專利名稱：用于例如細(xì)胞裂解的脈動(dòng)壓力波的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種方法，通過(guò)該方法受控?zé)嵩?優(yōu)選激光)在封閉液體中產(chǎn)生脈動(dòng)蒸汽泡。脈動(dòng)速率(頻率)優(yōu)選在超聲區(qū)域內(nèi)并具有很大的壓力，借此在液體中出現(xiàn)空化作用(cavitation)。所述空化作用的結(jié)果是引起懸浮成分例如細(xì)胞或細(xì)菌芽孢破裂。細(xì)胞成分的超聲破裂公知為通過(guò)超聲波裂解。
背景技術(shù)：
當(dāng)測(cè)試生化成分例如細(xì)胞或細(xì)菌芽孢時(shí)，感興趣的物質(zhì)(例如DNA、RNA、血紅蛋白、蛋白質(zhì)等)必須從所述細(xì)胞或芽孢中提取出來(lái)，感興趣的物質(zhì)包含在細(xì)胞或芽孢中，因此屏蔽化學(xué)藥物、酶的直接進(jìn)入或者直接測(cè)量。破裂細(xì)胞膜或細(xì)菌芽孢壁的方法公知為裂解(lysing)。裂解的方法之一為施用裂解劑，能化學(xué)裂解打開或溶解所述膜或壁。其他方法包括機(jī)械法如研磨(例如“弗氏壓碎器”)或反復(fù)凍融，反復(fù)凍融中的結(jié)晶作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁物理破裂。
一種常用的裂解方法為超聲法。超聲法包括將懸浮液中的細(xì)胞或芽孢暴露于超聲。細(xì)胞或芽孢懸浮在其中的液體介質(zhì)(多數(shù)通常為含水的)充當(dāng)超聲能的載體。如果相關(guān)的壓力數(shù)值大，會(huì)在液體中產(chǎn)生空泡?？栈饔冒ǜ邏何⑴莸男纬?分別潰滅。微泡的形成和隨后潰滅將引起液體介質(zhì)中的潰滅剪切力，并且同樣地存在于這里所包含的細(xì)胞或芽孢周圍，最后破壞打開膜及壁，并游離內(nèi)容物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在液體中產(chǎn)生脈動(dòng)壓力波(PPW)的方法，使用內(nèi)在產(chǎn)生換能器，即無(wú)需與外在PPW換能器(例如外在超聲波聚能器(ultrasound horn)或壓電換能器)具有機(jī)械界面，所述液體可以包含于微通道(micro channel)或微室(micro chamber)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種在液體中產(chǎn)生PPW的方法，所述液體可以包含于微通道或微室，所述PPW引起液體中的空化作用。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供裂解液體中一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的方法，所述液體可以包含于微通道或微室。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供解聚集液體中一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的方法，所述液體可以包含于微通道或微室。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種裂解細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法，優(yōu)選還能與分析裂解細(xì)胞成分的下一個(gè)步驟兼容或?qū)υ摬襟E有貢獻(xiàn)的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供產(chǎn)生液體中局部的(即空間限制的)PPW的方法，例如獲得局部空化作用和/或細(xì)胞的局部裂解；或者獲得微粒的局部解聚集。
當(dāng)閱讀說(shuō)明書和實(shí)施例時(shí)，本發(fā)明的其他目的變得顯而易見(jiàn)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在液體中產(chǎn)生脈動(dòng)壓力波(PPW)的方法，該方法包括如下步驟a)提供加熱裝置，b)用該加熱裝置加熱一部分液體，以使液體的該部分蒸發(fā)，由此形成蒸汽泡，c)或者部分冷凝或者全部冷凝蒸汽泡，以及d)重復(fù)步驟b)和步驟c)。
優(yōu)選所述PPW為超聲波。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在液體中裂解生物細(xì)胞的方法，該方法包括在液體中產(chǎn)生脈動(dòng)壓力波(PPW)。
本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及在液體中解聚微粒的方法，該方法包括在液體中產(chǎn)生脈動(dòng)壓力波(PPW)。


在本發(fā)明以下一些實(shí)施方式中將對(duì)照附圖描述，圖1表示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，其中激光能被控制在含有液體介質(zhì)的局限內(nèi)；圖2表示使用了包被加熱原件的實(shí)施方式，以及；圖3表示加熱器/激光循環(huán)以及產(chǎn)生20kHz超聲波的示例性操作方式中結(jié)果泡形成和消失的時(shí)間圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在液體中產(chǎn)生脈動(dòng)壓力波(PPW)的方法，該方法包括如下步驟a)提供加熱裝置，b)用所述加熱裝置加熱一部分液體，以使液體的該部分蒸發(fā)，由此形成蒸汽泡，c)冷凝該蒸汽泡，以及d)重復(fù)步驟b)和步驟c)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述PPW為超聲波。
所述PPW可以在多種液體中產(chǎn)生。例如，所述液體可以包括選自由水、二甲亞砜、丙酮和醇所組成的組中的溶劑。
