基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法
【專利摘要】本案為基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，包括以下步驟：1)用激光掃描共焦顯微鏡中的光電倍增管逐像素采集待成像樣本的信號數(shù)據(jù)；2)所述光電倍增管將掃描得到的各像素的信號數(shù)據(jù)放大后，通過積分器進行積分，其中首先對掃描至第一像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描時間進行積分，然后對掃描至第二像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描時間進行積分，直到對掃描至第N像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描時間進行積分，N大于等于1;3)將掃描至第一像素的積分作為第一像素的亮度值，而將掃描至第二像素的積分與掃描至第一像素的積分的差值作為第二像素的亮度值，依次計算相鄰兩次積分的差值，直到得到第N像素的亮度值。本案增強了LSCM的成像質(zhì)量。
【專利說明】基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，具體涉及基于積分采樣 的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)采集與處理方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 激光掃描共焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Mi croscopy，LSCM)是研究亞 微米細微結(jié)構(gòu)的有效技術(shù)手段。它是國內(nèi)外從事生物醫(yī)學和材料科學研究的科技工作者必 備的大型科研儀器。
[0003] 在LSCM系統(tǒng)中，掃描振鏡反射出掃描光斑，通過X-Y掃描機構(gòu)驅(qū)動掃描光斑 運動并遍歷樣本上的成像區(qū)域，從樣本返回的熒光信號通過光路后到達光電倍增管 (Photomultiplier Tube，PMT)，PMT的輸出為在掃描時間內(nèi)的連續(xù)模擬電壓信號。若待成 像物體反射回的是極弱光信號，PMT輸出信號呈現(xiàn)脈沖信號輸出特性；若待成像物體反射 回的是微弱光信號，PMT輸出信號呈現(xiàn)出脈沖信號和直流信號疊加的輸出特性。由于PMT在 弱光下的輸出隨機分布特性，如果直接對這個信號進行模數(shù)轉(zhuǎn)換，并由此重建圖像，則一個 恒定光強的樣本采樣也會得到一個像素點隨機明暗強烈變化的圖像。一般地，PMT輸出信 號含有高頻噪聲分量，輸出圖像質(zhì)量較差。
[0004] 對于LSCM系統(tǒng)，改善圖像質(zhì)量的傳統(tǒng)方式是過采樣的方法，即對PMT輸出的同一 個像素點信號進行多次采樣，然后取平均來獲得一個像素點信號的數(shù)據(jù)。這種方法能在一 定程度上提高信噪比，但是對提高圖像的信噪比作用有限，且要求有數(shù)十倍或數(shù)百倍正常 采樣率的AD轉(zhuǎn)換模塊，以及需要配套合適的寬帶放大電路，增加了成本；而且對于PMT的寬 帶輸出，該方法不可能對輸出信號進行完全采集。
[0005] 此外，由于在現(xiàn)有技術(shù)中，PMT將掃描到的像素點信號數(shù)據(jù)放大后，首先對掃描第 一像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描時間t進行積分，采用模數(shù)轉(zhuǎn)換器讀出積分值，即第一像素 亮度值，掃描完第一個點，對積分器清零；因此在掃描第二個點的時候，積分器的電容上重 新加載的是第二個像素產(chǎn)生的電壓信號，積分時間是從t到2t，因此，是用第二個像素的電 壓信號與時間間隔t進行積分，才能得到第二個像素的亮度值，掃描完第二個點，對積分器 清零；依此，在掃描第η個點的時候，是用第η個像素的電壓信號與時間間隔t進行積分，得 到第η個像素的亮度值，掃描完第η個點，對積分器清零。對像素駐留時間內(nèi)PMT輸出信號 進行模擬積分后采樣的的方式，每掃描一個點，就要對積分器清零，即在一個像素時間內(nèi)涉 及對積分器充電、采樣、和放電，雖然對圖像信噪比增強作用較強，但是受其機構(gòu)中開關(guān)裝 置的工作頻率和運放的電壓變化率等參數(shù)的限制，其最終的工作頻率也受到限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于積分米樣的激光掃描共 焦顯微鏡成像檢測方法，旨在減小控制開關(guān)的數(shù)字信號對采樣電壓的電磁干擾，提高采樣 的工作頻率，同時提高采樣電壓輸出值，降低模數(shù)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的設(shè)計難度，提高用于點成像信 號的信噪比，增強最終的成像質(zhì)量。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中，包括以下步驟：
