一種傾斜寬場光切片掃描成像顯微系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本實用新型包括激光發(fā)射裝置，由激光發(fā)射裝置發(fā)射的激光入射二維掃描振鏡、準直透鏡組及第一顯微物鏡組成的激光掃描光路對樣品臺上的樣品進行傾斜掃描；第二顯微物鏡、場鏡、探測器組成了成像探測光路，其光軸與激光掃描光路光軸垂直，成像顯示控制裝置通過數(shù)據(jù)采集卡、樣品臺控制裝置分別控制二維掃描振鏡、第二顯微物鏡、探測器的同步動作及樣品臺的自動位移，對采集的探測器成像數(shù)據(jù)處理形成樣品寬場三維圖像信息。本實用新型的成像顯微系統(tǒng)及成像方法掃描成像速度快，分辨率高，可實現(xiàn)寬場掃描成像。
【專利說明】一種傾斜寬場光切片掃描成像顯微系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于光學(xué)顯微領(lǐng)域，尤其是指光切片照明掃描顯微成像裝置和顯微成像方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對于分辨微小結(jié)構(gòu)以及生物功能顯微成像方面提出了越來越高的要求。除了高分辨率的要求之外，在檢測時間以及檢測范圍上也同樣需要更快更廣。
[0003]1994年，光切片照明熒光顯微，即平面光顯微鏡最早提出并被用于觀察較大的樣品，最初使用了正交光切片照明顯微的方式。在該設(shè)計中，使用光切片垂直照明樣品，然后在與照明光垂直的方向上觀察被照明面的熒光圖像。但是這種光切片掃描過程中需要通過平臺移動來實現(xiàn)掃描過程，掃描速度較慢。
[0004]但是，目前在生物和醫(yī)學(xué)眾多領(lǐng)域，往往需要在保證較高分辨率的同時，對較大范圍的生物組織快速進行顯微成像，現(xiàn)有技術(shù)依然不能滿足這一要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本實用新型所要解決的技術(shù)問題是提供一種傾斜寬場光切片掃描顯微成像系統(tǒng)及方法，通過該裝置，可在保證高分辨率的同時，對較大范圍的樣品組織進行快速顯微成像。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本實用新型提供一種傾斜寬場光切片掃描成像顯微系統(tǒng)，依次包括激光發(fā)射裝置、二維掃描振鏡、準直透鏡組、第一顯微物鏡、樣品臺、第二顯微物鏡、場鏡、探測器、數(shù)據(jù)采集卡及成像顯示控制裝置；其中，所述二維掃描振鏡反射所述激光發(fā)射裝置產(chǎn)生的激光后經(jīng)所述準直透鏡組聚焦再準直后經(jīng)所述第一顯微物鏡傾斜入射放置在所述樣品臺上的樣品形成傾斜入射樣品的激光掃描光路；所述準直透鏡組包括第一透鏡和第二透鏡，靠近所述第一顯微物鏡的所述第二透鏡與所述第一顯微物鏡構(gòu)成4f光學(xué)系統(tǒng)；掃描樣品后的出射光依次經(jīng)所述第二顯微物鏡、所述場鏡后在所述探測器上成像形成成像探測光路；所述激光掃描光路的光軸和所述成像探測光路的光軸垂直；所述第二顯微物鏡安裝在壓電片底座上，并可沿成像探測光路的光軸軸向發(fā)生位移；
[0007]所述樣品臺上的樣品被所述激光掃描光路聚焦光斑照亮區(qū)域位于所述第二顯微物鏡的物方焦面上；
[0008]所述數(shù)據(jù)采集卡分別與所述激光發(fā)射裝置、所述二維掃描振鏡、所述壓電片底座及所述探測器連接，并分別向與其連接的所述各部件發(fā)送控制信號控制所述各部件動作；
[0009]所述樣品臺與一樣品臺控制裝置連接，所述樣品臺控制裝置控制所述樣品臺進行三維移動；
[0010]所述成像顯示控制裝置分別與所述探測器、所述樣品臺控制裝置、所述數(shù)據(jù)采集卡連接，并分別向所述探測器、所述樣品臺控制裝置、所述數(shù)據(jù)采集卡發(fā)送設(shè)定參數(shù)及控制指令；并處理顯示樣品三維圖像信息；
[0011]當(dāng)樣品為熒光標(biāo)記時，在所述第二顯微物鏡與所述場鏡之間設(shè)置有濾光片。
[0012]所述激光發(fā)射裝置依次包括激光發(fā)生器、單模光纖、及準直透鏡；所述激光發(fā)生器發(fā)出激光經(jīng)所述單模光纖耦合后經(jīng)所述準直透鏡形成激光光束入射所述二維掃描振鏡。
[0013]所述二維掃描振鏡包括橫向掃描頭和縱向掃描頭，所述數(shù)據(jù)采集卡分別向所述橫向掃描頭和縱向掃描頭發(fā)送控制電壓信號控制其偏轉(zhuǎn)角度及偏轉(zhuǎn)周期。二維掃描振鏡接收來自數(shù)據(jù)采集卡的控制電壓信號，進行有規(guī)律有次序偏轉(zhuǎn)，實現(xiàn)掃描激光在樣品上的有序掃描，形成光切片序列。