并且或者可選地，所述液體可以例如包括非極性溶劑例如苯、甲苯、二甲苯、庚烷、辛烷和它們的混合物。
所述醇可以例如選自由甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇所組成的組。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，所述液體包括至少10％(w/w)的水例如至少50％(w/w)或75％(w/w)，進(jìn)而優(yōu)選至少90％(w/w)的水。
所述液體可以例如包括樣品，諸如全血、血清、血漿、唾液、尿、組織或者它們的成分。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述液體為用水性溶液稀釋的全血。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述液體為脫氣液體，例如脫氣的水。脫氣液體可以是例如每千克液體包括至多15mg溶解的氣體，例如至多10mg、5mg、3mg、2mg、1mg、0.5mg、0.1mg，或者0.05mg，例如至多0.01mg。例如，脫氣水性液體可以是例如每千克水性液體包括至多15mg溶解的氣體，例如至多10mg、5mg、3mg、2mg、1mg、0.5mg、0.1mg，或者0.05mg，例如至多0.01mg。
所述液體可以包括一種或多種添加劑。所述一種或多種添加劑可以例如選自由去污劑、防腐劑、pH緩沖液、鹽和水溶性聚合物所組成的組。
所述去污劑可以例如選自由吐溫20、乙基苯基聚乙二醇(NP 40)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、CHAPS、CHAPSO和十二烷基硫酸鈉(SDS)所組成的組。
所述防腐劑可以為例如疊氮化鈉。
所述pH緩沖液可以例如選自由磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、3-嗎啉基丙磺酸(Mops)和4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(HEPES buffer)所組成的組中。
所述鹽可以例如選自由MgCl2、NaCl、KCl、谷氨酸鈉和谷氨酸鉀所組成的組。
所述水溶性聚合物可以為例如聚乙二醇(PEG)和/或聚乙烯醇(PVA)。
更多有關(guān)信息以及相關(guān)添加劑實(shí)例可以在Sambrook等人的或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般教科書中找到。
用在上下文“X和/或Y”中的名詞“和/或”應(yīng)該解釋為“X”或“Y”或者“X和Y”。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述液體例如水性液體的平均溫度，在產(chǎn)生PPW過(guò)程中溫度范圍為-10℃至120℃，例如0℃至100℃、10℃至80℃和20℃至60℃。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述液體溫度范圍為60℃至80℃，更優(yōu)選范圍為65℃至75℃，例如約71℃。應(yīng)當(dāng)注意的是，雖然所述液體的平均溫度具有代表性的范圍為-10℃至120℃，但是可以存在具有更高溫度的部分液體，例如，由于通過(guò)加熱裝置加熱和/或由于由PPW引起空化作用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟b)和c)中蒸發(fā)和部分或全部濃縮的部分液體，各自表現(xiàn)為液體總質(zhì)量的小百分率。所述部分液體可以為例如該液體總質(zhì)量的至多1％，例如至多0.5％、0.1％或0.05％，或者優(yōu)選是該液體總質(zhì)量的至多0.01％，例如至多0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％，例如至多0.000005％。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)膜狀沸騰蒸發(fā)所述部分液體。膜狀沸騰的產(chǎn)生可以是通過(guò)充分快速加熱部分液體，以使部分液體的蒸發(fā)幾乎瞬間完成，例如至多500μs或者優(yōu)選至多100μs、50μs、10μs或5μs，例如更優(yōu)選至多1μs、0.1μs或0.01μs?？焖僬舭l(fā)通常形成保護(hù)性蒸氣層，用以保護(hù)剩余部分的液體避免受熱。優(yōu)選地，在0.1μs至100μs范圍內(nèi)完成部分液體的蒸發(fā)。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，所述液體接觸壁的壁表面。所述壁可以例如形成包含該液體的容器的一部分。所述容器可以例如為微室或微通道。
微室通常具有至多100μL的容積，例如至多50μL、10μL、5μL、1μL、100nL、或10nL，例如至多1nL的容積?？梢灶A(yù)期更小的微室容積。例如微室可以具有至多100pL的容積，例如至多50pL、10pL、5pL或1pL，例如至多0.1pL的容積。優(yōu)選所述微室具有至多10nL的容積，更優(yōu)選所述微室通常具有至多1nL的容積。
在pepi中，所述微室具有0.1pL至100μL范圍的容積，優(yōu)選10pL至1μL范圍，更優(yōu)選100pL至10nL范圍，例如0.5nL、1nL或5nL。
所述微室可以包括一個(gè)或多個(gè)開口，其例如可以連接到一個(gè)或多個(gè)微通道。
微通道通常具有至多500μm的橫截面尺寸，例如至多250μm、150μm、100μm、75μm、50μm、25μm或15μm，例如至多5μm。優(yōu)選地，所述微通道具有至多100μm的橫截面尺寸，更優(yōu)選所述微通道具有至多50μm的橫截面大小。微通道可以具有不均勻尺寸，例如100μm的寬度和50μm的深度。
許多類型的加熱方式可以用于加熱所述部分液體。例如加熱方式可以選自由加熱元件和電磁輻射所組成的組。
所述加熱元件可以為例如歐姆加熱元件，例如電阻器，或者液體的部分，例如所述液體具有電流傳導(dǎo)性質(zhì)。
