專利名稱：基體反應(yīng)器和在該反應(yīng)器中制備產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于其中涉及低分子和高分子反應(yīng)物的反應(yīng)的基體反應(yīng)器，其中反應(yīng)器空間VR含有基體并且包括反應(yīng)區(qū)室和供應(yīng)區(qū)室，其中所述基體由大孔材料組成，所述大孔材料能吸收低分子反應(yīng)物并且排斥高分子反應(yīng)物，并且其中基體的排斥體積V0可作為反應(yīng)區(qū)室并且基體的基體體積VM作為供應(yīng)區(qū)室。所述基體反應(yīng)器可以用于涉及高分子催化劑(例如酶催化的反應(yīng))的合成方法，特別用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)制備蛋白質(zhì)。
其中涉及低分子和高分子反應(yīng)物的反應(yīng)的例子是用于蛋白質(zhì)制備的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)。間歇式操作或者使用連續(xù)供料的方法并且特別適合用于蛋白質(zhì)制備的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)器原理對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已經(jīng)是公知的(Baranov&Spirin(1993)酶學(xué)方法(Meth.Enzym.)217，123-142)。在用于蛋白質(zhì)制備的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)方法中，使用DNA-依賴性RNA聚合酶從反應(yīng)混合物中的DNA模板合成相應(yīng)的mRNA，然后通過核糖體機(jī)器將mRNA翻譯為蛋白質(zhì)。反應(yīng)溶液的組成很復(fù)雜。它含有低分子成分(底物，緩沖劑，鹽，激活劑，抑制劑，穩(wěn)定劑)和高分子成分(DNA模板，RNA聚合酶，核糖體，tRNAs，酶，調(diào)節(jié)蛋白)。這些成分中的一些以純化形式被加入。一些重要的翻譯成分(核糖體，酶，調(diào)節(jié)蛋白)的這時作為細(xì)胞提取物例如大腸埃希氏桿菌S30-溶胞產(chǎn)物，網(wǎng)狀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或小麥胚芽溶胞產(chǎn)物加給體系。轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)率是1毫克/毫升數(shù)量級。為此的先決條件是底物和能量成分的連續(xù)供應(yīng)和反應(yīng)終產(chǎn)物的同時分離或稀釋。以這種方式，將反應(yīng)維持很多小時是可能的。根據(jù)連續(xù)交換無細(xì)胞(CECF)或者連續(xù)流動無細(xì)胞(CFCF)蛋白質(zhì)合成原理實(shí)施這些實(shí)驗(yàn)設(shè)置(US5478730；EPA0593757；EPA0312612；Baranov&Spirin(1993)酶學(xué)方法(Meth.Enzym.)217，123-142)。CECF反應(yīng)器由至少兩個不連續(xù)的室組成，這些室彼此由多孔膜分開。該多孔界面將高分子成分留在反應(yīng)室中而低分子成分可以在反應(yīng)室和供應(yīng)室之間交換。在CFCF方法中將供給溶液直接泵入反應(yīng)室并且將反應(yīng)終產(chǎn)物通過一個或幾個超濾膜壓出反應(yīng)區(qū)室。
但是，所有這些反應(yīng)器和其中進(jìn)行的反應(yīng)具有以下共有缺點(diǎn)·反應(yīng)器由膜表面和幾個室組成，因此在制備中操作復(fù)雜。
·如果改變批量規(guī)模(例如從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模改為生產(chǎn)規(guī)模)，則要設(shè)計，構(gòu)造和優(yōu)化新的反應(yīng)器。
·底物的供應(yīng)和終產(chǎn)物的分離通過膜發(fā)生，構(gòu)造將技術(shù)限制強(qiáng)加于有效交換表面上，因?yàn)椴豢赡軐?shí)現(xiàn)所有大小的表面/體積之比。
·膜容易被堵塞，這損害了反應(yīng)物供給。
·反應(yīng)溶液和供應(yīng)溶液要連續(xù)混合(例如通過攪拌或泵循環(huán))來抵消梯度和供應(yīng)不足。
現(xiàn)有技術(shù)反應(yīng)器的另一個問題是在制備蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)情況下，使用的溶胞產(chǎn)物與大腸埃希氏桿菌細(xì)胞溶膠狀態(tài)相比被大大稀釋。為此的原因是1.獲得溶胞產(chǎn)物的溶胞作用和制備方法和2.加入所有必需成分引起的稀釋。這導(dǎo)致降低的產(chǎn)率，因?yàn)榇蠓肿訌?fù)合體的平衡移向解離一側(cè)(質(zhì)量作用定律)。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)描述過目的在于提高溶胞產(chǎn)物的活性濃度的抵消這種副作用的幾種方法。一種方法是向反應(yīng)混合物加入高分子PEG(聚乙二醇)，其結(jié)合水，因此促進(jìn)留下的大分子的相互作用(US5593856)。該方法的缺點(diǎn)是反應(yīng)成分和積累的產(chǎn)物可以凝結(jié)并且沉淀。濃縮溶胞產(chǎn)物的另一種方法是利用反相滲透原理。在該方法中，通過例如聚乙二醇的濃縮高分子溶液的作用通過半滲透表面(例如透析管)，從溶胞產(chǎn)物去除水(Kigawa T.(1999)FEBS Lett.442，15-19)。但是，該方法的缺點(diǎn)是太復(fù)雜。后者也應(yīng)用于超濾方法(US5593856)，其中在使用之前利用超濾作用濃縮溶胞產(chǎn)物。在這種情況下還需要另外一個步驟來制備溶胞產(chǎn)物。
