專(zhuān)利名稱：用于降解擬除蟲(chóng)菊酯的方法和物質(zhì)的制作方法
用于降解擬除蟲(chóng)菊酯的方法和物質(zhì)
參考序列表
本說(shuō)明書(shū)附有包括SEQ ID NOS: 1_4的序列表，將其全文通過(guò)引用合并入本文。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于降解擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯的方法，用于進(jìn)行該降解的酶促組 合物，以及其它方面。
背景
擬除蟲(chóng)菊酯是與由菊花產(chǎn)生的天然殺蟲(chóng)劑除蟲(chóng)菊素相似的一組人造殺蟲(chóng)劑。擬 除蟲(chóng)菊酯被廣泛用于控制各種昆蟲(chóng)。擬除蟲(chóng)菊酯抑制昆蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)。存在在化學(xué)結(jié)構(gòu) 和暴露的癥狀上不同的兩種類(lèi)型。I型擬除蟲(chóng)菊酯包括烯丙菊酯、胺菊酯、芐呋菊酯、右 旋苯醚菊酯、生物芐呋菊酯和氯菊酯。II型擬除蟲(chóng)菊酯的一些實(shí)例是氯氰菊酯、氟氯氰 菊酯、溴氰菊酯、苯醚氰菊酯、氰戊菊酯和氟氰胺菊酯。I和II型擬除蟲(chóng)菊酯都抑制昆 蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)。該抑制在神經(jīng)細(xì)胞膜的鈉離子通道上發(fā)生。一些擬除蟲(chóng)菊酯也影響稱為 GABA的神經(jīng)遞質(zhì)的作用。在許多用于控制昆蟲(chóng)的商業(yè)產(chǎn)品(包括家用殺蟲(chóng)劑、寵物噴 霧劑(pet sprays)和洗發(fā)劑)中發(fā)現(xiàn)有擬除蟲(chóng)菊酯。一些擬除蟲(chóng)菊酯也用作直接用于頭的 虱治療和用作可用于衣服的驅(qū)蚊劑。
氯菊酯是擬除蟲(chóng)菊酯種類(lèi)的殺蟲(chóng)劑的成員。由于氯菊酯對(duì)水生生物的高 毒性，因此，除了用作大面積蚊子殺成蟲(chóng)劑外，其為美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(UnitedStates Environmental Protection Agency，EPA)對(duì)于農(nóng)作物和大面積應(yīng)用限制使用的殺蟲(chóng)劑。然而，其被分類(lèi)為用于住宅和工業(yè)應(yīng)用的普遍使用的殺蟲(chóng)劑。根據(jù)EPA數(shù)據(jù)，每年有大約 2百萬(wàn)磅氯菊酯被用于農(nóng)業(yè)、住宅和公共衛(wèi)生使用場(chǎng)所。
氯菊酯，除了其由人使用時(shí)具有相對(duì)安全性以外，還以昆蟲(chóng)/節(jié)肢動(dòng)物驅(qū)除性 著稱。因此，氯菊酯的另一個(gè)主要用途是在地毯料(carpeting)制造中用作防蛀劑。作為 制造過(guò)程的部分，會(huì)產(chǎn)生含氯菊酯的廢水(effluent)。所得的廢水對(duì)地毯制造工業(yè)產(chǎn)生了 處理和處置問(wèn)題，因?yàn)橛捎谄錆撛诘亩拘?，廢水不能直接排放入環(huán)境。
因此，必須小心操作，因?yàn)橐阎绻蛔⒁獾貙⑵湟胨骰蛩h(huán)的話，氯 菊酯可毒害魚(yú)類(lèi)。在哺乳動(dòng)物中，氯菊酯通過(guò)改變神經(jīng)膜鈉通道的正常生物化學(xué)和生理 學(xué)來(lái)改變神經(jīng)功能。人的中毒癥狀包括皮膚和眼睛的刺激、對(duì)聲音或觸摸的易怒性、異 常的面部感覺(jué)、皮膚上的刺痛、麻刺或發(fā)癢(creeping)的感覺(jué)、麻木、頭痛、眩暈、惡 心、嘔吐、腹瀉、過(guò)度唾液分泌和疲勞。
因此需要無(wú)毒的、環(huán)境安全和用戶友好的、能夠解除廢水以及其他溶液和混合 物中的氯菊酯毒性的擬除蟲(chóng)菊酯去污染劑，例如氯菊酯去污染劑。還需要可作用于不存 在于溶液中的氯菊酯的擬除蟲(chóng)菊酯去污染劑，例如氯菊酯去污染劑。本文中所示的公開(kāi) 內(nèi)容滿足和解決了這些需要。
概述
本文中提供了降解擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯的方法，所述方法包括將擬除蟲(chóng)菊酯 與含有有機(jī)磷水解酶(organophosphatehydrolase，ΟΡΗ)的組合物接觸。本文中還提供了降解樣品中的擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯的方法，所述方法包括將樣品與含有有機(jī)磷水解酶 (OPH)的組合物接觸。在一個(gè)方面，擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯被完全降解。在另一個(gè)方 面，擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯被部分降解。