所述加熱元件可以例如位于接觸液體的壁表面或者位于壁中。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述加熱元件為微型。例如，優(yōu)選加熱元件的最大尺寸為至多1000μm，例如至多1000μm、500μm、250μm、150μm、100μm或50μm，例如至多25μm。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，所述電磁輻射為電磁輻射束，例如聚焦束，諸如聚焦激光束。
所述電磁輻射通常通過(guò)電磁輻射源提供。所述電磁輻射源可以為激光、例如氣體激光器、固態(tài)激光器，諸如激光二極管(LD)，或者光源可以為發(fā)光二極管(LED)氙燈或者足夠強(qiáng)度的任何燈絲燈泡?？梢砸曰蛘呙}沖方式或者持續(xù)方式操作激光器或LED，氙燈或燈絲燈泡可以使用機(jī)械阻擋或偏移方式調(diào)節(jié)。
所述電磁輻射可以例如被液體吸收或者被包括與液體接觸壁表面的壁吸收。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述電磁輻射被接觸液體的壁表面吸收。所述壁表面可以例如包括光吸收材料層，在該情況下，壁的剩余部分可以起到電磁輻射非吸收載體的作用。
在一個(gè)實(shí)施方式中所述容器，例如微通道和/或微室，包括透明窗，該窗對(duì)電磁輻射波長(zhǎng)透明。當(dāng)使用例如紅外激光器提供的包括波長(zhǎng)范圍從700nm至3000nm的電磁輻射時(shí)，所述透明窗可以例如包括硅。所述透明窗可以例如包括可以透過(guò)可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍的光的玻璃或塑料。例如可以使用紅光二極管激光器，具有中心波長(zhǎng)632nm、635nm、670nm、680nm或720nm。
所述光吸收材料可以是任何容易吸收從光源發(fā)射的光能并從而將所吸收的光轉(zhuǎn)化為焦耳熱的材料。一種所述材料可以是氮化鋁；或者尤其當(dāng)使用硅作為基底材料時(shí)，可以是摻雜硅例如硼摻雜硅或磷摻雜硅；或者在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可以是含有提高特殊波長(zhǎng)或多重波長(zhǎng)吸收的添加劑的聚合物(例如來(lái)自Avecia-UK(PRO-JET830NP)、Epolin-US(EpoLightTM4121)、Clearweld-US(LD120)或Treffert-FR的商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品)。
光吸收材料可以形成微通道壁或微室壁的主要部分，確保壁的熱阻足夠低允許基本量的熱被轉(zhuǎn)移到微通道或微室。因此光吸收材料可以充當(dāng)熱板，例如在微通道內(nèi)加熱液體。所述光吸收材料可以吸收狹窄區(qū)域光譜，或者可以完全不通透并吸收從紫外線到中紅外線的任何波長(zhǎng)。
所述光吸收物質(zhì)可以涂布、噴霧、沉積或點(diǎn)綴(spotted)在壁上，可以形成緊貼通道壁的層，或者吸收到通道壁中。所述微通道和/或微室可以通過(guò)第一和第二基層物質(zhì)形成，所述第一基層物質(zhì)包括透明窗并且所述第二基層物質(zhì)包括光吸收材料。
優(yōu)選選擇所述光吸收材料，以使照射到壁表面的電磁輻射強(qiáng)度的至少1％能被吸收到光吸收材料中，例如至少2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或者99％，例如至少99.99％。
用加熱裝置加熱的部分液體形成的蒸汽泡通常達(dá)到最大高度范圍為1μm至200μm，優(yōu)選范圍為5μm至50μm，更優(yōu)選范圍為10μm至40，例如約25μm或約30μm。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在每一步驟b)中形成新的蒸汽泡?？蛇x地，當(dāng)新的步驟b)開始時(shí)，得自在前的步驟c)的蒸氣泡還沒(méi)有完全冷凝，并且來(lái)自新步驟b)的能量向存在的蒸汽泡加入新蒸氣。
通過(guò)步驟b)的加熱裝置加熱的持續(xù)時(shí)間范圍通常為0.1至100μs，優(yōu)選范圍為0.5至50μs，更優(yōu)選范圍為1至10μs。
在步驟c)中冷卻蒸汽泡，從而冷凝蒸汽泡。所述蒸汽泡可以例如在步驟c)過(guò)程中完全冷凝，即所有蒸汽泡的蒸汽恢復(fù)液體形式。
蒸汽泡可以被動(dòng)冷卻，即加熱裝置的能量散逸到周圍溶液中，也可以散逸到微室或微通道的壁中?？梢酝ㄟ^(guò)使用具有高導(dǎo)熱率的材料，例如各種金屬材料和半導(dǎo)體，加速蒸汽泡的被動(dòng)冷卻。在實(shí)施方式中，優(yōu)選硅為壁材料。
步驟b)的持續(xù)時(shí)間范圍通常為1至100μs，優(yōu)選范圍為5至50μs，更優(yōu)選范圍為10至40μs，例如15μs、20μs、25μs、30μs或35μs。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，以固定的頻率重復(fù)步驟b)和c)。
也可以以變化的頻率重復(fù)步驟b)和c)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，重復(fù)步驟b)和c)的頻率為0.5至1000kHz的范圍，例如10至500kHz的范圍，優(yōu)選15至150kHz的范圍，更優(yōu)選20至100kHz或15至50kHz的范圍。
新的步驟b)中，可以在先前步驟b)過(guò)程中形成先前蒸汽泡的微通道或微室中相同的位置上，形成蒸汽泡。此外，新的步驟b)中，可以在先前步驟b)過(guò)程中形成先前蒸汽泡的微通道或微室中不同的位置上，形成蒸汽泡。