本發(fā)明的目的是提供一種反應(yīng)器，其適合用于蛋白質(zhì)制備的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)并且克服了現(xiàn)有技術(shù)反應(yīng)器的缺點(diǎn)。另外提供適合用于蛋白質(zhì)制備的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)并且不具有現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的方法。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法抵消大分子成分的稀釋作用。特別要提供使得通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)制備的反應(yīng)器和方法。
本發(fā)明涉及用于其中涉及低分子和高分子反應(yīng)物的反應(yīng)和其中反應(yīng)器空間含有基體并且包括反應(yīng)區(qū)室與供應(yīng)區(qū)室的反應(yīng)器，其中
·基體由多孔材料組成，其中低分子反應(yīng)物可以大自由度分散，·高分子反應(yīng)物不能滲透到基體中，·低分子反應(yīng)物分布在整個反應(yīng)器空間VR中，·基體體積VM作為供應(yīng)區(qū)室和·基體的排斥體積V0作為反應(yīng)區(qū)室。
在根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器中，由于反應(yīng)器空間的基體結(jié)構(gòu)，反應(yīng)區(qū)室和供應(yīng)區(qū)室可以存在于一個反應(yīng)器空間中。這種變化方式是優(yōu)選的。但是，反應(yīng)區(qū)室和供應(yīng)區(qū)室存在于一個反應(yīng)器空間中并且還有與反應(yīng)器空間直接連接或者通過半滲透膜連接的另外一個供應(yīng)容器也是可接受的。
使用多孔材料作為基體并且多孔材料可以是無機(jī)材料例如氧化鋁和/或有機(jī)材料例如凝膠?；w在含水溶液中必須是可濕潤的或者能夠溶脹并且具有分子篩性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，含水溶液也指只含有50％體積的水的溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基體由聚合物，交聯(lián)聚合物(例如葡聚糖)，共聚物(例如聚丙烯酰胺)或無機(jī)“凝膠”組成。由0.1至1000微米范圍粒度的顆粒組成的基體是特別優(yōu)選的?；谑褂玫男问?即水合的)具有低物質(zhì)比重的基體是優(yōu)選的。物質(zhì)比重通常小于0.5克/毫升，但優(yōu)選小于0.3克/毫升?；w顆粒表面(以球體表面計算)優(yōu)選是0.004至40m2/ml床體積范圍。也用大分子排阻限(排除分子量)定義基體。排阻限可以是0.5至300kDa范圍。排阻限在2至300kDa之間是優(yōu)選的，排阻限在10至100kDa之間是特別優(yōu)選的。合適的材料是商業(yè)上可獲得的(例如Sephadex，Pharmacia；Bio-Gel，BIO-RAD)?？梢允褂镁鶆虻幕蛘卟煌６鹊牟牧?。也可以使用不同材料的混合物?；w本身由其本身不參與反應(yīng)，甚至也不作為催化劑的惰性材料組成。但是，根據(jù)需要，例如酶這樣的物質(zhì)可以結(jié)合在該惰性基體上。
反應(yīng)器空間完全或部分裝有該多孔基體材料。要求基體對反應(yīng)器的最小裝填量來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明效果。低于20體積％(床體積)不再能預(yù)期到本發(fā)明效果。當(dāng)然，在各種情況下，不排除基體裝填例如是19.9％體積。因此，根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器裝有至少大約20體積％，特別優(yōu)選至少大約30體積％的多孔基體材料。其中反應(yīng)器完全裝有多孔基體材料的變化形成是特別優(yōu)選的。80-100體積％范圍是極為優(yōu)選的。
基體將反應(yīng)器體積分為至少兩個區(qū)室?？梢灾挥傻头肿映煞终紦?jù)的一個空間和其中存在低分子及所有的高分子成分的一個空間。作為第一近似值，通過它們能夠達(dá)到的分布空間的大小確定得到的所用反應(yīng)物的最終濃度。
具有基本上低于基體排阻限的分子量的成分占據(jù)總反應(yīng)器體積VR。這適用于底物，緩沖物質(zhì)，鹽和低分子抑制劑，激活劑或穩(wěn)定劑。這也特別適用于能潛在抑制反應(yīng)(例如產(chǎn)物抑制作用)或者其積累改變一般反應(yīng)條件(例如pH值)并因此延緩反應(yīng)的低分子反應(yīng)終產(chǎn)物。
高分子成分不能滲透到基體中。它們唯一的分布空間是基體顆粒之間的體積，即排斥體積V0。從總反應(yīng)器體積減去基體體積計算該空間(V0＝VR-VM)，并且等于反應(yīng)區(qū)室。反應(yīng)區(qū)室和供應(yīng)區(qū)室通過短傳播途經(jīng)并且通過非常大的交換面積彼此連接。反應(yīng)區(qū)室V0與供應(yīng)區(qū)室VM的體積之比取決于基體的性質(zhì)，大小和結(jié)構(gòu)特征，并且取決于加入的基體的量。VR/VM之比可以在寬范圍內(nèi)變化。
大分子特定部分的反應(yīng)體積可以通過混合不同排阻限(例如10kDa和200kDa)的凝膠材料而增大。因此，在該實(shí)施例中，核糖體，DNA模板和mRNA的體積被減小(分子量大于200kDa)，而在延伸的反應(yīng)空間發(fā)生氨基?；?tRNA合成酶(分子量小于100kDa)對tRNA的載荷量。這可以用來優(yōu)化部分反應(yīng)的條件。
多孔基體的材料也使得具體修飾表面或腔。酶學(xué)功能例如修飾的酶(限制蛋白酶)或能量再生酶系統(tǒng)可以以特別顆粒上固定的特定比例導(dǎo)入體系中。腔的化學(xué)修飾使得具體吸附抑制物質(zhì)。
基體反應(yīng)器的構(gòu)造設(shè)計使得簡單地由試驗(yàn)規(guī)模變?yōu)樯a(chǎn)規(guī)模。在最簡單情況下，商售色譜柱可以用作反應(yīng)器，該柱大小在10毫升和1000升之間。一旦被優(yōu)化，該方法以簡單快速和成本有利方式被轉(zhuǎn)化為更大規(guī)模。這大大降低了反應(yīng)器和生產(chǎn)工廠設(shè)計，組建和評價的成本。反應(yīng)器材料可以不同，從不銹鋼(Edelstahl)至塑料或玻璃。但是，也可以使用其它材料。
