顯微鏡裝置制造方法
【專利摘要】一種顯微鏡具有物鏡、在照明束路徑上照亮樣品的光源、在樣品上產(chǎn)生在兩個(gè)空間方向上結(jié)構(gòu)化的扁平照明圖案的安排、在一條圖片束路徑上對入射光進(jìn)行檢測的表面檢測器、在樣品上在一個(gè)位移方向上對照明圖案進(jìn)行移位的安排、以及控制單元，該控制單元在檢測器檢測到光時(shí)拍攝一張圖片作為該圖案沿著位移方向的不同位置處的相位圖片并且用于從這些相位圖片計(jì)算地對所照亮的樣品區(qū)域的整體圖片進(jìn)行重建。位移方向向照明圖案的主對稱軸傾斜并且取決于該照明圖案被選擇成使得圖片重建所需的相位圖片的數(shù)量符合理論最小要求值。
【專利說明】顯微鏡裝置
[0001]本發(fā)明涉及一種顯微鏡裝置，該顯微鏡裝置帶有物鏡、用于照亮樣品的光源、用于在樣品上產(chǎn)生結(jié)構(gòu)照明圖案的安排、用于來自樣品的光的檢測器、用于在樣品上對照明圖案進(jìn)行移位的安排和用于在照明圖案的不同位置對樣品進(jìn)行拍照的控制單元，這些圖片作為相位圖片，從其中計(jì)算地對照亮樣品區(qū)域的整體圖片進(jìn)行重建。
[0002]基于攝像機(jī)的顯微熒光(寬場)圖片遭受來自被來自制備直到可辨識性的其他平面的信息失真的焦平面的所希望信息影響。
[0003]為了產(chǎn)生可以在與選定層隔離的情況下在其中觀察信息的層圖片，使用常規(guī)共聚焦激光掃描方法，其中用一個(gè)或多個(gè)激光光點(diǎn)對樣品進(jìn)行掃描。
[0004]W092 / 14118A1披露了一種使用表面?zhèn)鞲衅鲝囊呀?jīng)用結(jié)構(gòu)照明拍攝的單獨(dú)圖片計(jì)算地產(chǎn)生層圖片的顯微鏡。這些用于計(jì)算的單獨(dú)圖片的不同之處在于投影結(jié)構(gòu)在制備上的位置(下文將這些圖片稱為“相位圖片”)。W092 / 14118A1中描述的照明結(jié)構(gòu)是二維方格圖案，必須按恰好半個(gè)周期對其進(jìn)行移動，以便產(chǎn)生計(jì)算所需要的兩張相位圖片，方格圖案的方格恰好成像到單獨(dú)像素上是有必要的，從而使得當(dāng)對圖案進(jìn)行移位時(shí)，結(jié)果極其精密地對極小的不精確產(chǎn)生反應(yīng)。此外，僅用2個(gè)點(diǎn)對周期信號(在這種情況下為移位圖案調(diào)制)的采樣表現(xiàn)出對奈奎斯特-香農(nóng)采樣定理的違背；這引起系統(tǒng)和周期性的求值誤差(偽影)。
[0005]可以在W098 / 45745A1和W002 / 12945A2中找到計(jì)算地從相位圖片(其在已經(jīng)投影到樣品上的圖案的不同位置處產(chǎn)生)生成層圖片的一種或多種切實(shí)可行的方法版本。在那兒使用了一維刻線光柵而不是二維結(jié)構(gòu)照明圖案，必須對其投影移位至少兩次以便能夠從三個(gè)或更多個(gè)相位圖片計(jì)算所希望的層圖片。
[0006]在已經(jīng)用被稱為“結(jié)構(gòu)照明”的指示程序產(chǎn)生的層照片中，比共聚焦激光掃描顯微鏡更好地抑制離焦信息。此外，該方法在垂直于筆畫定向的方向上使分辨率得到提高。在M.G.L.Gustafsson、D.A.Agard 和 J.ff.Sedat 的 SPIE3919:141-150，2000 年論文集的文章“通過結(jié)構(gòu)照明使寬場突光顯微術(shù)的橫向分辨率加倍(Doubling the lateral resolutionof widefield fluorescence microscopy by structured illumination)，，中使用了以上內(nèi)容，其中，3次記錄了 3張相位圖片，在這些圖片中，已經(jīng)通過位移生成的三個(gè)光柵位置一次與一次三個(gè)轉(zhuǎn)動位置組合成光柵優(yōu)選方向(O°、120°和240° )。關(guān)于轉(zhuǎn)動，三個(gè)定向足夠了，相反地，平移也可以包括5個(gè)或更多個(gè)位置而不是3個(gè)。因此，從通過線性平移和轉(zhuǎn)動生成的至少9張相位圖片計(jì)算關(guān)于最大增加2個(gè)因數(shù)的分辨率不再具有優(yōu)選方向的層圖片。
[0007]EP1936422A1描述了一種帶有結(jié)構(gòu)照明的顯微鏡，在結(jié)構(gòu)照明中，通過轉(zhuǎn)向拍攝相位圖片的刻線光柵產(chǎn)生照明圖案并沿著垂直于光柵劃線的一個(gè)方向?qū)ζ溥M(jìn)行移位。光柵還用于對來自樣品的光進(jìn)行光解調(diào)。還提到，還可以使用二維光柵而不使用一維刻線光柵，然后必須在垂直于光柵劃線的兩個(gè)方向上對二維光柵進(jìn)行移位以便拍攝相位圖片。
[0008]DE102007047466A1描述了一種帶有結(jié)構(gòu)照明的顯微鏡，其中通過刻線光柵或二維結(jié)構(gòu)光柵生成照明圖案，對該照明圖案進(jìn)行移位以便在樣品上拍攝相位圖片。通過光柵產(chǎn)生物鏡的光瞳中的衍射分布，然后例如通過衍射級的選擇或轉(zhuǎn)動來對該衍射分布進(jìn)行操縱，轉(zhuǎn)動結(jié)構(gòu)相位板。
[0009]DE102007047468A1披露了一種帶有結(jié)構(gòu)照明的顯微鏡，其中通過在縱向方向上結(jié)構(gòu)化的線形照明對樣品進(jìn)行掃描，根據(jù)不同的相位位置進(jìn)行若干次樣品掃描，即，在結(jié)構(gòu)化的方向上對線進(jìn)行移位以便產(chǎn)生相互平衡的不同相位圖片之后。出于樣品掃描和相移的目的，通過位于照明掩模(已經(jīng)通過圓柱形透鏡將其照明)與管狀透鏡之間的X-Y掃描儀對照明線進(jìn)行移位。在入射到CCD檢測器上之前，來自樣品的光同樣行進(jìn)通過管狀透鏡。在光源和照明掩模之間存在可切換的衰減器以便在樣品的掃描過程中在掃描方向上對光強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)制。在C⑶檢測器上進(jìn)行“非去掃描”檢測。對樣品的掃描重復(fù)若干次，通過一條線對檢測器上的線圖案進(jìn)行移位；當(dāng)連接調(diào)制器時(shí)，通過相應(yīng)的時(shí)延實(shí)現(xiàn)以上內(nèi)容。為了獲得單相位圖片，通過選擇某些線和通過“舍棄”與其相鄰的圖片區(qū)域而生成的單獨(dú)圖片必須加起來。以此方式，實(shí)現(xiàn)殖適可調(diào)的共聚焦。
