專利名稱：：熒光假單孢桿菌制品及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種熒光假單孢桿菌制品及其應(yīng)用，具體涉及在消除土壤和水體五氯酚鈉污染上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：熒光假單孢桿菌(Pseudomanasfluorescens)是一種能發(fā)出熒光的細(xì)菌，天然存在于自然土壤中，通常情況下因?yàn)榫哂幸欢ǖ拇偈棺饔煤涂共∽饔?，用于農(nóng)作物的防病上。熒光假單孢桿菌在生長過程中能向環(huán)境中分泌一些胞外酶，分解復(fù)雜的有機(jī)物，獲取養(yǎng)分供自身生長利用。我國南方很多省份河流眾多，50-70年代曾大面積發(fā)生由釘螺滋生造成的人和動物血吸蟲病大爆發(fā)、大流行，造成大量的人畜死亡。為消滅血吸蟲病，我國從50年代末大量生產(chǎn)使用五氯酚鈉這一廣譜高效滅螺藥，起到很好的作用，農(nóng)田土壤和河流中的釘螺被大大控制住，因而血吸蟲病得到控制。但是，隨著后來大量的醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，過量施用的五氯酚鈉殘留在土壤中造成對人體的潛在危害，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。研究表明，五氯酚鈉對小鼠體液免疫、細(xì)胞免疫功能和巨噬細(xì)胞功能產(chǎn)生抑制作用；小鼠微核試驗(yàn)和斑馬魚胚胎發(fā)育試驗(yàn)表明五氯酚鈉對哺乳動物有一定的致突變性，同時五氯酚鈉對小鼠精子有強(qiáng)烈致畸作用；五氯酚鈉能誘導(dǎo)中國倉鼠卵巢細(xì)胞和鯉魚腎細(xì)胞DNA損傷和染色體畸變；五氯酚鈉影響水稻幼苗和葡萄老蔓的生長；五氯酚鈉能使柑桔幼葉干枯死亡；因此，消除我國南方農(nóng)田土壤和水體中殘留的大量的五氯酚鈉，對保障環(huán)境生態(tài)安全和人體健康都具有重要意義。理論上講，有很多物理化學(xué)方法能夠降解消除五氯酚鈉，但是對于廣袤的農(nóng)田土壤和農(nóng)村河流而言，這些方法都無法實(shí)施。主要是因?yàn)槌杀咎?，根本不能承受，同時，又引入新的污染物，造成二次污染，因此開發(fā)新的安全、低成本降解方法很有必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種熒光假單孢桿菌制品，該制品制備工藝簡便，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明的目的是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的熒光假單孢桿菌制品，制備步驟如下首先將培養(yǎng)基置入培養(yǎng)容器內(nèi)，滅菌后，控制培養(yǎng)溫度為28-32。C，接種熒光假單孢桿菌(Pseudomanasfluorescens)按每毫升液體培養(yǎng)基接種活菌體12X107個，培養(yǎng)48-72小時后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值6.5-7.5，沉淀池靜置1-3天，去掉上層澄清液，向下層渾濁液中分別添加占渾濁液體總重0.5-1%的工業(yè)纖維素，2-5%的麥麩或米糠和1-6%的粘土或凹凸棒土，離心處理，收集沉淀物即得熒光假單孢桿菌產(chǎn)制品。培養(yǎng)基的組成為每lOOOmL水中加入五氯酚鈉20-100mg，牛肉膏100-500mg，KH2P04200-600mg，K2HP041200-2000mg，MgS040.04-0.09mg，F(xiàn)eS042.5-3.5mg，CuS040.05-0.08mg，(NH4)2S04500-1500mg，pH6.5-7.5;培養(yǎng)基滅菌溫度為115120。C，壓力為30.10.15MPa，時間為2040分鐘。