本文中還提供了使樣品中的擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯失活的方法，所述方法包括 將樣品與含有OPH的組合物接觸。
本文中還提供了使樣品中擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯的活性降低的方法，所述方法 包括將樣品與含有OPH的組合物接觸。在一個(gè)方面，樣品具有在大約6.5至9.0范圍內(nèi) 的ρΗ。在另一個(gè)方面，ρΗ為大約8.5。在另一個(gè)方面，將樣品的ρΗ調(diào)整至8.5。在 一個(gè)方面，樣品的溫度在大約20°C至30°C的范圍內(nèi)。在另一個(gè)方面，樣品的溫度是大約 22 °C。
在一個(gè)方面，含有擬除蟲(chóng)菊酯的樣品例如含有氯菊酯的樣品是來(lái)自制造過(guò)程的 廢水。在一個(gè)方面，所述制造過(guò)程包括用擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯處理地毯料。
本文中還提供了降解樣品中的擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯的方法，所述方法包括將 樣品與含有表達(dá)OPH的微生物的組合物接觸。在一個(gè)方面，所述微生物是細(xì)菌。
本文中還提供了降解擬除蟲(chóng)菊酯的組合物例如降解氯菊酯的組合物，所述組合 物包含至少一種分離的酶。在一個(gè)方面，降解擬除蟲(chóng)菊酯的組合物例如降解氯菊酯的組 合物包含ΟΡΗ。在一個(gè)方面，提供了 OPH用于降解擬除蟲(chóng)菊酯的用途。
附圖概述
附圖被合并入本說(shuō)明書(shū)中并且構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分，其舉例說(shuō)明了各種實(shí)施方案。


圖1圖解說(shuō)明了在15分鐘的時(shí)間過(guò)程中樣品中剩余的氯菊酯的量。
圖2舉例說(shuō)明了 OWi的降解氯菊酯的活性作為溫度的函數(shù)。Offl活性表示為每 克酶的OPH單位數(shù)。
圖3舉例說(shuō)明了 OPH的降解氯菊酯的活性作為ρΗ的函數(shù)。OPH活性表示為每 克酶的OPH單位數(shù)。
圖4舉例說(shuō)明了 OPH的降解氯菊酯的活性作為緩沖液濃度的函數(shù)。OPH活性表 示為相對(duì)活性百分比。
發(fā)明詳述
本文中提供了降解擬除蟲(chóng)菊酯的方法，所述方法包括將擬除蟲(chóng)菊酯與含有有機(jī) 磷水解酶(OPH)的組合物接觸。
此外，提供了降解擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯的方法，其中擬除蟲(chóng)菊酯存在于樣品 中，所述方法包括將樣品與含有有機(jī)磷水解酶(OPH)的組合物接觸。
在一個(gè)方面，完全降解或至少部分降解該擬除蟲(chóng)菊酯。
擬除蟲(chóng)菊酯因具有殺昆蟲(chóng)性質(zhì)而著稱(參見(jiàn)，例如US 2007/0276013Α1、 WO 2005077186、WO 93-22297、WO 93-10 083、DE-A 2 641 343、ΕΡ-Α-347 488、 ΕΡ-Α-210 487、美國(guó)專(zhuān)利 3,264,177 和 ΕΡ-Α-234 045)。
在一個(gè)方面，擬除蟲(chóng)菊酯選自已知來(lái)自ΕΡ-Α-048 186的氟丙菊酯、已知來(lái)自EP-A-067 46的順式氯氰菊酯、已知來(lái)自EP_A_206 149的高效氟氯氰菊酯、已知 來(lái)自DE-A-2 802 962的氯氟氰菊酯、已知來(lái)自DE_A_2 326 077的氯氰菊酯、已知來(lái) 自DE-A-2 3 077的溴氰菊酯、已知來(lái)自DE-A-2 737四7的高效氰戊菊酯、已知來(lái)自 DE-A-3 117 510的醚菊酯、已知來(lái)自DE-A-2 231 312的甲氰菊酯、已知來(lái)自DE_A_2 335 347的氰戊菊酯、已知來(lái)自DE-A-2 757 066的氟氰戊菊酯、已知來(lái)自EP_A_106 469 的高效氯氟氰菊酯、已知來(lái)自DE-A-2 3 077的氯菊酯、已知來(lái)自EP_A_038 617的氟 胺氰菊酯、已知來(lái)自DE-A-2 742 546的四溴菊酯、已知來(lái)自EP_A_(^6 542的zeta-氟 氯氰菊酯、已知來(lái)自DE-A-2709 264的氟氯氰菊酯、已知來(lái)自EP_A_049 977的聯(lián)苯菊 酯、已知來(lái)自DE-A-2653189的乙氰菊酯、已知來(lái)自DE-A-3604781的eflusilanate、已知 來(lái)自 DE-A-37 08 231 的氟螨醚(fubfenprox)、已知來(lái)自 PesticideManual 1997、issue 11、 第1056頁(yè)的除蟲(chóng)菊素、已知來(lái)自GB-A-I 168 797的芐呋菊酯(已知來(lái)自"The Pesticide Manual、第 13 版、2003、第 232 頁(yè)的條目 197、by The British Crop Protection Council)的 精高效氯氟氰菊酯和苯醚菊酯。