[0010]DE10118463A1和DE10155002A1披露了帶有結(jié)構(gòu)照明的顯微鏡裝置，其中，為了獲得相位圖片，將已經(jīng)在縱向方向上正弦地調(diào)制的線焦點(diǎn)投影到樣品上，并且通過在縱向方向上對線焦點(diǎn)進(jìn)行移位來獲得后續(xù)相互平衡的不同相位圖片。為了提高深度分辨率，在檢測器上游存在開槽光闌。提到了當(dāng)檢測器為對中間圖片平面進(jìn)行觀察的CCD攝像機(jī)時(shí)，可以省略開槽光闌。
[0011]DE102007009550B4描述了一種用于對已經(jīng)用結(jié)構(gòu)化方式通過掩模、用作檢測器(其用作適應(yīng)性可變光闌)的CCD芯片照明的移動樣品進(jìn)行觀察的顯微鏡裝置。
[0012]結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(SM)還不能夠替代共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)，盡管寬場的指示優(yōu)點(diǎn)起因于該方法的兩個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn):
[0013]拍攝若干張圖片(這對于產(chǎn)生層圖片而言是有必要的)與通過點(diǎn)掃描儀拍攝圖片相比沒有那么耗時(shí)，但比點(diǎn)圖案掃描儀(旋轉(zhuǎn)盤)耗時(shí)得多。相比后者，速度的缺點(diǎn)更加顯著，層圖片的計(jì)算需要的相位圖片更多，并且必須在拍攝單獨(dú)相位圖片之間必須執(zhí)行更多的操作。
[0014]樣品越厚并且對其著色越強(qiáng)烈，則單獨(dú)圖片中的圖案引起的亮度調(diào)制越少。因此，隱藏在調(diào)制中的并且包含所希望的層信息的信號被背景噪聲掩蔽并且在噪聲中逐漸消失。相應(yīng)地，層圖片的信噪比也受到影響。
[0015]因此，本發(fā)明的目標(biāo)是緩解這些缺點(diǎn)并使得可獲得可以變成用于三維顯微術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)儀器的耐用裝置。這尤其通過以下內(nèi)容實(shí)現(xiàn):通過使所需相位圖片的數(shù)量最小化、通過減少相位圖片之間的操作數(shù)量(不用平移並轉(zhuǎn)動，而僅僅平移)并且通過一系列適用于增加單獨(dú)相位圖片的調(diào)制深度的措施；這致使層圖片具有改進(jìn)的信噪比。
[0016]通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡裝置和根據(jù)權(quán)利要求6所述的顯微鏡裝置實(shí)現(xiàn)如本發(fā)明所述的本目標(biāo)。
[0017]在如本發(fā)明中根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法中，有利的是，可以通過相對應(yīng)選擇的2維照明結(jié)構(gòu)和扁平照明圖案相對于已經(jīng)有利地被選擇用于本目的樣品的位移方向使所需的相位圖片的數(shù)量最小化。這尤其適用于單獨(dú)相位圖片之間的所需操作的數(shù)量:不是現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述的平移和轉(zhuǎn)動，而是僅需要一項(xiàng)平移。
[0018]如本發(fā)明中根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法的優(yōu)勢在于，照明圖案不同時(shí)采集所有的樣品區(qū)域，但在樣品上按順序?qū)ζ溥M(jìn)行組裝和再次拆卸，并且在這樣做時(shí)對其進(jìn)行記錄直到已經(jīng)采集了整個(gè)視場。同時(shí)，將沒有照亮的所有檢測器區(qū)域切換成不活躍。通過按順序組裝和再次拆卸的圖案的這種類共聚焦檢測，有效地掩蔽了所有可以減小調(diào)制深度和因此降低信噪比的散射光。
[0019]附圖簡要說明:
[0020]從屬權(quán)利要求中給出了本發(fā)明的優(yōu)選配置。
[0021]以下使用附圖通過示例詳細(xì)描述了本發(fā)明。
[0022]圖1示出了如本發(fā)明所述的顯微鏡裝置的一個(gè)示意性示例；
[0023]圖2示出了用于與本發(fā)明一起使用的照明圖案的第一示例；
[0024]圖3示出了與圖2相似的視圖，但示出了另一個(gè)示例；
[0025]圖4示出了與圖1相似的視圖，如本發(fā)明所述的顯微鏡裝置的一個(gè)替代性示例，該示例尤其適用于樣品的順序照明；
[0026]圖5示出了照明圖案在微透鏡陣列、樣品和攝像機(jī)芯片上的順序組裝和拆卸的展示；
[0027]圖6A和圖6B示出了與圖5類似的視圖，但示出了帶有圓柱形透鏡陣列的兩個(gè)不同的修改實(shí)施例；
[0028]圖7示出了一個(gè)檢測器像素上的信號的樣品特征，其中，六邊形的照明圖案在樣品(實(shí)線)上不斷移位或者已經(jīng)針對每張相位圖片記錄了測量點(diǎn)(點(diǎn)In);
[0029]圖8針對第一(實(shí)線)、第二(折線)和第三(虛線)級示出了來自圖7的單獨(dú)諧波部分；
[0030]圖9示出了根據(jù)方程(23)的方格圖案；
[0031]圖10示出了根據(jù)方程(41)的六邊形圖案；
[0032]圖11示出了六邊形圖案(折線)和刻線光柵(實(shí)線)的對比特征作為歸一化結(jié)構(gòu)頻率的函數(shù)；
[0033]圖12示出了方格照明圖案的第一級下的頻率空間內(nèi)的位移向量的正交投影；
[0034]圖13示出了六邊形照明圖案的第一級下的頻率空間內(nèi)的位移向量的正交投影；
[0035]圖14示出了表現(xiàn)軸向方向上的最大理論強(qiáng)度點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的與六邊形圖案(帶有粗略λ / NA的周期)在散焦方向上的非相干對比特征粗略對應(yīng)的特征的第一曲線(實(shí)線)、以及表現(xiàn)假設(shè)相干照明下的ζ軸方向上的此對比的第二曲線(折線)；
[0036]圖15示出了來自圖14的兩條曲線之間的漸變，示出了在24%與100% (中間值:29.4%、38.5 %、45 %、56 %、70 % )之間的不同三維相干長度或不同相對光瞳激勵(lì)的ζ方向上(當(dāng)使周期結(jié)構(gòu)成像時(shí))的理論對比特征。
