhuǎn)錄物分別被常規(guī)克隆并過表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)所表達(dá)蛋白的純化以及進(jìn)行它的結(jié)果-功能研究。鑒定組織中存在的新的和低豐度轉(zhuǎn)錄物的方法尚不存在，特別是對組織樣本、卵母細(xì)胞和早期胚胎，對于它們，組織可獲得性是個(gè)嚴(yán)重限制。表達(dá)組織中的所有轉(zhuǎn)錄物并將總表達(dá)蛋白譜與合適對照進(jìn)行比較可用于鑒定組織中存在的所有轉(zhuǎn)錄物，特別是新轉(zhuǎn)錄物。此新的組織蛋白質(zhì)組文庫構(gòu)建方法能夠在僅僅一次試驗(yàn)中表達(dá)組織中存在的所有轉(zhuǎn)錄物以及利用蛋白質(zhì)組學(xué)和/或其它合適方法對所有表達(dá)蛋白質(zhì)的分析。附圖和附表i兌明圖1顯示所表達(dá)蛋白質(zhì)的pi和質(zhì)量范圍分布。圖2顯示所純化DNA結(jié)合蛋白的特征鐠。圖3顯示4個(gè)所鑒定(SSP.No:1405、1955、6601和7303)DNA結(jié)合蛋白的MALDITOFi普。圖4顯示所研究蛋白其中4個(gè)的ESIMS鐠。表l:25種cDNA(來自NCBI)的數(shù)據(jù)，利用ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器上可用的翻譯和pI/分子量工具進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)包括cDNA中存在的終止密碼子和通過這些分析得到的蛋白質(zhì)/肽質(zhì)量。表2:通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析在所述研究中鑒定的DNA結(jié)合蛋白的lt據(jù)。表3:使用可供利用的序列基序鑒定的蛇卵母細(xì)胞DNA結(jié)務(wù)蛋白以及它們的預(yù)測生理功能。表4:通過PMF分析鑒定的蛋白質(zhì)身份與利用其ESIMS序列標(biāo)簽通過NCBIBLAST鑒定的蛋白質(zhì)身份之間的比較。發(fā)明詳述由上所述，我們認(rèn)為在將組織中存在的cDNA庫克隆i^達(dá)載體的所有三個(gè)框(a、b和c)并且匯集所述克隆之后，可獲得組織蛋白質(zhì)組文庫。在這些文庫表達(dá)之后，會(huì)發(fā)現(xiàn)所述組織中存在的至少大多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)并且所有表達(dá)的蛋白質(zhì)應(yīng)該是生理蛋白質(zhì)。1.從組織構(gòu)建組織蛋白質(zhì)組文庫可以如上所i^組織出發(fā)構(gòu)建組織蛋白質(zhì)組文庫?？梢允褂?，和3，特異性引物從分離自組織的少至10-100納克的總RNA或2-50納克的mRNA庫出發(fā)合成總cDNA?？墒褂?，和3，引物PCR擴(kuò)增所得的cDNA庫，所述引物由連接到5，和3，端的不同且特異性的6堿基(或更多)特異性限制性酶位點(diǎn)(具有已知^艮少在所述基因中存在的序列)組成(類似于常見生物技術(shù)7>司所售的文庫構(gòu)建試劑盒中所提供的)。所述cDNA的5，和3，端可被相應(yīng)的限制性酶進(jìn)行限制性消化，所得cDNA庫可被克隆ii^達(dá)載體的所有三個(gè)框a、b和c。所述栽體的選擇在下文第3節(jié)中有描述。因此，所獲得的質(zhì)?？梢员晦D(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)所克隆轉(zhuǎn)錄物的合適細(xì)菌宿主。另外，早先的CCMB的研究人員開發(fā)出了一種鹽誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(宿主GJ1158，專利號58306卯，1998年11月3日)，其以天然可溶形式表達(dá)大多數(shù)所克隆的轉(zhuǎn)錄物(BhandariandGowrishankar，1997)。此宿主需J^5l僅300mM氯化鈉(便宜)作為過表達(dá)所克隆基因的誘導(dǎo)物。另夕卜，GJ1158過表達(dá)所克隆的轉(zhuǎn)錄物成為通?？扇艿牡鞍踪|(zhì)。因此，上面所獲得的質(zhì)粒庫可通過電穿孔被轉(zhuǎn)化進(jìn)電感受態(tài)GJ1158細(xì)菌，所得克隆培養(yǎng)于不含氯化鈉的LB(LuriaBrothwithoutsodiumchloride,LBON)瓊脂平板上。為獲得文庫中克隆更好的代表性，應(yīng)對所克隆進(jìn)a、b和c的每個(gè)質(zhì)粒庫進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化，每個(gè)表達(dá)框的庫分別進(jìn)行組合。應(yīng)使用質(zhì)粒庫a、b和c在GJ1158和DH5a細(xì)菌中制備文庫，以甘油保存物的形式保存在-80X:，因?yàn)橘|(zhì)粒在表達(dá)宿主中不穩(wěn)定。所述栽體中所克隆cDNA的5，端上存在6xHis標(biāo)簽編碼序列有助于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)N端的6xHis^J^酸標(biāo)簽，其可用于使用NiNTA-瓊脂糖色譜純化文庫表達(dá)的蛋白質(zhì)。2.從現(xiàn)有組織cDNA文庫構(gòu)建組織蛋白質(zhì)文庫的步驟作為替代，甚至可以從現(xiàn)有cDNA文庫出發(fā)構(gòu)建cDNA文庫?？刹捎糜辛己么硇缘腸DNA文庫，4吏用合適限制性酶釋放所有cDNA，并將它們連接i^達(dá)載體的所有三個(gè)讀碼框(a、b和c)，以獲得組織蛋白質(zhì)組文庫。應(yīng)使用在所有三個(gè)讀碼框中表達(dá)克隆cDNA的載體，cDNA應(yīng)被克隆進(jìn)所有三個(gè)框，并組合所述文庫，以獲得組織蛋白質(zhì)組文庫。在下文第3節(jié)中描述載體的選擇。出于此目的，我們必須選擇三種(a、b和c)形式都可獲得的表達(dá)載體，其可在所有三個(gè)框中表達(dá)克隆轉(zhuǎn)錄物。在cDNA文庫中，不同限制性位點(diǎn)應(yīng)存在于所克隆cDNA的5，和3，端。我們還必須尋找兩個(gè)不同的6(或更多)a特異性限制性位點(diǎn)，其存在于所克隆cDNA的5，和3，端之一,相同的位點(diǎn)還必須以5，—3，的方向存在于表達(dá)載體中(所述cDNA將克隆于其中)。如果我們用這些限制性酶中的兩個(gè)消化所述文庫，那么^放所有具有不同且特異性5，和3，端的cDNA。然后，從所述文庫釋放的cDNA可被克隆到所考慮載體的所有三個(gè)形式(a、b和c)中，然后將所述文庫加以組合以得到組織蛋白質(zhì)組文庫。因?yàn)槭褂?(或更多)堿基限制性酶位點(diǎn)(假定僅使用6堿基限制性酶)，相同6磁J^序列應(yīng)該在所述轉(zhuǎn)錄物中每46(4x4x4x4x4x4=4096)個(gè)核苷酸里僅出現(xiàn)一次。組織中存在的大量蛋白質(zhì)應(yīng)該在10-100kDa之間，其^10-15%2DPAGE中可被良好解析。"i^酸的平均質(zhì)量為115Da,這些蛋白質(zhì)應(yīng)具有最大870個(gè)氨基酸。因此它們的cDNA—般應(yīng)不大于2.61kb。6堿基限制性酶位點(diǎn)在cDNA中的出現(xiàn)頻率在4096個(gè)核普酸中僅僅為一次，所以cDNA發(fā)生內(nèi)部截?cái)嗟臋C(jī)會(huì)將相當(dāng)?shù)?。因此，可從良好代表的組織cDNA文庫得到"兩個(gè)6(或更多)堿基限制性酶消化的"cDNA庫，可將所述轉(zhuǎn)錄物克隆進(jìn)所有表達(dá)栽體框的相同限制性位點(diǎn)，以得到組織蛋白質(zhì)組文庫。3a.用于克隆自現(xiàn)有cDNA文庫釋放的cDNA之栽體的選擇，以及自組織開始PCR擴(kuò)增cDNA的替代方法的選擇為了克隆自上述步驟1和2獲得的cDNA,可使用任何表達(dá)載體組，其(a)在多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite,MCS)的5，端含有融合蛋白質(zhì)標(biāo)簽，和(b)在文庫誘導(dǎo)后以三種讀碼框表達(dá)所克隆cDNA的三種形式都可獲得。在生物技術(shù)市場上有數(shù)種商品載體可獲得。一個(gè)例子是pET28。但是并非必需在pET28的所有三個(gè)框中克隆cDNA，也不限于用此載體構(gòu)建組織蛋白質(zhì)組文庫。PCR擴(kuò)增自組織獲得的cDNA可以兩條不同的方式進(jìn)行。一般地，在PCR擴(kuò)增方案中，可使用5'和3，特異性引物，所回收的cDNA可被克隆到以所有三種表達(dá)框表達(dá)克隆轉(zhuǎn)錄物的三種表達(dá)栽體中。作為替代，可利用使得cDNA轉(zhuǎn)錄物在5'端偏移一個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)核苷酸的三個(gè)5，特異性引物，以使得自所有PCR反應(yīng)獲得的組合cDNA庫可被克隆進(jìn)任一表達(dá)載體中，并且在5，端具有融合蛋白標(biāo)簽，從而所克隆的轉(zhuǎn)錄物可自動(dòng)以所有三個(gè)讀碼框進(jìn)行表達(dá)。3b.上述組織蛋白質(zhì)組文庫構(gòu)建過程中可能產(chǎn)生的問題之一些解釋和解答在大部分使用所述可用方法構(gòu)建的文庫中；cDNA在3，端是完整的，而它們中許多在5，端是不完整的。因此，通過利用這些方法，我們將僅僅克隆所述cDNA的編碼區(qū)到所述載體的MCS中，因?yàn)閏DNA的5，非翻譯區(qū)通常不被克隆。因此cDNA的5，非翻譯區(qū)既不被克隆也不被表達(dá)，造成了蛋白表達(dá)框的不確定性。另外，仍然可以通過用于蛋白質(zhì)鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)成功地分析在表達(dá)這些cDNA后產(chǎn)生的N端截?cái)嗟鞍?。在宣稱合成完整cDNA5，端的一些方法中，cDNA的5，非翻譯區(qū)仍沒有擴(kuò)增超it^始密碼子ATG上游10-20個(gè)核苷酸。對數(shù)十個(gè)cDNA的5，非翻譯區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，即使高達(dá)30個(gè)核普酸，這些區(qū)域通常也不帶有終止密碼子。因此，即使合成了5，非翻譯區(qū)的10-20個(gè)核普酸，將其克隆進(jìn)載體的MCS并表達(dá)，這些表達(dá)的蛋白質(zhì)既不會(huì)出現(xiàn)由于終止密碼子的截?cái)?，也不?huì)阻礙基于蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白質(zhì)鑒定。在所述載體中克隆并表達(dá)的cDNA通常產(chǎn)生約30個(gè)氨基酸的肽，其包括融合肽標(biāo)簽(扭8-標(biāo)簽^81-標(biāo)簽/凝血酶)，其也不會(huì)給基于蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白質(zhì)鑒定造成任何問題。