在一個(gè)方面，擬除蟲(chóng)菊酯選自氟丙菊酯、烯丙菊酯(右旋-順-反式、右旋-反 式)、高效氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、生物烯丙菊酯、生物烯丙菊酯-5-環(huán)戊基-異構(gòu)體、 生物氯菊酯、生物氯菊酯、生物芐呋菊酯、二氯炔戊菊酯(chlovaporthrin)、順-氯氰菊 酯、順-芐呋菊酯、順-氯菊酯、功夫菊酯(clocythrin)、乙氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰 菊酯、氯氰菊酯(α-、β-、θ-、ζ-)、苯醚氰菊酯、溴氰菊酯、右旋烯炔菊酯(1R-異 構(gòu)體)、順式氰戊菊酯、醚菊酯、五氟苯菊酯、甲氰菊酯、吡氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴 氟菊酯、氟氰戊菊酯、三氟醚菊酯(fhifenprox)、氟氯苯菊酯、氟氰胺菊酯、芐螨醚、精 高效氯氟氰菊酯、炔咪菊酯、噻恩菊酯、高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、甲氧卞 氟菊酯、氯菊酯(順_、反_)，苯醚菊酯(1R-反式異構(gòu)體)、右旋炔丙菊酯、丙氟菊 酯、protrifenbute、pyresmethrin、芐呋菊酯、RU 15525、氟硅菊酯(silafluofen)、氟胺氰 菊酯、七氟菊酯、環(huán)戊烯丙菊酯、胺菊酯(-1R-異構(gòu)體)、四溴菊酯、四氟苯菊酯、ZXI 8901、除蟲(chóng)菊素類(lèi)(除蟲(chóng)菊素).。
在一個(gè)方面，擬除蟲(chóng)菊酯選自氟丙菊酯、順式氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氯 氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、順式氰戊菊酯、醚菊酯(ethofenprox)、甲氰菊酯、 氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氟胺氰菊酯、氟氰胺菊酯、四溴菊 酯、zeta-氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、乙氰菊酯、eflusilanate，芐螨醚、除蟲(chóng) 菊素、芐呋菊酯、精高效氯氟氰菊酯、烯丙菊酯、胺菊酯、右旋苯醚菊酯、生物芐呋菊 酯、苯醚氰菊酯和苯醚菊酯。
在一個(gè)方面，擬除蟲(chóng)菊酯選自烯丙菊酯、胺菊酯、芐呋菊酯、右旋苯醚菊酯、 生物芐呋菊酯和氯菊酯。
在一個(gè)方面，擬除蟲(chóng)菊酯選自氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、苯醚氰菊 酯、氰戊菊酯和氟氰胺菊酯。
在一個(gè)方面，擬除蟲(chóng)菊酯選自氯菊酯、芐呋菊酯和苯醚菊酯。
在一個(gè)方面，擬除蟲(chóng)菊酯是氯菊酯。
氯菊酯是擬除蟲(chóng)菊酯的一個(gè)實(shí)例，其是在例如農(nóng)業(yè)以及材料生產(chǎn)和加工等領(lǐng)域 中廣泛使用的化合物。然而，氯菊酯以及其他擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)魚(yú)和各種哺乳動(dòng)物是有毒的，因此必需小心地操作和處置來(lái)自氯菊酯的工業(yè)和商業(yè)使用的含有氯菊酯的廢物。例 如，來(lái)自地毯制造過(guò)程中的含氯菊酯廢水帶來(lái)了操作和處置問(wèn)題。本文中顯示有機(jī)磷水 解酶(OPH)可降解氯菊酯。通過(guò)使用高效催化酶處理氯菊酯廢物和含氯菊酯組合物，可 避免使用額外的有毒或昂貴的化學(xué)品。
1.定義和縮寫(xiě)
按照本文詳述，使用下列縮寫(xiě)和定義。應(yīng)當(dāng)指出，如本文中所使用的，除非上 下文中明確地指出，否則單數(shù)形式無(wú)定冠詞和有定冠詞(一個(gè)(種)或這/該(種)等) 的指代物包括多個(gè)(種)所指物。因此，例如，提到“酶”，包括許多這樣的酶，提到“制劑”包括提到一種或多種制劑以及對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的其等價(jià)物，等寸。