根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器與先前可獲得的反應(yīng)器不同之處在于-供應(yīng)區(qū)室VM和反應(yīng)區(qū)室V0之間的非常大的交換面積并且兩個區(qū)室之間基本上沒有底物擴(kuò)散，-供應(yīng)區(qū)室VM和反應(yīng)區(qū)室V0之間的非常短的傳播途經(jīng)，其保證對反應(yīng)有效供應(yīng)并且消除梯度形成問題。不需要攪拌或混合。
-簡單構(gòu)造并且成本上有利的生產(chǎn)。
-對小規(guī)模優(yōu)化的條件向更大規(guī)模的簡單的可轉(zhuǎn)移性。
第一次有可能開發(fā)體外蛋白質(zhì)合成的特別潛力，例如大規(guī)模并且以經(jīng)濟(jì)方式制備毒性蛋白質(zhì)或者將非天然氨基酸插入蛋白質(zhì)中。
下面描述根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器的可能實(shí)施方案(參見圖1)。
1)基體柱反應(yīng)器-反應(yīng)器由完全裝滿基體(總體積＝VR)的室/柱組成。
-供應(yīng)區(qū)室相應(yīng)于基體體積(VM)。
-反應(yīng)區(qū)室相應(yīng)于基體的排斥體積V0。
-基體的排阻限是0.5-300kDa，優(yōu)選2-300kDa范圍。
-反應(yīng)器具有溶液入口(上)和出口(下)。
-溶液供應(yīng)導(dǎo)致液體柱向出口平穩(wěn)流動。
-反應(yīng)器可以是恒溫的。
因此其中基體是凝膠基體的基體反應(yīng)器是特別優(yōu)選的。特別地，其中反應(yīng)器空間具有圓柱形的基體反應(yīng)器是優(yōu)選的。因此優(yōu)選的實(shí)施方案是其中反應(yīng)器是可以是恒溫的裝有凝膠基體的色譜柱的反應(yīng)器。特別地，優(yōu)選的是基體具有2-300kDa范圍的排阻限。
根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器原理也可以有利地與確定的反應(yīng)器類型(間歇式，CECF，CFCF)相組合。這能夠?qū)е掠捎谔岣叩纳a(chǎn)率而提高的產(chǎn)率。因?yàn)橐筝^小量的原材料來達(dá)到最佳濃度(例如DNA模板，T7聚合酶，tRNAs)，本發(fā)明原理也是成本降低的原因。
2)基體間歇式反應(yīng)器·反應(yīng)器由可密封反應(yīng)器組成。
·反應(yīng)器具有足夠的容積來容納反應(yīng)溶液和可變量的凝膠基體。
·反應(yīng)器可以是恒溫的(例如在水浴中)。
3)含有基體的CECF反應(yīng)器·所述反應(yīng)器是CECF反應(yīng)器，包括至少兩個室，它們通過一個或幾個半滲透膜連接。
·反應(yīng)器包括至少一個反應(yīng)室和至少一個供應(yīng)室。
·反應(yīng)室部分或全部裝有凝膠基體。
·反應(yīng)器可以是恒溫的(例如保溫箱)。
·反應(yīng)器可以任選地攪拌或振動。
4)含有基體的CFCF反應(yīng)器·CFCF反應(yīng)器包括至少一個帶有出口開口和至少一個多孔表面的室。
·這個室是反應(yīng)室并且部分或全部裝有基體。
·供應(yīng)溶液可以通過開口泵壓到反應(yīng)室中。消耗過的供應(yīng)溶液通過超濾膜被壓出反應(yīng)室。
·反應(yīng)器可以是恒溫的(例如保溫箱)。
·反應(yīng)溶液可以任選地通過攪拌，振動，或者泵循環(huán)而攪動。
本發(fā)明的另一個主題是在本發(fā)明反應(yīng)器中制備產(chǎn)物的方法，其中起始物是低分子和高分子原料，其中·反應(yīng)混合物的低分子成分和特別是反應(yīng)消耗的底物大部分在整個反應(yīng)器空間VR中均勻分布，·反應(yīng)器空間中只有基體的排斥體積V0對于高分子成分特別是對催化活性反應(yīng)物是有效的并且·底物只有在基體的排斥體積V0中才可以被轉(zhuǎn)化(反應(yīng))。
根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選是其中通過一種或幾種酶將一種或幾種底物轉(zhuǎn)化為一種或幾種產(chǎn)物的酶促方法。所述反應(yīng)器可以特別地在制備蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)方法中使用。
高分子成分是核糖體，tRNAs，DNA模板，RNA聚合酶，mRNA和中間代謝的酶(例如氨基?；鵷RNA合成酶，轉(zhuǎn)甲酰酶，焦磷酸酶，核苷酸激酶)和能量再生體系(例如乙酸激酶，丙酮酸激酶，肌酸激酶，糖酵解酶，檸檬酸循環(huán)酶)和調(diào)節(jié)蛋白(例如起始因子，延長因子，終止因子)和支持蛋白質(zhì)折疊和進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾的因子。
低分子成分包括底物(20種天然存在的氨基酸，ATP，GTP，CTP，UTP，第二能量底物例如乙酰磷酸)和效應(yīng)物(緩沖物質(zhì)，鹽，還原化合物，葉酸，抑制劑，穩(wěn)定劑)。本發(fā)明定義低分子化合物比基體的排阻限小。相應(yīng)地，高分子化合物比排阻限大。柱方法是特別優(yōu)選的，其特征在于·凝膠基體被摻入到反應(yīng)器空間中。
·用供應(yīng)溶液平衡凝膠基體并且在反應(yīng)溫度下保溫(其中在摻入之前或之后發(fā)生凝膠基體的平衡)，
·將反應(yīng)溶液施加給柱子，·在柱中將反應(yīng)溶液攪拌經(jīng)過所述反應(yīng)時間(靜態(tài)過程)或者緩慢泵壓通過柱子(動態(tài)過程)和·反應(yīng)完全之后從柱子上洗脫下含有產(chǎn)物的反應(yīng)溶液。
本發(fā)明方法還包括對間歇式方法和連續(xù)供料方法的改進(jìn)。
間歇式方法向一批反應(yīng)混合物加入供應(yīng)溶液平衡過的凝膠基體，使得由于提高的底物利用率而延長反應(yīng)時間。作為第一近似值，加入凝膠基體導(dǎo)致高分子反應(yīng)物體積沒有增加，因此反應(yīng)不受稀釋作用的損害?？傊尤牖w導(dǎo)致相對溶胞產(chǎn)物來說提高的生產(chǎn)率。
CECF和CFCF方法反應(yīng)空間中凝膠基體的存在總體上導(dǎo)致高分子反應(yīng)物較小的稀釋作用，這相對溶胞產(chǎn)物來說提高了生產(chǎn)率。在這種情況下·供應(yīng)溶液平衡過的凝膠基體被摻入CECF或CFCF反應(yīng)器的反應(yīng)室中，·含有高分子反應(yīng)物的反應(yīng)溶液被填流至反應(yīng)室中，開始體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)制備蛋白質(zhì)，·在CECF方法情況下，供應(yīng)室裝有供應(yīng)溶液，·在CFCF方法情況下，供應(yīng)溶液被連續(xù)泵入反應(yīng)室，·在確定的溫度下將反應(yīng)混合物攪拌或振動經(jīng)過所述反應(yīng)時間和·在反應(yīng)終止時從反應(yīng)室取出含有產(chǎn)物的反應(yīng)溶液。