盡管在im框中表達(dá)的肽和截?cái)嗟鞍踪|(zhì)的預(yù)期質(zhì)量只有約2.3kDa(參見前文所述的獲得組織蛋白質(zhì)組文庫的理論_基礎(chǔ))，但我們固定了10kDa的值以消除以任何可能性產(chǎn)生的這些4m框表達(dá)的蛋白質(zhì)，見上文所述。因此，此方法仍是有效的，并形成了大,蛋白質(zhì)表達(dá)和鑒定的有^Ki方案。4.組織蛋白質(zhì)組文庫的it^達(dá)和蛋白質(zhì)純化這些方案必需基于用于構(gòu)建cDNA文庫的載體進(jìn)行設(shè)計(jì)。但是，這里給出的是利用GJ1158細(xì)菌(對此上文已有過描述)的組織蛋白質(zhì)組文庫的過表達(dá)。GJ1158細(xì)菌中所述文庫(a、b和c)的甘油保存物可一起接種于含卡那霉素的LBON，使其在371C下以100rpm的恒定速率搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。第二天細(xì)菌用含卡那霉素LBON以1:100稀釋進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至培養(yǎng)物的600納米光密度達(dá)到0.6-0.8之間。培養(yǎng)物應(yīng)用300mM氯化誘導(dǎo)3小時(shí)，在此期間蛋白質(zhì)表達(dá)到達(dá)穩(wěn)定水平，轉(zhuǎn)移到41C并保存一個(gè)小時(shí)以使細(xì)胞分裂停滯。在4匸以5000xg離心IO分鐘；回收細(xì)菌沉淀并在-80"C保存，直至用于蛋白純化。細(xì)菌應(yīng)均勻懸浮于pH8.0含8M尿素的100mM磷酸鈉緩沖液中(5毫升緩沖^/克濕重細(xì)菌)，室溫下通過溫和渦旋攪拌細(xì)胞60分鐘。在室溫下以100000xg離心混懸液30分鐘，回收澄清裂解液。利用標(biāo)準(zhǔn)方案(QIAexpressionist用戶手冊，2001)通過NiNTA-瓊脂糖柱對澄清裂解液進(jìn)行色鐠分離，以純化帶6x扭s標(biāo)簽的總蛋白。通it^t含10mMEDTA、3mM苯甲脒以及各1mM的PMSF、亮抑酶肽(leupeptin)和抑肽酶(aprotinin)的milliQ水進(jìn)行徹底透析使純化的蛋白脫鹽，以防止可能的蛋白7jC解，由于處于變性條件下，大部分蛋白質(zhì)將會(huì)沉淀，然后凍干所述蛋白質(zhì)懸液。5.純化組織總蛋白可利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Vaibhavetal.，2005)純化組織中存在的總蛋白，這種方法用于組織蛋白質(zhì)庫的2DPAGE分析。6.從組織蛋白質(zhì)組文庫和組織中所純化蛋白質(zhì)的電泳才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(Joubert-Caronetal.,1999)，將通過上述NiNTA-瓊脂糖柱純化并凍干的蛋白質(zhì)溶解于等電聚焦電泳(iso-electr叩horesis，IEF)的樣品緩沖液中并進(jìn)行IEF和2DPAGE。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物也應(yīng)在旁邊泳道進(jìn)行電泳。也可在相同IEF和2DPAGE膠中對分離的組織總蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳。7.比較所表達(dá)的蛋白質(zhì)組文庫和組織純化的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)組學(xué)分析成功的比較很大程度上依賴于在文庫構(gòu)建中所使用的方法和文庫中全長/截?cái)郼DNA的代表性。組織含有許多蛋白質(zhì)及其所有mRNA。或許因?yàn)槲覀兛寺〗M織總cDNA并全部表達(dá)它們，所以來自所述組織的純化蛋白質(zhì)和文庫表達(dá)蛋白質(zhì)的2DPAGE模式預(yù)期是相似的。但是，相比于組織蛋白質(zhì)鐠，在文庫表達(dá)蛋白質(zhì)的2DPAGE特征鐠中少數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)可能朝較低質(zhì)量水平偏移，這是由于所選限制性位點(diǎn)序列存在于這些轉(zhuǎn)錄物的中間，在cDNA消化過程中這些轉(zhuǎn)錄物發(fā)生截?cái)嗖⒖寺〉剿鲚d體中。由加和pl改變，所以文庫表達(dá)蛋白質(zhì)也可能從它們在組織蛋白質(zhì)的2DPAGE上的位置朝邊上偏移?？梢詮奈膸毂磉_(dá)的蛋白膠上分離蛋白質(zhì)點(diǎn)，使用胰酶進(jìn)行膠內(nèi)消化，提取肽并通過MALDITOF4吏用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行分析(Mannetal.,2001)。盡管組織蛋白質(zhì)組文庫中表達(dá)的和組織蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)點(diǎn)之間的一般性比^A可能的，但是無法期待這兩個(gè)圖樣之間的一對一比較。然而，構(gòu)建自患疾病個(gè)體組織的組織蛋白質(zhì)組文庫中表達(dá)的蛋白質(zhì)諉圖與正常個(gè)體之間的比較是可能的，其在醫(yī)學(xué)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
具有誘人且現(xiàn)成的應(yīng)用。8.可對所述方法造成限制和降低效率的參數(shù)組織中存在的各個(gè)mRNA的水平一般認(rèn)為依賴于它們自身以及它們蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)速率。但是，可存在以下mRNA，其可與所述組織中存在的蛋白質(zhì)因子相結(jié)合并由于多種未知原因保持不翻譯。因此，組織中存在的各個(gè)蛋白質(zhì)相對比例是否是相同組織中存在的它們對應(yīng)mRNA的真實(shí)比例是未知的。因此，此方法僅僅有助于以翻譯蛋白質(zhì)的方式找出所述組織中存在的所有mRNA。盡管許多mRNA及其對應(yīng)蛋白質(zhì)存在于組織中，但是需要獨(dú)立的研究組織中存在的所鑒定蛋白質(zhì)的具體mRNA是否確實(shí)在組織中被翻譯。下述一些因素是此才支術(shù)的一些決定性因素，例如(a)代表組織mRNA庫的cDNA的忠實(shí)性/成比例合成，(b)cDNA連接ii4達(dá)栽體的效率，(c)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)菌的效率，(d)產(chǎn)生穩(wěn)定水平蛋白質(zhì)表達(dá)所需的文庫誘導(dǎo)時(shí)間，以及(e)細(xì)菌中/翻譯自文庫中克隆的蛋白酶的合成，其可造成it^達(dá)蛋白質(zhì)的降解。在蛋白質(zhì)純化的一些關(guān)鍵步驟中，蛋白質(zhì)降解可造成整個(gè)過程的限制，特別是當(dāng)一些克隆的和it^達(dá)的cDNA是未知的強(qiáng)力蛋白酶時(shí)。這些限制中的大部分或者與文庫構(gòu)建過程的通常限制有關(guān)和/或依賴于所具體使用的組織類型。因此，這些必須針對每種組織標(biāo)準(zhǔn)化，不能被描述為一般性預(yù)防措施。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了獲得組織蛋白質(zhì)組文庫的方法，其包括如下步驟a.v^U且織中分離總RNA和mRNA，b.從步驟a獲得的mRNA合成總cDNA庫，c.使用引物(含特異性限制性酶位點(diǎn))擴(kuò)增回收自步驟b的cDNA，以將這些位點(diǎn)并入所擴(kuò)增的cDNA中，d.使用特定限制性酶消化步驟c中獲得的PCR擴(kuò)增cDNA，e.將步驟d中獲得的消化cDNA克隆*達(dá)載體的所有三個(gè)5，—3，方向讀碼框中，f.將步驟e中獲得的質(zhì)粒庫通過電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌，培養(yǎng)所述細(xì)菌并誘導(dǎo)所述文庫進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，g.從步驟f中獲得的細(xì)菌中分離所表達(dá)的蛋白質(zhì)，h.分析步驟g中獲得的總蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述限制性酶是II型限制性敏如Rsal、Sfil、Sgfl、Pmel、Notl等)，其由5(或更多)>5^限制性酶組成，切割后產(chǎn)生粘性末端。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，總cDNA文庫定向克隆進(jìn)表達(dá)載體一個(gè)或所有3個(gè)可能的表達(dá)框中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，it^達(dá)所述文庫以產(chǎn)生總蛋白質(zhì)文庫。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述cDNA庫來源于任何生物材料，例如病毒、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物組織、臨床組織樣品、組織培養(yǎng)細(xì)胞、卵母細(xì)胞、受精卵、胚胎和純化的細(xì)胞器、組織或整個(gè)生物體。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，將自組織mRNA庫逆轉(zhuǎn)錄或自現(xiàn)有文庫釋放的標(biāo)準(zhǔn)化cDNA庫克隆進(jìn)任一表達(dá)載體或一組表達(dá)栽體的一個(gè)或所有三個(gè)讀碼框中。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體中的cDNA庫的克隆/表達(dá)與蛋白酶抑制劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑共克隆和或共表達(dá)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，制備組織蛋白質(zhì)組文庫，其中它可用于產(chǎn)生"真實(shí)"表達(dá)蛋白質(zhì)的代表性文庫以及it^達(dá)給定組織中存在的大量轉(zhuǎn)錄物(mRNA)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫可用于過量產(chǎn)生、電泳分離和蛋白質(zhì)組分析/鑒定以mRNA存在于組織中的所有蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫可用于鑒定新蛋白質(zhì)，即4吏cDNA的截?cái)喈a(chǎn)物被克隆和表達(dá)，或者在從細(xì)菌中純化蛋白質(zhì)的過程中產(chǎn)生部分降解的10-100kDa的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫可用于鑒定組織中存在的低豐度的和新的蛋白質(zhì)/轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，從構(gòu)建的或市售的或預(yù)先制備的cDNA文庫用5或更多核苷酸限制性酶限制性消化cDNA。