除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本領(lǐng)域技術(shù)人 員通常理解的相同的意義。在下文中提供下列術(shù)語(yǔ)。
1.1.定義
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指籍以依據(jù)基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過(guò) 程。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。
“分離的”意指序列至少大體上不含至少一種與該序列天然結(jié)合并且在自然界 (例如基因組序列)中發(fā)現(xiàn)的其他成分。
“純化的”意指材料以相對(duì)純的狀態(tài)存在，例如至少大約90%純、至少大約 95%純或至少大約96%、97%, 98%或99%純。
如本文中所使用的，“氨基酸序列”與術(shù)語(yǔ)“多肽”和/或術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”同 義。在一些情況下，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”與術(shù)語(yǔ)“肽”同義；在一些情況下，術(shù)語(yǔ)“氨 基酸序列”與術(shù)語(yǔ)“酶”同義。
如本文中所使用的，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核 苷酸和其變體、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因組來(lái)源的、合成或重組 來(lái)源的序列，可以是雙鏈或單鏈，無(wú)論代表有義鏈還是反義鏈。如本文中所使用的，術(shù) 語(yǔ)“核苷酸序列”包括基因組DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。
如本文中所使用的，“合成的”化合物是通過(guò)體外化學(xué)或酶促合成產(chǎn)生的。其 包括，但不限于，使用宿主生物例如酵母細(xì)胞宿主或選擇的其他表達(dá)宿主的最佳密碼子 用法產(chǎn)生的變體核酸。如本文中所使用的，“ΟΡΗ活性”是指本文中所示的對(duì)氯菊酯的 降解。
7“樣品”，當(dāng)在本文中使用該術(shù)語(yǔ)時(shí)，是可含有氯菊酯的任何物質(zhì)。 1.2.縮寫(xiě)除非另外指出，否則應(yīng)用下列縮寫(xiě) cDNA 互補(bǔ) DNA DEAE 二乙氨基乙醇DNA 脫氧核糖核酸EC 酶分類(lèi)的酶學(xué)委員會(huì)(enzyme commission for enzyme classification) GCMS 氣相色譜-質(zhì)譜法 HPLC 高效液相色譜
mRNA 信使核糖核酸
OP 有機(jī)磷酸鹽/酯
OPH 有機(jī)磷水解酶
PCR 聚合酶鏈反應(yīng)
ppm 百萬(wàn)分率(parts per million)
RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)
SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
IXSSC 0.15M NaCL 0.015M 檸檬酸鈉、pH 7.0
w/v 重量/體積
w/w 重量/重量
2.用于除去擬除蟲(chóng)菊酯污染的方法和組合物
2.1.組合物
本文中公開(kāi)的用于除去擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯污染的組合物包含有機(jī)磷水解酶 (ΟΡΗ)。OPPi，也稱為磷酸三酯酶，在本文中顯示可降解氯菊酯。如本文中所公開(kāi)的， 去除污染的酶促方法提供了優(yōu)于其他去污劑的重大優(yōu)勢(shì)。作為催化劑，酶是高效的并且 可在數(shù)分鐘或甚至數(shù)秒內(nèi)對(duì)許多倍于其自身重量的污染物進(jìn)行解毒。
ΟΡΗ,最初稱為對(duì)硫磷水解酶，是在許多細(xì)菌分離中發(fā)現(xiàn)的酶。OPH具有抗多 種有機(jī)磷酸鹽/酯(OP)化合物包括化學(xué)戰(zhàn)神經(jīng)毒劑的活性。許多研究者已研究了 OPPi， 關(guān)于結(jié)構(gòu)和功能的信息可見(jiàn)于本領(lǐng)域中(例如、Mulbry等人、J.Bacteriol. (1989) 171 : 6740-6746 ； RausheL Cum Opin.Microbiol. (2002) 5 288-295)。
在一個(gè)方面，“有機(jī)磷水解酶”、“ΟΡΗ”、“磷酸三酯酶”、“PTE”，如本文中所使用的，是指在例如有機(jī)磷酸酯(OP)的水解中，具有作用于有機(jī)磷化合物(例如 對(duì)氧磷)(包括膦酸和次膦酸的酯)的能力的任何芳二烷基磷酸酶(E.C.3.1.8.1)。