本發(fā)明還包括用于進(jìn)行蛋白質(zhì)制備的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)的配方。這些配方特別適合在本發(fā)明基體反應(yīng)器中制備蛋白質(zhì)。制備蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)中需要的所有的成分分為兩種溶液，即供應(yīng)溶液和反應(yīng)溶液。供應(yīng)溶液只含有低分子成分例如緩沖劑，鹽，底物和效應(yīng)物。合適的緩沖劑和鹽是例如Hepes或Tris，鉀離子，鎂離子和銨離子。要求的底物是20種天然存在的氨基酸，四種核糖核酸ATP，GTP，CTP，UTP或者合適的代謝母體例如AMP，GMP，CMP，UMP和第二能量底物例如磷酸烯醇丙酮酸，磷酸肌酸或乙酰磷酸或者這樣的底物的合適的代謝母體。效應(yīng)物是對反應(yīng)有正影響或者抑制副作用的物質(zhì)。這些包括一種或幾種還原化合物，特別是含有巰基的化合物例如二硫蘇糖醇，二硫赤蘚糖醇，谷胱甘肽，巰基乙磺酸，和另外的蛋白質(zhì)-穩(wěn)定化合物例如甘油，糖，二乙二醇，聚乙二醇，洗滌劑，輔助因子及激活劑例如輔酶和中間代謝的共底物例如葉酸。NAD/NADH，NADP/NADPH或者其母體，還有抑制不期望的副反應(yīng)的抑制劑例如利福平，RNA酶抑制劑，蛋白酶抑制劑，疊氮化合物。
反應(yīng)溶液含有需要的高分子成分并且也可以含有供應(yīng)溶液的一些或全部低分子成分。反應(yīng)溶液的基礎(chǔ)和含多高分子成分的來源是細(xì)胞溶胞產(chǎn)物?？梢詮脑?例如大腸埃希氏桿菌)或從真核細(xì)胞(例如酵母，網(wǎng)狀細(xì)胞，小麥胚芽)獲得這種溶胞產(chǎn)物。通常通過細(xì)胞溶胞和顆粒級分的分離(例如通過離心)獲得這樣的溶胞產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員從文獻(xiàn)中對這些方法是公知的。用這種方法獲得的溶胞產(chǎn)物可以直接加給反應(yīng)溶液或者可以首先加工和/或分級分離(例如通過透析，沉淀，差速離心，色譜方法，濃縮步驟)并且以幾種合適的級分的形式加入。
用于制備蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)十分復(fù)雜并且需要大量細(xì)胞成分。現(xiàn)在不可能假設(shè)所有這些成分的全部是已知的或者它們的功能已經(jīng)被完全了解。
溶胞產(chǎn)物帶來的高分子成分是核糖體，轉(zhuǎn)移RNA，調(diào)節(jié)蛋白和酶。調(diào)節(jié)蛋白特別是翻譯的起始因子，延長因子，終止因子。酶成分例如是氨基?；鵷RNA合成酶，用于能量供給和轉(zhuǎn)化的酶體系(例如乙酸激酶，丙酮酸激酶，肌酸激酶，二磷酸核苷激酶，一磷酸核苷激酶，糖酵解酶和檸檬酸循環(huán)酶)和中間代謝的酶例如焦磷酸酶，轉(zhuǎn)甲酰酶，轉(zhuǎn)氨酶。此外，可以假設(shè)溶胞產(chǎn)物的其它成分對于有效轉(zhuǎn)錄和翻譯是必需的。
其它高分子物質(zhì)作為獨(dú)立成分加給反應(yīng)溶液。這些包括轉(zhuǎn)移RNA，DNA-依賴性RNA聚合酶，優(yōu)選病毒聚合酶例如T7-RNA聚合酶，T3-RNA聚合酶，SP6 RNA聚合酶，另外再生能量成分的其它酶和溶胞產(chǎn)物中不含有的或數(shù)量不夠的中間代謝的酶(例如肌酸激酶，丙酮酸激酶，焦磷酸酶)，另外的高分子抑制劑(例如RNasin)，另外的蛋白質(zhì)有效而正確折疊所必需的酶體系(例如陪伴分子，蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶，肽基脯氨酰-順-反異構(gòu)酶)，另外的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾所必需的酶，穩(wěn)定蛋白質(zhì)或者將它們保持在溶液中的另外的大分子成分。
向反應(yīng)溶液加入環(huán)形(例如質(zhì)粒)或線性核酸(例如PCR產(chǎn)物)作為要轉(zhuǎn)錄和翻譯的蛋白質(zhì)的模板。蛋白質(zhì)密碼(例如cDNA序列)和系統(tǒng)正確轉(zhuǎn)錄和翻譯所需要的另外的調(diào)節(jié)序列位于該模板上。這些包括例如啟動子序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，起始密碼子，終止密碼子，聚合酶終止序列和翻譯增強(qiáng)子。另外，模板也可以含有克隆，擴(kuò)增或mRNA穩(wěn)定作用所需要的區(qū)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，供應(yīng)溶液有下面的組成150-300mM乙酸鉀，4-20mM乙酸鎂，1-10％甘油，0.5-2.5mM ATP，0.5-2.5mMCTP，0.5-2.5mM GTP，0.5-2.5mM UTP，0.1-2mM的各種氨基酸(所有的20種天然存在的氨基酸)，10.8微克/毫升葉酸，0.5-5mM EDTA，100mM HEPES-KOH pH7.6/30℃，1微克/毫升利福平，0.03％疊氮化鈉，10-100mM乙酰磷酸，1-10mM二硫蘇糖醇，1-10mM巰基乙磺酸，70mM KOH。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)溶液有下面的組成150-300mM乙酸鉀，4-20mM乙酸鎂，1-10％甘油，0.5-2.5mM ATP，0.5-2.5mMCTP，0.5-2.5mM GTP，0.5-2.5mM UTP，0.1-2mM的各種氨基酸(所有的20種天然存在的氨基酸)，10.8微克/毫升葉酸，0.5-5mM EDTA，100mM HEPES-KOH pH7.6/30℃，1微克/毫升利福平，0.03％疊氮化鈉，10-100mM乙酰磷酸，480微克/毫升來自大腸埃希氏桿菌MRE600的tRNA，1-10mM二硫蘇糖醇，1-10mM巰基乙磺酸，70mM KOH，0.1U/微升RNA酶抑制劑，1-20微克/毫升模板，100-500微克/毫升大腸埃希氏桿菌A19溶胞產(chǎn)物，1-10U/微升T7-RNA聚合酶。