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫可用于產(chǎn)生生物分子庫，如mRNA/cDNA/蛋白質(zhì)/肽，以用于研究或如工業(yè)、治療、生物醫(yī)學(xué)、健勤目關(guān)、生物技術(shù)、食品技術(shù)和化妝品等其它目的，包括其研究和或應(yīng)用。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，其中這些文庫可用于分析組織總細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)，其選自表達(dá)和或分離/鑒定所有表達(dá)蛋白質(zhì)或其任意亞組，所述亞組如膜蛋白、DNA結(jié)合蛋白、脂蛋白、核蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、信號蛋白、核糖體蛋白、線粒體蛋白或任意其它蛋白質(zhì)亞組；在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫用于通過以下方法對所表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析色鐠法、1D或2D聚丙烯跣胺^電泳(PAGE)、等電聚焦電泳(IEF)、高效^M目色鐠(HPLC)、基質(zhì)輔助激光解吸-電離飛行時(shí)間(MALDITOF)、電噴霧電離質(zhì)鐠(ElectroSprayIonizationMassSpectrometry,ESIMS)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫可用于鑒定在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)的具有至少10kDa分子量的蛋白質(zhì)。以舉例說明本發(fā)明的方式給出下述實(shí)施例，其提供了獲得組織蛋白質(zhì)組文庫的基礎(chǔ)和方法，因此它們不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1從NCBI數(shù)據(jù)庫收集數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA，使用ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器上可用的mRNA/DNA—蛋白質(zhì)翻譯工具以所有5，—3'方向讀碼框翻譯它們；25個(gè)mRNA的數(shù)據(jù)、其中發(fā)現(xiàn)的終止密碼子以及計(jì)算的蛋白質(zhì)/肽質(zhì)量總結(jié)于表l中。我們收集了100個(gè)數(shù)據(jù)庫報(bào)道蛋白質(zhì)(大小范圍從10至100kDa)的mRNA序列，使用ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器上可用的翻譯工具將它們在所有三個(gè)5，—3，方向讀碼框中翻譯，我們觀察到只有一個(gè)框得到全長蛋白質(zhì)。另外，在其余兩個(gè)im讀碼框中終止密碼子以平均16至24個(gè)氨基酸的頻率出現(xiàn)。這意味著這些錯(cuò)誤的表達(dá)載體讀碼框中cDNA的克隆和表達(dá)產(chǎn)生大小范圍在16-24個(gè)^J^酸之間或1.84-2.76kDa之間的截?cái)嚯摹＿@完全與上文所述的"通過克隆組織cDNA庫到表達(dá)載體的所有三個(gè)讀碼框中，獲得所述組織蛋白質(zhì)組文庫的理論基礎(chǔ)"相一致。當(dāng)cDNA克隆于錯(cuò)誤的表達(dá)載體讀碼框中并^達(dá)蛋白時(shí)，會(huì)產(chǎn)生直至第一個(gè)終止密碼子的多肽然后終止翻譯。因?yàn)樵陔S機(jī)克隆和表達(dá)的cDNA文庫中產(chǎn)生的不想要的假設(shè)(非天然)蛋白和肽是獲得組織蛋白質(zhì)組文庫中的主要瓶頸，所以我們決定分析一組收集自NCBI的mRNA(預(yù)期產(chǎn)生質(zhì)量范圍在10-100kDa的蛋白質(zhì))，以得到在餘溪的表達(dá)讀碼框中克隆和表達(dá)后可由它們產(chǎn)生的所有肽。關(guān)于由所述cDNA產(chǎn)生的第一個(gè)多肽之質(zhì)量的信息對評估這些im框克隆的cDNA在這些條件下是否產(chǎn)生假設(shè)蛋白質(zhì)/肽是必要且充分的。但是，為了獲得有關(guān)質(zhì)量值〉10kDa的多肽的數(shù)量以及克隆于表達(dá)載體錯(cuò)誤讀碼框中轉(zhuǎn)錄物所產(chǎn)生的最大多肽的質(zhì)量之信息，我們也計(jì)算了來自一組mRNA的此信息并在表l中給出。有時(shí)組織蛋白質(zhì)組文庫中克隆的轉(zhuǎn)錄物可只具有部分(5，截?cái)嗟?cDNA。相比全長cDNA所產(chǎn)生的多肽，它們會(huì)產(chǎn)生不同組的翻譯終止多肽(由于克隆和表達(dá)cDNA的M框中間的終止密碼子)。因?yàn)槲覀儗⑺?gt;10kDa的多肽(參見第5頁第2段有關(guān)為何固定于此的解釋)作為人為切斷值，這將驗(yàn)證在所述組織蛋白質(zhì)組文庫中，錯(cuò)誤表達(dá)載體讀碼框中全長和5，截?cái)郼DNA的克隆和表達(dá)。在上述25個(gè)mRNA中發(fā)現(xiàn)的在#^讀碼框中翻譯的質(zhì)量值>10kDa的全部肽中，在因終止密碼子形成的總共1021個(gè)肽中有24個(gè)，算出其相對豐度僅為2.35%,而每個(gè)蛋白質(zhì)的平均肽數(shù)目約為20[1021/(2x25)=20。因此，這些肽可以以五個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)的幾率出現(xiàn)，并且這些肽出現(xiàn)在翻譯cDNA開始時(shí)的可能應(yīng)該非常低。因?yàn)樵?^框表達(dá)cDNA"中的蛋白質(zhì)合成在第一個(gè)終止密碼子處終止，所以合成質(zhì)量值>10kDa的截?cái)嚯牡目赡軙?huì)非常低。另外，因?yàn)閹讉€(gè)物種如大腸桿菌小鼠(J/"s附mscw/ms)、人(好(o附os"http://ews)、果繩(Z)msc^/i,7fle)、線蟲(Cle/"fl/ice)的基因組測序已經(jīng)完成并且它們的基因/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫可用，即使在總文庫表達(dá)后產(chǎn)生少量這樣的肽，它們也可作為來自這些物種的假設(shè)蛋白被檢測到。由上所述，從不正確(錯(cuò)誤)表達(dá)讀碼框中克隆的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的極少數(shù)大肽不會(huì)成為獲得和表達(dá)組織蛋白質(zhì)組文庫的限制/障礙。我們分析了回收自NCBI數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)的100個(gè)mRNA;但是，我們僅給出了來自25個(gè)mRNA(表1)的數(shù)據(jù)，因?yàn)檫@些數(shù)據(jù)與來自所有100個(gè)mRNA的總數(shù)據(jù)相一致。表l:實(shí)施例1支持的數(shù)據(jù)數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)cDNA收集自NCBI數(shù)據(jù)庫，使用ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器上可用的DNA—蛋白質(zhì)翻譯工具以所有5，—3，方向讀碼框翻譯它們。25個(gè)cDNA的數(shù)據(jù)、其中發(fā)現(xiàn)的終止密碼子以及計(jì)算的蛋白質(zhì)/肽質(zhì)量總結(jié)于表l中在表1所示數(shù)據(jù)中，連續(xù)多個(gè)終止密碼子被認(rèn)為是單個(gè)終止密碼子。相同數(shù)目的終止密碼子和肽提示在讀碼框序列開始處存在終止密碼子。表1中給出的第一個(gè)肽和最大肽的質(zhì)量相同表示所述第一個(gè)就是最大肽。僅僅為了提供更多機(jī)會(huì)出現(xiàn)較大的肽以及它們在錯(cuò)誤表達(dá)框轉(zhuǎn)錄物中的頻率，當(dāng)在cDNA起始處有終止密碼子時(shí)我們考慮下一個(gè)緊接著的肽。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例2采用來自上文"實(shí)施例1"的線索，我們進(jìn)行了有趣的實(shí)驗(yàn)；使用下文"實(shí)施例3"中所述的"材料和方法"，我們合成了來自純化的蛇卵母細(xì)胞mRNA的總cDNA，將所回收的cDNA庫克隆進(jìn)pT7T3D定向克隆栽體。我們通過電穿孔將質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)化進(jìn)鹽誘導(dǎo)型GJ1158細(xì)菌并表達(dá)總轉(zhuǎn)錄物文庫。約33。/。所克隆的cDNA將處于正確的表達(dá)載體讀碼框中，會(huì)產(chǎn)生真實(shí)蛋白質(zhì)，而其它克隆在4m讀碼框中的cDNA會(huì)產(chǎn)生截?cái)嚯?。如^達(dá)之后細(xì)菌能夠從這樣的文庫產(chǎn)生總蛋白質(zhì)文庫，我們預(yù)期所表達(dá)的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pl)和質(zhì)量(kDa)范圍應(yīng)類似于細(xì)菌蛋白質(zhì)。在12%2DPAGE上進(jìn)行了對"未誘導(dǎo)"和"誘導(dǎo)"文庫總蛋白質(zhì)的分析(圖1A和1B)，并比較蛋白質(zhì)譜。圖1中"誘導(dǎo)"和"未誘導(dǎo)"中蛋白質(zhì)點(diǎn)模式的比較清楚表明，所表達(dá)蛋白質(zhì)在pl和質(zhì)量范圍內(nèi)的分布(在2D蛋白質(zhì)模式中由紫色團(tuán)表示)與其余(大腸桿菌)蛋白質(zhì)非常好地匹配。這清楚地證明了當(dāng)克隆于表達(dá)栽體中并一起進(jìn)ei秀導(dǎo)時(shí)，細(xì)菌能夠表達(dá)蛋白質(zhì)文庫。另外細(xì)菌不顯示出區(qū)分它們自身的和所克隆的轉(zhuǎn)錄物蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)表達(dá)上不表現(xiàn)出尺寸偏好。但是，我們非常明白，我們的文庫僅將三分之一的克隆和表達(dá)于所述文庫正確讀碼表達(dá)框的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)成為全長蛋白質(zhì)，從上述結(jié)果出發(fā)，我們預(yù)測總cDNA文庫能夠以所有三種可能的表達(dá)栽體框定向克隆ii4達(dá)栽體，并且可it^達(dá)這些文庫以產(chǎn)生總蛋白質(zhì)文庫，我們稱之為"組織蛋白質(zhì)組文庫"。當(dāng)我們克隆和表達(dá)單個(gè)cDNA到正確的表達(dá)載體框中并且在這樣的凝膠中解析200微克的誘導(dǎo)總蛋白質(zhì)時(shí)，預(yù)期得到表達(dá)自所克隆cDNA的大量單蛋白質(zhì)點(diǎn)，其數(shù)量約為在所述凝膠中所解析的總蛋白質(zhì)的30-40%。