新的步驟b)的新蒸汽泡可以包括與先前步驟b)的先前蒸汽泡所包括的部分液體基本相同的部分液體?？蛇x地，新蒸汽泡可以包括除在先前步驟b)中蒸發(fā)液體外的不同部分的液體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述液體流過(guò)微通道和/或微室。通常的流速范圍為1pL至100μL/分鐘，優(yōu)選范圍為1nL至10μL/分鐘，更優(yōu)選范圍為10nL至1μL/分鐘?？蛇x地，所述液體不流過(guò)微通道和/或微室。
在一次重復(fù)中步驟b)和步驟c)的總持續(xù)時(shí)間范圍通常為1μS至2mS，優(yōu)選范圍為2μS至100μS，更優(yōu)選范圍為10μS至50μS或者5μS至20μS。
在本發(fā)明的一個(gè)重要實(shí)施方式中，PPW引起液體中的空化作用。
當(dāng)施用在液體上的PPW能量強(qiáng)度超過(guò)將液體分子結(jié)合在一起的吸引力時(shí)，產(chǎn)生叫做空化作用的現(xiàn)象。空化作用貫穿微泡內(nèi)爆過(guò)程的形成、生長(zhǎng)和潰滅一不能與蒸汽泡混淆。所述微泡的內(nèi)爆產(chǎn)生在液體中短期存在的“熱點(diǎn)”，可以釋放足夠的能量促進(jìn)許多種化學(xué)反應(yīng)。
空化作用的效果可以受很多因素影響，例如液體溫度、PPW的強(qiáng)度、空化作用的持續(xù)時(shí)間以及PPW的頻率。
在液體中產(chǎn)生空化作用的關(guān)鍵為克服“空化閾”，該空化閾是被引入流體中的能量強(qiáng)度引發(fā)微泡形成、生長(zhǎng)和潰滅的點(diǎn)。然而不同的流體或液體具有不同的空化閾，只有施加的能量大于該空化閾才能促成空化作用形成。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，蒸汽泡的尺寸和/或液體排量以及微泡形成和冷凝的速率足以在液體中產(chǎn)生空化作用，即蒸汽泡通過(guò)擴(kuò)張各自收縮而施加在液體上的壓力。
例如，當(dāng)加熱裝置為電磁輻射束時(shí)，光斑面積、束的效果、加熱的持續(xù)時(shí)間、冷凝的持續(xù)時(shí)間，以及重復(fù)的次數(shù)應(yīng)當(dāng)足以產(chǎn)生空化作用。
可選地，如果加熱裝置為加熱元件，那么加熱元件上的電壓、加熱的持續(xù)時(shí)間、冷凝的持續(xù)時(shí)間，以及重復(fù)的次數(shù)應(yīng)當(dāng)足以產(chǎn)生空化作用。
空化作用通常發(fā)生在蒸發(fā)的液體部分附近。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選所述空化作用發(fā)生在離蒸汽泡外周至多5000μm的距離內(nèi)，例如至多2500μm、1000μm、750μm、500μm、400μm、300μm、200μm、150μm或100μm的距離內(nèi)，例如離蒸汽泡外周至多50μm的距離內(nèi)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，空化作用發(fā)生在離蒸汽泡外周至少50μm的距離內(nèi)，例如至少100μm、200μm、500μm、1000μm、2000μm或3000μm，的距離內(nèi)，例如離蒸汽泡外周至少5000μm的距離內(nèi)。
所述蒸汽泡的最大尺寸用于距離的計(jì)算。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述空化作用發(fā)生在離壁表面上電磁輻射束光斑中心至多5000μm的距離內(nèi)，例如例如至多2500μm、1000μm、750μm、500μm、400μm、300μm或100μm的距離，例如離壁表面上電磁輻射束光斑中心至多50μm的距離內(nèi)。
通常，所述空化作用發(fā)生在離壁表面上電磁輻射束光斑中心1μm至5000μm的距離范圍內(nèi)，例如1μm-50μm、50μm-100μm、100μm-250μm、250μm-500μm、500μm-1000μm和1000μm-5000μm的范圍。優(yōu)選所述空化作用至少發(fā)生在離壁表面上電磁輻射束光斑中心1μm-250μm的距離范圍內(nèi)，例如1μm-100μm的范圍。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述空化作用發(fā)生在離壁表面上電磁輻射束光斑中心至少50μm的距離范圍內(nèi)，例如至少100μm、200μm、500μm、1000μm、2000μm或3000μm的距離內(nèi)，例如離壁表面上電磁輻射束光斑中心至少5000μm的距離。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述空化作用發(fā)生在離加熱元件中心至多5000μm的距離內(nèi)，例如至多2500μm、1000μm、750μm、500μm、400μm、300μm或100μm的距離內(nèi)，例如離加熱元件中心至多50μm的距離。
可以用許多方法檢測(cè)空化作用的存在。例如可以使用敏感擴(kuò)音器檢測(cè)空化作用。可選地，可以使用溶解于水或甘油的空化作用示蹤物例如魯米諾(luminol)檢測(cè)空化作用。當(dāng)暴露于空化作用時(shí)，空化作用示蹤物發(fā)光，可以通過(guò)敏感光學(xué)檢測(cè)器例如光電倍增管、冷控溫CCD陣列(cooled CCD array)或者雪崩二極管檢測(cè)。如果加熱裝置為電磁輻射，可能需要濾出電磁輻射波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)空化作用示蹤物發(fā)出的光。
有用的魯米諾溶液可以通過(guò)將魯米諾(西格瑪化學(xué)公司，美國(guó))溶解在二甲亞砜(西格瑪化學(xué)公司，美國(guó))中制備，濃度10-2M，在即將使用前，用含0.01M磷酸鈉和0.15M氯化鈉的pH 7.4的磷酸鹽緩沖生理鹽水將該溶液稀釋至濃度為1×10-5M。
空化作用的另一指示劑為與液體接觸塑料表面的物理劣化。所述劣化可以借助顯微鏡或掃描電子顯微鏡(SEM)在視覺(jué)上檢測(cè)。