[0037]圖1示出了如本發(fā)明所述的顯微鏡裝置的第一示意性示例，其中示出了結(jié)構(gòu)照明、用于產(chǎn)生照明光束12的光源10、微透鏡陣列14、束偏轉(zhuǎn)元件16、用于照明光的第一管狀透鏡18、分色器20、顯微鏡物鏡22、用于從樣品24出射的光的第二管狀透鏡26、以及攝像機(jī)檢測器28(例如，C⑶攝像機(jī)芯片)。透鏡陣列14位于光源10與中間圖片平面30之間并且用于使激發(fā)光束12聚焦到中間圖片平面30內(nèi)，從而使得在那兒產(chǎn)生在兩個(gè)空間方向上結(jié)構(gòu)化的扁平點(diǎn)圖案31。通過第一管狀透鏡18和物鏡22按照結(jié)構(gòu)照明圖案32使點(diǎn)圖案31成像到樣品24上，使得分色器20對根據(jù)圖1中所示的示例的照明光具有反射作用。源自樣品并且可以是例如熒光(該照明光起到激發(fā)光的作用)的光34通過分色器20傳遞并且通過物鏡22和第二管狀透鏡26在檢測器28上成像。
[0038]通過束偏轉(zhuǎn)元件16，可以相對于樣品24對照明圖案32進(jìn)行移位以便記錄不同的相位圖片，即，關(guān)于樣品24的具有三維結(jié)構(gòu)照明圖案的不同相位角的圖片。控制單元36使生成相移所需的束偏轉(zhuǎn)元件16與攝像機(jī)28進(jìn)行的圖片拍攝同步并且因此產(chǎn)生可以與另一張相位圖片平衡的相位圖片的拍攝以便獲得所希望的樣品層圖片。
[0039]圖1中所示的關(guān)于顯微鏡透鏡陣列14的安排尤其適用于用激光(即，相干光)進(jìn)行的激發(fā)，并且可替代地用于通過中間圖片平面30上游的微透鏡陣列產(chǎn)生圖案，可以將穿孔掩模陣列(未示出)放置在所指示的中間圖片平面30內(nèi)。但這相應(yīng)地降低了輻射效率。以下將對專門用相干光起作用的第三可能性進(jìn)行描述。
[0040]在圖1所示的實(shí)施例中，束偏轉(zhuǎn)元件16位于中間圖片平面30與第一管狀透鏡18之間的非無限空間內(nèi)。束偏轉(zhuǎn)元件16可以是例如機(jī)動化的偏轉(zhuǎn)鏡或樞轉(zhuǎn)安裝的玻璃窗口。前者不僅影響圖案在樣品上的位置，而且還影響光瞳束，后者相反地使光瞳束不變，因?yàn)橐呀?jīng)受到影響的照明束12的束偏移不改變其角度。然而由于為了產(chǎn)生不同的相位圖片，僅需要照明圖案32在樣品24上的相對小的位移(在照明光波長的數(shù)量級上)，可以通過被制作成為偏轉(zhuǎn)鏡的束偏轉(zhuǎn)元件16的適當(dāng)放置使物鏡的光瞳內(nèi)的束偏移保持小得可忽視。為了當(dāng)將束偏轉(zhuǎn)元件16放置在管狀透鏡18和物鏡22之間時(shí)實(shí)現(xiàn)同樣的事情，將必須將束偏轉(zhuǎn)元件16放置在物鏡的光瞳附近。
[0041]在如本發(fā)明所述的方法中，使用三維調(diào)制的激發(fā)光圖案實(shí)施激發(fā)，并且對已經(jīng)從樣品發(fā)出的光的剩余三維調(diào)制進(jìn)行求值。為了盡可能實(shí)現(xiàn)大的調(diào)制，應(yīng)將束路徑中的可以減小調(diào)制深度的關(guān)鍵光學(xué)元件數(shù)量減少到最小。當(dāng)照明圖案僅出現(xiàn)在物體平面內(nèi)時(shí)這成功最佳，或者在與圖片的平面共軛的平面內(nèi)時(shí)這是不可能的，從而使得可以到最大程度地補(bǔ)償成像誤差。
[0042]雖然在圖1所示的示例中使用了已經(jīng)在中間圖像平面30內(nèi)產(chǎn)生的扁平圖案到樣品24上的投影，但可替代地，也可以通過對來自物鏡的光瞳的相干照明光的焦點(diǎn)進(jìn)行干涉而僅在樣品24本身內(nèi)產(chǎn)生所希望的照明光結(jié)構(gòu)化。例如，來自源自樣品平面24( S卩，物鏡22的另一個(gè)焦平面)內(nèi)的物鏡的光瞳中的七個(gè)六邊形安排的點(diǎn)的相干光的干擾產(chǎn)生毯狀六邊形照明圖案32(見圖3)?？梢詫⒑线m的相位板插入到中間圖像平面30內(nèi)以在物鏡的光瞳內(nèi)產(chǎn)生這七個(gè)點(diǎn)用于遠(yuǎn)心光學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0043]然后可以除了通過上述束偏轉(zhuǎn)元件16以外還通過物鏡的焦點(diǎn)和光瞳的振幅的合適的相對相移來進(jìn)行對在樣品24上拍攝不同相位圖片所需的照片圖案進(jìn)行移位。可以將這些焦點(diǎn)分配到照明圖案的多個(gè)衍射級，焦點(diǎn)的相對相移恰好對應(yīng)于樣品24上的照明圖案的傅里葉階的相對相移?？梢酝ㄟ^物鏡的光瞳內(nèi)的或附近的振鏡掃描儀、聲光調(diào)制器或還可以通過直接影響無限束路徑(當(dāng)其例如被制作為在干涉儀的一條臂中帶有壓電致動器和反射鏡的組合的干涉儀時(shí))中的光路徑來例如產(chǎn)生相移。
[0044]通過樣品內(nèi)的干涉生成所希望的照明圖案還允許實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRFM)的高分辨率版本。由于已經(jīng)通過干涉法產(chǎn)生的照明圖案的局部頻率取決于一個(gè)焦點(diǎn)到另一個(gè)焦點(diǎn)的相對距離，通過選擇分辨率邊界附近的此頻率(即，通過將焦點(diǎn)定位在光瞳的邊緣上)，用合適的物體，可以在從蓋玻璃到樣品的過渡處實(shí)現(xiàn)單獨(dú)干涉束分量的全反射。這允許帶有提高的表面分辨率的TIRF激發(fā)。當(dāng)產(chǎn)生樣品內(nèi)的干涉圖案時(shí)，然而必須考慮到只有當(dāng)引起來自樣品內(nèi)的物鏡光瞳的僅6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行干涉時(shí)才保證TIRF。在進(jìn)一步上述用于使用相位板在物鏡的光瞳內(nèi)產(chǎn)生六邊形圖案的程序中，通過衍射在那兒產(chǎn)生六個(gè)六邊形安排的點(diǎn)，其中一個(gè)點(diǎn)在中心內(nèi)，該點(diǎn)源自干涉的零衍射級。如果沒有抑制此零衍射級，則將產(chǎn)生毀滅TIRF測量結(jié)果的相當(dāng)大的背景。出于此原因，有利的是產(chǎn)生照明束路徑12內(nèi)的“更靠前的”物鏡的光瞳內(nèi)的樣品24內(nèi)干涉所需的6個(gè)焦點(diǎn)。然后，這還能夠?qū)崿F(xiàn)TIRF角度的可變匹配。