但是，當(dāng)克隆和表達(dá)cDNA文庫并解析200微克蛋白質(zhì)時(shí)，僅有約10-13%(三分之一)在正確框中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)以多蛋白質(zhì)點(diǎn)的形式出現(xiàn)，而剩余20-27%的^:框表達(dá)蛋白質(zhì)以肽結(jié)束并且由于它們質(zhì)量小而跑出了所i^。在"未誘導(dǎo)"和"誘導(dǎo)"膠中存在少數(shù)強(qiáng)度相同的主M白質(zhì)點(diǎn)(圖l),這與我們在這些凝膠中解析相同量的蛋白質(zhì)是一致的。這清楚的證明了細(xì)菌能夠表達(dá)cDNA文庫，蛇卵母細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫能夠表ii^正確表達(dá)框中克隆的全范圍的蛋白質(zhì)。表2通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)列1:序列號；2:依次為SSP號、pl和蛋白質(zhì)質(zhì)量(kDa);3:依次為所用搜索工具、蛋白質(zhì)/EstdZ得分；4:依次是蛋白質(zhì)、pl和質(zhì)量(kDa)、物種和基因身份；以及列5:序列和肽的匹配率％。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注釋0:有關(guān)來自Mascot最佳得分的蛋白質(zhì)質(zhì)量、pi和物種的線索用于Profound#:有關(guān)來自Mascot最佳得分的蛋白質(zhì)質(zhì)量和pi的線索用于Profound①有關(guān)來自Mascot最佳得分的物種的線索用于Profound(*):表示蛋白質(zhì)/EstdZ得分s^t低于"顯著得分水平"實(shí)施例3在細(xì)菌能夠表達(dá)蛋白質(zhì)文庫的上述發(fā)現(xiàn)的鼓勵(lì)下，我們嘗試并成功地使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫表達(dá)的蛋白質(zhì)中解析一組稀有且低豐度蛋白質(zhì)(DNA結(jié)合蛋白)然后用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對它們進(jìn)行表征。我們預(yù)期此實(shí)踐應(yīng)構(gòu)成成功開發(fā)"組織蛋白質(zhì)組文庫"的證據(jù)和M。在蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫中表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白僅僅構(gòu)成所述組織蛋白質(zhì)的一小部分。因?yàn)檫@些是低豐度蛋白質(zhì)，我們肯定需要大量的組織表達(dá)蛋白質(zhì)。我們培養(yǎng)了卯升每批10升的細(xì)菌培養(yǎng)物，誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物以在合適的培養(yǎng)物生長水平(光密度)上進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。收獲細(xì)菌，在存在蛋白酶抑制劑的適當(dāng)天然(native)緩沖液4H^下勻漿，收集可溶性蛋白。不溶性蛋白溶解于變性溶劑中，重折疊并以可溶性形式幾乎定量回收4^P總蛋白。將總可溶性蛋白通過蛇DNA-Sepharose柱進(jìn)行色鐠分離，以分離DNA結(jié)合蛋白。我們在12。/o2DPAGE上解析回收的DNA結(jié)合蛋白，將蛋白點(diǎn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析以鑒定蛋白質(zhì)。有意思的是，我們回收到幾種蛇DNA結(jié)合蛋白。另外，所分離的DNA結(jié)合蛋白占450毫克總文庫蛋白質(zhì)中的1.80亳克，經(jīng)計(jì)算即總文庫蛋白質(zhì)的0.40%。所回收的DNA結(jié)合蛋白的量與從組織蛋白質(zhì)中預(yù)期回收DNA結(jié)合蛋白相一致。下文給出了在我們關(guān)于使用所述蛋白質(zhì)組學(xué)方法克隆蛇卵母細(xì)胞總cDNA庫、&達(dá)總蛋白質(zhì)文庫、純化所述DNA結(jié)合蛋白以及對它們的鑒定之研究中所使用的方法以及獲得的結(jié)果。表3使用可用序列基序鑒定的蛇卵母細(xì)胞DNA結(jié)合蛋白及其預(yù)測生理功能Sl,No,SSPNo,蛋白質(zhì)、基因和所鑒定蛋白質(zhì)的物種與其它已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域相似性根據(jù)可用結(jié)構(gòu)域預(yù)測的功能1-1304未命名蛋白產(chǎn)物，黑青斑河豚gi|47219343免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；酪氨酸激酶，催化結(jié)構(gòu)域ft絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，催化結(jié)構(gòu)域信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；轉(zhuǎn)錄，DNA復(fù)制，重組，和修復(fù)2.1305305核糖休蛋白36，福氏志賀苗28抹-30[S陶e'/afl欲加ri浙307別24054885核糖體S6;RpsF;翻譯；核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生信號傳導(dǎo)組氨酸激嗥，膠狀紅環(huán)菌PM";訓(xùn)47573640PAS;His激酶A;HATP酶c;轉(zhuǎn)錄/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和分泌3.1405ARF1的另一個(gè)伴估蛋白，小鼠gi|1B204847鋅指結(jié)構(gòu)域；推定轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，調(diào)控G2/M轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)錄/細(xì)胞分裂和染色體分配4.1701轉(zhuǎn)^醇酶B的結(jié)構(gòu)B鏈，大腸桿苗Azoarct/s鄰.Hi/Vfl:gi|56478047轉(zhuǎn)搭醇酵TalB非氧化性(戊糖磷酸途徑)糖代謝_假設(shè)蛋白，固氮弧菌屬ebA4606;'[^2oa廠ct;ssp,ab/V化gil56478047古生菌ATP酶；Holliday交叉resolvasome，解旋酵亞基DNA復(fù)制，重組和修復(fù)5.1955vi靈i蛋白，光滑爪錄rXe。oous/柳fel別36303787中間絲蛋白，其由中間絲頭(DNA結(jié)合)和中間絲結(jié)構(gòu)域組成染色體分離ATP酶，其參與細(xì)胞分裂和染色體分配LOC496727蛋白，熱帶爪蟾序列同別567890606.2203預(yù)測的類似于HNRPC蛋白，人/"/omosap/加sl:gi|51468879RRM;RNA識別基序核內(nèi)前mRNA加工7.2302CAA303719.1蛋白，水稻fO/yza幼闊別5777631Tub家族蛋白未知8，3205DNA結(jié)合蛋白H-NS;DNA結(jié)合_<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在構(gòu)建蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫、表#從文庫表達(dá)蛋白分離DNA結(jié)合蛋白中所使用的方法材料電泳化學(xué)品-丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、考馬斯藍(lán)R-250、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇和試劑如trizol、尿素、鹽脧胍和SDS獲得自SigmaChemicalCompany,St.Louis,MO，(USA)。蛋白酶抑制劑-PMSF、亮抑酶肽、苯曱脒和抑肽酶購自BoehringerMannheim,Germany。CNBr-活4t的Sepharose、TimeSavercDNA合成試劑盒、定向克隆工具盒和PT7T3D克隆載體購自PharmaciaBiotech(Sweden)。即用型等電聚焦電泳膠條購自BIO-RADLaboratories(USA)。Dyna珠mRNA純化試劑盒購自Dynal，USA。其它分析級試劑購自本地供應(yīng)侖，Qualigens，E.Merck和BDH。方法a.收集蛇卵母細(xì)胞卵母細(xì)胞收集自處于繁殖期的滑鼠蛇(i^fls挑"c仍iw)，速凍在液氮中，保存于-8ox:待用。b.構(gòu)建蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫按照Trizol提取方法(ChomczynskiandSacchi，1987)自蛇卵母細(xì)胞中分離總RNA。簡言之，在10毫升含0.2毫升/毫升氯仿的市售Trizol試劑中勻漿1克卵母細(xì)胞組織。氯仿有效地變性蛋白質(zhì)并產(chǎn)生無蛋白質(zhì)污染的RNA。使用異丙醇(0.5毫升/毫升)將RNA從水相中沉淀出來，通過反復(fù)用70%乙醇洗使其脫鹽。使用Dyna珠mRNA純化系統(tǒng)將多聚腺苷酸化(poly-A)RNA(mRNA)從總RNA中純化出來。使用Time-savercDNA合k試劑盒將poly-ARNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，將純化的由0.5-4.5kb大小組成的cDNA片段連接進(jìn)PT7T3D噬菌粒定向克隆栽體的五co及/和A^/限制性位點(diǎn)之間，其按照使用說明書進(jìn)行。將所得重組噬菌粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)GJ1158,—種鹽誘導(dǎo)型大腸桿菌菌抹(BhandariandGowrishankar，1997)。分離的mRNA是完好的，cDNA合成得到0.5-4.5kb之間的轉(zhuǎn)錄物，其預(yù)期產(chǎn)生寬范圍分子量的蛋白質(zhì)。c.誘導(dǎo)蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫將所述文庫的甘油保存物和對照GJ1158細(xì)菌接種到含氨節(jié)青霉素的LBON(LuriaBroth,不含NaCl)培養(yǎng)基中，使之在37X:下以100rpm恒定轉(zhuǎn)速搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。第二天，細(xì)菌在含氨千青霉素的LBON中1:100稀釋進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至培養(yǎng)物的600納米光密度(opticaldensity,OD)達(dá)到約0.6-0.8之間(BhandariandGowrishankar，1997)。