本發(fā)明涉及顯微成像，特別涉及一種多光子超分辨顯微成像裝置及方法。

背景技術(shù)：

激光共聚焦顯微鏡是80年代隨著光學、視頻、計算機等技術(shù)的飛速發(fā)展而誕生的新一代顯微鏡。目前，已成為形態(tài)學、分子細胞生物學、神經(jīng)科學、藥理學、遺傳學等領(lǐng)域中強有力的研究工具。多光子共聚焦顯微鏡是近年來發(fā)展的一種成像技術(shù)，主要包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡，其原理是使用高光子密度激發(fā)發(fā)光材料，使其同時吸收兩個光子或三個光子躍遷到激發(fā)態(tài)。相對于傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡，多光子共焦顯微鏡具有以下優(yōu)勢：(1)可以采用在生物組織中穿透能力比較強的紅外激光作為激發(fā)光源，可以解決生物組織中深層物質(zhì)的成像問題；(2)由于多光子熒光波長遠離激發(fā)光波長，因此多光子共焦顯微鏡可以實現(xiàn)暗場成像；(3)多光子熒光可以避免普通熒光成像中的熒光漂白問題和對生物細胞的光致毒問題；(4)多光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性，有利于對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像研究。

由于多光子顯微鏡通常使用紅外光源作為激發(fā)光源，根據(jù)ernstabbe成像理論，遠場光學顯微鏡的橫向分辨率極限約為λ/2na，其中λ是光波波長，na為透鏡數(shù)值孔徑且小于1，因此在可見光波段內(nèi)，多光子熒光顯微鏡的橫向分辨極限為300納米。但是，細胞的細微結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細胞增殖﹑分化﹑凋亡以及信號傳遞等體系的特征尺度都在納米量級，所以多光子顯微鏡分辨率的提高就成為一個亟需解決的難題。

美國專利公開的專利號為us5731588的受激輻射損耗顯微鏡(sted)是第一個突破衍射限制的超分辨顯微鏡，這項技術(shù)在2006年度被《science》雜志評選為科學界十大突破之一，2008年被《naturemethod》雜志評為年度技術(shù)，最終于2014年獲得諾貝爾化學獎。sted顯微術(shù)的基本原理是使用兩束組合激光，一束激光被聚焦成正常的衍射極限焦斑，使焦斑內(nèi)的熒光分子處于激發(fā)態(tài)，另一束波長較長的經(jīng)過相位調(diào)制的中心為零點激光，稱為退激發(fā)光，使激發(fā)態(tài)的電子以受激發(fā)射損耗的方式回到基態(tài)，并發(fā)出一個與退激發(fā)光波長相同的光子。

經(jīng)過二十年的不斷改進和創(chuàng)新，sted超分辨顯微術(shù)已取得了長足進步，日趨成熟和多樣化。已經(jīng)有專利公開了雙光子sted顯微術(shù)(cn101821607a)。目前實現(xiàn)雙光子sted成像的組裝方式為采用兩個激光飛秒激光器，一個作為激發(fā)光源，一個作為退激發(fā)光源。由于需要同步來自兩個激光器脈沖的，因此裝置非常復(fù)雜。更重要的是采用兩個飛秒光源會使裝置的成本變得昂貴，難以推廣應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種結(jié)構(gòu)簡單、成本低的多光子超分辨顯微成像裝置及方法。

第一方面，本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像裝置，包括：激光光源、分光裝置、并光裝置、物鏡和光子探測器；所述激光光源發(fā)出的激光到所述分光裝置，所述分光裝置將入射的激光并分為激發(fā)光和退激發(fā)光，所述激發(fā)光經(jīng)過的光路為第一光路，所述退激發(fā)光經(jīng)過的光路為第二光路，所述第二光路中設(shè)有空間調(diào)制裝置，所述空間調(diào)制裝置用于對所述退激發(fā)光進行空間調(diào)制，使得所述退激發(fā)光的光斑成為中心零點的光斑；所述并光裝置用于將所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊為同軸光線，重疊后的激光用于經(jīng)物鏡聚焦后照射熒光樣品，光子探測器用于采集探測熒光樣品發(fā)出的熒光，進行成像。

本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像裝置，僅使用一個激光光源，通過偏分光裝置將激光分成兩束，一束作為退激發(fā)光，另一束作為激發(fā)光，退激發(fā)光經(jīng)相位調(diào)制變成中心零點的光斑，然后將激發(fā)光和退激發(fā)光通過并光裝置合并為同軸光線，并由物鏡聚焦到待測樣品上，激發(fā)待測樣品的熒光。產(chǎn)生的熒光進入單光子探測器進行采集，進行成像。由于本發(fā)明中使用的激發(fā)光和退激發(fā)光來自同一臺激光器，因此他們的脈沖重復(fù)頻率從本質(zhì)上是同步的，無需使用額外的電子元器件,結(jié)構(gòu)簡單、成本低。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述第二光路中還設(shè)有脈沖拉寬裝置和脈沖時間調(diào)制裝置。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述脈沖拉寬裝置包括多個脈沖拉寬器。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述第二光路中還設(shè)有第一能量開關(guān)，用于控制所述退激發(fā)光的激光能量。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊后的激光還經(jīng)過第二能量開關(guān)，所述第二能量開關(guān)用于控制重疊后激光的激光能量。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述光子探測器的入射端還設(shè)置有濾鏡，所述濾鏡用于選擇所需測量的光譜范圍。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述第一光路中設(shè)有第一擴束器，所述第二光路中設(shè)有第二擴束器，且所述第二激光先經(jīng)過所述第二擴束器擴束后，進入所述空間調(diào)制裝置。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述第一擴束器和所述第二擴束器均為凸透鏡。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，還包括半波片，所述激光光源發(fā)出的激光經(jīng)所述半波片入射到所述分光裝置。