[0014]所述準直透鏡組的第一透鏡的像方焦點和第二透鏡的物方焦點重合。
[0015]所述數(shù)據(jù)采集卡向所述二維掃描振鏡發(fā)送的控制電壓信號周期、向所述壓電片底座發(fā)出的控制電壓信號周期、及所述探測器的曝光時間相同。
[0016]所述激光發(fā)射裝置包括發(fā)射不同波長激光的第一激光發(fā)射裝置和第二激光發(fā)射裝置，所述第一激光發(fā)射裝置依次包括激光發(fā)生器、單模光纖、準直透鏡及反射鏡，所述第二激光發(fā)生裝置依次包括激光發(fā)生器、單模光纖、準直透鏡及偏振分束器；所述第一激光發(fā)射裝置發(fā)射的激光光束經(jīng)準直后由所述反射鏡反射至所述偏振分束器，再經(jīng)所述偏振分束器反射入射所述二維掃描振鏡，同時，所述第二激光發(fā)射裝置發(fā)射的激光光束經(jīng)準直后穿過所述偏振分束器入射所述二維掃描振鏡；所述第一激光發(fā)射裝置和第二激光發(fā)射裝置所產(chǎn)生的激光于所述二維掃描振鏡處合束后再經(jīng)準直通過所述第一顯微物鏡入射樣品；所述樣品為經(jīng)雙色熒光標(biāo)記的雙色熒光樣品。
[0017]根據(jù)上述本實用新型的成像系統(tǒng)進行成像的方法:
[0018](I)調(diào)節(jié)傾斜光切片掃描成像顯微系統(tǒng)至初始位置；將樣品劃分為多個掃描區(qū)域；
[0019]2)激光發(fā)射裝置發(fā)射出激光光束經(jīng)單模光纖耦合后，經(jīng)準直透鏡準直得到準直激光光束并入射二維掃描振鏡后，經(jīng)準直透鏡組聚焦再準直后經(jīng)第一顯微物鏡傾斜入射樣品;
[0020]3)通過樣品臺控制裝置調(diào)節(jié)樣品臺水平和垂直位置，使樣品被照亮區(qū)域位于入射激光光束的束腰位置；通過顯示成像控制裝置控制數(shù)據(jù)采集卡向壓電片底座發(fā)送調(diào)節(jié)信號，使第二顯微物鏡沿壓電片底座光軸方向位移，使樣品被照亮區(qū)域位于第二顯微物鏡的物方焦面上；然后，精確調(diào)節(jié)樣品平臺水平位置，使入射激光聚焦光斑位于樣品目標(biāo)區(qū)域；
[0021](4)數(shù)據(jù)采集卡向二維掃描振鏡發(fā)送周期相同的橫向掃描電壓控制信號和縱向掃描電壓控制信號，二維掃描振鏡中橫向掃描頭和縱向掃描頭分別在橫向、縱向依次有序轉(zhuǎn)動，周期性有序性調(diào)節(jié)二維掃描振鏡出射激光光束的角度，實現(xiàn)激光光束穿過第一顯微透鏡后的入射激光聚焦光斑在樣品入射面內(nèi)周期性有序性的移動掃描形成一組樣品光切片序列；同時數(shù)據(jù)采集卡向壓電片底座發(fā)送控制信號調(diào)節(jié)第二顯微物鏡位置，保證入射激光聚焦光斑掃描光切片一直位于第二顯微物鏡的物方焦面上；同時，米集數(shù)據(jù)卡向探測器發(fā)送控制拍攝速率的控制信號使其拍攝速率與光切片掃描移動速率相同；
[0022](5)形成的一組樣品光切片序列依次經(jīng)反射后通過第二顯微物鏡和場鏡在探測器上依次成像；所述樣品光切片的長度等于所述聚焦激光光斑的橫向掃描幅度，寬度等于聚焦激光在樣品中的穿透深度，厚度等于聚焦激光光斑的直徑；[0023]6) 二維掃描振鏡及第二顯微物鏡被還原至初始位置，調(diào)節(jié)樣品臺至目標(biāo)掃描區(qū)域，重復(fù)上述操作，對其他掃描區(qū)域進行依次依序掃描；
[0024]7)顯示成像控制裝置采集各個掃描區(qū)域掃描后形成的樣品光切片序列數(shù)據(jù)，并進行數(shù)據(jù)處理及拼接，形成樣品寬場三維圖像信息。
[0025]在進行熒光樣品掃描成像時，在第二顯微物鏡和場鏡之間需要增加濾光片，通過濾光片消除由于激光光斑散射和反射引入的雜散光，僅使激發(fā)熒光反射光通過濾光片后在探測器上成像。
[0026]上述的顯示成像控制裝置為主控計算機，通過軟件可以對數(shù)據(jù)采集卡、樣品臺控制裝置等輸出控制信號進行控制。激光發(fā)射裝置中的激光發(fā)射強度通過數(shù)據(jù)采集卡進行控制，由主控計算機輸入控制信號，自動調(diào)節(jié)激光強度。探測器為CCD探測器，探測器的成像探測面位于場鏡的像方焦面上。
[0027]激光發(fā)射裝置為兩組時，兩組發(fā)射的激光波長不同，不同波長的激光波長可以激發(fā)樣品上標(biāo)記的兩種突光，產(chǎn)生不同的突光反射光，位于第二顯微物鏡和場鏡之間的濾光片可以允許激發(fā)的不同波長的熒光反射光通過，但是激光光束的散射和反射光則不禁止通過；兩種不同波長的熒光反射光在探測器上成像，形成兩種熒光標(biāo)記的樣品熒光光切片成像。