培養(yǎng)物應(yīng)用300mM氯化鈉資導(dǎo)3小時(shí)，未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物也在相同條件下培養(yǎng)3小時(shí)。將所述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到4C并保存一個(gè)小時(shí)以使細(xì)胞分裂停滯。然后，在4r以5000xg離心10分鐘；回收細(xì)菌沉淀并在-80"C^^，直至用于蛋白純化。d.從細(xì)菌沉淀^^取蛋白質(zhì)將來自2升培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀(12克)均勻懸浮于40毫升的含0.1%TritonX-IOO、100微克/毫升溶菌酶、3mM苯甲脒和各1mM的EDTA、PMSF、抑肽酶和亮抑酶肽的50mMTris-HCl，pH8.0中，在室溫孵育一小時(shí)。所述懸液在41C劇烈超聲以裂解細(xì)菌、剪切細(xì)菌DNA并降低溶液粘度，通過在4C以10000xg離心30分鐘回收蛋白質(zhì)。通過以下步驟使沉淀經(jīng)受蛋白復(fù)性(Andersonetal.，1999):溶解于20毫升含8M鹽酸胍+lmMDTT的50mM的Tris-HCl，pH8.0，然后對含5mM半胱氨酸、15mM胱氨酸和2M尿素的50mMTris-HCl(pH8.0)透析12小時(shí)，之后用除了不含尿素之外相同的介質(zhì)透析4小時(shí)。如上所述離心透析的蛋白質(zhì)，不溶蛋白經(jīng)受多于一輪的復(fù)性過程。復(fù)性蛋白的上清與早先收集的可溶蛋白質(zhì)合并，通過蛇DNA-Sepharose進(jìn)行色譜。e.DNA-Sepharose親和介質(zhì)的制備使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備DNA-Sepharose，其按照4吏用方案將丑iVi/7消化的雌蛇(戶0^sw"owiw)基因組DNA偶聯(lián)到CNBr活化的Sepharose(Pharmacia)。使用標(biāo)準(zhǔn)方案(KodanagaandTjian，1986)從雌蛇的腎或肝分離高分子量基因組DNA，每亳升Sepharose使用100微克DNA用于偶聯(lián)。f.DNA結(jié)合蛋白的親和純化從2升細(xì)菌培養(yǎng)物中提取并匯集的總蛋白質(zhì)通過25亳升蛇DNA-Sepharose柱進(jìn)行色譜分離。未結(jié)合蛋白質(zhì)循環(huán)通過柱2-3次以提供較大的機(jī)會(huì)結(jié)合蛇蛋白質(zhì)并增加所述結(jié)合蛋白質(zhì)的回收。用50倍柱體積的含lmMEDTA、1mMDTT和100mMNaCl的50mMTris-HCl(pH8.0)溶液將+^t結(jié)合的蛋白質(zhì)從所i^上洗脫下來，然后通過再用50倍柱體積的除了用300mMNaCl代替100mM之外其余相同的緩沖液洗所i^a。用含1MNaCl的相同緩沖液將DNA結(jié)合蛋白a上洗脫下來。用通過10-kDa截?cái)喾肿恿恐的さ腁micon濾器過濾濃縮所洗脫的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行更換數(shù)次的每次100倍體積的透析，其中使用含3mM苯甲脒和各1mM的PMSF、EDTA、抑肽酶和亮抑酶肽的50mM的Tris-HCl(pH8.0)。使用Speed-vac濃縮器濃縮所透析的蛋白質(zhì)，并溶解于相同樣品緩沖液中以進(jìn)行IEF。g.1D和2DPAGE、^i^成像和圖像分析在12.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠中使用標(biāo)準(zhǔn)方案(Laemmli，1970)進(jìn)行一維SDSPAGE。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)記物也在鄰近泳道進(jìn)行電泳，以評估所解析蛋白質(zhì)的分子量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(Joubert-Cartonetal"1999&0，F(xiàn)arrell，1975)進(jìn)行2DPAGE。第一維是IEF，在IPG-膠條(11厘米，pH5-8)上進(jìn)行，其得自BIO-RAD。我們利用這些IPG膠條，因?yàn)樗鼈冊诔醪降?DPAGE實(shí)驗(yàn)中提供了所分離DNA結(jié)合蛋白令人滿意的解析度。第二維，SDSPAGE由12%聚丙烯酰胺分離膠和5。/。的間隔膠(spacergel)組成，在標(biāo)準(zhǔn)BIO-RAD電泳裝置中進(jìn)行。純化的DNA結(jié)合蛋白溶解于IEF樣品緩沖液[40mMTris，pH:10，7M尿素，2M硫脲，和l。/。C7BzO(3-(4-庚基)-苯基-3-羥基-丙基-二甲基銨-丙磺酸鹽}中，Bradford反應(yīng)后進(jìn)行分光光度法估計(jì)。用預(yù)先與200微克DNA結(jié)合蛋白相混合的再水化緩沖液(8M尿素，2%CHAPS,50mMDTT和0.2%載體兩性電解質(zhì)pH3-10;BIO-RAD)對每個(gè)IPG膠條進(jìn)行再水化。在ProteanIEF盒(BIO-RAD)中使用終電壓10000，20匸，總60000Vh進(jìn)行IEF。IEF之后，IPG膠^H^存于-80"C直至用于第二維。第一維電泳的IPG膠條在室溫含2.5mMDTT和2.3%(w/v)SDS的125mMTris-HCl(pH6.8)溶液中孵育15分鐘，用1%相同緩沖液中熔化的瓊脂糖封住間隔膠的頂部。以恒定電流40mA進(jìn)行2DPAGE膠，直至分層的溴酚藍(lán)染料到達(dá)^底部。通過用5:1:4的甲醇乙酸Milli-Q水中0.2%考馬斯亮藍(lán)R-250對SDS和2DPAGE進(jìn)行常規(guī)染色過夜，然后在相同溶劑中脫色。使用FluorSMultiimager(BIO-RAD)和可見光源獲得2D凝膠圖像。使用PDQuest圖像分析軟件(BIO-RAD)進(jìn)行圖像分析。所有圖^^相同的設(shè)置下拍攝，使用:^不同部分的3至4個(gè)大點(diǎn)固定座標(biāo)。并且針對染色的小變化使用蛋白質(zhì)點(diǎn)的總光密度對凝膠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。分配SSP(StandardSpot,標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn))號給蛋白質(zhì)點(diǎn)，手動(dòng)切下不同劍歐的蛋白質(zhì)點(diǎn)，根據(jù)它們的SSP號匯集在一起。h.制備樣品以進(jìn)行MALDI-TOF分析我們依次進(jìn)行凝膠電泳，匯集來自所有凝膠的每個(gè)蛋白質(zhì)的凝膠點(diǎn)，用胰酶進(jìn)行消化。使用標(biāo)準(zhǔn)方案制備MALDITOF分析的樣品。簡言之，在50mM碳酸氫銨中洗考馬斯藍(lán)染色的含蛋白質(zhì)點(diǎn)的^切塊，短暫的孵育于相同緩沖液中。然后又用1:1的50mM碳酸氫銨和50%乙腈洗皿切塊。凝膠切塊在乙腈中脫水，在20mM碳酸氫銨中重新溶脹，其含有所需量的胰酶。使用測序級牛胰酶(Sigma)在37"C下進(jìn)行過夜膠內(nèi)消化，所述胰酶無糜蛋白酶活性(chymotrypticactivity)，終濃度為1:10至1:30(胰酶蛋白質(zhì))。用50%乙腈中的5。/。三氟乙酸(Trifloroaceticacid,TFA)提取來自膠內(nèi)消化物的肽兩次，匯集所提取的肽，Speed-Vac濃縮并重構(gòu)于8微升含50%乙腈的0.1。/。TFA，使用ZipTipC18柱(Millipore,USA)脫鹽。純化的肽(0.1。/。TFA和50。/o乙腈中)沉積在MALDITOF板上，使之風(fēng)干，用a-M-4-羥基肉桂酸(10亳克/亳升，在相同介質(zhì)中制備)基質(zhì)在其上形成層，風(fēng)干，用于MALDITOF分析。i.MALDITOF研究和譜圖分析我們使用Voyager型DESTRMALDITOF質(zhì)^R(PerSeptiveBiosystems，F(xiàn)ramingham，MA,USA)，使用延時(shí)引出以反射模式記錄MALDI質(zhì)鐠圖，使用以下^進(jìn)行每個(gè)測量20kV加速電壓、72%柵極電壓、175-220ns延時(shí)時(shí)間以及750的低質(zhì)量門。從100個(gè)激光轟擊(lasershots)累計(jì)諳圖。使用外部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Calmix1和2;AppliedBiosystems)進(jìn)行肽質(zhì)量校準(zhǔn)。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟4吏MALDITOF鐠圖接受基線校正、噪音去除和峰檢測。我們消除了數(shù)據(jù)中與胰酶、角蛋白和校準(zhǔn)混合物相關(guān)的肽質(zhì)量，得到最終的肽質(zhì)量列表。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)，對于所述蛋白質(zhì)的每個(gè)10-kDa的部分我們平均回收了約10-15個(gè)肽。j.PMF搜索分析蛇蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫目前仍是不可用的。因?yàn)槲覀冾A(yù)期因此，我們使用1-2個(gè)漏切(missedcleavage)、"甲硫氨酸的部分氧化"和200ppm質(zhì)量偏差以"全分類(AllTaxonomy)"模式啟動(dòng)PMF搜索。可能是由于蛇PMF數(shù)據(jù)庫的不可用，對于大多數(shù)蛋白質(zhì)質(zhì)量偏差必須增加到300-400ppm才能得到確定的蛋白質(zhì)鑒定。但是，在Mascot均方根(rootmeansquare,RMS)ppm誤差(用以鑒定蛋白質(zhì)的質(zhì)量數(shù)據(jù)組使用的實(shí)際誤差)改變僅有65-250ppm。最近進(jìn)行的馬拉松式研究(Danieletal.,2004)比較了多種PMF搜^參數(shù)，認(rèn)為400卯m的質(zhì)量偏差對于得到有意義的蛋白質(zhì)鑒定是必需的，其證實(shí)了在我們的PMF搜索中使用的質(zhì)量偏差^lt在合理的限制之內(nèi)。由于可用NCBInr數(shù)據(jù)庫的范圍和大小以及蛇蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不可用，我們始終使用NCBInr以及Mascot和Profound搜索工具以進(jìn)行我們的PMF分析。使用200卯m質(zhì)量偏差起始PMF搜索，然后增加到300-400卯m，無論使用顯著蛋白質(zhì)得分鑒定蛋白質(zhì)是否必要?；诘鞍踪|(zhì)質(zhì)量值和pl，我們使用l-2個(gè)漏切，對于每個(gè)IOkDa質(zhì)量的蛋白質(zhì)允許1個(gè)漏切。偏堿性的蛋白質(zhì)含有更高含量的堿性氨基酸-精氨^/賴氨酸，胰酶在緊挨著它們的位置切割多肽，蛋白水解的限制需要對于這些蛋白質(zhì)允許更多的漏切。搜索參數(shù)中允許的質(zhì)量和pl范圍顯然影響通過Profound所鑒定蛋白質(zhì)的EstdZ得分。