OPH的常用的其他名稱包括對(duì)氧磷酶、A-酯酶、芳基三磷酸(酯) 酶、有機(jī)磷酯酶、酯酶Bi、酯酶E4、對(duì)氧磷酯酶、甲基對(duì)氧基嘧啶磷酯酶 (pirimiphos-methyloxonesterase) ； OPA酸酐酶、有機(jī)磷水解酶、對(duì)氧磷水解酶、有機(jī)磷 酸酸酐酶。
該酶的基因已被克隆、測(cè)序并且在許多原核和真核宿主生物中進(jìn)行了表 達(dá)。OPH酶的2個(gè)常見(jiàn)來(lái)源是從缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta) MG和黃桿菌 (Flavobacterium sp.)菌株ATCC 27551分離的相同的opd基因。缺陷假單胞菌MG opd基 因由McDaniel等人((1989) J.Bacteriol.、170 2306-2311 ；以其全文通過(guò)引用合并入本 文)分離。McDaniel等人的opd基因(登錄號(hào)為M20392)在Genebank中注釋如下，并且 以其全文通過(guò)引用合并入本文LOCUS PSEPTE 1322bp DNA BCT，1996年4月21日， DEFINITION PlasmidpCMSl (來(lái)自缺陷假單胞菌)磷酸二酯酶(opd)基因、完全編碼序 列.登錄號(hào) M20392 NID gl51517 VERSION M20392.1 GI 151517。來(lái)自缺陷假單胞菌序 列的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1中。
opd基因的開(kāi)放閱讀框架，如由McDaniel等人報(bào)導(dǎo)的，包含975個(gè)堿基，編碼具 有35kDa分子量的325個(gè)氨基酸殘基的OPH多肽。Mulbry等人(J.Bacteriol. (1989) 171 6740-6746 ；以其全文通過(guò)引用合并入本文)也克隆了 opd基因，但該克隆相對(duì)于上述opd 基因缺少 4 個(gè)氨基端殘基 Mer-Ile-Gly-Thr 或 SIGT) (SEQ ID NO 2)。
黃桿菌MTCC 2495的有機(jī)磷水解酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO 4中。示于 SEQ ID NO 3中的氨基酸序列與SEQ ID NO 4有1個(gè)氨基酸的差異，即在末端缺少絲氨酸。
在另外的方面，OPH包含具有SEQ ID No.l的氨基酸序列。在另外的方面， OPH包含具有SEQ ID No.3的氨基酸序列。在另外的方面，OPH包含具有SEQ ID No.4的氨基酸序列。
還確定了 OPH的三維晶體結(jié)構(gòu)，其顯示天然酶是每亞基含有2個(gè)Zn2+離子的均 二聚體。Co2+置換的酶對(duì)具有P-F和P-S鍵的神經(jīng)毒劑和底物具有更大的活性(Omburo 等人、J.Biol.Chem. (1992)沈7 13278-13283)。雖然與其他降解化學(xué)試劑的酶相比較已 對(duì)OPH進(jìn)行了更多的研究，但其細(xì)胞功能和天然底物仍然未知。
在一個(gè)方面，提供了與本文中定義的氨基酸序列或與具有本文中定義的特殊性 質(zhì)的多肽具有一定程度的序列同一性或序列同源性的多肽的用途。在一個(gè)方面，提供了 與SEQ ID No.l、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4具有一定程度的序列同一性的肽或其同源 物。此處，術(shù)語(yǔ)“同源物”意指與受試氨基酸序列或受試核苷酸序列具有序列同一性的 實(shí)體。此處，術(shù)語(yǔ)“同源性”可等同于“序列同一性”。
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列應(yīng)當(dāng)提供和/或編碼保持OPH酶的功能活性 和/或增強(qiáng)其活性的多肽。
在本說(shuō)明書(shū)中，同源序列包括可與受試序列至少50%，優(yōu)選至少55%，例如至 少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至 少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一的氨基酸序列。通常，同源 物將包括與受試氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。雖然也可在相似性(即具有相似的化學(xué) 性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)方面考慮同源性，但在本發(fā)明的背景中，優(yōu)選以序列同一性表 述同源性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，OPH酶是具有SEQ IDNo 1、3或4中顯示的序列或與其具 有至少50%，優(yōu)選至少55%，例如至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%， 至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少 99%序列同一性的序列的有機(jī)磷水解酶。