[0028]激光發(fā)射裝置的發(fā)射的激光經(jīng)耦合及準直后入射二維掃描振鏡，在二維掃描振鏡主要包括橫向掃描頭和縱向掃描頭。分別對橫向掃描頭加載橫向掃描電壓信號、對縱向掃描頭加載縱向掃描電壓信號，使橫向掃描頭和縱向掃描頭發(fā)生偏轉(zhuǎn)改變激光光束的反射路徑；橫向掃描電壓控制所述二維掃描陣鏡使激光通過所述第一顯微物鏡聚焦后的聚焦光斑沿垂直于所述激光光束入射面方向掃描，縱向掃描電壓控制二維掃描振鏡使激光通過所述第一顯微物鏡之后的聚焦光斑在所述入射激光光束入射面內(nèi)移動，從而實現(xiàn)所述聚焦激光光斑的二維掃描；橫向掃描電壓控制信號為鋸齒波信號，縱向掃描電壓控制信號為階梯信號；縱向加載的階梯信號的變化間隔與橫向加載的鋸齒波信號的周期相同；這樣，當(dāng)所述激光聚焦光斑橫向掃描一次之后會縱向移動一小段間隔繼續(xù)下一次掃描；每一次橫向掃描都能夠在樣品中反射光形成光切片，由若干次縱向移動而形成一組樣品光切片序列，完成一次完整的局部掃描；由于第二顯微物鏡的光軸與聚焦激光光斑的光軸垂直，故可以保證熒光生物切片完全位于第二顯微物鏡的物方焦面內(nèi)，每一個熒光生物切片都通過所述第二顯微透鏡以及所述場鏡組成的成像光路成像到CXD探測器上；所述樣品熒光切片的長度等于所述聚焦激光光斑的橫向掃描幅度，寬度等于聚焦激光在熒光生物組織中的穿透深度，厚度等于聚焦激光光斑的直徑，通過調(diào)整所述縱向階梯信號的梯度電壓可以控制樣品上的熒光切片密度；所述縱向階梯信號的遞增梯度數(shù)量決定了一次所述局部掃描產(chǎn)生的樣品光切片的數(shù)量。
[0029]光束照射到樣品發(fā)生反射和散射，得到的反射光和散射光被第二顯微物鏡接收，然后經(jīng)過場鏡收集并聚焦到所述CCD探測器上；第二顯微物鏡與場鏡組成的成像探測光路的光軸與準直透鏡組和第一顯微物鏡組成的激光掃描光路的光軸垂直，并且成像探測光路的光軸處于激光掃描光路光束的入射面內(nèi)；將第二顯微物鏡固定在壓電片底座上，在壓電片上施加信號電壓，可以使第二顯微物鏡沿著光軸方向做一維的伸縮移動；CCD探測器放置在場鏡的像面上，CXD探測面與光軸垂直，這樣就能將通過第二顯微物鏡的物像成像在CCD探測器上；在第二顯微物鏡與所述場鏡之間，根據(jù)觀察樣品特性，選擇性放置濾光片。當(dāng)樣品為熒光樣品時，放置濾光片，濾光片保證激發(fā)的樣品熒光的反射光可以通過，消除激光反射光及散射光，保證激發(fā)突光光切片成像。
[0030]本實用新型的工作原理如下:
[0031]采用功率可調(diào)的激光發(fā)生器，單模光纖，準直透鏡組成的激光發(fā)射裝置來作為系統(tǒng)的激光光源，根據(jù)待測熒光或者非熒光樣品的特征來調(diào)整激光器的輸出功率，激光的出射功率會影響系統(tǒng)成像的信噪比，并且功率太高會導(dǎo)致熒光樣品被迅速漂白。
[0032]之后，采用二維掃描振鏡，準直透鏡組以及第一顯微物鏡組成的激光掃描光路來實現(xiàn)光切片掃描。準直激光光束通過二維掃描振鏡反射，然后經(jīng)過準直透鏡組聚焦再準直為平行光后，由第一顯微物鏡聚焦到待測樣品表面。準直透鏡組包括第一透鏡和第二透鏡，第二透鏡靠近第一顯微物鏡，并與第一顯微物鏡組成共焦4f光學(xué)系統(tǒng)，這樣，在二維陣鏡轉(zhuǎn)動時，出射準直激光光束方向改變，通過準直透鏡組中的第一透鏡和第二透鏡、與第一顯微物鏡之后的聚焦光斑位置會發(fā)生改變。
[0033]具體的光切片掃描實現(xiàn)方法為:在二維掃描振鏡的橫向和縱向分別加載掃描電壓信號，不同的信號電壓分別對于橫向和縱向不同的偏轉(zhuǎn)角度。橫向掃描電壓信號為鋸齒波信號，控制激光光斑在垂直于激光光束入射到樣品平臺入射面的方面快速掃描，縱向掃描電壓信號為階梯信號，控制激光光斑在激光入射到樣品平臺的入射面內(nèi)移動。階梯信號每一個梯度的保持時間與橫向鋸齒信號的周期一致，并且梯度信號的變化與鋸齒信號變化同步，這樣保證聚焦激光光斑橫向每掃描一次形成一層樣品光切片之后，縱向會移動一段距離進行下一次橫向掃描。每一層樣品光切片的長度等于橫向掃描的幅度，寬度等于激光在組織中的穿透深度，厚度等于聚焦激光光斑的直徑。樣品縱向移動的次數(shù)與階梯信號的階梯數(shù)一致，這樣就能通過連續(xù)掃描獲得由若干層樣品熒光切片組成的切片序列。定義這樣的一次掃描過程為局部掃描，掃描范圍為局部掃描范圍。
[0034]掃描過程中要注意的是，通過第一顯微物鏡聚焦之后的激光光束用來對樣品掃描的區(qū)域為激光光束的束腰區(qū)域。在光束束腰區(qū)域光束的發(fā)散角很小(可近似認為是平行光)，能夠保證聚焦后的掃描激光光束在樣品中芽透一定深度之后能夠仍然保持較小的光斑直徑，確保每一層樣品熒光切片的厚度是均勻的。