[0009] 步驟1)用激光掃描共焦顯微鏡中的光電倍增管逐像素采集待成像樣本的信號數(shù) 據(jù)；
[0010] 步驟2)所述光電倍增管將掃描得到的各像素的信號數(shù)據(jù)放大后，通過積分器進 行積分，其中首先對掃描至第一像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描時間進行積分，然后對掃描至 第二像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描時間進行積分，直到對掃描至第N像素得到的信號數(shù)據(jù)和 掃描時間進行積分，N大于等于1 ;
[0011] 步驟3)將掃描至第一像素的積分作為第一像素的亮度值，而將掃描至第二像素 的積分與掃描至第一像素的積分的差值作為第二像素的亮度值，依次計算相鄰兩次積分的 差值，直到得到第N像素的亮度值。
[0012] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中，
[0013] 在所述步驟2)之后，還包括用模數(shù)轉(zhuǎn)換器讀取積分器得到的積分值；
[0014] 在所述步驟3)中，以模數(shù)轉(zhuǎn)換器讀取到的積分值作為第一像素的亮度值，以及計 算差值的基礎(chǔ)。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中， 所述積分值為電壓值。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中，
[0017] 在所述步驟1)中還包括將待成像樣本中的像素以行為單位分成若干組；
[0018] 所述N等于一行中的像素數(shù)；
[0019] 所述光電倍增管分組進行掃描；
[0020] 當對一行像素執(zhí)行完所述步驟2)和步驟3)之后，對積分器執(zhí)行清零操作，然后重 復執(zhí)行步驟2)，所述光電倍增管對下一行像素執(zhí)行掃描操作，以此循環(huán)直到執(zhí)行完所有行 的掃描和所有像素亮度估值。
[0021] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中， 所述激光掃描共焦顯微鏡中的掃描振鏡反射出掃描光斑，且所述掃描振鏡通過可沿X方向 和Y方向移動的驅(qū)動機構(gòu)的驅(qū)動，以遍歷待成像樣本上的所有成像區(qū)域，所述掃描光斑照 射到所述待成像樣本上，使得所述待成像樣本返射回微弱熒光，所述光電倍增管接收到所 述微弱突光信號。
[0022] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中，
[0023] 所述待成像樣本中的每個像素均返回微弱熒光供所述光電倍增管采集，且所述光 電倍增管將采集到的微弱熒光信號轉(zhuǎn)換成脈沖電壓信號和/或直流電壓信號。
[0024] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中，
[0025] 所述積分器包括運算放大器和設(shè)置在所述運算放大器的負極輸入端和輸出端之 間的充電電容，所述充電電容的電壓容量設(shè)置為大于任一行像素的微弱熒光信號轉(zhuǎn)換成的 電壓值之和。
[0026] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其 中，還包括與所述充電電容相并聯(lián)的開關(guān)S，當所述開關(guān)S打開，積分器對光電倍增管輸出 信號進行積分，當所述開關(guān)S閉合，對積分器清零。
[0027] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中，
[0028] 所述模數(shù)轉(zhuǎn)換器的精度位數(shù)η為η =圖像灰度值位數(shù)+log2 (像素點數(shù)），其中像 素點數(shù)為每行的像素點數(shù)。
[0029] 優(yōu)選的是，所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其中， 所述光電倍增管對任一行進行掃描時，所述積分器中的充電電容隨著掃描像素點的增加而 電量逐步增加，直到所述光電倍增管掃描完該行中的最后一個像素，對充電電容執(zhí)行清空 操作，即積分器清零。