本發(fā)明因此還涉及本發(fā)明反應(yīng)器用于酶促反應(yīng)特別是制備蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)的用途。
根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器用于獨(dú)立進(jìn)行的反應(yīng)例如只是產(chǎn)生蛋白質(zhì)的翻譯反應(yīng)或者只是體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)也是可能的。


圖1基體柱反應(yīng)器的可能實(shí)施方案和VR(反應(yīng)器體積)，VM(基體體積)和V0(排斥體積)的說明。
附圖2加和不加平衡過的基體的間歇式反應(yīng)中GFP的合成(實(shí)施例1)。
附圖3
CECF反應(yīng)器和反應(yīng)室中含有基體的CECF反應(yīng)器中GFP的合成。使用相同的試劑進(jìn)行這兩個反應(yīng)(實(shí)施例2)。
附圖4CECF反應(yīng)器中和相當(dāng)大小的柱反應(yīng)器中GFP的合成。使用相同的試劑進(jìn)行這兩個反應(yīng)(實(shí)施例3)。
附圖5CECF反應(yīng)器中和柱反應(yīng)器(靜態(tài)方法)中GFP的合成。柱反應(yīng)器中裝有1毫升和3毫升反應(yīng)溶液。使用相同的試劑進(jìn)行所有的反應(yīng)(實(shí)施例4)。
附圖6200毫升柱反應(yīng)器中GFP的合成(動態(tài)方法)。施加20毫升反應(yīng)溶液。使用相同的試劑作為對照進(jìn)行0.1毫升間歇式反應(yīng)和1毫升CECF反應(yīng)(實(shí)施例5)。
附圖7GFP表達(dá)載體pIVEX2.1-GFP的質(zhì)粒圖和序列(SEQ.ID.NO1)。
附圖8CAT表達(dá)載體pIVEX1.1-CAT的質(zhì)粒圖和序列(SEQ.ID.NO2)。
實(shí)施例通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。列出的反應(yīng)成份，反應(yīng)器和GFP測定和CAT測定適用于所有的列出的實(shí)施例。
使用綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成作為例子來測試根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器和本發(fā)明方法。作為轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。在處于T7噬菌體啟動子控制下的表達(dá)質(zhì)粒上編碼GFP-cDNA和CAT-cDNA。相應(yīng)地利用DNA-依賴性T7-RNA聚合酶發(fā)生生成mRNA的轉(zhuǎn)錄作用。體外以這種方式轉(zhuǎn)錄的mRNA借助于偶聯(lián)體系中存在的大腸埃希氏桿菌溶胞產(chǎn)物而翻譯成蛋白質(zhì)。
A)反應(yīng)成份1.質(zhì)粒pIVEX2.1-GFP含有來自Aequoria victori的突變體GFPcycle3(27kDa)形式的綠色熒光蛋白質(zhì)的序列(自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)(1996)14，314-319)；GFPcycle3突變體的編碼區(qū)克隆到pTU58中而不是野生型GFP序列(科學(xué)(Science)(1994)263，802)，參見圖7/SEQ ID NO1。pIVEX1.1-CAT含有來自大腸埃希氏桿菌的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因(參見圖8/SEQ IDNO2)。
2.大腸埃希氏桿菌S30溶胞產(chǎn)物根據(jù)Zubay(Annu.Rev.Genet.(1973)7，267)的修飾的方法使用大腸埃希氏桿菌A19菌株制備溶胞產(chǎn)物。修飾的溶胞產(chǎn)物緩沖液100mMHEPES-KOH pH7.6/30℃，14mM乙酸鎂，60mM乙酸鉀，0.5mM二硫蘇糖醇。各種實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)率差別是由于不同的溶胞產(chǎn)物制劑。
3.反應(yīng)溶液185mM乙酸鉀，15mM乙酸鎂，4％甘油，2.06mM ATP，1.02mM CTP，1.64mM GTP，1.02mM UTP，257μM的各種氨基酸(所有的20種天然存在的氨基酸)，10.8微克/毫升葉酸，1.03mM EDTA，100mM HEPES-KOH pH7.6/30℃，1微克/毫升利福平，0.03％疊氮化鈉，40mM乙酰磷酸，480微克/毫升來自大腸埃希氏桿菌MRE600的tRNA，2mM二硫蘇糖醇，10mM巰基乙磺酸，70mM KOH，0.1U/微升RNA酶抑制劑，15微克/毫升質(zhì)粒，220微升/毫升大腸埃希氏桿菌A19溶胞產(chǎn)物，2U/微升T7-RNA聚合酶。
4.供應(yīng)溶液185mM乙酸鉀，15mM乙酸鎂，4％甘油，2.06mM ATP，1.02mM CTP，1.64mM GTP，1.02mM UTP，257μM的各種氨基酸(所有的20種天然存在的氨基酸)，10.8微克/毫升葉酸，1.03mM EDTA，100mM HEPES-KOH pH7.5/30℃，1微克/毫升利福平，0.03％疊氮化鈉，40mM乙酰磷酸，2mM二硫蘇糖醇，10mM巰基乙磺酸，70mM KOH。
5.平衡過的基體根據(jù)供應(yīng)商的說明以溶脹狀態(tài)洗滌象細(xì)Sephadex G25這樣的凝膠基體。用對色譜柱的常規(guī)方法裝填空柱子。裝填過的色譜柱用1-2柱體積的供應(yīng)溶液平衡。對于間歇式反應(yīng)和CECF反應(yīng)，通過將凝膠基體幾次懸浮于供應(yīng)溶液并且稍微減壓抽吸干而將凝膠基體平衡。將該方法處理過的基體加給批混合物或者摻入CECF反應(yīng)器中。
B)反應(yīng)器對于間歇式反應(yīng)使用塑料制成的可密封的反應(yīng)器。使用的CECF反應(yīng)器包括兩個室，具有1毫升容積的反應(yīng)室和具有大約10毫升容積的供應(yīng)室。室之間由10kDa透析膜彼此分開并且各自可以通過可閉合的開口裝載。各室含有磁子攪拌棒。使用備好待用的PD10柱(Pharmacia)或者可以恒溫的并且裝有凝膠基體的商業(yè)上可獲得的色譜柱(Pharmacia)作為基體柱反應(yīng)器。所有的反應(yīng)器類型在30℃下操作。振蕩間歇式反應(yīng)混合物，攪拌CECF反應(yīng)，加載基體柱反應(yīng)器并且使用泵洗脫。