[0035]此外，掃描激光光束的入射角度與樣品平臺水平夾角45°，故樣品光切片也與樣品平臺夾角為45°。第二顯微物鏡用來對樣品光切片成像，成像探測光路光軸與樣品光切片是垂直的。45°角入射樣品，可保證入射的穩(wěn)定性，同時本實用新型的成像顯微系統(tǒng)結(jié)構(gòu)對稱緊湊。另外，在光切片縱向移動的同時，第二顯微物鏡在壓電片底座的帶動下沿成像掃描光路的光軸軸向跟隨光切片伸縮位移，故能將樣品光切片始終保持在第二顯微物鏡的物方焦面上，從而保證在CXD探測器上獲得每一層光切片的圖像信息。
[0036]受到第一顯微物鏡的出瞳以及第二顯微物鏡的伸縮范圍的限制，局部掃描的區(qū)域比較小，為了能夠?qū)崿F(xiàn)寬場樣品的觀察，采用樣品平臺的移動來獲得寬場樣品全部的樣品光切片。即在每一次局部掃描完成之后，通過主控計算機向樣品臺控制裝置發(fā)出控制信號，來移動樣品平臺，使其他待觀測區(qū)域移動至觀察掃描區(qū)域，進行下一次局部掃描。依次依序往復(fù)移動樣品臺進行樣品局部掃描，最終獲得大范圍完整的樣品寬場光切片信息。
[0037]通過這種樣品切片掃描的方式，由于激光掃描光路采用傾斜入射的方式，成像探測光路可以將樣品垂直方向于光軸的圖像轉(zhuǎn)化為橫向和縱向的圖像，即可以得到跟橫向和縱向方向接近的軸向分辨率。
[0038]非熒光樣品以及雙色熒光樣品的顯微觀測原理與單色熒光樣品的觀察原理基本一致。區(qū)別分別為，非熒光樣品是通過的為激光聚焦光斑在樣品中的散射光，而不是樣品受激發(fā)產(chǎn)生的熒光；雙色熒光樣品需要讓不同波長的激光光束合束，然后對于雙色熒光樣品進行掃描。
[0039]本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型具有以下有益的技術(shù)效果:
[0040]通過傾斜45°入射的激光光束掃描形成光切片，可以改善顯微成像的軸向信噪t匕，有效的提高樣品觀察的軸向分辨率。由于數(shù)據(jù)采集卡對二維掃描振鏡、壓電片底座的控制信號周期相同，控制第二顯微物鏡與二維掃描振鏡的偏轉(zhuǎn)同步，保證樣品被掃描激光光路的聚焦光斑的束腰照亮區(qū)域一直位于第二顯微物鏡的物方焦面，保證光軸軸向的高分辨率，實現(xiàn)軸向超分辨。
[0041]通過二維掃描振鏡掃描與樣品平臺掃描相結(jié)合的掃描方式，可以實現(xiàn)快速寬場光切片掃描，縮短寬場掃描需要的時間。同時通過對探測器的快門動作頻次控制和曝光時間周期，保證了光切片成像的圖像信息。本實用新型的傾斜掃描成像顯微系統(tǒng)，可以通過對局部掃描區(qū)域逐一有序掃描成像從而實現(xiàn)寬場范圍內(nèi)的樣品三維掃描圖像。且由于本實用新型的傾斜掃描成像顯微系統(tǒng)的光學(xué)元部件少，易于控制，可以保證三維圖像品質(zhì)?？蓪Ψ菬晒鈽悠?、熒光樣品、雙色熒光樣品等進行掃描成像。本實用新型的成像顯微系統(tǒng)為平面光顯微鏡，其掃描激光激發(fā)的為薄平面，激發(fā)部分易于被成像探測光路采集到，其量子得率高，相對于共聚焦顯微鏡來說，本實用新型的成像顯微系統(tǒng)光損傷小，成像品質(zhì)更高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1，為本實用新型的寬場熒光切片掃描顯微裝置的一種實施方式的示意圖。
[0043]圖2，為本實用新型的寬場熒光切片掃描顯微裝置的第二種實施方式的示意圖。
[0044]圖3，為本實用新型的寬場熒光切片掃描顯微裝置的第三種實施方式的示意圖。
[0045]圖4，為激光傾斜掃描切片示意圖。
[0046]圖5，為本實用新型中計算機控制二維掃描陣鏡、壓電片、CCD相機的波形圖以及對應(yīng)的時序關(guān)系，其中，Ca)控制二維掃描陣鏡使入射激光光斑垂直于激光入射面掃描的鋸齒波信號波形圖；(b)控制二維掃描陣鏡使激光光斑在入射面內(nèi)掃描的階梯信號的波形圖；(C)控制壓電片使第二顯微物鏡沿軸向伸縮的階梯信號的波形圖；(d)控制CCD自動拍攝的脈沖信號的波形圖。
【具體實施方式】
[0047]針對本實用新型的成像系統(tǒng)及方法，分別舉例并結(jié)合圖示進行具體說明。
[0048]—種傾斜寬場光切片掃描成像顯微系統(tǒng)，包括激光發(fā)射裝置、二維掃描振鏡、準直透鏡組及第一顯微物鏡，第二顯微物鏡、場鏡、探測器，樣品臺，數(shù)據(jù)采集卡，樣品臺控制裝置，成像顯示控制裝置。準直透鏡組及第一顯微物鏡形成的光路為激光掃描光路；第二顯微物鏡及場鏡形成的光路為成像探測光路。下面以非熒光樣品、熒光樣品及雙色熒光樣品為例舉例說明。[0049]實施例1
[0050]以對非熒光樣品進行成像為例，參看圖1。
[0051]成像顯示控制裝置，為主控計算機16，在主控計算機中安裝有控制及成像顯示程序，通過主控計算機16，向數(shù)據(jù)采集卡發(fā)出控制信號指令，通過數(shù)據(jù)采集卡控制本實用新型成像裝置中的激光強度、二維掃描振鏡的偏轉(zhuǎn)角度、壓電片底座位移、探測器的快門控制等動作，實現(xiàn)二維掃描振鏡、壓電片底座、探測器的快門控制的同步動作。