[0045]在圖1中所示的實(shí)施例中，對于每張相位圖片，根據(jù)照明圖案同時(shí)照亮有待照亮的樣品表面的所有區(qū)域，即，在大面積上通過照明光束12完全照亮微透鏡陣列14 (或者，在替代性實(shí)施例中，點(diǎn)掩模或相位掩模)。典型地，有待光激勵(lì)的表面將是矩形的，并且有待盡可能均勻地對表面進(jìn)行光激勵(lì)。
[0046]照明圖案優(yōu)選地為六邊形點(diǎn)圖案，這是因?yàn)榱呅螆D案一方面在對相位圖片進(jìn)行平衡之后比方格點(diǎn)圖案提供圖片平面的三維更加均勻的分辨率提高(用六邊形圖案實(shí)現(xiàn)與用已經(jīng)被轉(zhuǎn)動三次并且Gustafsson等人的初始提到的文章中所描述的光柵一樣大的分辨率提高)，并且另一方面，還具有比線圖案或方格圖案小1.5個(gè)因數(shù)的填充因數(shù)。由于填充因數(shù)，減少了不希望的背景并且因此減少了來自不希望的焦面的噪聲成分。根本地，通過照亮帶有三維結(jié)構(gòu)照明圖案的樣品并且通過若干張相位圖片的后續(xù)求值，不僅生成清除了不希望的離焦信息的層照片，而且當(dāng)拍攝若干張相位圖片時(shí)(其中，相對于樣品對圖案進(jìn)行移位以便改變照明圖案的三維相位)實(shí)現(xiàn)相關(guān)圖片平面的水平分辨率提高，并且然后以一種合適的方式使這些相位圖片相互平衡。在這樣做時(shí)，可以在每空間方向最大實(shí)現(xiàn)提高分辨率2個(gè)因數(shù)，即，因此最大可以超過顯微鏡的衍射引起的分辨率邊界2個(gè)因數(shù)(例如可以在Gustafsson等人的初始引用的文章中找到本效果的描述)。對于本原理的實(shí)際應(yīng)用而言，希望關(guān)于所需的相位圖片的數(shù)量和所要求的移動的簡單性對在樣品和照明圖案之間獲得相位圖片所需的動作進(jìn)行優(yōu)化。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，已經(jīng)認(rèn)識到，在熟練選擇圖案的位移方向相對于圖案的對稱性主軸的角度的情況下，可以在沿著此位移方向已經(jīng)拍攝少許相位圖片的情況下通過圖案沿著本位移方向的唯一位移來實(shí)現(xiàn)具有最大分辨率提高的層照片。在此，取決于照明圖案選擇位移方向，從而使得圖片重建所需的相位圖片的數(shù)量對應(yīng)于已經(jīng)考慮在內(nèi)的照明圖案的頻率階的數(shù)量所需的理論最小值(即，已經(jīng)在圖片的起源中重新組合的照明圖案的傅里葉階的數(shù)量)。在頻率空間中，這對應(yīng)于如下標(biāo)準(zhǔn):對于所選擇的位移方向而言，所考慮的頻率階中的每個(gè)頻率階就每個(gè)頻率階的相移盡可能與其他頻率階的相移不同的意義上從一張相位圖片到下一張相位圖片經(jīng)歷盡可能明確的相移，即，被移位以便與其自身的速度相匹配每個(gè)頻率階被移位以便與其自身的速度相匹配。
[0048]首先，對第I節(jié)至第3節(jié)中的以下詳細(xì)數(shù)學(xué)推導(dǎo)的重要結(jié)果進(jìn)行總結(jié)。
[0049]圖3舉例示出了六邊形點(diǎn)圖案作為照明圖案，其中，當(dāng)僅將照明圖案的第一頻率階考慮在內(nèi)時(shí)(此處，基于與這三個(gè)相等主對稱方向的六邊對稱，具有三個(gè)第一階；針對方格圖案相應(yīng)地僅具有兩個(gè)第一階)，位移方向42相對于三個(gè)相等主對稱方向(在圖3中標(biāo)記為 40)其中之一的角 α 為 ±19.11° 或 n*60° ±19.11。(η = 1，2，3，...)；在圖 3 中，示出了標(biāo)記為44并且垂直于位移方向42的方向角，其中主對稱軸40'相應(yīng)地為10.89° ；第三主對稱方向在圖3標(biāo)記為40"。如第2.3節(jié)中所陳述的，對于第一階而言，仍然具有第二解決方案，確切地為10.9° ;然而，出于實(shí)際原因(所需的絕對位移越小，則容錯(cuò)越好)，第一解決方案是優(yōu)選的。優(yōu)選地，實(shí)際上應(yīng)選擇位移方向42從而使得此角α在18.6°與19.6°之間的范圍內(nèi)。
[0050]圖2示出了方格圖案作為照明圖案，當(dāng)僅將照明圖案的第一頻率階考慮在內(nèi)時(shí)(另一條主對稱軸在圖2中標(biāo)記為140')，此處位移方向42與主對稱軸140之間的最佳角度α為71.565°。根本地，此處該角可以是η*90° ±71.565° (根據(jù)第2.2節(jié)，此處還存在第二理論解決方案，然后實(shí)際上出于命名為六邊形的原因，該解決方案不是那么有利)。但由于更高的對稱性和更小的填充因數(shù)，通常優(yōu)選六邊形圖案。
[0051]僅考慮照明圖案的第一頻率階，在六邊形圖案的情況下，必須沿著位移方向42取至少七張不同的相位圖片，而在方格圖案的情況下，五張不同的相位圖片就足夠了。
[0052]在第2.5節(jié)中并且尤其在表I中示出了對六邊形照明圖案的更高階進(jìn)行考慮的結(jié)果。相應(yīng)地，例如，考慮圖案的第一和第二階的情況下的最佳位移角為13.90° (第二解決方案，5.21°沒有那么有利)，完整的圖片重建需要13張不同的相位圖片。在考慮圖案的第一、第二和第三階的情況下，最佳位移角為6.59°，則完整的圖片重建需要19張不同的相位圖片。表I還示出了為六邊形照明圖案選定的位移角實(shí)際上應(yīng)被選擇成在從1°到20°、優(yōu)選地4到20度的范圍內(nèi)(因?yàn)镺1解決方案更合適)，準(zhǔn)確值取決于對應(yīng)應(yīng)用中有待考慮的照明圖案的傅里葉階的數(shù)量。在大多數(shù)情況下，第一階的考慮或第一和第二階的考慮將是足夠的，從而使得所選擇的位移角將通常在13°與20°之間。
[0053]對于六邊形照明，填充因數(shù)比對于方格照明更小，并且每個(gè)照明場在所有方向上被非照明區(qū)域包圍，其結(jié)果是單獨(dú)相位照片的調(diào)制被放大，并且減少了來自有待在相位圖片的平衡中消除的不希望的焦面的噪聲成分。
[0054]不同相位圖片的對應(yīng)相位優(yōu)選地均勻地分布在可能的相位角的區(qū)域上。單獨(dú)相位圖片所需的圖案的位移在激發(fā)光的波長的數(shù)量級上(典型地，照明圖案的三維結(jié)構(gòu)化在衍射邊界的附近并且因此在激發(fā)光的波長的數(shù)量級上)。由于所需的照明圖案位移因此非常小，所以如圖1中所示的束偏轉(zhuǎn)元件16在非無限空間內(nèi)的安排不是關(guān)鍵的。