C)GFP測定為了生成熒光團(tuán)，GFP要求存在足量的氧。溶解于反應(yīng)溶液中的氧的量少并且不足以使轉(zhuǎn)化完全。因此，在測量之前將所有樣品在4℃下“熟化”12-32小時。使用來自Kontron公司的Tegimenta SFM-25型光譜熒光計測定樣品。在395nm波長下測定激發(fā)作用，在510nm波長下測定發(fā)射作用。
使用來自Roche Diagnostics的編輯號是No.1814524的重組GFP作為標(biāo)準(zhǔn)物。使用濃度是1微克/毫升和2微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。
為了測定，根據(jù)濃度，使用100mM HEPES-KOH pH7.6/30℃，14mM乙酸鎂，60mM乙酸鉀，0.5mM二硫蘇糖醇將樣品稀釋到1∶50至1∶400。
D)CAT測定根據(jù)廠商說明使用CAT FAST綠色熒光底物(分子探針)用酶學(xué)方法進(jìn)行CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)測定。
E.方法實(shí)施例1基體間歇式反應(yīng)器對間歇式反應(yīng)器間歇式反應(yīng)混合物的組成如上所述(與反應(yīng)溶液相同)。為了起始反應(yīng)，最后向混合物加入模板質(zhì)粒。向可密封反應(yīng)器加入1毫升等份的反應(yīng)溶液。向反應(yīng)混合物之一加入2克平衡過的凝膠基體(SephadexG25，研細(xì))。將混合物密封并且在振動下在30℃下溫育4小時。通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定GFP的產(chǎn)率(參見上文)。

*因?yàn)樽懔抗?yīng)氧，所以不要求熟化過程結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)間歇式反應(yīng)相比，加入凝膠基體將熒光活性GFP的產(chǎn)率提高61％。
實(shí)施例2含有基體的CECF反應(yīng)器對CECF反應(yīng)器將0.5毫升平衡過的凝膠基體(Sephadex G-10)摻入到CECF反應(yīng)器的反應(yīng)室(1毫升反應(yīng)室，10毫升供應(yīng)室)。將具有改變組成的0.5毫升反應(yīng)溶液裝入反應(yīng)室。反應(yīng)溶液的高分子成份是雙倍濃度(960微克/毫升來自大腸埃希氏桿菌MRE600的tRNA，0.2U/微升RNA酶抑制劑，30微克/毫升質(zhì)粒，440微升/毫升大腸埃希氏桿菌A19溶胞產(chǎn)物，4U/微升T7-RNA聚合酶)，并且低分子成份的濃度是單一濃度(即和供應(yīng)溶液中的一樣)。將10毫升供應(yīng)溶液裝入供應(yīng)室。標(biāo)準(zhǔn)條件下在CECF反應(yīng)器中進(jìn)行對比反應(yīng)。即將1毫升含有15微克GFP質(zhì)粒的反應(yīng)溶液裝入反應(yīng)室并且將大約10毫升供應(yīng)溶液裝入供應(yīng)室。兩個反應(yīng)器在攪拌下(150rpm)在30℃下溫育20小時。各反應(yīng)期終止時，取出反應(yīng)室內(nèi)含物，并且通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定合成的GFP的產(chǎn)率(參見上文)。

*4℃下熟化36小時。
結(jié)果基體摻入CECF反應(yīng)器反應(yīng)室中將熒光活性GFP的制備提高56％。
實(shí)施例3基體柱反應(yīng)器(1/10規(guī)格)對CECF反應(yīng)器的比較標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行CECF反應(yīng)，即將1毫升含有15微克GFP質(zhì)粒的反應(yīng)溶液裝入反應(yīng)室并且將大約10毫升供應(yīng)溶液裝入供應(yīng)室。反應(yīng)器在攪拌下(150rpm)在30℃下溫育20小時。使用裝有Sephadex G25(Pharmacia)的商售PD-10柱作為基體柱反應(yīng)器。以生產(chǎn)商提供的信息為基礎(chǔ)估計反應(yīng)器參數(shù)如下VR＝8.3毫升，VO＝2.5毫升，VM＝5.6毫升。該柱子用10毫升供應(yīng)溶液平衡。加入1毫升反應(yīng)溶液(15微克GFP質(zhì)粒/毫升)之后，封閉柱子并且30℃下溫育6小時。各反應(yīng)期終止時，從CECF反應(yīng)器取出反應(yīng)溶液，或者從PD-10柱洗脫出反應(yīng)溶液。并且通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定合成的GFP的產(chǎn)率(參見上文)。
結(jié)果

*4℃下GFP熟化20小時。
PD-10柱上進(jìn)行的反應(yīng)得到362微克熒光活性GFP。與相同規(guī)格(1毫升)的CECF反應(yīng)相比，這得到76％的產(chǎn)率。
實(shí)施例4基體柱反應(yīng)器(3/10規(guī)格，靜態(tài)方法)10毫升研細(xì)的Sephadex G25裝入兩個色譜柱中并且接著各自用1柱體積的供應(yīng)溶液平衡。以生產(chǎn)商提供的信息為基礎(chǔ)估計反應(yīng)器參數(shù)VR＝10毫升，VO＝3毫升，VM＝7毫升。將1毫升反應(yīng)溶液施加給柱子1并且將3毫升反應(yīng)溶液施加給柱子2。接著封閉柱子并且30℃下溫育20小時。進(jìn)行1毫升間歇式反應(yīng)和1毫升CECF反應(yīng)器中的反應(yīng)作為對照(也是30℃下20小時)。反應(yīng)期完成后洗脫柱子。并且通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定各自合成的GFP的產(chǎn)率(參見上文)。

*4℃下熟化20小時。
結(jié)果相對于使用的反應(yīng)溶液的量來說，兩個柱反應(yīng)器進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)率與CECF反應(yīng)器的產(chǎn)率是可比較的。在加載了三倍反應(yīng)溶液量的柱子2的情況下，可能將總產(chǎn)率提高2.2倍。