第二方面，本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像方法，包括如下步驟：

步驟s1，將初始激光分為激發(fā)光和退激發(fā)光；

步驟s2，對所述退激發(fā)光進行空間調(diào)制，使得所述退激發(fā)光的光斑成為中心零點的光斑；

步驟s3，將所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊為同軸光線，并聚焦于待測熒光物上；

步驟s4，采集熒光樣品發(fā)出的熒光，獲得圖像。

本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像方法，將初始激光分成兩束，一束作為退激發(fā)光，另一束作為激發(fā)光，退激發(fā)光經(jīng)相位調(diào)制變成中心零點的光斑，然后將激發(fā)光和退激發(fā)光合并為同軸光線，并聚焦到待測樣品上，激發(fā)待測樣品的熒光，熒光樣品發(fā)出的熒光，進行成像。由于本發(fā)明中使用的激發(fā)光和退激發(fā)光來自同一臺激光器，因此他們的脈沖重復(fù)頻率從本質(zhì)上是同步的，無需使用額外的電子元器件,結(jié)構(gòu)簡單、成本低。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。在所有附圖中，類似的元件或部分一般由類似的附圖標記標識。附圖中，各元件或部分并不一定按照實際的比例繪制。

圖1為一實施例提供的多光子超分辨顯微成像裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為一實施例提供的對退激發(fā)光進行時間調(diào)制的示意圖；

圖3為一實施例提供的對退激發(fā)光空間調(diào)制所使用的相位板圖；

圖4為一實施例提供的多光子超分辨顯微成像方法的原理圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明技術(shù)方案的實施例進行詳細的描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只作為示例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。

需要注意的是，除非另有說明，本申請使用的技術(shù)術(shù)語或者科學術(shù)語應(yīng)當為本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的通常意義。

圖1到圖3為一實施例提供的多光子超分辨顯微成像裝置，附圖標記如下：

1-激光光源，2-半波片，3-分光裝置，4-第一擴束器，5-并光裝置，6-玻璃棒，7-脈沖時間調(diào)制裝置，8-單模保偏光纖，9-第二能量開關(guān)，10-第二擴束器，11-空間調(diào)制裝置，12-第二能量開關(guān)，13-雙色分光鏡，14-偏振調(diào)控裝置，15-掃描控制裝置，16-物鏡，17-載物臺，18-濾鏡，19-光子探測器，20-計算機。

本實施例的本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像裝置，包括：激光光源1、分光裝置3、并光裝置5、物鏡16和光子探測器19；所述激光光源1發(fā)出的激光到所述分光裝置3，所述分光裝置3將入射的激光并分為激發(fā)光和退激發(fā)光，所述激發(fā)光經(jīng)過的光路為第一光路，所述退激發(fā)光經(jīng)過的光路為第二光路，所述第二光路中設(shè)有空間調(diào)制裝置11，所述空間調(diào)制裝置11用于對所述退激發(fā)光進行空間調(diào)制，使得所述退激發(fā)光的光斑成為中心零點的光斑；所述并光裝置5用于將所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊為同軸光線，重疊后的激光用于經(jīng)物鏡16聚焦后照射熒光樣品，光子探測器19用于采集探測熒光樣品發(fā)出的熒光，上傳到計算機20數(shù)模轉(zhuǎn)換后，進行成像。

其中，所述激光光源1為飛秒脈沖激光器，所述空間調(diào)制裝置11為渦旋相位板。所述分光裝置3和所述并光裝置5均為分光棱鏡。

本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像裝置，僅使用一個激光光源1，通過偏分光裝置3將激光分成兩束，一束作為退激發(fā)光，另一束作為激發(fā)光，退激發(fā)光經(jīng)相位調(diào)制變成中心零點的光斑，然后將激發(fā)光和退激發(fā)光通過并光裝置5合并為同軸光線，并由物鏡16聚焦到待測樣品上，激發(fā)待測樣品的熒光。產(chǎn)生的熒光進入單光子探測器19進行采集，進行成像。由于本發(fā)明中使用的激發(fā)光和退激發(fā)光來自同一臺激光器，因此他們的脈沖重復(fù)頻率從本質(zhì)上是同步的，無需使用額外的電子元器件,結(jié)構(gòu)簡單、成本低。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述第二光路中還設(shè)有脈沖拉寬裝置和脈沖時間調(diào)制裝置7。本實施例采用飛秒激光作為初始光源，為了達到更好的退激發(fā)效果，需要把脈沖寬度拉寬到200到300皮秒。本實施例中，脈沖拉寬裝置使用30厘米長的高折射率玻璃棒6和100米長的保偏單模光纖，高折射率玻璃棒6g將脈沖寬度先拉寬到皮秒級，之后將退激發(fā)光導(dǎo)入100米長的單模保偏光纖8進一步拉寬到300皮秒左右。