可通過(guò)眼睛或更常用地借助于可容易獲得的序列比較程序來(lái)進(jìn)行序列同一性比 較。此類(lèi)可商購(gòu)獲得的計(jì)算機(jī)程序使用復(fù)雜的比較算法來(lái)比對(duì)兩個(gè)或更多個(gè)序列，以最 佳地反映出可能已導(dǎo)致所述兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的差異的進(jìn)化事件。因此，此類(lèi)算法 使用評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行操作，其中相同或相似氨基酸獲得獎(jiǎng)賞(評(píng)分)，而插入缺口、缺口延 伸和不相似氨基酸的比對(duì)獲得罰分。比較算法的評(píng)分系統(tǒng)包括
i)每一次插入缺口時(shí)賦予罰分(缺口罰分，gap penalty score)，
ii)每一次將已有缺口延伸額外位點(diǎn)時(shí)，賦予罰分(延伸罰分，extension penalty score),
iii)當(dāng)比對(duì)相同氨基酸時(shí)賦予高評(píng)分，和
iv)當(dāng)比對(duì)非相同氨基酸時(shí)賦予可變的評(píng)分。
大多數(shù)比對(duì)程序允許對(duì)缺口罰分作修改。然而，當(dāng)使用這樣的軟件進(jìn)行序列比9較時(shí)，優(yōu)選使用缺省值。
對(duì)非相同氨基酸的比對(duì)所給予的評(píng)分根據(jù)評(píng)分矩陣(scoring matrix)(也稱為替換 矩陣(substitution matrix))賦予。這樣的替換矩陣中提供的評(píng)分反映了在進(jìn)化過(guò)程中一 個(gè)氨基酸被另一個(gè)氨基酸置換的可能性各有不同并且取決于被置換的氨基酸的物理/化 學(xué)性質(zhì)這樣的事實(shí)。例如，極性氨基酸被另一個(gè)極性氨基酸所置換的可能性高于被疏水 性氨酸置換的可能性。因此，評(píng)分矩陣將為相同的氨基酸賦予最高的評(píng)分，為不相同但 相似的氨基酸賦予較低的評(píng)分，為不相同不相似的氨基酸賦予甚至更低的評(píng)分。最常使 用的評(píng)分矩陣是PAM矩陣(Dayhoff等人(1978)、Jones等人(1992))、BLOSUM矩陣 (Henikoff 和 Henikoff (1992))和 Gonnet 矩陣(Gonnet 等人(1992))。
進(jìn)行這樣的比對(duì)的合適計(jì)算機(jī)程序包括但不限于Vector NTI (Invitrogen Corp.)以 及 ClustalV、ClustalW 和 ClustalW2 程序(Higgins DG & Sharp PM (1988)、Higgins 等人 (1992)、Thompson等人(1994)、Larkin等人Q007))。不同比對(duì)工具的選擇可在www. expasv.org上從ExPASy Proteomics服務(wù)器獲得?？蛇M(jìn)行序列比對(duì)的軟件的另一個(gè)實(shí)例 是BLAST (基礎(chǔ)局部比對(duì)檢索工具)，其可從目前可在http://www.ncbi.nlm、nih.gov/上 找到的美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)頁(yè)獲得，并且最早在Altschul等人(1990)J.Mol. Biol.215 ； 403-410 中進(jìn)行了描述。
在軟件已產(chǎn)生比對(duì)后，就可能計(jì)算相似性百分比和序列同一性百分比。軟件通 常將這作為序列比對(duì)的一部分來(lái)完成并且產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。
在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選使用ClustalW軟件進(jìn)行序列比對(duì)。優(yōu)選，使用下列用 于配對(duì)比對(duì)的參數(shù)來(lái)進(jìn)行使用ClustalW的比對(duì)
權(quán)利要求
1.降解擬除蟲(chóng)菊酯的方法，所述方法包括將擬除蟲(chóng)菊酯與含有有機(jī)磷水解酶(OPH) 的組合物接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯存在于樣品中，所述方法包括將樣品與含 有有機(jī)磷水解酶(OPH)的組合物接觸。