[0055]可以根據(jù)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)一步減少來自除了所希望的焦面以外的其他焦面的噪聲成分，因?yàn)闆]有在樣品的所有位點(diǎn)處同時(shí)應(yīng)用和記錄照明圖案，但在樣品上按順序?qū)ζ溥M(jìn)行組裝和再次拆卸直到已經(jīng)采集了整個(gè)視場。因此，對于每個(gè)相場而言，對有待照亮的樣品表面的部分區(qū)域內(nèi)的照明圖案進(jìn)行組裝和再次拆卸，這些部分區(qū)域一起覆蓋有待照亮的樣品表面。每張相位圖片相應(yīng)地不是通過整個(gè)樣品表面的激勵(lì)照明而起源，而是根據(jù)照明圖案通過部分照明而按順序起源。在這樣做時(shí)，觸發(fā)檢測器28從而使得實(shí)質(zhì)上在那時(shí)僅樣品表面的照亮部分區(qū)域所成像到其上的檢測器區(qū)域137是活躍的。因此，檢測器本身用作類共焦開槽光闌。從用于用限定的槽寬進(jìn)行記錄而拍攝攝像機(jī)圖片的另一條連接已知的技術(shù)也被稱為“卷簾快門(rolling shutter)”技術(shù)。
[0056]有利地，以在與“卷簾快門”移動相同的方向上遷移的帶狀形式對照明圖案進(jìn)行組裝和拆卸。圖5中使用六邊形圖案展示了這種情況，其中在上半部分中，在時(shí)間h時(shí)，示出了照明光帶112在根據(jù)六邊形對稱(在圖5中的左側(cè))制作的微透鏡陣列14上位置、從其中產(chǎn)生的六邊形結(jié)構(gòu)照片圖案的帶132在樣品24(圖5中的中間)上的位置、以及被帶132照亮的樣品區(qū)域的帶狀圖像137在攝像機(jī)芯片28 (在圖5中的右側(cè)；區(qū)域137也對應(yīng)于在時(shí)間h時(shí)活躍地切換的攝像機(jī)芯片的部分)上的位置；在圖5的下部部分中，示出了帶112、132和137在時(shí)間tn時(shí)的對應(yīng)位置，帶112、132和137遷移所在的方向在圖5中被標(biāo)記為133。用被標(biāo)記為135的灰色區(qū)域在圖5中指示在對應(yīng)瞬間沒有活躍的檢測器28的那一部分。
[0057]所照亮和檢測的帶132在方向133上越窄，則該安排越接近共焦到一個(gè)方向上的安排，在邊界情況下，其是帶共焦顯微鏡(“柵縫掃描共焦”)。如果帶132的寬度被選擇成使得其對應(yīng)于攝像機(jī)芯片28的高度，這對應(yīng)于以上參照帶有在相位圖片拍攝過程中是靜止的照明圖案的圖1至圖3所描述的情況。選擇帶132越窄，則對不希望的焦面上的信號成分抑制得越好，其結(jié)果是提高了調(diào)制深度并且改進(jìn)了信號/噪聲比。但同時(shí)暴露時(shí)間因此變得更短，并且必須相對應(yīng)地使單獨(dú)圖案點(diǎn)更亮以便實(shí)現(xiàn)給定的信號/噪聲比。然而，由于樣品破壞隨著峰強(qiáng)度比隨著所施加的光劑量增加地更多，由于激發(fā)光引起的樣品破壞隨著共焦的增加而增加。為了防止樣品破壞，必須容忍更長的測量時(shí)間或更差的信噪比。在前者情況下，不是在樣品上更緩慢地移動照明帶132，將在一個(gè)帶位置上拍攝若干張相位圖片并且從其中形成平均相位圖片。通過改變照明帶的寬度，可以選擇信號/噪聲比、圖片拍攝速率與樣品破壞之間的在那時(shí)最好的折衷。
[0058]當(dāng)使用六邊形圖案時(shí)(如圖5中所示)，在三線照明帶132的情況下(如圖5中所示)，可以實(shí)現(xiàn)理論上最大可能的分辨率提高，在任何情況下，其可對于避免將攝像機(jī)芯片28上的活躍檢測間隙寬度設(shè)計(jì)成比將恰好對應(yīng)本帶寬稍微更小或稍微更大的偽影是有用的。
[0059]本程序使結(jié)構(gòu)照明與攝像機(jī)芯片28上的去掃描共焦檢測組合(例如與DE102007047468A1中所描述的方法相比)。例如相比DE102007047468A1中所描述的方法，不需要或者在一段時(shí)間中在照明圖案的順序組裝和拆卸過程對照明光進(jìn)行調(diào)制，沒有從照明帶的一個(gè)位置到下一個(gè)位置的“饋通”，并且在單次掃描過程結(jié)束時(shí)已經(jīng)具有使用檢測器芯片的所有線的完整相位圖片，不需要圖片的后續(xù)共焦校正。
[0060]將使用sCMOS芯片簡要解釋所提出的方法的實(shí)踐優(yōu)點(diǎn)。在其卷簾快門模式下，芯片在IOms內(nèi)可以讀出1080條線。這是10微秒/像素/線。如果將“艾里斑”投影到8條像素線上，則將其讀出持續(xù)222微秒的24條像素線歸屬與一個(gè)六邊形基本單元。因此，相位圖片的拍攝持續(xù)10，222ms。如果對于束的返回，估算出最大值768 μ s (這是現(xiàn)實(shí)的)，則拍攝一張相位圖片持續(xù)11ms，并且拍攝高分辨率層圖片所需的所有相位圖片持續(xù)長達(dá)7倍，即，77ms。相應(yīng)地，原則上，獲得13張層圖片/秒，圖片大小在2540X1080像素。用于此目的共焦顯微鏡對于此目的需要許多倍長并且同時(shí)更多地裝載樣品。通過減小場的大小，可以在不增加樣品裝載的情況下實(shí)現(xiàn)更高的攝影速率。
[0061]圖4示意性地示出了顯微鏡裝置，可以用其實(shí)現(xiàn)所描述的樣品順序結(jié)構(gòu)照明。與根據(jù)圖1的結(jié)構(gòu)相比，光源10與顯微鏡陣列14之間具有掃描裝置50、掃描透鏡52和機(jī)動化掃描儀反射鏡54以移動用來照亮微透鏡14上的透鏡陣列14的激光束12，從而使得以沿著方向133遷移的帶112的形式按順序照亮該透鏡陣列。在這樣做時(shí)，在中間圖片平面30中形成點(diǎn)圖案的相對應(yīng)遷移的照明帶，通過第一管狀透鏡18和物鏡22使該照明帶相應(yīng)地成像到樣品24上，從而使得形成照明圖案的按順序組裝和拆卸相對應(yīng)遷移帶132。由于對于照明帶132在樣品上的移動而言比在樣品上獲得不同相位圖片所需的照明光圖案的位移中需要大得多的路徑，所以出于此目的，必須提供(從光源10觀察)位于中間圖片平面30 (其在與物鏡的光瞳共軛的平面內(nèi))的前面的特殊掃描裝置50，從而使得在掃描過程中，物鏡的光瞳內(nèi)的束位置保持不變。掃描裝置50此處僅移動非關(guān)鍵的照明帶132(通過其在微透鏡14上移動光帶112)，但不移動其調(diào)制深度將在通過掃描光學(xué)器件的通道內(nèi)極度惡化的特別關(guān)鍵的調(diào)制照明光。此外，調(diào)制深度的任何損失將特別降低相位圖片的調(diào)制深度。在圖4中所示的結(jié)構(gòu)中，通過僅在于攝像機(jī)圖片絕對對稱的平面內(nèi)產(chǎn)生的調(diào)制照明圖片來避免這些問題，其結(jié)果是對所有的光學(xué)系統(tǒng)的誤差進(jìn)行補(bǔ)償。與以上進(jìn)行的陳述類似，不是微透鏡陣列14，而是在中間圖像平面30的前面，可以在中間圖片平面30本身內(nèi)引入穿孔掩模陣列(未示出)或相位板(同樣未示出)。正如以上所描述的，例如使用束偏轉(zhuǎn)元件16進(jìn)行產(chǎn)生相位圖片所需的束偏轉(zhuǎn)。