[0052]通過主控計算機16向樣品臺控制裝置15發(fā)出控制信號指令控制樣品臺三維移動動作。
[0053]激光發(fā)射裝置，主要包括依次設(shè)置的激光器I，單模光纖2，準直透鏡3。單模光纖2的出射端面位于準直透鏡3的物方焦點處。激光器I發(fā)生激光經(jīng)單模光纖2耦合后，經(jīng)準直透鏡3進行準直,使激光光束形成平行準直激光光束。激光器I的輸出功率可調(diào)，根據(jù)樣品特性進行調(diào)節(jié)。根據(jù)待測熒光樣品或非熒光樣品的特征來調(diào)整激光器的輸出功率，激光器的輸出功率會影響系統(tǒng)成像的信噪比，并且功率太高會導(dǎo)致熒光樣品被迅速漂白。在本實用新型中，激光器的輸出功率，即激光強度通過成像顯示控制裝置，即主控計算機向數(shù)據(jù)采集卡14發(fā)出指令，由數(shù)據(jù)采集卡向激光器發(fā)出調(diào)節(jié)信號，調(diào)節(jié)激光器的輸出功率。
[0054]二維掃描振鏡4，包括橫向掃描頭和縱向掃描頭，橫向掃描頭為橫向掃描，縱向掃描頭為縱向掃描，在橫向掃描頭、縱向掃描頭上均帶有反射鏡，準直激光光束入射二維掃描振鏡4，通過橫向掃描頭上的反射鏡反射至縱向掃描頭，再通過縱向掃描頭上的反射鏡反射，從二維掃描振鏡4中出射后通過準直透鏡組和第一顯微物鏡后聚焦于樣品上。二維掃描振鏡4上的橫向掃描頭和縱向掃描頭分別與數(shù)據(jù)采集卡14連接，主控計算機16向數(shù)據(jù)采集卡14發(fā)送信號指令，通過數(shù)據(jù)采集卡14向二維掃描振鏡的橫向掃描頭和縱向掃描頭分別發(fā)出橫向電壓控制信號和縱向電壓控制信號，控制橫向掃描頭和縱向掃描頭的偏轉(zhuǎn)角度，調(diào)整從二維掃描振鏡出射光束的出射角度，從而達到調(diào)整入射樣品的激光光束聚焦光斑位置。橫向電壓控制信號為鋸齒波電壓信號，縱向電壓控制信號為階梯波電壓信號，橫向電壓控制信號和縱向電壓控制信號的周期相同。當(dāng)激光聚焦光斑橫向掃描一次之后會縱向移動一小段間隔繼續(xù)下一次掃描。
[0055]準直透鏡組包括第一透鏡5和第二透鏡6，第一透鏡5的像方焦點與第二準直透鏡6的物方焦點重合；第二透鏡6與第一顯微物鏡7組成4f光學(xué)系統(tǒng)。經(jīng)二維掃描振鏡出射的激光光束經(jīng)第一透鏡5進行聚焦后再經(jīng)第二透鏡6進行準直，準直后的激光光束經(jīng)過第一顯微物鏡入射樣品。準直透鏡組和第一顯微物鏡組成的光路為激光掃描光路，激光掃描光路入射樣品的入射角度為45度。
[0056]樣品臺9，為三維可移動樣品臺。通過一樣品臺控制裝置15與主控計算機16連接。通過主動計算機對樣品臺控制裝置發(fā)出控制指令，樣品臺控制裝置15可以控制樣品臺在水平面的X軸和I軸方向移動，也可以控制樣品臺的縱向方向Z軸方向進行垂直移動，實現(xiàn)三維方向移動，以方便調(diào)整樣品8的位置。
[0057]第二顯微物鏡10、場鏡12及探測器13依次設(shè)置在成像探測光路上。第二顯微物鏡10安裝在壓電片底座11上。經(jīng)過第一顯微物鏡入射樣品8后的激光光束的反射光和散射光經(jīng)過第二顯微物鏡及場鏡后在探測器的探測面上成像。成像探測光路的光軸與激光掃描光路的光軸相垂直。第二顯微物鏡10沿光軸的軸向位置可通過壓電片底座進行調(diào)節(jié)。通過主控計算機16控制數(shù)據(jù)采集卡向壓電片底座發(fā)出調(diào)節(jié)電壓信號，壓電片底座沿成像探測光路的光軸軸向位置發(fā)生物理形變，從而帶動第二顯微物鏡10沿光軸軸向位移?？刂频诙@微物鏡的軸向位置調(diào)節(jié)的控制電壓信號周期與控制二維掃描振鏡的橫向和縱向偏轉(zhuǎn)的橫向掃描電壓信號和縱向掃描電壓信號的周期相同，保證第二顯微物鏡位移與二維掃描振鏡偏轉(zhuǎn)同步，保證激光掃描光路的激光光束束腰位置照亮樣品的照亮區(qū)域始終位于第二顯微物鏡的物方焦面上。激光掃描光路傾斜入射即可，僅需成像探測光路的光軸與激光掃描光路的光軸垂直。激光掃描光路傾斜45度入射樣品時成像顯微系統(tǒng)結(jié)構(gòu)對稱緊湊,穩(wěn)定性更高。
[0058]探測器13為CXD探測器，其分別與數(shù)據(jù)采集卡14和主控計算機16連接。入射非熒光樣品的激光光束經(jīng)反射、散射后的出射光通過第二顯微物鏡后通過場鏡12收集并在CXD探測器的探測面上成像，CXD探測器的快門控制信號由主控計算機發(fā)送至數(shù)據(jù)采集卡，由數(shù)據(jù)采集卡進行控制快門動作頻度，保證其與二維掃描振鏡的偏轉(zhuǎn)保持同步，保證對每一次掃描的光切片都進行成像。CCD探測器的曝光時間周期與控制二維掃描振鏡的偏轉(zhuǎn)的橫向或縱向掃描電壓信號周期相同，保證每次光切片的曝光，保證光切片成像質(zhì)量。CCD探測器上的光切片成像數(shù)據(jù)發(fā)送至主控計算機，并由主控計算機進行計算處理，形成樣品掃描三維圖像信息。