空化作用檢測(cè)的另一方法為，將微粒例如具有約5μm直徑的乳膠顆粒或者紅細(xì)胞的懸浮液暴露于PPM，并通過(guò)顯微鏡檢查所得的懸浮液。如果空化作用在所述懸濁液中發(fā)生，可以在懸浮液中找到得自受破壞的懸浮液微粒的亞微米碎片。
在本發(fā)明的一個(gè)重要實(shí)施方式中，所述液體包括微粒。例如，液體可以包括許多微粒，例如至少2個(gè)微粒、10個(gè)微粒、102個(gè)微粒、103個(gè)微粒、104個(gè)微粒、106個(gè)微?；?08個(gè)微粒，例如至少1010個(gè)微粒。所述溶液可以例如為微粒的懸浮液。
所述微粒可以包括選自由有機(jī)聚合物、金屬、金屬氧化物、合金、磁性材料和所述材料的組合所組成的組中的材料。所述金屬氧化物可以為氧化硅例如石英或玻璃。所述有機(jī)聚合物可以選自由聚乙烯乙二醇-聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯醇、多肽、聚乙烯、聚丙烯和聚甲基甲基丙烯酸酯(polymethamethacrylate)以及所述材料的組合物所組成的組。另外，所述微粒可以包括如上所述材料的一個(gè)或多個(gè)部分的復(fù)合材料。
所述微粒可以為例如選自由生物細(xì)胞、微小顆粒和納米顆粒所組成的組。
所述微粒可以例如具有范圍為1nm至500μm的最長(zhǎng)橫截面尺寸。所述微?？梢詾榧{米顆粒，即具有范圍為1nm至1000nm的最長(zhǎng)橫截面尺寸，例如25nm至1000nm，或者所述微?？梢詾槲⑿☆w粒，即具有范圍為1μm至500μm的最長(zhǎng)橫截面尺寸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述微粒為生物細(xì)胞。也就是說(shuō)，所述液體可以含有生物細(xì)胞或生物細(xì)胞的懸浮液。
所述生物細(xì)胞可以為例如細(xì)菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如紅血球細(xì)胞或白血球細(xì)胞或癌細(xì)胞。所述生物細(xì)胞還可以為細(xì)菌芽孢。
過(guò)度暴露于空化作用可以破壞生物細(xì)胞的成分，即受體、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述包括生物細(xì)胞的液體暴露于脈動(dòng)壓力波至多600秒，例如至多500秒、400秒、300秒、200秒、1 00秒、50秒、25秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒、1秒、0.1秒或0.01秒，例如至多0.001秒。
在本發(fā)明的一個(gè)重要實(shí)施方式中，所述電磁輻射束為激光束。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，電磁輻射束光斑最大尺寸為至多1000μm，其中所述束接觸與液體接觸的壁或壁表面。優(yōu)選地，電磁輻射束光斑最大尺寸為至多500μm，其中所述束接觸與液體接觸的壁或壁表面，更優(yōu)選至多300μm，例如200μm、100μm、75μm、50μm、25μm、15μm、10μm或5μm，例如至多1μm。
通常，電磁輻射束例如激光輻射的功效為1mW-200W的范圍，例如在1mW-100mW、100mW-500mW、500mW-1W、1W-20W和20W-200W的范圍。
或者通過(guò)在步驟b)過(guò)程中提供電磁輻射單脈沖，或者通過(guò)提供累積包含與所述單脈沖相同能量的多重短脈沖，可以完成步驟b)的加熱。
所述電磁輻射可以通過(guò)激光器，例如氣體激光器或者固態(tài)激光器，例如激光二極管來(lái)提供。所述電磁輻射可以由發(fā)光二極管(LED)、氙燈或任何足夠強(qiáng)度的燈絲燈泡來(lái)提供。可以以脈沖方式或持續(xù)方式操作激光器或LED，可以使用機(jī)械阻擋或偏移方式調(diào)節(jié)氙燈或燈絲燈泡。
所述電磁輻射可以包括范圍為190nm-5000nm的波長(zhǎng)，例如190nm-400nm、400nm-700nm、700nm-1500nm，以及1 500nm-5000nm。在pepi中，電磁輻射包括范圍為600nm-800nm的波長(zhǎng)，例如631-633nm、634-636nm、669-671nm、679-81、719-721nm或806-809nm，以及例如632nm、635nm、670nm、680nm、720nm或808nm。
在pepi中，至少90％，例如至少95％或99％的電磁輻射能量由范圍190nm至5000nm的波長(zhǎng)提供，例如190nm-400nm、400nm-700nm、700nm-1500nm，以及1500nm-5000nm。在pepi中至少90％，例如至少95％或99％的電磁輻射能量由范圍600nm-800nm的波長(zhǎng)提供，例如631-633nm、634-636nm、669-671nm、679-81nm、719-721nm或806-809nm，以及例如632nm、635nm、670nm、680nm、720nm或808nm。
本發(fā)明的另一方面涉及在液體中裂解生物細(xì)胞的方法，該方法包括在液體中根據(jù)這里描述的方法產(chǎn)生PPW。
因此，本發(fā)明涉及在液體中裂解細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟a)提供加熱裝置，b)用該加熱裝置加熱一部分液體，以使液體的該部分蒸發(fā)，由此形成蒸汽泡，c)冷凝該蒸汽泡，以及d)重復(fù)步驟b)和步驟c)，以形成液體中的PPW，所述PPW裂解生物細(xì)胞。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，如這里所述，控制所述PPW以形成液體中的空化作用。
裂解生物細(xì)胞的方法或產(chǎn)生PPW的方法可以進(jìn)一步包括以下步驟e)分析裂解的生物細(xì)胞的成分。
裂解的生物細(xì)胞成分的分析可以利用例如在PCT申請(qǐng)WO 2004/016948中描述的系統(tǒng)和方法，該申請(qǐng)此處并入作為參考。