[0062]如在來自圖1的示例中，優(yōu)選地使用一個(gè)帶有六邊形對稱的圖案，其結(jié)果是可以使樣品平面內(nèi)的分辨率最大化。在這樣做時(shí)，還在來自圖4的示例中，如在來自圖1的示例中，可以使用圖片平面30內(nèi)的相應(yīng)穿孔掩模而不使用透鏡陣列14。
[0063]如果目的是實(shí)現(xiàn)更高的圖片速率而放棄最大分辨率提高，可以產(chǎn)生帶圖案而不是六邊形圖案來作為樣品上的照明圖案并且用參照關(guān)于六邊形圖案的圖4和圖5所描述的方式順序地對其進(jìn)行掃描并且其中掩蔽來自還沒有照亮的樣品區(qū)域的所有發(fā)射物(去掃描檢測)。在本發(fā)明的本方面中，僅在一個(gè)空間方向上(即，在照明帶的縱向方向上)一次針對一張相位圖片對樣品上順序形成的照明圖案進(jìn)行結(jié)構(gòu)化，而在與其垂直的方向上(即，照明圖案的順序組裝和拆卸的方向133)沒有三維結(jié)構(gòu)化。這由于“卷簾快門”的同步移動而僅出現(xiàn)在檢測器上。
[0064]此處，可以通過增加照明帶132的選定寬度上的調(diào)制深度來建立一側(cè)上的樣品破壞(帶越寬，則局部照亮樣品所用的強(qiáng)度變得越小)與信號/噪聲比的改進(jìn)之間的最佳折衷。
[0065]圖6A示出了邊界情況，其中僅照亮高度上衍射受限的一條帶132，其結(jié)果是“柵縫共焦”結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)與帶有結(jié)構(gòu)帶照明的結(jié)構(gòu)的那些優(yōu)點(diǎn)組合。
[0066]對于帶狀圖案而言，例如如圖6A中所示，可以使用圓柱形透鏡陣列114，透鏡的軸向方向與方向133—致，在該方向上通過掃描裝置50通過使照明光束帶112在圓柱形透鏡陣列114上移動來對照明帶132進(jìn)行組裝和拆卸?？商娲兀梢栽谥虚g圖片平面30內(nèi)使用帶掩模，其帶走向平行于方向133。然而，當(dāng)使用圓柱形透鏡陣列114時(shí)，輻射效率(幾乎)高達(dá)兩倍。通過省略圓柱形透鏡陣列(或者光柵)，獲得經(jīng)典的開槽掩模共焦顯微鏡。其深度分辨率小于如本發(fā)明所述的安排的深度分辨率，但僅需要使用單次掃描而不需要它們中的三個(gè)來拍攝圖片。
[0067]通過多光子激發(fā)在樣品內(nèi)生成所希望的照明圖案中存在適用于使來自位于所希望的焦面外的所有平面的信息最小化并且以此方式用于實(shí)現(xiàn)最大調(diào)制深度和最佳信號/噪聲比的進(jìn)一步措施。在這樣做時(shí)，使用多光子激發(fā)的已知層敏感性，由于實(shí)質(zhì)上僅在所希望的焦面內(nèi)的多光子激發(fā)的非線性，發(fā)生樣品的熒光激發(fā)。因此，仍然在樣品深處實(shí)現(xiàn)光的最大調(diào)制激發(fā)，并且在相位圖片的計(jì)算求值中，必須僅清除來自其他平面的仍然散射的發(fā)射光。[0068]毯狀物(即，在整個(gè)攝像機(jī)芯片上延伸)點(diǎn)圖案將使激光輸出分布在太多點(diǎn)之間，并且由于激發(fā)的二次強(qiáng)度依賴性，將使得需要不現(xiàn)實(shí)高的激光輸出。因此，有利的是使如上所述的激光輸出僅集中在一條窄帶132上并且在作為按順序組裝和拆卸的點(diǎn)圖案的有待照亮的樣品表面上對其進(jìn)行引導(dǎo)。平行于其以所述方式在攝像機(jī)芯片28的區(qū)域137上按順序且選擇性地檢測結(jié)果熒光，在那時(shí)將該區(qū)域切換成活躍。激發(fā)波長的兩倍(或?qū)τ谌庾蛹ぐl(fā)，三倍)提供更差的分辨率，但該方法目的主要在于樣品的良好對比度、高速度和低光子裝載。相應(yīng)地，圖6A中所述的照明模式尤其非常適用于多光子激發(fā)。
[0069]如果傳感器寬帶的亮度(對于多光子激發(fā)，其將通常是一個(gè)筆畫的問題，因?yàn)閮H以此方式應(yīng)預(yù)期足夠高的局部強(qiáng)度)高度仍然不足以實(shí)現(xiàn)充足的信號，可以在其寬度上減少照明筆畫。如果在掃描過程中可以垂直于掃描方向?qū)P畫進(jìn)行移位(即，如果掃描裝置50被設(shè)計(jì)成雙向的)，則可以對減少的場的不足(至少部分地)進(jìn)行平衡。出于如此原因，必須用雙軸掃描裝置(未示出)替換單軸掃描儀54。由于多光子顯微術(shù)非常經(jīng)常用于觀察具有一個(gè)優(yōu)選方向的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，所以許多情況下的“通道掃描(aisle scan)”可以檢測所有重要的圖片元素，盡管其僅在視場的一小部分上延伸。圖6B中示出了此通道掃描的一個(gè)示例作為圖6A中所示的示例的修改。
[0070]而在二維照明圖案中存在必須將圖案線性地移位到其內(nèi)的最佳角以便能夠?qū)崿F(xiàn)來自最小數(shù)量的相位圖片的最佳結(jié)果，當(dāng)使用帶狀圖案(即，僅在一個(gè)方向上調(diào)制的一張照明圖案)時(shí)，只要一個(gè)分量在垂直于帶的方向上的位移具有一個(gè)調(diào)制相位并且可以拍攝至少所需數(shù)量的三張不同相位圖片時(shí)，單獨(dú)相位圖片之間根本不存在照明圖案的優(yōu)選位移方向。為了在不必替換不只中間圖片平面30上游的微透鏡陣列14(中間圖片平面30內(nèi)的或者穿孔掩模或者相位板，兩者都未示出)的情況下能夠例如使用帶有至少7張相位圖片的六邊形照明圖案用同一測量安排快速且容易地在高速模式(帶有順序帶結(jié)構(gòu)和僅三個(gè)所需的相位圖片)與一個(gè)高分辨率模式之間進(jìn)行切換，束偏轉(zhuǎn)16的定向優(yōu)選地被選擇成使得其允許對與六邊形圖案而言最佳的位移角。然后可以使用同一安排實(shí)現(xiàn)用于產(chǎn)生(至少)三張相位圖片的線性帶照明的兩倍位移。