[0059]對于非熒光樣品，本實用新型的成像顯微系統(tǒng)的CXD探測器上的成像為激光光束在樣品上的反射和散射光的成像。
[0060]實施例2
[0061]以單色熒光蛋白標(biāo)記的單色熒光樣品為例。
[0062]與實施例1對非突光樣品掃描成像顯微系統(tǒng)不同的是:對單色突光樣品進行掃描成像時，在第二顯微物鏡10和場鏡12之間加裝有濾光片17，參看圖2。濾光片17允許熒光樣品上被掃描激光光束激發(fā)的熒光通過，消除掃描激光光束產(chǎn)生的反射光和散射光，僅使熒光樣品掃描區(qū)域的被激發(fā)熒光在CCD探測器的探測面上成像。其他成像顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與實施例1相同。對突光樣品進行激光掃描時，發(fā)射的激光波長為單色突光樣品標(biāo)記的熒光蛋白對應(yīng)的吸收波長，對不同樣品可以選擇不同的激光波長，如綠色熒光蛋白mEoc2，可以選擇532納米和561納米的激光，對EGFP可以用波長488納米的激光。不同熒光分子需要的吸收波長不同。
[0063]實施例3
[0064]以雙色熒光蛋白標(biāo)記的雙色熒光樣品為例。
[0065]在實施例2中對單色突光樣品的掃描成像顯微系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,增加一組激光發(fā)射裝置，形成兩組平行設(shè)置的第一激光發(fā)射裝置和第二激光發(fā)射裝置，參看圖3。
[0066]第一激光發(fā)射裝置依次包括激光器18、單模光纖19、準直透鏡20及反射鏡21，所述第二激光發(fā)生裝置依次包括激光器1、單模光纖2、準直透鏡3及偏振分束器22 ;第一激光發(fā)射裝置的激光器18發(fā)射的激光光束經(jīng)單模光纖19耦合后經(jīng)準直透鏡20準直形成準直激光光束，然后經(jīng)反射鏡21反射至偏振分束器22，再經(jīng)偏振分束器22反射后入射二維掃描振鏡4，同時，第二激光發(fā)射裝置的激光器I發(fā)射的激光光束經(jīng)單模光纖2耦合后經(jīng)準直透鏡3準直形成準直激光光束后，穿過偏振分束器22入射二維掃描振鏡4 ;第一激光發(fā)射裝置和第二激光發(fā)射裝置所產(chǎn)生的準直激光光束激光經(jīng)偏振分束器后合束同時入射二維掃描振鏡4，再由二維掃描振鏡4反射再經(jīng)準直透鏡組后通過第一顯微物鏡入射雙色熒光樣品。激光器I和激光器18發(fā)射的激光波長不同,分別對應(yīng)雙色突光樣品中兩種標(biāo)記突光蛋白的吸收波長。通過兩束不同波長的激光光束激發(fā)雙色熒光樣品中的雙色熒光，雙色熒光穿過第二顯微物鏡、濾光片、場鏡后在探測器的探測面上成像。濾光片17允許讓激發(fā)的雙色熒光通過，同時消除兩種波長激光光束的反射光和散射光。
[0067]上述三種實施例為本實用新型針對非熒光樣品、單色熒光樣品、雙色熒光樣品的舉例，針對其他的樣品，比如三色熒光樣品，增加一組激光發(fā)射裝置即可。
[0068]本實用新型上述三實施例的掃描成像顯微系統(tǒng)的成像顯微方法:1)首先使掃描成像顯微系統(tǒng)處于初始位置。然后針對掃描樣品的種類，由主控計算機向數(shù)據(jù)采集卡發(fā)出指令，通過數(shù)據(jù)采集卡調(diào)節(jié)激光器的輸出功率至合適值。激光器發(fā)射出光束，經(jīng)單模光纖耦合和準直透鏡準直，得到準直激光光束；該準直激光由二維掃描振鏡反射后，經(jīng)過準直透鏡組的第一透鏡聚焦再經(jīng)過第二透鏡的再準直，再準直后的激光光束經(jīng)過第一顯微物鏡，形成激光掃描光路，激光掃描光路的經(jīng)過第一顯微物鏡的聚焦光斑入射樣品臺，此時，將樣品臺水平放置，調(diào)整激光掃描光軸的角度使其與樣品平臺夾角為45°。
[0069]2)將樣品放置在樣品臺上，然后通過主控計算機向樣品臺控制裝置輸出指令，由樣品臺控制裝置控制樣品臺移動，調(diào)整樣品的位置。首先調(diào)整樣品臺垂直位置，使樣品表面待測區(qū)域位于通過第一顯微物鏡聚焦的激光光束的焦點附近，精確調(diào)節(jié)樣品在垂直方向的位置，直到通過第一顯微物鏡聚焦的激光光束的束腰位置對樣品進行照明，然后調(diào)節(jié)控制樣品臺在水平面內(nèi)移動將樣品移動到待掃描區(qū)域的初始位置。