實(shí)施例5基體柱反應(yīng)器(20/200規(guī)格，動態(tài)方法)中GFP的合成研細(xì)的Sephadex G25裝入夾套色譜柱(Pharmacia)中并且接著用1柱體積的供應(yīng)溶液平衡。以生產(chǎn)商提供的信息為基礎(chǔ)估計反應(yīng)器參數(shù)如下VR＝200毫升，VO＝60毫升，VM＝140毫升。利用水浴使柱子保持恒溫30℃。將用151微克/毫升GFP質(zhì)粒起始的20毫升反應(yīng)溶液泵壓到柱子上(120毫升/小時)。接著以12毫升/小時的速度將反應(yīng)溶液泵壓通過基體。將洗脫液在4℃下分級分離。使用相同的反應(yīng)混合物進(jìn)行CECF反應(yīng)(1毫升規(guī)格)和間歇式反應(yīng)(0.1毫升規(guī)格)作為對照。通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定級分和對照混合物中合成的GFP的產(chǎn)率(參見上文)。

結(jié)果在20毫升大小基體柱反應(yīng)器中10小時之內(nèi)產(chǎn)生15.2毫克熒光活性GFP。因此產(chǎn)率是0.76毫克/毫升初始反應(yīng)溶液。0.58毫克/毫升CECF反應(yīng)器中的產(chǎn)率在這種反應(yīng)器類型中在通常獲得的范圍內(nèi)。因此基體柱反應(yīng)器具有與CECF反應(yīng)器可比較的產(chǎn)率(131％)。該項實(shí)驗(yàn)還證明與1毫升CECF混合物相比規(guī)格可以提高20-倍而產(chǎn)率沒有明顯損失。
實(shí)施例6基體柱反應(yīng)器(12.5/125規(guī)格，動態(tài)方法)中CAT合成研細(xì)的Sephadex G25裝入夾套色譜柱(Pharmacia)中并且接著用1柱體積的供應(yīng)溶液平衡(30毫升/小時)。以生產(chǎn)商提供的信息為基礎(chǔ)估計反應(yīng)器參數(shù)如下VR＝125毫升，VM＝87.5毫升，VO＝37.5毫升。利用水浴使柱子保持恒溫30℃。將用15微克/毫升pIVEX1.1-CAT的質(zhì)粒起始的12.5毫升反應(yīng)溶液泵壓到柱子上(18毫升/小時)。接著以3.6毫升/小時的速度將反應(yīng)溶液泵壓通過反應(yīng)器。將洗脫液在4℃下分級分離。利用酶促熒光測試測定功能-活性CAT的產(chǎn)率。

結(jié)果基體柱反應(yīng)器中12.5毫升反應(yīng)混合物中產(chǎn)生6.6毫克CAT酶。
實(shí)施例7基體間歇式反應(yīng)器中CAT合成用15微克/毫升pIVEX1.1-CAT開始兩個50微升間歇式反應(yīng)。反應(yīng)首先在30℃下溫育。30分鐘之后向一批加入100毫克平衡過的基體(Sephadex G25，研細(xì)的)。6小時之后利用熒光測試測定功能-活性CAT酶的產(chǎn)率。

結(jié)果通過加入平衡過的基體將產(chǎn)率提高74％。實(shí)施例8基體間歇式反應(yīng)器中基體量的變化用15微克/毫升pIVEX2.1-GFP開始50微升間歇式反應(yīng)。反應(yīng)在30℃下溫育。30分鐘之后向混合物加入不同量(0毫克，50毫克，100毫克和150毫克)的平衡過的基體(Sephadex G25，研細(xì)的)。5小時反應(yīng)時間之后將混合物在4℃下保持以使產(chǎn)生的GFP熟化。

*4℃下GFP熟化1小時。
結(jié)果通過加入平衡過的基體將產(chǎn)率提高至多250％。實(shí)施例9基體柱反應(yīng)器(1/10規(guī)格，動態(tài)方法)中不同凝膠材料的比較根據(jù)生產(chǎn)商說明將各種凝膠材料(Sephadex，Bio-Gel)溶脹，裝入10毫升柱子中并且用15毫升供應(yīng)溶液平衡。對各個柱子施加1毫升反應(yīng)溶液(15微克/毫升pIVEX2.1-GFP)。然后直接用200微升供應(yīng)溶液洗滌反應(yīng)溶液。以2小時間隔加入1毫升等份的供應(yīng)溶液(保溫箱，30℃)。收集洗脫出的級分并且在4℃下貯存。通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定各自合成的GFP的產(chǎn)率(參見上文)。

*4℃下GFP熟化20小時。
結(jié)果基體反應(yīng)器中可以使用就聚合物類型，粒度和排阻分子量來說不同的各種凝膠材料。
序列表<110>Roche Diagnostics GmbH<120>基體反應(yīng)器和在該反應(yīng)器中制備產(chǎn)物的方法<130>5307/00/<140><141><150>10011209.9<151>2000-03-08<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>4342<212>DNA<213>Aequoria victori<400>1aaacgacggc cagtgccaag cttgcatgca aggagatggc gcccaacagt cccccggcca 60cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag tggcgagccc 120gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg 180tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat ctcgatcccg cgaaattaat 240acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg tttaacttta 300agaaggagat ataccatgac tagcaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt 360cttgttgaat tagatggtga tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa 420ggtgatgcta catacggaaa gcttaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct 480gttccatggc caacacttgt cactactttc tcttatggtg ttcaatgctt ttcccgttat 540ccggatcata tgaaacggca tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag 600gaacgcacta tatctttcaa agatgacggg aactacaaga cgcgtgctga agtcaagttt 660gaaggtgata cccttgttaa tcgtatcgag 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1.用于其中涉及低分子和高分子反應(yīng)物的反應(yīng)的反應(yīng)器，反應(yīng)器空間VR含有能在含水溶液中溶脹并且由多孔材料組成的基體，所述多孔材料-能吸收低分子反應(yīng)物并且-排斥高分子反應(yīng)物，并且其中所述反應(yīng)器裝有至少20體積％的基體。