[0071]除了照明平面內(nèi)的所述分辨率提高以外，結(jié)構(gòu)照明還允許在ζ方向上提高分辨率。這是由于以下事實(shí):對于用相干光的周期圖案的表面照明而言，由于塔爾博效應(yīng)，在物鏡的實(shí)際焦面的上方和下方自動地出現(xiàn)一系列次級焦點(diǎn)，兩個(gè)方向上的第一次級焦點(diǎn)以較低的強(qiáng)度表現(xiàn)逆轉(zhuǎn)的圖案。同時(shí)，ζ方向上的所有這些焦點(diǎn)比單獨(dú)的衍射有限焦點(diǎn)更清晰。對于I維刻線光柵的情況而言，Gustafsson等人已經(jīng)對此進(jìn)行了描述。在此，使用六邊形結(jié)構(gòu)的二維照明也在求值圖片中產(chǎn)生更好的結(jié)果。當(dāng)同時(shí)僅照亮六邊形圖案的三條或更多條線時(shí)，還出現(xiàn)對分辨率有利的效應(yīng)。
[0072]因此，在使用如本發(fā)明所述的方法的情況下，可以明顯提高光學(xué)顯微鏡在橫向方向并且還有軸向方向兩者上的分辨率；這能夠拍攝樣品的高分辨率三維圖片。
[0073]以下描述了用于方格圖案和用于六邊形圖案的最佳位移角的數(shù)學(xué)推導(dǎo)。
[0074]1.一維結(jié)構(gòu)照明
[0075]在對于結(jié)構(gòu)照明當(dāng)今常用的所有方法中，可以使用在一個(gè)空間方向上帶有一個(gè)或多個(gè)頻率的圖案。在這樣做時(shí)，拍攝若干張相位圖片，必須在這些圖片之間對圖案或圖案的圖片進(jìn)行移位。假設(shè)一個(gè)空間方向上的頻率，用于第一相位圖片的一個(gè)像素(X，y)上的強(qiáng)度可以被寫成
[0076]
【權(quán)利要求】
1.一種顯微鏡裝置，該顯微鏡裝置帶有物鏡(22)、用于在照明束路徑(12)上照亮樣品(24)的光源(10)、用于在該樣品上產(chǎn)生在兩個(gè)空間方向上被結(jié)構(gòu)化的扁平照明圖案(32)的裝置(14，18，22，50)、用于在一條圖片束路徑(34)上對來自該樣品的光進(jìn)行檢測的表面檢測器(28)、用于在一個(gè)位移方向上對該樣品上的該照明圖案進(jìn)行移位的裝置(16)、以及控制單元(36)，該控制單元被制作成用于在該檢測器檢測到光時(shí)拍攝一張圖片作為該圖案沿著該位移方向(42)在不同位置處的相位圖片并且用于從這些相位圖片以計(jì)算方式對被照亮樣品區(qū)域的整體圖片進(jìn)行重建，其特征在于，該位移方向向該照明圖案(32)的主對稱軸(40，40'，40"，140，140')傾斜并且取決于該照明圖案被選擇成使得該圖片重建所需的相位圖片的數(shù)量與理論最小要求值相對應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的顯微鏡裝置，其中，該照明圖案(32)為六邊形點(diǎn)圖案，并且該位移方向(42)被選擇成相對于三個(gè)主對稱軸(40，40'，40")其中之一(40)在從I到20度的范圍內(nèi)，并且可以拍攝至少7張相位圖片。
3.如權(quán)利要求2所述的顯微鏡裝置，其中，該位移方向(42)被選擇成相對于這三個(gè)主對稱軸(40，40'，40")其中之一(40)在從4到20度、優(yōu)選地13到20度的范圍內(nèi)。
4.如以上權(quán)利要求其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該照明圖案的裝置(14，18，22)被制作以便利用針對每張相位圖片的照明圖案(32)同時(shí)照亮有待照亮的樣品表面的所有區(qū)域。
5.如權(quán)利要求1至3其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該照明圖案(32)的裝置(14，18，22，50)被制作以便在針對每張相位圖片有待照亮的樣品表面的部分區(qū)域(132)內(nèi)按順 序?qū)υ撜彰鲌D案進(jìn)行組裝并再次拆卸，這些部分區(qū)域一起覆蓋這些有待照亮的樣品表面從而使得用該照明圖案不是同時(shí)而是按順序部分地照亮有待照亮的該樣品表面，該控制單元(36)被制作成用于控制該檢測器(28)從而使得基本上僅該檢測器區(qū)域(137)在那時(shí)是活躍的，在該檢測器區(qū)域上該樣品表面的恰被照亮的部分區(qū)域被成像。
6.一種顯微鏡裝置，該顯微鏡裝置帶有物鏡(22)、用于在照明束路徑(12)上照亮樣品(24)的光源(10)、用于在該樣品上產(chǎn)生在至少一個(gè)空間方向上被結(jié)構(gòu)化的照明圖案(32)的裝置(14，18，22，50，114)、用于在一條圖片束路徑(34)上對來自該樣品的光進(jìn)行檢測的表面檢測器(36)、用于在一個(gè)位移方向上對該樣品上的該照明圖案進(jìn)行移位的裝置(16)、以及控制單元(36)，該控制單元被制作成用于在該檢測器檢測到光時(shí)拍攝一張圖片作為該圖案沿著該位移方向(42)在不同位置處的相位圖片，從這些相位圖片以計(jì)算方式對被照亮樣品區(qū)域的整體圖片進(jìn)行重建，所述用于產(chǎn)生該照明圖案的裝置被制作以便在有待照亮的樣品表面的部分區(qū)域(132)內(nèi)按順序?qū)︶槍γ繌埾辔粓D片的該照明圖案進(jìn)行組裝并再次拆卸，這些部分區(qū)域一起覆蓋這些有待照亮的樣品表面從而使得用該照明圖案不是同時(shí)而是按順序部分地照亮這些有待照亮的樣品表面，并且該控制單元被制作成用于控制該檢測器從而使得基本上僅該檢測器區(qū)域(137)在那時(shí)是活躍的，在該檢測器區(qū)域上該樣品表面的恰被照亮的部分區(qū)域被成像。
7.如權(quán)利要求6所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該照明圖案的裝置(14，18，22,50,114)被制作成用于組裝和拆卸在一個(gè)方向上遷移的帶(132)的形式的該照明圖案(32)。
8.如權(quán)利要求7所述的顯微鏡裝置，其中，該帶(132)的寬度被選擇成使得使用其照亮的樣品區(qū)域被成像到至少三條檢測器線(137)上。