裂解的生物細(xì)胞成分的分析例如可以包括電泳技術(shù)例如毛細(xì)管電泳(CE)；核酸擴(kuò)增技術(shù)例如PCR；免疫測(cè)定法。這些和其它相關(guān)分析技術(shù)被Sambrook等人更詳細(xì)地描述。
裂解的生物細(xì)胞成分的分析例如可以包括一種或多種光學(xué)分析方法，例如選自由紫外光譜法、可見(jiàn)光光譜法、近紅外光譜法、紅外光譜法和熒光檢測(cè)所組成的組中的方法。
本發(fā)明另一個(gè)方面涉及用于液體中微粒解聚集的方法，該方法包括根據(jù)此處所述的方法在液體中產(chǎn)生PPW。
術(shù)語(yǔ)“解聚集微粒”是指打碎和/或重分散團(tuán)聚的分子成為單個(gè)微?；蛭⒘５妮^小聚集體。
因此本發(fā)明涉及用于液體中微粒解聚集的方法，該方法包括如下步驟a)提供加熱裝置，b)用該加熱裝置加熱一部分液體，以使液體的該部分蒸發(fā)，由此形成蒸汽泡，c)部分冷凝或者全部冷凝蒸汽泡，以及d)重復(fù)步驟b)和步驟c)，以形成液體中的PPW，所述PPW解聚集微粒。
本發(fā)明的一個(gè)特別的方面涉及在液體中產(chǎn)生波動(dòng)壓力波的方法，該方法包括以下步驟i)提供所述液體的一部分的局部加熱，以使所述液體的所述部分變成蒸汽狀態(tài)，所述蒸汽通過(guò)膨脹排開剩余若干體積的液體；ii)移除/關(guān)掉熱源，允許產(chǎn)生的蒸汽冷卻并冷凝和收縮；iii)以固定的頻率重復(fù)步驟i)和步驟ii)；因此蒸汽泡的重復(fù)產(chǎn)生，所述蒸汽泡的分別潰滅，對(duì)液體介質(zhì)起到振蕩機(jī)械換能器的作用。當(dāng)振蕩的頻率在超聲區(qū)域(超過(guò)12-15kHz)時(shí)，在液體中產(chǎn)生空化作用一導(dǎo)致形成具有非常高內(nèi)壓的微泡。微泡的高壓將引起懸浮在液體中的固體組分破裂。懸浮組分可以為體細(xì)胞或細(xì)菌芽孢，細(xì)胞膜-各自地-細(xì)菌外殼由于暴露于空化效應(yīng)而破裂，并最終釋放細(xì)胞間或芽孢間的內(nèi)容物諸如例如DNA材料。
許多方法可以用于提供局部加熱產(chǎn)生蒸汽泡。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以放置歐姆加熱元件(電阻器)直接與液體介質(zhì)接觸?？刂齐娮悠骷Ⅰ{馭加熱元件。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，加熱通過(guò)外部來(lái)源進(jìn)行，定向于有意使泡形成的位置。任何形式的電磁能可以定向于所述位置。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，激光束定向于裝有液體介質(zhì)的主體的一部分，這樣在需要的位置提供了集中的能量。激光能可以被吸收并在特定界面層轉(zhuǎn)化成焦耳熱。所述激光能還可以在液體自身中轉(zhuǎn)化成焦耳熱，例如使用在所述液體介質(zhì)內(nèi)表現(xiàn)高吸收度的合適的發(fā)射激光波長(zhǎng)。所述集中的能量將加熱所述位置相關(guān)的液體，引起迅速的蒸汽轉(zhuǎn)換。關(guān)閉激光束會(huì)引起加熱位置的快速冷卻，隨后形成的蒸汽泡將冷凝并潰滅。激光發(fā)射的來(lái)源可以用普通電子控制系統(tǒng)精確控制。所述控制系統(tǒng)將能控制加熱脈沖周期以及間歇周期。通過(guò)所述電子控制系統(tǒng)可以有效實(shí)現(xiàn)不同頻率以及脈沖操作。
用于裂解體細(xì)胞的優(yōu)選操作頻率為15-40kHz的區(qū)域(例如20kHz)，但是能產(chǎn)生較低頻率(例如可聽見(jiàn)的頻率1-15kHz)和較高頻率。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，只在短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用超聲頻率，隨后是一定時(shí)間的非超聲活動(dòng)。短時(shí)間的操作將引起液體中的空化作用，但是由于隨后時(shí)間的無(wú)活動(dòng)，懸浮成分(例如細(xì)胞和/或細(xì)胞壁)將不會(huì)受到永久性破壞。然而所述活動(dòng)將引起細(xì)胞不結(jié)塊或解聚集。特別是亞微米尺寸的粉末(例如納米粉末)當(dāng)在液體中懸浮時(shí)往往結(jié)塊/聚集；超聲脈沖的影響將使他們解聚集。
一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中液體介質(zhì)包含在微流體系統(tǒng)中，這樣帶有懸浮組分的液體的部分將在亞毫米尺寸的微通道或微室中經(jīng)受超聲波作用。如前所述，歐姆加熱元件可以應(yīng)用在微流體系統(tǒng)中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，軟件控制的激光束定向于微通道或微室的離散位置，泡形成和破裂一各自超聲波的產(chǎn)生一將只作用于小部分被選封閉的液體。可以從X或X-Y掃描裝置(檢流計(jì))定向激光束，以便微流系統(tǒng)(或芯片)的任何部分可以選擇性地受到激光束的影響。在一個(gè)實(shí)施方式中，激光束可以反復(fù)掃描一個(gè)區(qū)域或通道的一個(gè)長(zhǎng)度，而如上所述持續(xù)產(chǎn)生超聲波，因此液體的較大面積或體積能夠受到超聲波作用。
圖1展示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，其中激光能定向于包含液體介質(zhì)的局限。所述局限體(1)具有局限或室或通道橫截面(2)。激光束(3)通過(guò)半透明體材料定向于所述室。激光能被吸收并在主體材料和液體介質(zhì)界面間轉(zhuǎn)化成熱，導(dǎo)致膨脹蒸汽泡(4)的形成。所述膨脹的泡將在封閉液體介質(zhì)上施加很大壓力。鄰近的圖(5)說(shuō)明的是激光脈沖(6)-激光“開時(shí)間”，隨后的間歇停頓(7)-激光“關(guān)時(shí)間”。在激光“關(guān)時(shí)間”過(guò)程中，蒸汽泡得到冷卻、冷凝及收縮，從而以負(fù)壓作用于液體。根據(jù)說(shuō)明書重復(fù)該循環(huán)，導(dǎo)致液體介質(zhì)經(jīng)歷脈動(dòng)壓力，其頻率分別與激光脈沖打開和關(guān)閉的頻率相同。