[0030] 本發(fā)明的有益效果是：1)相對像素駐留時間積分的方式僅需在一行像素點掃描 結(jié)束后閉合開關(guān)，對積分器清零，不需要頻繁的對電容器進行充放電控制，不但可以避免控 制開關(guān)的數(shù)字信號對積分值的電磁干擾，還能提高模數(shù)轉(zhuǎn)換器的采樣工作頻率；2)對LSCM 成像中PMT輸出信號進行連續(xù)積分，能夠表示完整的光電信號探測器在若干個像素駐留時 間內(nèi)的光信號累加，提高了信號的幅值，輸出了更高的采樣電壓，降低了模數(shù)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的設(shè) 計難度；3)通過計算相鄰兩次積分值的差值，得到當前像素的亮度值，可更有效的濾除PMT 輸出信號的高頻噪聲分量，顯著提高用于點成像信號的信噪比，增強了最終的成像質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明一實施例所述的基于積分米樣的激光掃描共焦顯微鏡成像檢測方 法的工作流程圖；
[0032] 圖2為本發(fā)明一實施例所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像檢測方 法中積分采樣器的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0034] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0035] 基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，參閱圖1，包括以下步 驟：
[0036] 步驟1)用激光掃描共焦顯微鏡中的光電倍增管逐像素采集待成像樣本的信號數(shù) 據(jù)；
[0037] 步驟2)首先對掃描第一像素得到的信號數(shù)據(jù)進行積分，積分時間是從0到T，得到 第一像素的亮度值U (T)，其中T為每個像素的掃描時間；在掃描第二個點的時候，積分器的 電容上加載的是第二個像素與第一個像素疊加的電壓信號，其中包含了兩個T時間間隔， 對掃描第一像素與第二像素疊加的信號數(shù)據(jù)進行積分，積分時間是從〇到2T，得到U(2T)， 因此U(2T)_U(T)為第二像素的亮度值；因為像素必然是有亮度的，如果完全沒有亮度，那 么這個電壓值也就是〇,而絕不可能是負值，因此，這個電壓值是一直在正向疊加的；
[0038] 步驟3)直到對掃描前η像素得到的累加信號數(shù)據(jù)和掃描時間nT進行積分，積分 值為U (ηΤ)，第η像素的亮度值為U (nT)-U ((η-1) Τ)，其中，η為圖像樣本中一行像素點數(shù)，η 大于等于1。
[0039] 在以上本發(fā)明原理基礎(chǔ)上，還可以有許多變形。
[0040] 例如，本發(fā)明還可以包括模數(shù)轉(zhuǎn)換器，這樣就可以將積分值進行模數(shù)轉(zhuǎn)換，將數(shù)字 信號作為亮度值，并且方便計算差值。
[0041] 進一步的，還包括積分值是一種電壓信號。
[0042] 本發(fā)明還可以包括以下情況，通常的圖像都不會是幾個像素，而是很多個像素，如 果累計很多個像素進行掃描，則積分器的電容上的電壓閾值過大，因此，將待成像樣本中的 像素以行為單位分成若干組，所述光電倍增管分組進行掃描，這樣積分器的電容上的電壓 閾值只要大于像素點最多的那一行像素電壓；當一行像素掃描結(jié)束后，對積分器執(zhí)行清零 操作，然后所述光電倍增管對下一行像素執(zhí)行掃描操作，以此循環(huán)直到執(zhí)行完所有行的掃 描和所有像素亮度估值。
[0043] 本發(fā)明還可以包括，LSCM中的掃描振鏡反射出掃描光斑，且掃描振鏡通過可沿X 方向和Y方向移動的驅(qū)動機構(gòu)的驅(qū)動，以遍歷待成像樣本上的所有成像區(qū)域，掃描光斑照 射到所述待成像樣本上，使得所述待成像樣本返射回微弱熒光，所述光電倍增管接收到所 述微弱突光信號。
[0044] 進一步的，待成像樣本中的每個像素均返回微弱熒光供所述光電倍增管采集，且 光電倍增管將采集到的微弱熒光信號轉(zhuǎn)換成脈沖電壓信號和/或直流電壓信號。
[0045] 參閱圖2,本發(fā)明還可以包括以下情況，所述積分器包括運算放大器和設(shè)置在所述 運算放大器的負極輸入端和輸出端之間的充電電容，所述充電電容的電壓容量設(shè)置為大于 任一行像素的微弱熒光信號轉(zhuǎn)換成的電壓值之和。
[0046] 進一步的，還包括與所述充電電容相并聯(lián)的開關(guān)S，當開關(guān)S打開，積分器對光電 倍增管輸出信號進行積分，當開關(guān)S閉合，電容器放電，對積分器清零。
[0047] 進一步的，還包括模數(shù)轉(zhuǎn)換器的精度位數(shù)η為η =圖像灰度值位數(shù)+log2 (像素點 數(shù)），其中像素點數(shù)為每行的像素點數(shù)。
[0048] 本發(fā)明還可以包括以下情況，所述光電倍增管對任一行進行掃描時，積分器中的 充電電容隨著掃描像素點的增加而電量逐步增加，直到所述光電倍增管掃描完該行中的最 后一個像素，對充電電容執(zhí)行清空操作，即積分器清零。