9.如權(quán)利要求7和8其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，該帶(132)僅在縱向方向上被結(jié)構(gòu)化。
10.如權(quán)利要求7至9其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，該帶(132)僅在橫向方向上被結(jié)構(gòu)化。
11.如權(quán)利要求7至10其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該照明圖案的裝置(14，18，22，50，114)被制作成用于允許該帶(132)僅在與該帶垂直的方向上遷移。
12.如權(quán)利要求7至11其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該結(jié)構(gòu)化圖案(32)的裝置(18，22，50，114)具有圓柱形透鏡陣列(114)，該遷移帶的方向(112)與這些圓柱形透鏡的軸向方向平行。
13.如權(quán)利要求7至10其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，該帶(132)在該檢測器(36)上在該帶的縱向方向上的成像僅在該檢測器表面的部分區(qū)域上延伸，所述用于產(chǎn)生該照明圖案的裝置(14，18，22，50，114)被制作成用于當(dāng)對該圖案進(jìn)行組裝時(shí)不僅在與該帶垂直的方向上而且還在該帶的縱長方向上允許該帶遷移，以便當(dāng)對該照明圖案進(jìn)行組裝和拆卸時(shí)沿著根據(jù)一個(gè)樣品結(jié)構(gòu)的彎曲軌跡。
14.如權(quán)利要求7至13其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，該照明圖案(32)的位移方向包含該帶(132)的縱向方向上的一個(gè)分量。
15.如以上權(quán)利要求之一所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該結(jié)構(gòu)化照明圖案(32)的裝置(14，18，2 2，50，114)被制作成用于在物體平面內(nèi)或與物體平面共軛的平面(30)內(nèi)產(chǎn)生該照明圖案。
16.如權(quán)利要求15所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該結(jié)構(gòu)化照明圖案的裝置被制作成用于通過對該物鏡的光瞳內(nèi)的相干照明光的焦點(diǎn)進(jìn)行干涉來產(chǎn)生該照明圖案。
17.如權(quán)利要求16所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于對該樣品(24)上的該照明圖案進(jìn)行移位的裝置被制作成用于造成該物鏡的光瞳內(nèi)的焦點(diǎn)的振幅的相對相移以便對該樣品上的該照明圖案(32)進(jìn)行移位。
18.如權(quán)利要求17所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于在該樣品(24)上產(chǎn)生該照明圖案的裝置具有在該光瞳內(nèi)或附近的振鏡掃描儀、聲光調(diào)制器或干涉儀，該干涉儀在該干涉儀的一條臂內(nèi)帶有壓電制動器與反射鏡的組合，以便引起該物鏡的光瞳內(nèi)的焦點(diǎn)的所述相對相移。
19.如權(quán)利要求15所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該結(jié)構(gòu)化照明圖案的裝置(14,18,22,50,114)具有用于在一個(gè)中間圖片平面(30)內(nèi)產(chǎn)生點(diǎn)圖案(31)的元件(14，114)。
20.如權(quán)利要求19所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于在該中間圖片平面內(nèi)產(chǎn)生該點(diǎn)圖案的該元件為位于該中間圖片平面內(nèi)的穿孔掩模。
21.如權(quán)利要求19所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于在該中間圖片平面(30)內(nèi)產(chǎn)生該點(diǎn)圖案(31)的該元件是位于該光源(10)與該中間圖片平面之間的透鏡陣列(14，114)，以便在該中間圖片平面內(nèi)產(chǎn)生該照明光的焦點(diǎn)。
22.如權(quán)利要求4或權(quán)利要求19至21其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于對該樣品上的該照明圖案進(jìn)行移位的裝置在該中間圖片平面(30)與第一管狀透鏡(18)之間的非無限空間內(nèi)具有束偏轉(zhuǎn)元件(16)。
23.如權(quán)利要求22所述的顯微鏡裝置，其中，該束偏轉(zhuǎn)元件(16)被制作成機(jī)動化偏轉(zhuǎn)反射鏡或被制作成轉(zhuǎn)動玻璃窗口。
24.如權(quán)利要求5或6以及權(quán)利要求19至21其中之一所述的顯微鏡裝置，其中，所述用于產(chǎn)生該照明圖案的裝置具有帶有一個(gè)掃描透鏡(52)的掃描裝置(50)，以便在用于在該中間圖片平面(30)內(nèi)產(chǎn)生該點(diǎn)圖案(31)的該元件(14，114)上移動照明光從而按順序?qū)υ撜彰鲌D案(32)進(jìn)行組裝和拆卸。
25.如以上權(quán)利要求之一所述的顯微鏡裝置，其中，該顯微鏡裝置被制作成使得該表面檢測器(28)位于與帶有該點(diǎn)圖案(31)的該中間圖片平面(30)絕對對稱的平面內(nèi)。
26.如權(quán)利要求25所述的顯微鏡裝置，其中，該中間圖片平面(30)通過一個(gè)或該第一管狀透鏡(18)和該物鏡(22)被成像到該樣品(24)上，并且該樣品通過該物鏡和與該第一管狀透鏡完全相同的第二管狀透鏡(26)被成像到該表面檢測器(28)上，該照明束路徑(12)通過分色器(20)與該圖片束路徑(34)分開。
27.如以上權(quán)利要求之一所述的顯微鏡裝置，其中，該顯微鏡裝置被制作用于對該樣品的二光子激發(fā) 進(jìn)行檢測。
【文檔編號】G02B21/00GK103890633SQ201280047584
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月29日
【發(fā)明者】R.烏爾, M.施羅普 申請人:Fei公司