圖2表示使用被包住的加熱元件的實(shí)施方式。局限體(1)具有局限或室或通道橫截面(2)。加熱元件(3)為通過(guò)導(dǎo)線(5)電連接于脈沖產(chǎn)生控制電子器件。所述加熱元件根據(jù)時(shí)間圖(6)分別地打開關(guān)閉。泡的產(chǎn)生和潰滅如上述解釋(如圖1下面詳細(xì)的說(shuō)明所述)。
圖3表示在操作產(chǎn)生20kHz超聲波的示例模式中，加熱器/激光器循環(huán)和結(jié)果泡的形成和消失的時(shí)間圖表。如圖所示，在50μs周期過(guò)程中，激光器或加熱元件活化3μs(“關(guān)時(shí)間”為47μs)。虛線說(shuō)明泡的生長(zhǎng)。所述泡將在熱源消失后生長(zhǎng)一段時(shí)期，達(dá)到最大尺寸，在此之后潰滅并恢復(fù)到其原來(lái)的液體狀態(tài)。50μs周期提供得到的超聲波頻率為20kHz。
特別實(shí)施方式1為在液體中產(chǎn)生脈動(dòng)壓力波的方法，該方法包括i)提供所述液體的一部分的局部加熱，以使所述液體的所述部分變成蒸汽狀態(tài)，所述蒸汽膨脹排出若干體積的剩余液體；ii)移除/關(guān)掉熱源，允許產(chǎn)生的蒸汽冷卻并冷凝和收縮；iii)以固定的頻率重復(fù)步驟i)和步驟ii)；特別實(shí)施方式2為根據(jù)特別實(shí)施方式1的方法，其中，所述局部加熱由與液體無(wú)機(jī)械連接的來(lái)源提供。
特別實(shí)施方式3為根據(jù)特別實(shí)施方式2的方法，其中，所述局部加熱的來(lái)源為光學(xué)束。
特別實(shí)施方式4為根據(jù)特別實(shí)施方式3的方法，其中，所述光學(xué)束為激光。
特別實(shí)施方式5為根據(jù)特別實(shí)施方式1的方法，其中，所述局部加熱的來(lái)源為電力驅(qū)動(dòng)的加熱元件。
特別實(shí)施方式6為根據(jù)特別實(shí)施方式1的方法，其中，所述重復(fù)的頻率為超聲頻率。
特別實(shí)施方式7為根據(jù)特別實(shí)施方式5的方法，其中，所述超聲頻率引起液體中的空化作用。
特別實(shí)施方式8為根據(jù)特別實(shí)施方式1的方法，其中，所述液體含有懸浮組分，例如像血細(xì)胞或者細(xì)菌芽孢這樣的細(xì)胞組分。
特別實(shí)施方式9為根據(jù)特別實(shí)施方式7和8的方法，其中，脈動(dòng)壓力波將引起所述懸浮組分或其部分破裂，例如破壞細(xì)胞壁。
特別實(shí)施方式10為根據(jù)特別實(shí)施方式8的方法，其中，所述脈動(dòng)壓力波應(yīng)用于許多帶有間歇停頓的短周期，可以調(diào)整周期的長(zhǎng)度以便團(tuán)塊懸浮組分(例如，細(xì)胞、珠?；蛐∏?發(fā)生解聚集。
特別實(shí)施方式11為根據(jù)特別實(shí)施方式10的方法，其中，所述懸浮組分為納米粉末。
特別實(shí)施方式12為根據(jù)特別實(shí)施方式1的方法，其中，所述液體包含在微通道或微室中，例如亞毫米尺寸的微通道或微室。
特別實(shí)施方式13為根據(jù)特別實(shí)施方式3的方法，其中，用一維或二維光學(xué)掃描裝置(例如，檢流計(jì))傳遞所述光能。
特別實(shí)施方式14為根據(jù)特別實(shí)施方式3的方法，其中，吸收部分包括在與液體介質(zhì)的直接連接中，在該處吸收光能并轉(zhuǎn)化為焦耳熱。
應(yīng)當(dāng)注意的是，根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明一個(gè)方面上下文中描述的實(shí)施方式和特征，還可以應(yīng)用到本發(fā)明的其他方面。
實(shí)施例如本實(shí)施例中所述，本發(fā)明得到實(shí)驗(yàn)上的測(cè)試和證實(shí)。
2mm聚乙烯(PE)基底物質(zhì)使用準(zhǔn)分子激光進(jìn)行了微機(jī)械加工。通道結(jié)構(gòu)的大小加工成100μm寬和25μm深。用紅外線吸收染料(PRO-JET830NP，Avecia，英國(guó))制備2mm PE蓋，這樣所述蓋的一個(gè)表面將表現(xiàn)出紅外線輻射的強(qiáng)吸收，最終在所述表面部分將紅外線轉(zhuǎn)化為焦耳熱。將該蓋焊接到前面提到的具有紅外吸收面的通道結(jié)構(gòu)上，形成通道結(jié)構(gòu)的第四壁。
聚焦的激光束(來(lái)自高功率商業(yè)可供發(fā)光二極管(LD)-500mW，808nm)從照像機(jī)顯微鏡安裝的相反面定向于基底物質(zhì)。電子控制LD，這樣脈沖和周期長(zhǎng)度能夠得到調(diào)整和控制。
所述通道結(jié)構(gòu)用等滲生理鹽水溶液中的抗凝人全血充滿；每80％生理鹽水20％全血(體積百分比)。
調(diào)整聚焦激光束，運(yùn)行脈沖的寬度為3μs接著47μs期間沒(méi)有活動(dòng)，從而產(chǎn)生20kHz重復(fù)頻率，激光循環(huán)的時(shí)間圖表如圖3所示。所述激光循環(huán)從控制軟件起始，立即觀察到液體中的物理騷動(dòng)。從指示的紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)清楚地辨別液體的騷動(dòng)。少于一秒的時(shí)間內(nèi)懸浮的血細(xì)胞在激光束周圍區(qū)域內(nèi)立即開始裂解。在接下來(lái)的3秒時(shí)間內(nèi)，在約150μm通道區(qū)域的所有細(xì)胞都得到裂解，并且激光脈沖發(fā)生的接下來(lái)2秒不引起作用向通道其他任何方向進(jìn)一步蔓延。