在不同的分類中具有相同功能的蛋白質(zhì)應(yīng)該是同源的，但是它們的質(zhì)量和pl值經(jīng)?？擅黠@不同。我們預(yù)期需要根據(jù)其它數(shù)據(jù)庫中的同源蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的蛇蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不可獲得性有可能影響我們的PMF搜索結(jié)果，并且僅僅提供較低的蛋白質(zhì)/EstdZ得分。在所有PMF搜索中，對于實(shí)驗(yàn)觀察到的蛋白質(zhì)pl和質(zhì)量我們允許1個(gè)單位的pl和5kDa質(zhì)量。我們通常尋找具有與實(shí)驗(yàn)所觀察到的蛋白質(zhì)質(zhì)量和pl值最接近的蛋白質(zhì)身份(id)。在幾個(gè)實(shí)例中，我們得到具有與所研究的蛇卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)的質(zhì)量和pl值足夠相近的蛋白質(zhì)身份。但是，在一少部分實(shí)例中對于得到唯一的具有最佳蛋白質(zhì)/EstdZ得分的身份具有偏差似乎是必需的，因?yàn)樗鼈冏陨硎怯蒑ascot和Profound所鑒定的最佳匹配。在一些實(shí)例中，Profound鑒定的蛋白質(zhì)不同于由具有可接受得分的Mascot所鑒定的蛋白質(zhì)，盡管它也鑒定出具有高蛋白質(zhì)得分的Mascot鑒定的蛋白質(zhì)。在這些實(shí)例中，我們考慮和報(bào)道了所有通過這些分析所鑒定的具有可接受得分的蛋白質(zhì)。在許多情況下，我們最初使用Mascot,得到具有合理的高蛋白質(zhì)得分(50〃6至65〃6)的蛋白質(zhì)質(zhì)量、pi和物種，然后在Profound中使用此信息，以鑒定在數(shù)據(jù)中顯示的具有明顯可接受Estdz得分的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的PMF搜索使用大腸桿菌替代"所有分類"，對于那些事實(shí)上由"所有分類"中的搜索(見結(jié)果)鑒定為大腸桿菌蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，得到一致的蛋白質(zhì)/EstdZ得分，而其它的只得到非常低的蛋白質(zhì)得分。這證明了我們所回收的蛋白質(zhì)不來自大腸桿菌，具體來說這是因?yàn)榇竽c桿菌基因組已經(jīng)被完全測序，在數(shù)據(jù)庫中所有的大腸桿菌蛋白質(zhì)都是可用的。k.電噴霧電離質(zhì)謙(ESIMS):少數(shù)蛋白質(zhì)在消化后產(chǎn)生足以進(jìn)行ESIMS分析的肽。因此，我們對這些被消化的蛋白質(zhì)進(jìn)行ESIMS,以得到它們的內(nèi)部序列標(biāo)簽。使用來自PESciex(Toronto,Canada)的帶有納米噴霧源的QSTARPulsar(ESI畫Q-TOF)獲得MS/MS片段化譜。在1000V噴霧電壓下獲得TOFMS。多個(gè)帶電片段接受MS/MS,其碰撞能量范圍為30-50eV。1.NCBIBLAST分析ESIMS研究提供給我們蛋白質(zhì)的僅僅10-15個(gè)氨基酸的序列標(biāo)簽。我們使用NCBI蛋白質(zhì)BLAST的"搜索短的、接近完全匹配"工具進(jìn)行序列標(biāo)簽的BLAST。因?yàn)镋SIMS不能區(qū)分氨基酸"L和I"以及"K和Q"，我們必須以這些氨基酸所有可能的組合進(jìn)行這些BLAST搜索。在BLAST鑒定的具有最高得分的蛋白質(zhì)中，我們尋找早先同時(shí)被Mascot和ProfoundPMF搜索鑒定的蛋白質(zhì)，并報(bào)告結(jié)果。結(jié)果在此研究中，總RNA分離自蛇卵母細(xì)胞，mRNA純化并轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，如"方法"部分中所述。分離的mRNA是完好的，cDNA合成得到0.5-4.5kb之間的轉(zhuǎn)錄物，其預(yù)期產(chǎn)生大小范圍很大的蛋白質(zhì)。因此我們的文庫構(gòu)建步驟是正確的，文庫應(yīng)表達(dá)寬分子量范圍的蛋白質(zhì)。早先，通過3小時(shí)的誘導(dǎo)，蛋白質(zhì)在GJ1158細(xì)菌中的it^達(dá)顯示為穩(wěn)定期(BhandariandGowrishankar，1997)。由此看來，在生長到0.2-0.8個(gè)600納米處OD單位之間的多種水平后，誘導(dǎo)蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫3個(gè)小時(shí)，在12.5%SDSPAGE上解析總蛋白質(zhì)。在誘導(dǎo)3個(gè)小時(shí)之后，蛋白質(zhì)表達(dá)隨培養(yǎng)物OD值增加，在約0.6OD時(shí)達(dá)到平臺期，在0.6-0.8OD可見極好的it^達(dá)。因此，在所有進(jìn)一步的所述文庫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中使用這些^Ht。未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的不帶噬菌粒的對照GJ1158細(xì)菌與帶有噬菌粒的未誘導(dǎo)文庫的蛋白質(zhì)鐠圖是相似的，而誘導(dǎo)文庫的蛋白質(zhì)鐠圖顯示出相比于未誘導(dǎo)對照發(fā)生顯著改變。來自未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫被分成可溶和不可溶組分，在SDSPAGE上進(jìn)行分析。文庫表達(dá)蛋白質(zhì)的較大部分存在于可溶組分中，這與大部分的GJ1158表達(dá)蛋白質(zhì)以可溶形式被發(fā)現(xiàn)是一致的(BhandariandGowrishankar,1997)。我們將誘導(dǎo)文庫蛋白質(zhì)的不可溶部分溶解于變性溶劑中，如"方法"部分中所述將所述蛋白質(zhì)復(fù)性。我們重復(fù)對于剩余不可溶蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取和復(fù)性步驟，最終回收可溶組分中的大多數(shù)所表達(dá)的蛋白質(zhì)。因此，我們的蛋白質(zhì)提取和復(fù)性步驟成功回收到最終可溶形式的數(shù)量上幾乎大多數(shù)文庫表達(dá)的蛋白質(zhì)。來自蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫的"未誘導(dǎo)"和"誘導(dǎo)"蛋白質(zhì)2DPAGE鐠圖顯示于圖1。"誘導(dǎo)，，蛋白質(zhì)譜圖顯示出一些新的蛋白質(zhì)點(diǎn)(在紫色圏中顯示)，其未出現(xiàn)在"未誘導(dǎo)"對照中。"誘導(dǎo)"蛋白質(zhì)鐠圖清楚顯示蛇卵母細(xì)胞總cDNA文庫在誘導(dǎo)之后表達(dá)多個(gè)來自克隆cDNA的蛋白質(zhì)。因此，本文所使用的文庫構(gòu)建、總cDNA文庫表達(dá)和提取蛋白質(zhì)的方法獲得了成功。使用如"方法"部分中所述的蛇DNA-Sepharose柱，我們分離了來自總文庫表達(dá)蛋白中的DNA結(jié)合蛋白。當(dāng)未誘導(dǎo)文庫或?qū)φ誈J1158細(xì)菌蛋白質(zhì)在相同條件下通過DNA-Sepharose柱接受色譜法時(shí)，我們幾乎回收不到任何的結(jié)合蛋白質(zhì)。另外，不論添加的竟?fàn)巹┐竽c桿菌DNA存在與否，色譜法中純化DNA結(jié)合蛋白得到幾乎相同的2DPAGE模式。it^明，色譜法中所使用的條件允許蛇DNA結(jié)合蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合蛇DNA-Sepharose。在文庫表達(dá)蛋白的提取和可溶化處理過程中，細(xì)菌DNA片段也被提取進(jìn)可溶組分。這些大腸桿菌DNA片段可能明確地與蛇DNA-Sepharose竟?fàn)幗Y(jié)合大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白。這可能解釋了所觀察到的蛇DNA結(jié)合蛋白與DNA-Sepharose之間的相互作用特異性。我們通過蛇DNA-Sepharose柱分幾批處理了從卯升文庫誘導(dǎo)培養(yǎng)物中回收的總蛋白質(zhì)，回收了約1.8毫克文庫中表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白。我們預(yù)期每升GJ1158細(xì)菌培養(yǎng)物回收約5毫克it^達(dá)蛋白。因此卯升培養(yǎng)物應(yīng)得到約450亳克it^達(dá)蛋白。因?yàn)槲覀儍HM總文庫表達(dá)蛋白質(zhì)中分離DNA結(jié)合蛋白，其只占總i^表達(dá)蛋白的很小一部分，所以這些蛋白質(zhì)的低回收率(it^達(dá)蛋白質(zhì)的約0.4%)可能是合理的。我們在IEF和之后的2DPAGE上解析了此蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)R-250對膠進(jìn)行染色。在圖2中顯示的純化的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的鐠圖顯示出存在幾個(gè)良好解析的點(diǎn)，質(zhì)量范圍在約15-100kDa，pI在約5-9。因此，本文使用的提取和純化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的方法似乎是成功的。所解析的DNA結(jié)合蛋白的點(diǎn)從2DPAGE上切下，接受胰酶的膠內(nèi)消化，所回收的肽用于MALDITOF和ESIMS分析。我們收集了80個(gè)DNA結(jié)合蛋白的點(diǎn)，其明顯具有足以進(jìn)行MALDITOF分析的濃度，合理地得到了37個(gè)蛋白質(zhì)的良M圖。這些蛋白質(zhì)其中四個(gè)的代表性MALDITOF鐠圖顯示于圖3中。我們合理地獲得這些蛋白質(zhì)的良好PMF數(shù)據(jù)，成功確定了所有具有合理的良好蛋白質(zhì)/EstdZ得分的蛋白質(zhì)身份。表2給出了23個(gè)分離的蛇卵母細(xì)胞DNA結(jié)合蛋白的數(shù)據(jù)以及通過這些分析得到的身份。但是，所鑒定的其余蛋白質(zhì)不是DNA結(jié)合的，而是細(xì)菌來源的，對此我們提供了最有可能的解釋(見下文)。當(dāng)我們使每個(gè)所鑒定的蛇DNA結(jié)合蛋白質(zhì)接受使用通過上述步驟(表2)所得參數(shù)的"大腸桿菌"中的PMF分析以取代"所有分類"的時(shí)候，每個(gè)分析給出僅僅具有很低得分的蛋白質(zhì)身份，這清楚M明這些蛋白質(zhì)不是大腸桿菌蛋白質(zhì)。如果這些蛋白質(zhì)是大腸桿菌蛋白質(zhì)，那么這就不是預(yù)期的，因?yàn)?U^桿菌基因組是完全測序的，其數(shù)據(jù)庫可用并且大腸桿菌蛋白質(zhì)可通過PMF分析亳不困難的得以鑒定。在一些情況下，使用Mascot/Profound或者兩種皆使用，我們在200ppm質(zhì)量誤差下得到確定的蛋白質(zhì)身份。