[0070]3)調(diào)整第二顯微物鏡，使由第二顯微物鏡和場鏡組成的成像探測光路的光軸與激光掃描光路的光軸垂直，并且調(diào)整第二顯微物鏡的位置，使樣品上被激光掃描光路照亮的區(qū)域位于第二顯微物鏡的物方焦面上，使其可以對樣品中被激光光束激發(fā)出的熒光圖像成像(熒光樣品時，增加有濾光片)或?qū)悠分袑す夤馐姆瓷涔饣蛏⑸涔鈭D像成像(非熒光樣品時，不加裝濾光片)。第二顯微物鏡位置調(diào)節(jié)基于其放置在壓電片底座上，壓電片底座在電壓控制信號作用下可沿光軸方向發(fā)生物理形變，從而帶動第二顯微物鏡發(fā)生位移，實現(xiàn)調(diào)節(jié)第二顯微物鏡的物方焦面的位置。使用場鏡來收集通過第二顯微物鏡的光線并將其成像到CCD探測器上，CCD探測器探測面與成像探測光路的光軸垂直。
[0071]4)在正式掃描前，需要對于光切片成像顯微系統(tǒng)進行標(biāo)定。標(biāo)定輸入二維掃描振鏡的橫向鋸齒波掃描電壓信號的幅值對應(yīng)激光聚焦光斑在樣品上的掃描幅度，標(biāo)定縱向階梯波掃描電壓信號的遞增梯度對應(yīng)的激光聚焦光斑在樣品上的縱向移動間隔。測試并且確認在選用的第一顯微物鏡的出瞳限制下，橫向和縱向掃描的最大范圍，校準輸入壓電片底座的階梯波電壓信號，確保第二顯微物鏡的移動能夠與熒光切片的縱向移動相互匹配，確保樣品熒光切片始終能夠通過第二顯微物鏡清晰成像。
[0072]5)確定每一次通過二維掃描振鏡的偏轉(zhuǎn)而實現(xiàn)的激光聚焦光斑二維掃描的橫向和縱向范圍，并將其定義為局部掃描范圍。然后，將樣品上待測寬場區(qū)域劃分為若干個局部掃描區(qū)域，在主控計算機上設(shè)定對樣品臺控制器發(fā)送的樣品臺移動指令，以便在正式掃描時控制樣品臺依次依序按照劃分的局部掃描區(qū)域移動。
[0073]6)調(diào)節(jié)設(shè)定完畢后，開始進行樣品掃描。主控計算機通過數(shù)據(jù)采集卡向二維掃描振鏡的橫向掃描頭和縱向掃描頭分別輸入鋸齒波掃描電壓信號和階梯波掃描電壓信號，橫向鋸齒波掃描信號通過控制二維掃描振鏡橫向偏轉(zhuǎn)來控制激光掃描光路的聚焦光斑在垂直于激光掃描光路入射面的方向掃描，縱向階梯波掃描電壓信號控制二維掃描振鏡縱向偏轉(zhuǎn)來控制激光掃描光路的聚焦光斑在激光掃描光路的入射面內(nèi)移動，縱向階梯波掃描電壓信號的遞增梯度間隔與橫向鋸齒波掃描電壓信號的周期相等，且兩者變化同步，如此，二維掃描振鏡的橫向和縱向的合成掃描可以控制掃描激光光束聚焦光斑在完成每次橫向掃描之后縱向移動一段間隔經(jīng)行下一次掃描，每次橫向掃描都形成一層光切片，故光切片經(jīng)過若干次縱向移動會形成一組突光切片序列，每一層突光切片與樣品平臺夾角為45° ,參見圖4，展示了光切片序列的示意圖，樣品光切片的長度取決于二維掃描振鏡橫向鋸齒波掃描電壓信號的幅度，寬度取決于掃描激光光束聚焦光斑在樣品中的穿透深度，厚度等于掃描激光光束聚焦光斑的直徑，每兩層光切片之間的間隔取決于縱向階梯波掃描電壓信號的遞增梯度。同時，數(shù)據(jù)采集卡向壓電片底座輸出階梯波電壓控制信號，控制壓電片底座帶動第二顯微物鏡沿軸向跟隨光切片移動，保證每一層光切片都正好在第二顯微物鏡的物方焦面上。同時，光切片每移動一次，數(shù)據(jù)采集卡發(fā)送一次脈沖信號給CCD探測器，控制CCD探測器的快門打開一次，CCD探測器的曝光時間設(shè)置為每一次二維掃描振鏡的橫向鋸齒波掃描電壓信號的周期，從而記錄下每一層光切片的圖像信息。圖5為通過數(shù)據(jù)采集卡輸出的控制二維掃描振鏡的橫向和縱向掃描電壓信號、控制壓電片底座的控制電壓信號及控制探測器曝光時間的電壓信號的時序關(guān)系示意圖。當(dāng)樣品上一個局部掃描區(qū)域掃描完畢以后將樣品移動到另一個局部掃描區(qū)域中，主控計算機控制成像顯微系統(tǒng)復(fù)歸初始狀態(tài)，同時重復(fù)6)中的掃描過程分別對劃分的每一個局部掃描區(qū)域進行掃描，每一個局部掃描區(qū)域都會形成一組光切片序列。使用CCD探測器對每個掃描區(qū)域的光切片序列進行圖像信息采集。
[0074]7) CXD探測器將獲得的圖像信息即時傳輸回主控計算機進行數(shù)據(jù)處理。首先，將每個局部掃描區(qū)域的樣品光切片還原為樣品的三維圖像，然后將不同局部掃描區(qū)域之間的處理結(jié)果進行拼接還原出寬場范圍的樣品三維圖像信息。
[0075]本實用新型由于數(shù)據(jù)采集卡對二維掃描振鏡、壓電片底座的控制信號周期相同，控制第二顯微物鏡與二維掃描振鏡的偏轉(zhuǎn)同步，保證樣品被掃描激光光路的聚焦光斑的束腰照亮區(qū)域一直位于第二顯微物鏡的物方焦面，保證光軸軸向的高分辨率。同時通過對探測器的快門動作頻次控制和曝光時間周期，保證了光切片成像的圖像信息。本實用新型的傾斜掃描成像顯微系統(tǒng)，可以通過對局部掃描區(qū)域逐一有序掃描成像從而實現(xiàn)寬場范圍內(nèi)的樣品三維掃描圖像。且由于本實用新型的傾斜掃描成像顯微系統(tǒng)的光學(xué)元部件少，易于控制，可以保證三維圖像品質(zhì)。可對非熒光樣品、熒光樣品、雙色熒光樣品等進行掃描成像。