3.權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的方法，其中擬除蟲(chóng)菊酯被完全降解或至少部分降解。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯選自氟丙菊酯、順式氯氰 菊酯、高效氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、順式氰戊菊酯、醚菊酯、 甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氟胺氰菊酯、氟氰胺菊 酯、四溴菊酯、zeta-氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、乙氰菊酯、eflusilanate、除蟲(chóng) 菊素、芐呋菊酯、Y-氯氟氰菊酯、烯丙菊酯、胺菊酯、右旋苯醚菊酯、生物芐呋菊酯、 苯醚氰菊酯和苯醚菊酯。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯選自烯丙菊酯、胺菊酯、芐 呋菊酯、右旋苯醚菊酯、生物芐呋菊酯和氯菊酯。
6.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯選自氯氰菊酯、氟氯氰菊 酯、溴氰菊酯、苯醚氰菊酯、氰戊菊酯和氟氰胺菊酯。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯選自氯菊酯、芐呋菊酯和苯 醚菊酯。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯是氯菊酯。
9.權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品具有在大約6.5至大約9.0范圍內(nèi) 的pH。
10.權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)的方法，其中pH是大約8.5。
11.權(quán)利要求10的方法，其中將樣品的pH調(diào)整至8.5。
12.權(quán)利要求2至11中任一項(xiàng)的方法，其中樣品的溫度在大約20°C至30°C的范圍內(nèi)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中樣品的溫度是大約22°C。
14.權(quán)利要求2至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是來(lái)自制造過(guò)程的廢水。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述制造過(guò)程包括使用擬除蟲(chóng)菊酯處理地毯料。
16.降解樣品中的擬除蟲(chóng)菊酯的方法，所述方法包括將所述樣品與含有表達(dá)OPH的微 生物的組合物接觸。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述微生物是細(xì)菌。
18.使擬除蟲(chóng)菊酯失活的方法，所述方法包括將擬除蟲(chóng)菊酯與含有OPH的組合物接觸。
19.使擬除蟲(chóng)菊酯的活性降低的方法，所述方法包括將擬除蟲(chóng)菊酯與含有OPH的組合 物接觸。
20.使樣品中的擬除蟲(chóng)菊酯失活的方法，所述方法包括將所述樣品與含有OPH的組合 物接觸。
21.使樣品中的擬除蟲(chóng)菊酯的活性降低的方法，所述方法包括將所述樣品與含有OPH 的組合物接觸。
22.權(quán)利要求15至21中任一項(xiàng)的方法，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯是氯菊酯。
23.降解擬除蟲(chóng)菊酯的組合物，所述組合物包含至少一種分離的酶。
24.權(quán)利要求22的組合物，其包含ΟΡΗ。
25.權(quán)利要求23至24中任一項(xiàng)的組合物，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯是氯菊酯。
26.0ΡΗ用于降解擬除蟲(chóng)菊酯的用途。
27.權(quán)利要求26的用途，其中所述擬除蟲(chóng)菊酯是氯菊酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯進(jìn)行酶促解毒的方法和組合物。所述方法包括將有機(jī)磷水解酶OPH的組合物施加到被擬除蟲(chóng)菊酯例如氯菊酯污染的表面或物質(zhì)上。
文檔編號(hào)A62D3/02GK102026688SQ200980115334
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日
發(fā)明者C·克斯塔博利 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司