在另一些情況下，只有在使用300-400pm質(zhì)量誤差之后才可得到蛋白質(zhì)身份。在許多情況下，我們得到具有Mascot或Profound有效得分的蛋白質(zhì)身份，而其它鑒定的蛋白質(zhì)僅具有低于有效得分水平的得分，其標(biāo)記為"(*)"，在表2中緊挨著所述得分值。在少數(shù)情況下，所鑒定蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)和/或EstdZ得分略微低于"有效得分"水平。因?yàn)镸ascot和Profound獨(dú)立或同時(shí)得到具有合理的高蛋白質(zhì)/EstdZ得分的相同身份，所以我們接受這些。在許多情況下，不可能在使用Profound的一次搜索中得到具有有效得分的蛋白質(zhì)身份。在這些情況下，我們首先通過Mascot得到合理的高蛋白質(zhì)得分，使用質(zhì)量和pi和/在Profound中所鑒定蛋白質(zhì)的分類，以得到確定的身份(參見方法部分)。在這些情況下，在表2中適當(dāng)?shù)臉?biāo)記所述身份，并在底部給出說明。此策略使得我們得到數(shù)個(gè)蛇卵母細(xì)胞蛋白的確定身份，有報(bào)道稱通過ProfoundPMF搜索相對難以得到確定的蛋白質(zhì)身份，因此認(rèn)為帶來對蛋白質(zhì)身份更精確的預(yù)測(Danieletal.,2004)。但是，我們的經(jīng)騶4人為通過Mascot得到確定的蛋白質(zhì)身份更加困難，因此留下了這樣的印象，可能Mascot提供了更精確的蛋白質(zhì)預(yù)測。蛇蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不可用也有可能是造成我們PMF搜索中困難以及得到此觀點(diǎn)的原因。我們將PMF分析鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行NCBI"保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫"搜索，以了解它們可能的生理功能。我們得到所鑒定蛋白質(zhì)最有可能的生理功能，其在表3中顯示。有趣的是，注意到大多數(shù)所鑒定的蛋白質(zhì)(表3)似乎需要DNA結(jié)合特性以實(shí)現(xiàn)它們預(yù)期的生理功能，這表明這些可能是真正的/功能性DNA結(jié)合蛋白。有趣的是，列表中有屬于多個(gè)物種(如微生物、害蟲、植物、蒼蠅類和哺乳動(dòng)物)的所鑒定的蛋白質(zhì)。在蛇卵母細(xì)胞中鑒定到不同物種的蛋白質(zhì)不一定意味著蛇卵母細(xì)胞實(shí)際含有這些蛋白質(zhì)，而是暗示所分離的蛇卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)與早先報(bào)道來自這些物種的蛋白質(zhì)同源。在;Mf究中所鑒定的DNA結(jié)合蛋白包括參與轉(zhuǎn)錄/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、DNA復(fù)制、重組和^f務(wù)復(fù)、細(xì)胞分裂和染色體分離/分配、前mRNA加工的因子、核酸酶和DNA結(jié)合蛋白。雖然使用嚴(yán)格的色鐠條件，盡管明顯不具有DNA結(jié)合特性但少數(shù)蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)仍保留在DNA-Sepharose柱上，使它們ii^到DNA結(jié)合蛋白的組中。我們表達(dá)整個(gè)蛋白質(zhì)文庫，溶解大多數(shù)文庫表達(dá)蛋白質(zhì)，使它們在天然條件下通過DNA-Sepharose柱進(jìn)行色譜。在生理?xiàng)l件的細(xì)胞中，細(xì)胞的多種功能以及需要這些功能的蛋白質(zhì)被嚴(yán)格劃分，因此生物系統(tǒng)不允許非功能性的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合。在DNA-Sepharose親和色鐠過程中，所有天然蛋白質(zhì)在溶液中共同存在。這可能導(dǎo)致一些非DNA結(jié)合互作用。P-內(nèi)酰胺酶是來源于PT7T3D克隆載體的這些蛋白中的一個(gè)，其在GJ1158細(xì)菌中表達(dá)以7jC解氨節(jié)青霉素，用作細(xì)菌的選擇標(biāo)記。DNA結(jié)合蛋白也具有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用基序(除了DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外)，與其它含有相似基序的功能性蛋白形成多蛋白質(zhì)復(fù)合物，在細(xì)胞中與乾基因相結(jié)合以實(shí)現(xiàn)它們的功能。因此，DNA結(jié)合蛋白具有與其它蛋白相互作用的能力，在非生理性系統(tǒng)中(如本文的親和色譜)不具有DNA結(jié)合特性的蛋白質(zhì)可能很好地與之結(jié)合并1DNA結(jié)合蛋白的組中。另外，這些蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)(疏水)相互作用在色譜的清洗和洗脫過程中由于緩沖液鹽濃度的增加變得穩(wěn)定。在本研究中，回收參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)-氨基酸相互作用的并且周質(zhì)(通常疏水)定位的蛋白質(zhì)加強(qiáng)了此觀點(diǎn)，為在說服力的原因。當(dāng)肽濃;^A夠時(shí)，我們進(jìn)行了ESIMS研究并獲得了6個(gè)蛋白質(zhì)的序列標(biāo)簽。所研究蛋白質(zhì)其中4個(gè)的代表性ESIMS鐠在圖4中顯示。我們通過NCBIBLAST分析進(jìn)行了所狄列的數(shù)據(jù)庫搜索，如"方法"部分中所述。有趣的是，通過PMF分析獲得的蛋白質(zhì)身份3601、4401、6403和7305存在于NCBIBLAST所鑒定的具有最高得分的蛋白質(zhì)中。通過PMF分析獲得的1405和7303蛋白質(zhì)身份不存在于由NCBIBLAST鑒定的相應(yīng)蛋白質(zhì)中。從圖3可見，蛋白質(zhì)1405和7303獲得的MALDITOF譜質(zhì)量很好。進(jìn)一步的PMF分析在Mascot和Profound搜索中獲得唯一的身份，并且至少具有Profound的高得分(表2)。因?yàn)橥ㄟ^PMF分析所鑒定的蛋白質(zhì)1405和7303是DNA結(jié)合的(表2)，因?yàn)槲覀兪褂肈NA-Sepharose色鐠法回收這些蛋白質(zhì)，所以我們得出以下結(jié)論，由PMF分析得到的這些蛋白質(zhì)的身份^>可靠。另外，與NCBIBLAST不同，基于來源于全長蛋白質(zhì)之信息的PMF分析更加可靠，并且支持我們的上述結(jié)論。在表4中顯示獲得的ESIMS所研究蛋白質(zhì)的序列標(biāo)簽、來自PMF和NCBIBLAST分析的蛋白質(zhì)身份、所鑒定蛋白質(zhì)的質(zhì)量值以及來自2DPAGE的相應(yīng)實(shí)翁度。表4比較通過PMF分析獲得以及利用其ESIMS序列標(biāo)簽通過NCBIBLAST鑒定的蛋白質(zhì)身份<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>1.標(biāo)記為(*)的蛋白質(zhì)得分，指示此得分低于所需的有效得分水平。接受這些"蛋白質(zhì)身份"的原因在文中有解釋。我們從稀有組織開始；從總cDNA文庫表達(dá)蛋白質(zhì)中分離低豐度的蛋白質(zhì)，使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對它們進(jìn)行表征。盡管蛋白量的限制和數(shù)據(jù)的不可用造成了一些困難，但是我們使用新方法全力克服了這些困難，所述方法顯然可用于許多處于這些限制下的類似領(lǐng)域中的工作。構(gòu)建蛇卵母細(xì)胞cDNA文庫、表達(dá)總文庫、使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法純化/鑒定蛋白質(zhì)，以上整個(gè)工作清楚的證明了此方法是有效的方案，具有非常有潛力的用途。我們在分離和鑒定總組織cDNA文庫中表達(dá)的稀有蛋白質(zhì)上的成功為開發(fā)"組織蛋白質(zhì)組文庫"提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，所述文庫是一個(gè)非常新的概念。本方法相對于現(xiàn)存技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)目前蛋白質(zhì)的it^達(dá)是一個(gè)漫長而繁重的步驟。蛋白質(zhì)的代表性cDNA是通過PCR擴(kuò)增自組織cDNA庫，并連接進(jìn)表達(dá)載體的正確讀碼框，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)適宜的宿主細(xì)胞，然后誘導(dǎo)所述蛋白質(zhì)的表達(dá)。文獻(xiàn)中沒有描述過允許表達(dá)cDNA庫以過量產(chǎn)生它們相應(yīng)蛋白質(zhì)庫的方法，其節(jié)省了在單獨(dú)it^達(dá)所有轉(zhuǎn)錄物上的嘗試和時(shí)間。因此，作為本文所提供概念的證明，原理和實(shí)施例1-3是真正新穎的。此方法允許獲得所克隆cDNA庫it^達(dá)成為它們相應(yīng)的蛋白質(zhì)庫。一些相當(dāng)重要的分子類型，如DNA結(jié)合蛋白，以非常低的量存在于細(xì)胞中，甚至于鑒定它們以及鑒定它們在細(xì)胞和組織中的存在都非常困難。由于它們的低豐度以及組織的可用性，從細(xì)胞和這些組織中分離這些分子相當(dāng)?shù)睦щy，有時(shí)是不可能的。一些所述細(xì)lfe/組織(如來自患者的組織樣本、卵母細(xì)胞和早期胚胎)僅以非常有效或微小的量可獲得。因此，本文所給出的方法允許對于存在于它們組織/文庫中的mRNA/cDNAit^達(dá)大量的蛋白質(zhì)。另外，它使得從組織蛋白質(zhì)組文庫中it^達(dá)的蛋白質(zhì)庫中能夠鑒定和/分離這些蛋白質(zhì)。這也是本方法一個(gè)重要的新穎性。研究人員曾經(jīng)嘗試合成肽組合文庫，以尋找特定的具有生物學(xué)活性/治療應(yīng)用的肽。本發(fā)明提供了一個(gè)用于表i^E4^讀碼框中翻譯并截?cái)嗟拇髷?shù)量肽的選擇。在與疾病進(jìn)行斗爭的過程中，生物系統(tǒng)很可能表達(dá)一些M框中的蛋白質(zhì)以獲得具有生物學(xué)活性且有治療用途的肽。這些肽可作為治療劑用于控制生物過程。目前尚沒有方法表達(dá)/合成/過量產(chǎn)生生物學(xué)重要的/治療性的肽。錯(cuò)誤框中表達(dá)肽導(dǎo)致翻譯終止(由于終止密碼子)，從而產(chǎn)生一個(gè)大的生物學(xué)肽庫(見下文)，其可能具有重要的生物學(xué)特性/治療用途。因此，本方法是用于產(chǎn)生研究獲取這些重要肽庫的起始材料之新方法和來源。在文庫構(gòu)建中可用數(shù)個(gè)高級方法。通過蛋白質(zhì)表達(dá)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析可分析少至10個(gè)細(xì)胞或組織樣本中存在的轉(zhuǎn)錄物，所述分析中使用PCR擴(kuò)增cDNA庫并構(gòu)建表達(dá)文庫。