[0049] 盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1. 基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特征在于，包括以下步 驟： 步驟1)用激光掃描共焦顯微鏡中的光電倍增管逐像素采集待成像樣本的信號數(shù)據(jù)； 步驟2)所述光電倍增管將掃描得到的各像素的信號數(shù)據(jù)放大后，通過積分器進行積 分，其中首先對掃描至第一像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描時間進行積分，然后對掃描至第二 像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描時間進行積分，直到對掃描至第N像素得到的信號數(shù)據(jù)和掃描 時間進行積分，N大于等于1 ; 步驟3)將掃描至第一像素的積分作為第一像素的亮度值，而將掃描至第二像素的積 分與掃描至第一像素的積分的差值作為第二像素的亮度值，依次計算相鄰兩次積分的差 值，直到得到第N像素的亮度值。
2. 如權(quán)利要求1所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特 征在于， 在所述步驟2)之后，還包括用模數(shù)轉(zhuǎn)換器讀取積分器得到的積分值； 在所述步驟3)中，以模數(shù)轉(zhuǎn)換器讀取到的積分值作為第一像素的亮度值，以及計算差 值的基礎(chǔ)。
3. 如權(quán)利要求2所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特 征在于，所述積分值為電壓值。
4. 如權(quán)利要求1所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特 征在于， 在所述步驟1)中還包括將待成像樣本中的像素以行為單位分成若干組； 所述N等于一行中的像素數(shù)； 所述光電倍增管分組進行掃描； 當對一行像素執(zhí)行完所述步驟2)和步驟3)之后，對積分器執(zhí)行清零操作，然后重復執(zhí) 行步驟2)，所述光電倍增管對下一行像素執(zhí)行掃描操作，以此循環(huán)直到執(zhí)行完所有行的掃 描和所有像素殼度估值。
5. 如權(quán)利要求1所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特 征在于，所述激光掃描共焦顯微鏡中的掃描振鏡反射出掃描光斑，且所述掃描振鏡通過可 沿X方向和Y方向移動的驅(qū)動機構(gòu)的驅(qū)動，以遍歷待成像樣本上的所有成像區(qū)域，所述掃描 光斑照射到所述待成像樣本上，使得所述待成像樣本返射回微弱熒光，所述光電倍增管接 收到所述微弱熒光信號。
6. 如權(quán)利要求5所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特 征在于， 所述待成像樣本中的每個像素均返回微弱熒光供所述光電倍增管采集，且所述光電倍 增管將采集到的微弱熒光信號轉(zhuǎn)換成脈沖電壓信號和/或直流電壓信號。
7. 如權(quán)利要求1所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特 征在于， 所述積分器包括運算放大器和設(shè)置在所述運算放大器的負極輸入端和輸出端之間的 充電電容，所述充電電容的電壓容量設(shè)置為大于任一行像素的微弱熒光信號轉(zhuǎn)換成的電壓 值之和。
8. 如權(quán)利要求7所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特 征在于，還包括與所述充電電容相并聯(lián)的開關(guān)S，當所述開關(guān)S打開，積分器對光電倍增管 輸出信號進行積分，當所述開關(guān)S閉合，對積分器清零。
9. 如權(quán)利要求1所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其特 征在于， 所述模數(shù)轉(zhuǎn)換器的精度位數(shù)η為η =圖像灰度值位數(shù)+log2 (像素點數(shù)），其中像素點 數(shù)為每行的像素點數(shù)。
10. 如權(quán)利要求1所述的基于積分采樣的激光掃描共焦顯微鏡成像數(shù)據(jù)處理方法，其 特征在于，所述光電倍增管對任一行進行掃描時，所述積分器中的充電電容隨著掃描像素 點的增加而電量逐步增加，直到所述光電倍增管掃描完該行中的最后一個像素，對充電電 容執(zhí)行清空操作，即積分器清零。
【文檔編號】G02B21/36GK104219463SQ201410475362
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】黃維張, 運海 申請人:中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術(shù)研究所