專利名稱：一種降解聯(lián)苯菊酯的菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)農(nóng)藥生物降解技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株對聯(lián)苯菊酯具高效降解能力的 菌株及其應(yīng)用，用于聯(lián)苯菊酯的生物降解，以及該農(nóng)藥污染的水體，土壤以及農(nóng)產(chǎn)品的生物 修復(fù)和生物凈化。
背景技術(shù)：
擬除蟲菊酯是目前使用量僅次于有機(jī)磷的一類殺蟲劑，為殺蟲劑中的第二大類， 約占世界殺蟲劑市場的20%，在我國的施用面積已占?xì)⑾x劑總施用面積的1/3以上。近年 來，農(nóng)藥中毒事件及職業(yè)性中毒病例逐年增加。曾一度被人們認(rèn)為低毒、使用安全的擬除蟲 菊酯類農(nóng)藥，近年來相關(guān)研究表明，此類農(nóng)藥有蓄積毒性，人長期接觸會引起慢性疾病，有 致癌、致畸、致突變的危險(xiǎn)；另外對魚類，蛘類等水生生物有很高的毒性。聯(lián)苯菊酯和其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥一樣，殘留在作物上然能引起人畜中毒，嚴(yán)重 危害人的健康。世界各國及組織(美國、歐盟、國際食品法典委員會(CAC)等)都對聯(lián)苯菊 酯制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。由于聯(lián)苯菊酯對光，熱穩(wěn)定，在環(huán)境中的半衰期較長，在自然環(huán)境下難分解，因此 用微生物降解自然環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥具有重要意義，特別是針對應(yīng)用廣泛的聯(lián)苯菊酯 農(nóng)藥的高效降解菌株，其應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益更為明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，提供一株對聯(lián)苯菊酯具有高 效降解能力菌株。該菌株對聯(lián)苯菊酯具有高效降解能力，達(dá)80%以上。本發(fā)明的另一目的 在于提供應(yīng)用本發(fā)明菌株降解聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥的應(yīng)用方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下本發(fā)明提供一株對聯(lián)苯菊酯具有高效降解能力的降解菌株，該菌株為枯草芽孢桿 菌(Bacillus Subtilis)的菌株 LBKl ；所述菌株的 16SrDNA 序列為 SEQ ID :N0. 1。所述的菌株的應(yīng)用，該菌株用于聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥的生物降解。所述的菌株的應(yīng)用，降解組合條件為溫度25°C -35 PH = 6-8,接種量 3% -10%，裝液量 25-100ml。所述的菌株的應(yīng)用，降解組合條件為溫度30°C，PH = 7，接種量10%，裝液量 50ml。該菌株生物學(xué)特性革蘭氏陽性，周生鞭毛，桿狀，菌落呈乳白色圓點(diǎn)且表面光滑， 接觸酶、產(chǎn)H2S反應(yīng)陽性；不能利用葡萄糖，不能水解淀粉?？梢砸月?lián)苯菊酯為唯一碳源。該 菌株在4°C 40°C，pH 4.0 8.0范圍內(nèi)均可生長。但是最適生長溫度為30°C，最適生長 PH為7.0。該菌株對農(nóng)藥的耐受濃度為0.6mg/L，最適生長農(nóng)藥濃度為0. lmg/L。該菌株在 72h內(nèi)對聯(lián)苯菊酯的降解率可達(dá)80%以上。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。菌株的分離與篩選土樣采集與浙江省某農(nóng)藥廠。所用培養(yǎng)基為=LB培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10. 0g，酵母膏5. 0g, Nac 15. Ogo基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(g/L)NaCl 1. 0g, NH4NO3L 0g, K2HPO4L 5g, KH2PO4O. 5g, MgSO4 · 7Η200· lg，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. Olg，蒸 lOOOmL，調(diào) ρΗ7· 0 左右。固體培養(yǎng)基向液體培養(yǎng) 基中加2%的瓊脂。在無菌條件下向已裝有100ml基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中加入IOg污泥，內(nèi) 含50mg/L聯(lián)苯菊酯。于30°C，180r/min震蕩培養(yǎng)7d后，按10%的接種量轉(zhuǎn)接到含IOOmg/ L聯(lián)苯菊酯的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基里，同樣條件培養(yǎng)7d。以后每7d按10%接種量進(jìn)行馴化培養(yǎng)， 聯(lián)苯菊酯濃度每次增加50mg/L。直到提高聯(lián)苯菊酯濃度為400mg/L后，將培養(yǎng)液涂布在基 礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上，選取生長快，菌落規(guī)則，傳代穩(wěn)定的單菌落，劃線培養(yǎng)3次后制成斜面， 保存于冰箱待用。菌株生化鑒定表1 LBKl菌株生理生化測定結(jié)果
測定項(xiàng)目Test Items結(jié)果Results
革蘭氏染色+
淀粉水解試驗(yàn)-
接觸酶試驗(yàn)+葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)-
產(chǎn)H2S試驗(yàn)+
甲基紅試驗(yàn)-
V-P實(shí)驗(yàn)-
明膠液化試驗(yàn)-菌株分子鑒定LBKl菌株經(jīng)16SrDNA測定，獲得如下序列SEQ ID :N0. 1 TGTCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGT GTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCT TCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTG CCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTT GCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGA CGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGC
4TCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAA TGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGT ATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTT CCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAAT AATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTA CCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATC ACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGG CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCA CCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCA AACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACC CGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCA測序結(jié)果在NCBI的GeneBank里進(jìn)行Blust比對，其結(jié)果與Bacillus Subtilis strain BEF5314同源性達(dá)到98%，因此LBKl在分子分類上鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)ο菌株的生物降解作用該菌的用途是降解聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥，適用于農(nóng)藥污染的水體、土壤及農(nóng)產(chǎn)品的生物 修復(fù)或生物凈化。種子液的制備將LBKl菌株在無菌操作條件下用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于50ml LB 液體培養(yǎng)基中，于30°C、搖床120r/min培養(yǎng)48h。然后在4000r/min條件下離心IOmin收 集菌體，并用IOml的0. 02mol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液洗滌2次，再用同一緩沖液制成菌懸 液并調(diào)整菌體濃度使其0D600在1. 5左右，備用。LBKl對聯(lián)苯菊酯的降解率的初步測定實(shí)驗(yàn)在基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中添加聯(lián)苯菊 酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為200mg/L，總體系為50mL，按5%的接種量將種子液接入基礎(chǔ)鹽培 養(yǎng)液中，30°C，180r/min搖床培養(yǎng)。以不接菌的培養(yǎng)液為空白對照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。LBKl對不同濃度聯(lián)苯菊酯的降解在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使 其濃度分別為100、200、300、400mg/L，以5%的接種量接入LBK1，于30°C、180r/min的條件 下?lián)u床培養(yǎng)。LBKl正交優(yōu)化試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)考察溫度、PH值、接種量和裝液量四個(gè)因素對LBKl降解聯(lián)苯菊酯的影響。 采用四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)方案，根據(jù)L9(34)正交表，進(jìn)行正交試驗(yàn)。運(yùn)用SPSS軟件對各 因素的影響程度進(jìn)行評估，并給出最佳組合條件。最佳條件為A2B2C3D2即溫度30°C，PH = 7，接種量10%，裝液量50ml，在此條件下降解率可達(dá)95. 92%。測定結(jié)果如下表2 LBKl對聯(lián)苯菊酯的降解
菌株初始濃度 (mg/L)培養(yǎng)時(shí)間(h)1224487296120CK200190.9188.6184.5184.5180.2180.2LBKl200166.1123.685.969.845.841.2 表3 LBKl對不同濃度聯(lián)苯菊酯的降解
起始濃度 (mg/L)培養(yǎng)時(shí)間(h)24h48h72h96h120h10054.636.321.317.416.1200119.687.455.249.746.0300219.5168.6133.3116.8102.0400333.6305.1278.7254.5246.1 表4正交優(yōu)化試驗(yàn)
因素溫度PH接種量裝液暈實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號(A) °C(B)(C) %(D) ml降解率(％)125632584.29
權(quán)利要求
一種降解聯(lián)苯菊酯的菌株，其特征在于，該菌株為枯草芽孢桿菌屬的LBK1菌株；所述菌株的16SrDNA序列為SEQ IDNO.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株的應(yīng)用，該菌株用于聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥的生物降解。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌株的應(yīng)用，其特征在于，降解組合條件為溫度 250C -35°C, PH = 6-8，接種量 3% _10%，裝液量 25-100ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌株的應(yīng)用，其特征在于，降解組合條件為溫度30°C，PH= 7，接種量10%，裝液量50ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株對聯(lián)苯菊酯高效降解的菌株及其用途。該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)LBK1菌株，菌株生物學(xué)特性革蘭氏陽性，周生鞭毛，桿狀，菌落呈乳白色圓點(diǎn)且表面光滑，接觸酶、產(chǎn)H2S反應(yīng)陽性；葡萄糖氧化發(fā)酵反應(yīng)、V.P.反應(yīng)、M.R.反應(yīng)、明膠液化反應(yīng)為陰性；不能水解淀粉。菌株對聯(lián)苯菊酯的降解率達(dá)80％以上。該菌株可以用于農(nóng)藥的生物降解，以及農(nóng)藥污染的水體，土壤以及農(nóng)產(chǎn)品的生物修復(fù)或生物凈化。
文檔編號A62D3/02GK101967459SQ201010513259
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者馮貴穎, 呼世斌, 孔潔, 景岳龍, 朱鳳曉 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)