進一步地，所述第二光路中還設(shè)有第一能量開關(guān)，用于控制所述退激發(fā)光的激光能量。所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊后的激光還經(jīng)過第二能量開關(guān)，所述第二能量開關(guān)用于控制重疊后激光的激光能量。通過第一能量開關(guān)和第二能量開關(guān)調(diào)節(jié)激發(fā)光和退激發(fā)光的能量，從而匹配樣品的熒光分子。

所述光子探測器19的入射端還設(shè)置有濾鏡18，用于選擇所需測量的光譜范圍，防止其他光譜影響成像效果。

根據(jù)本發(fā)明提供的一實施方式，所述第一光路中設(shè)有第一擴束器4，所述第二光路中設(shè)有第二擴束器10，且所述第二激光先經(jīng)過所述第二擴束器10擴束后，進入所述空間調(diào)制裝置11。所述第一擴束器4和所述第二擴束器10均為凸透鏡。

具體的，本實施例的多光子超分辨顯微成像裝置還包括半波片2，所述激光光源1發(fā)出的激光經(jīng)所述半波片2入射到所述分光裝置3。物鏡16的入射端還設(shè)有用于控制掃描范圍的掃描控制裝置15，掃描控制裝置15為三維納米移動平臺，當然也可以為聲光振鏡。

在掃描控制裝置15的入射端還進一步設(shè)有偏振調(diào)控裝置14，用于調(diào)節(jié)激光的偏振性，使其滿足激光空間調(diào)制裝置11的需求，先透過偏振調(diào)控裝置14，然后進入掃描控制裝置15。

其中，本裝置還設(shè)有二色分光鏡，光子探測器19、濾鏡18、雙色分光鏡13、偏振調(diào)控裝置14、掃描控制裝置15、物鏡16和載物臺17依次設(shè)置在同一直線上。所述激發(fā)光和退激發(fā)光重疊后，經(jīng)雙色分光鏡13反射進入偏振調(diào)控裝置14，并依次穿過掃描控制裝置15和物鏡16，聚焦在待測樣品上。樣品發(fā)出的熒光，依次穿過物鏡16、掃描控制裝置15、偏振調(diào)控裝置14、雙色分光鏡13和濾鏡18進入光子探測器19，通過計算機20進行成像。

參照圖4，另一實施例中，本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像方法，包括如下步驟：

步驟s1，將初始激光分為激發(fā)光和退激發(fā)光；

步驟s2，對所述退激發(fā)光進行空間調(diào)制，使得所述退激發(fā)光的光斑成為中心零點的光斑；

步驟s3，將所述激發(fā)光和所述退激發(fā)光重疊為同軸光線，并聚焦于待測熒光物上；

步驟s4，采集熒光樣品發(fā)出的熒光，獲得圖像。

本發(fā)明提供的多光子超分辨顯微成像方法，將初始激光分成兩束，一束作為退激發(fā)光，另一束作為激發(fā)光，退激發(fā)光經(jīng)相位調(diào)制變成中心零點的光斑，然后將激發(fā)光和退激發(fā)光合并為同軸光線，并聚焦到待測樣品上，激發(fā)待測樣品的熒光，熒光樣品發(fā)出的熒光，進行成像。由于本發(fā)明中使用的激發(fā)光和退激發(fā)光來自同一臺激光器，因此他們的脈沖重復(fù)頻率從本質(zhì)上是同步的，無需使用額外的電子元器件,結(jié)構(gòu)簡單、成本低。

進一步地，步驟s2之前，還對所述退激發(fā)光進行擴束，步驟s3之前，對所述激發(fā)光進行擴束。為了使激發(fā)光和退激發(fā)光到達待測樣品的時間一致，還對退激發(fā)光進行時間調(diào)制。

在本申請的描述中，需要理解的是，術(shù)語“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“水平”、“內(nèi)”、“外”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對本發(fā)明的限制。

此外，術(shù)語“第一”、“第二”等僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。在本發(fā)明的描述中，“多個”的含義是兩個以上，除非另有明確具體的限定。

本發(fā)明的說明書中，說明了大量具體細節(jié)。然而，能夠理解，本發(fā)明的實施例可以在沒有這些具體細節(jié)的情況下實踐。在一些實例中，并未詳細示出公知的方法、結(jié)構(gòu)和技術(shù)，以便不模糊對本說明書的理解。

在本說明書的描述中，具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書的范圍當中。