在停止激光活動(dòng)之后觀察到以下現(xiàn)象在超聲波活動(dòng)發(fā)生的區(qū)域周圍觀察到材料“云”。在圍繞活動(dòng)發(fā)生的區(qū)域內(nèi)聚合物進(jìn)一步永久性的變質(zhì)或轉(zhuǎn)化得到清楚地鑒定，該區(qū)域表現(xiàn)為乳白半透明外觀。聚合物表面的永久性變質(zhì)是高功率超聲波活性的普通指示劑。
在高倍放大顯微鏡下觀察通道結(jié)構(gòu)裝載的靜止液體，顯示出亞微粒碎片的小球只存在于通道中受到激光活動(dòng)的位置。所述碎片由于“布朗運(yùn)動(dòng)”波動(dòng)，從而表明亞微米的尺寸。進(jìn)一步觀察到，在經(jīng)歷了所述處理之后，溶液中沒(méi)有“空”細(xì)胞存在。沒(méi)有其特有的血紅蛋白內(nèi)容物的空細(xì)胞(紅細(xì)胞)說(shuō)明，因升高的溫度或任何溶液性質(zhì)的變化(例如pH、生理鹽水濃度等)的溶血作用。這清楚地表明，超聲裂解引起懸浮細(xì)胞溶解。
參考文獻(xiàn)Sambrook等人分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第三版，卷1和卷2，Sambrook等人，2001，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Sambrook et alMolecular cloninga LaboratoryManual3nd edition，Volume 1 and2，Sambrook et al.，2001，Cold Spring HarborLaboratory Press)WO2004/016948
權(quán)利要求
1.一種在液體中產(chǎn)生脈動(dòng)壓力波(PPW)的方法，該方法包括如下步驟a)提供加熱裝置，b)用該加熱裝置加熱一部分液體，以使所述液體的該部分蒸發(fā)，由此形成蒸汽泡，c)冷凝該蒸汽泡，以及d)重復(fù)步驟b)和步驟c)。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述PPW為超聲波。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述液體包括選自由水、二甲亞砜、丙酮和醇所組成的組中的溶劑，以及和/或非極性溶劑。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述加熱裝置選自由加熱元件和電磁輻射所組成的組。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述電磁輻射在液體中被吸收。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述電磁輻射在與所述液體接觸的壁中被吸收。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述步驟b)和c)以固定的頻率重復(fù)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述步驟b)和c)以變化的頻率重復(fù)。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述步驟b)和c)以0.5-1000kHz范圍的頻率重復(fù)，例如10-500kHz、15-150kHz和20-100kHz的范圍。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述液體包含于微通道或微室。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述蒸汽泡的尺寸以及其形成和冷凝的速率足以在液體中產(chǎn)生空化作用。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述液體包含微粒。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述微粒選自由生物細(xì)胞、微小顆粒和納米顆粒所組成的組。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述液體包含生物細(xì)胞。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述電磁輻射束為激光束。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述光斑的最大尺寸為至多500μm。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述激光束的功效為1mW-200W。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的用于裂解液體中生物細(xì)胞的方法。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，該方法還包括步驟e)分析裂解后的生物細(xì)胞的組分。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的用于解聚集微粒的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脈動(dòng)蒸汽泡的產(chǎn)生方法，通過(guò)該方法受控?zé)嵩?優(yōu)選激光3)在封閉液體中產(chǎn)生脈動(dòng)蒸汽泡4。脈動(dòng)速率(頻率)優(yōu)選在超聲區(qū)域內(nèi)，借此在液體中出現(xiàn)空化作用。所述空化作用的結(jié)果是引起懸浮成分例如細(xì)胞或細(xì)菌芽孢破裂。細(xì)胞成分的超聲破裂公知為通過(guò)超聲波裂解。
文檔編號(hào)G10K15/08GK101095187SQ200580045525
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者托馬斯·烏辛 申請(qǐng)人:麥莫斯弗羅有限公司