2.權(quán)利要求1要求的反應(yīng)器，其中由于反應(yīng)器空間的基體結(jié)構(gòu)，在一個反應(yīng)器空間中存在反應(yīng)區(qū)室和供應(yīng)區(qū)室。
3.權(quán)利要求1或2要求的反應(yīng)器，其中在基體的排斥體積V0中發(fā)生反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1-3之一要求的反應(yīng)器，其中基體體積VM作為低分子反應(yīng)成分和特別是底物的供應(yīng)區(qū)室。
5.權(quán)利要求1-4之一要求的反應(yīng)器，其中反應(yīng)區(qū)室和供應(yīng)區(qū)室不被膜隔開。
6.權(quán)利要求1-5之一要求的反應(yīng)器，其中反應(yīng)區(qū)室和供應(yīng)區(qū)室不被膜隔開，但是另外有一個與反應(yīng)器空間直接連接或者通過半滲透膜連接的供應(yīng)容器。
7.權(quán)利要求1-6之一要求的反應(yīng)器，其中所述基體是凝膠基體。
8.權(quán)利要求1-7之一要求的反應(yīng)器，其中所述反應(yīng)器空間具有圓柱形形狀。
9.權(quán)利要求1-8之一要求的反應(yīng)器，其中所述反應(yīng)器是裝有凝膠基體的柱子。
10.權(quán)利要求1-9之一要求的反應(yīng)器，其中所述基體具有0.5-300kDa范圍內(nèi)的排阻限。
11.權(quán)利要求1-10之一要求的反應(yīng)器，其中所述基體由非交聯(lián)的或者交聯(lián)的有機(jī)聚合物或共聚物和/或無機(jī)材料組成。
12.在權(quán)利要求1-11之一要求的反應(yīng)器中制備產(chǎn)物的方法，其中起始物是低分子和高分子原料，其特征在于-反應(yīng)混合物的低分子成分和特別是反應(yīng)消耗的底物大部分在整個反應(yīng)器空間VR中均勻分布，-反應(yīng)器空間中只有基體的排斥體積V0對于高分子成分特別是對催化活性反應(yīng)物是有效的并且-底物只有在基體的排斥體積V0中才可以被轉(zhuǎn)化。
13.權(quán)利要求12要求的方法，其特征在于它是酶促方法。
14.用于制備蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)的權(quán)利要求12或13之一要求的方法，其中所述高分子成份包括核糖體，tRNAs，DNA模板，RNA聚合酶，mRNA和酶和來自溶胞產(chǎn)物的調(diào)節(jié)蛋白，而低分子成份包括底物和效應(yīng)物，緩沖物質(zhì)和鹽。
15.權(quán)利要求12-14之一要求的方法，其特征在于-凝膠基體被摻入到反應(yīng)器空間中，-用供應(yīng)溶液平衡凝膠基體，-反應(yīng)器空間中的平衡過的凝膠基體接觸反應(yīng)溶液并且-反應(yīng)器保持在恒溫下。
16.權(quán)利要求15要求的方法，其特征在于-在裝有基體的室或柱中進(jìn)行該方法，-將反應(yīng)溶液施加給柱子和-反應(yīng)期間反應(yīng)溶液在柱子上停留。
17.權(quán)利要求15要求的方法，其特征在于-在裝有基體的室或柱中進(jìn)行該方法，-將反應(yīng)溶液施加給柱子和-反應(yīng)溶液連續(xù)泵壓或一步一步通過柱子，反應(yīng)期間持續(xù)如此。
18.權(quán)利要求15要求的方法，其特征在于-在間歇式反應(yīng)器中進(jìn)行該方法和-反應(yīng)溶液和平衡過的凝膠基體在反應(yīng)器空間中匯合在一起，其中，加入的基體體積至少是反應(yīng)溶液體積的20體積％。
19.權(quán)利要求15要求的方法，其特征在于-在CECF反應(yīng)器中進(jìn)行該方法，-將凝膠基體加入到CECF反應(yīng)器的反應(yīng)區(qū)室中和-基體體積大于反應(yīng)區(qū)室容積的20體積％。
20.權(quán)利要求15要求的方法，其中-在CFCF反應(yīng)器中進(jìn)行該方法，-將凝膠基體加入到CFCF反應(yīng)器的反應(yīng)區(qū)室中和-基體體積大于反應(yīng)區(qū)室容積的20體積％。
21.權(quán)利要求1-11之一要求的反應(yīng)器用于酶促反應(yīng)的用途。
22.權(quán)利要求1-11之一要求的反應(yīng)器用于制備蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)的用途。
23.權(quán)利要求12-20之一要求的方法用于酶促反應(yīng)的用途。
24.權(quán)利要求11-20之一要求的方法用于制備蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)的用途。
25.在權(quán)利要求12-20之一要求的方法中進(jìn)行制備蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)的配方。
26.權(quán)利要求25要求的包括供應(yīng)溶液和反應(yīng)溶液的配方。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于其中涉及低分子和高分子反應(yīng)物的反應(yīng)的基體反應(yīng)器。反應(yīng)器空間V
文檔編號C40B60/14GK1429275SQ01806292
公開日2003年7月9日 申請日期2001年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月8日
發(fā)明者B·布赫伯格, W·穆特, A·雷德 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司