文庫構(gòu)建的方法包括標(biāo)準(zhǔn)化方法，也可用消減文庫，其增加了低豐度轉(zhuǎn)錄物的頻率。消減文庫的構(gòu)建與總cDNA文庫的克隆及誘導(dǎo)的聯(lián)合實(shí)現(xiàn)了甚至低豐度轉(zhuǎn)錄物的過表達(dá)以及通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法對它們的分析/鑒定。有可能開發(fā)特別設(shè)計(jì)用于在表達(dá)載體所有讀碼框中克隆和it^達(dá)組織總cDNA的質(zhì)?；蚴删Ｔ泽w。這些載體中所需的序列元件是待克隆cDNA的5，和3'端特定6-8威基特定限制性位點(diǎn)(Rsal、Sfil、Sgfl、Pmel、Notl等)、抗生素抗性基因、幫助純化所有表達(dá)蛋白的5，端特定M酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽或GST融合標(biāo)簽等)以及擴(kuò)增所克隆cDNA所需的在待克隆cDNA某一側(cè)的通用(T7和T3)引物序列，等等。BDBioscience出售SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒，其使用噬菌體表達(dá)載體。此栽體宣稱以所有三個(gè)表達(dá)框表達(dá)蛋白質(zhì)，盡管每個(gè)整合進(jìn)謹(jǐn)菌體的所克隆cDNA在它們可^達(dá)之前必須以噬菌粒形式釋放。這需要對每個(gè)克隆標(biāo)準(zhǔn)化，因此它們不可用于在一次實(shí)驗(yàn)中表達(dá)所有克隆的cDNA。因此，需要開發(fā)可在一次實(shí)驗(yàn)中表達(dá)所有克隆cDNA的特定載體，其可用于開發(fā)組織蛋白質(zhì)組文庫。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)已經(jīng)具有了自動(dòng)、高通量的能力，所以它可有利地用于分析和鑒定甚至是存在于含有大數(shù)量蛋白質(zhì)之混合物中的蛋白質(zhì)。如上述，總文庫表達(dá)方法可以和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合，以分析甚至是存在于僅有微小量可用的臨床組織樣本、卵母細(xì)胞和早期胚胎中的轉(zhuǎn)錄物。這有利于比較這些樣本與合it^照的蛋白質(zhì)鐠，一方面用以評估蛋白質(zhì)譜圖的改變，另一方面用于鑒定它們中存在的未知蛋白質(zhì)。通過使用這些方法，可以更快的解決當(dāng)前生物學(xué)研究中的重要的難題，如核重編程、胚胎分化、發(fā)育、衰老和疾病，所述方法顯然加快了蛋白質(zhì)組學(xué)、生物物理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的iiJL參考文獻(xiàn)1.Amatschek,S.，Koenig，U.,AuerH.，Steinlein,P.，PacherM.,Gruenfelder,A.，Dekan,G.,Vogl，S.,Kubista,E.,Heider，K.H.，Stmtow^C,，Schreiber,M.,Sommergruber,W.(2004)Tissue-wideexpressionprofilingusingcDNAsubtractionandmicroarraystoidentify加mor-specificgenes.CancerRes.64,844-8562.Anderson,M,,Blowers,D>，He德，N.Hegde,P.,Breeze,A"Hampton,I.andTaylor,I.(1999)，Refolding'puriflcalionandcharacterizationofaloopdeletionmutantofhumanBcl-2frombacterialinclusionbodies,ProteinExpressionandPurificationIS,162-1703.Bhandari,P.andGowrishankar,J.AnEscherichiacolihoststrainusefUlforefficientoverproductionofclonedgeneproductswithNaCIastheinducer.-(1997)J.Bacterio!.1",4403-44064.Campbell,K.H.,Albei.sio，R.,Lee,J.andRitchie,W,A.(2001)Nucleartransferinpractice.CloningStemCells,3,201-2085.Campbell,K.H.,McWhir，J.，Ritchie,W.A.andWilmut,I.(1996)Implicationsofcloning,Nature380,64-666.Chomczynski,P.andSacchi，N.(1987)Single-stepmethodofRNAisolationbyacid-guanidiniumthiocyanate-phenol匿chloroformextraction;Anal.Biochem.162,156-1597.Coleman,A.(2002)Cloning1，185-2008.Daniel,C.C.,Gerhard,K,,Kai,S.，Helmut,E.M',,Joachim,K.andMartin,B.(2004)，Evaluationofalgorithmsforproteinidentificationfromsequencedatabasesusingmassspectrometrydata,Proteomics4，619-6289.GiltnaneJ.M.andRimmD.L.(2004)Technologyinsight:Identificationofbiomarkerswithtissuemicroarmytechnology.Nat.Clin.Pract.Oncol.l，l(W-l110，Hochstrasser，D.F.,Sanchez,J.C.andAppel,R.D.(2002)Proteomicsanditstrendsfacingnature'scomplexity,Proteomics2，807-81211.Joubert-Caron,R.,Peuiilard,〗.，Kohanna,S.,Poirier,'F.，LeCaer,J.P.,Schuhmacher，M.，Bornkamm,G.W.,Polack，A.,Caron,M.，Bladier,D.andRaphael,M.A,(I卿)Acomputer-assistedtwO"dkn^isio加IgdelectrophoresisapproachforstudyingthevariationsinproteinexpressionrelatedtoaninducedfunctionalrepressionofNFkappaBinlymphoblastoidcelllines.Electrophoresis20，1017-畫12.Kadonaga,J.T.amiTjian,R.(1986)AffinitypurificationofsequenospecificDNAbindingproteins:Proc,Natl,Acad,Sci.USA,83，5889-589313.Ueb,B,，Carl，M.，Hock^R,，Gebaner，D,andScheer，U.(1998)IdentificationofanovelmRNA-associatedproteininoocytesofPlem'odeleswaltlandAfe卿ttffte喊Exp.CellRes,24S，272-28114.Laemmli，U.K.(1970)CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4，"Nature227，680-68515.Mann,Ni"Hendrickson，R.C.andPandy，A，(2001)Analysisofproteinsandproteomesbymassspectrometry-Annu.Rev.Biochem.70，437-47316.Nordhoff,E.，Egelhofer,V，,Giavalisco，P.,Eickhoff，H.,Horn,M,，PrzewiesH!c，T"Tfieiss，D.，Schneider,U,,Lehrach,H,andGobom》J,(2001)Large"geltwo-dimensionalelectro-phoresis-matrixassistedlaserdesorption/ionization-timeoffiight-rtiassspectrometry:ananalyticalchallengeforstudyingcomplexproteinmixtures.Electrophoresis22,2844-285517,0,FarrdJ,P,H,(1975),High-reso〗utiontwo-dimensionae!ec，ophoresisofproteins.J，BiolCheih,2S0，4007、402118.PandaA,K，(2003)Bioprocessingoftherapeuticproteinsfromtheinclusionbodiesof五.Adv，Biochem,Eng;Biotechnol，85，43-9319.Paynton，B.V,(1998)RNA-bindingproteinsinmouseoocytes抑dembryos:expressionofgenesencodingYbox,DEADboxRNAhelicase,andpolyAbindingproteins,Dev.Genet.23，285-29820.RavassardP，，Icard-LiepkalnsC.，palletDumasMilneEdwardsJ'B.(1997)cDNAlibrariesfromalowamountofcells,MethodsMolBioL67，317-2921.Ryabova，I,V,，Virtanen,I.andCoux，CXM,(1994)DistributionofprosomeproteinsandtheirrelationshipwiththecytoskeletoninoogenesisofJSfewo/wASMol*R印rod,Dev.37，22，Sambrook，J"Fritsch，E,F,，Mani站is，T，(1989)ColdSpringHarborLaboratoryManua:Vol;123.Solter,D.(2000)MammalianCloning:advancesandlimitations'Nat.Rev.Genet.1,199-20724.Tsunoda，Y.andKato,Y.(2002)Recentprogressandproblemsinanimalcloning;Differentiation69,158-16125.Usermanual(2001)TheQI入expressionistProtocolslO-p犯&17-p9026.Va她av,C.C.,Subhashard,C,，Dhople，V,M.,Sundaram,C.S,Jaga雄dham,M.V,，Kumar,K.N.,SrinWas,P.N.B.S.，Mythili,R,，Rao，M,K.,KuHcarai，M.K.，Hegde，S.,Hegde,A.S.,Samual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