【權(quán)利要求】
1.一種傾斜寬場光切片掃描成像顯微系統(tǒng)，依次包括激光發(fā)射裝置、二維掃描振鏡、準直透鏡組、第一顯微物鏡、樣品臺、第二顯微物鏡、場鏡、探測器、數(shù)據(jù)采集卡及成像顯示控制裝置；其中，所述二維掃描振鏡反射所述激光發(fā)射裝置產(chǎn)生的激光后經(jīng)所述準直透鏡組聚焦再準直后經(jīng)所述第一顯微物鏡傾斜入射放置在所述樣品臺上的樣品形成傾斜入射樣品的激光掃描光路；所述準直透鏡組包括第一透鏡和第二透鏡，靠近所述第一顯微物鏡的所述第二透鏡與所述第一顯微物鏡構(gòu)成4f光學(xué)系統(tǒng)；掃描樣品后的出射光依次經(jīng)所述第二顯微物鏡、所述場鏡后在所述探測器上成像形成成像探測光路；所述激光掃描光路的光軸和所述成像探測光路的光軸垂直；所述第二顯微物鏡安裝在壓電片底座上，并可沿成像探測光路的光軸軸向發(fā)生位移； 所述樣品臺上的樣品被所述激光掃描光路聚焦光斑照亮區(qū)域位于所述第二顯微物鏡的物方焦面上； 所述數(shù)據(jù)采集卡分別與所述激光發(fā)射裝置、所述二維掃描振鏡、所述壓電片底座及所述探測器連接，并分別向與其連接的所述各部件發(fā)送控制信號控制所述各部件動作； 所述樣品臺與一樣品臺控制裝置連接，所述樣品臺控制裝置控制所述樣品臺進行三維移動； 所述成像顯示控制裝置分別與所述探測器、所述樣品臺控制裝置、所述數(shù)據(jù)采集卡連接，并分別向所述探測器、所述樣品臺控制裝置、所述數(shù)據(jù)采集卡發(fā)送設(shè)定參數(shù)及控制指令；并處理顯示樣品三維圖像信息； 當(dāng)樣品為熒光標(biāo)記的熒光樣品時，在所述第二顯微物鏡與所述場鏡之間設(shè)置有濾光片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描成像顯微系統(tǒng)，其特征在于所述激光發(fā)射裝置依次包括激光發(fā)生器、單模光纖、及準直透鏡；所述激光發(fā)生器發(fā)出激光經(jīng)所述單模光纖耦合后經(jīng)所述準直透鏡形成激光光束入射所述二維掃描振鏡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描成像顯微系統(tǒng)，其特征在于所述二維掃描振鏡包括橫向掃描頭和縱向掃描頭，所述數(shù)據(jù)采集卡分別向所述橫向掃描頭發(fā)送橫向控制電壓信號，向縱向掃描頭發(fā)送縱向控制電壓信號控制其偏轉(zhuǎn)角度及偏轉(zhuǎn)周期。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描成像顯微系統(tǒng)，其特征在于所述準直透鏡組的第一透鏡的像方焦點和第二透鏡的物方焦點重合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描成像顯微系統(tǒng)，其特征在于所述數(shù)據(jù)采集卡向所述二維掃描振鏡發(fā)送的橫向控制電壓信號周期、縱向控制電壓信號周期、向所述壓電片底座發(fā)出的控制電壓信號周期、及控制所述探測器拍攝速率周期相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描成像顯微系統(tǒng)，其特征在于所述激光發(fā)射裝置包括發(fā)射不同波長激光的第一激光發(fā)射裝置和第二激光發(fā)射裝置，所述第一激光發(fā)射裝置依次包括激光發(fā)生器、單模光纖、準直透鏡及反射鏡，所述第二激光發(fā)生裝置依次包括激光發(fā)生器、單模光纖、準直透鏡及偏振分束器；所述第一激光發(fā)射裝置發(fā)射的激光光束經(jīng)準直后由所述反射鏡反射至所述偏振分束器，再經(jīng)所述 偏振分束器反射入射所述二維掃描振鏡，同時，所述第二激光發(fā)射裝置發(fā)射的激光光束經(jīng)準直后穿過所述偏振分束器入射所述二維掃描振鏡；所述第一激光發(fā)射裝置和第二激光發(fā)射裝置所產(chǎn)生的激光于所述二維掃描振鏡處合束后再經(jīng)準直通過所述第一顯微物鏡入射樣品；所述樣品為經(jīng)雙色熒光標(biāo)記的雙色熒光樣品。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的掃描成像顯微系統(tǒng)，其特征在于所述激光掃描光路的光軸與所述樣品臺水平面夾角為45度。
【文檔編號】G02B21/36GK203705345SQ201420021659
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】于冬梅, 匡翠云, 畢學(xué)衛(wèi) 申請人:蘇州大貓單分子儀器研發(fā)有限公司