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單孢桿菌制品，其特征在于，在熒光假單孢桿菌的培養(yǎng)過程中，0-8小時保持培養(yǎng)壓力為0.03-0.05Mpa，通氣量為0.3_0.5VVM，8-26小時保持培養(yǎng)壓力為0.08-0.12Mpa，通氣量為0.6-1.2VVM，6小時到培養(yǎng)結(jié)束保持培養(yǎng)壓力為0.04-0.06Mpa，通氣量為0.3-0.5VVM。進(jìn)行離心時，可采用500-1000轉(zhuǎn)工業(yè)離心機(jī)離心10-15分鐘，收集沉淀熒光假單孢桿菌混合物，為粘稠液體產(chǎn)物，即為最終產(chǎn)品。使用時，將上述產(chǎn)品加入20-50倍體積的水分，拌勻，均勻噴灑農(nóng)田地表、河流、五氯酚鈉化工廠廢水中用于降解五氯酚鈉。本發(fā)明另一目的在于提供該熒光假單孢桿菌制品的應(yīng)用，具體應(yīng)用在使用該微生物制品處理農(nóng)田土壤、河流、五氯酚鈉化工廠的含五氯酚鈉土壤、水體和化工廢水，并將五氯酚鈉降解，變成無毒物質(zhì)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明采用熒光假單孢桿菌制品來降解消除農(nóng)田土壤、河流和化工廢水中的五氯酚鈉，保護(hù)環(huán)境，減少污染。本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的產(chǎn)品制備過程操作簡便，容易控制，沒有易燃易爆化學(xué)品，生產(chǎn)成本和使用成本低；2.本發(fā)明的產(chǎn)品制備過程中沒有有毒有害的氣體、液體和固體產(chǎn)生排放到環(huán)境中，發(fā)酵基質(zhì)全部利用轉(zhuǎn)入產(chǎn)品中，生產(chǎn)過程達(dá)到污染零排放，且最終產(chǎn)品是一種環(huán)境友好的綠色生態(tài)產(chǎn)品，使用于農(nóng)田土壤和河流后，不會污染環(huán)境，對人體和其他生物沒有危害；3.本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品的作用機(jī)理不同于一般的化學(xué)或物理法，也不同于普通的植物吸收法，其作用機(jī)理是該熒光假單孢桿菌制品施入農(nóng)田土壤和河流后，在適宜的環(huán)境條件下，熒光假單孢桿菌活體和孢子能繼續(xù)萌發(fā)、生長、繁殖，并保持足夠的活性，利用土壤或水體中的五氯酚鈉做碳源和能源，分泌胞外酶，將土壤和水體中的五氯酚鈉降解，利用其中的能量和碳源合成自身需要的營養(yǎng)物質(zhì)，供自身生長發(fā)育，從而達(dá)到降解土壤和水體中的五氯酚鈉的目的，作用持續(xù)時間長；4.本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品特別適合于生產(chǎn)有機(jī)食品、無公害食品、綠色食品，用于消除農(nóng)田土壤中的五氯酚鈉；本發(fā)明采用熒光假單孢桿菌處理含五氯酚鈉的農(nóng)田土壤、河流和工業(yè)廢水，不但凈化環(huán)境，減少污染，成本很低，而且容易實(shí)現(xiàn)，因此有著廣闊的應(yīng)用前景。5.本發(fā)明的原料易得，熒光假單孢桿菌屬微生物可從國內(nèi)很多家高校、科研機(jī)構(gòu)購得，也可從也可從中國科學(xué)院微生物研究所、中國農(nóng)科院菌種保藏中心、山東大學(xué)、武漢大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)和有關(guān)農(nóng)業(yè)大學(xué)及南京信息工程大學(xué)獲得。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一熒光假單孢桿菌制品1、1000L水中分別加入下列各物質(zhì)配置培養(yǎng)基五氯酚鈉60g，牛肉膏500g，KH2P04400g，K2HP04900g，MgS040.05g，F(xiàn)eS040.25g，CuS040.06mg，(NH4)28041000g，調(diào)p朋.5-7.5。滅菌條件為120°C，0.13MPa，時間為30分鐘；培養(yǎng)基中干物質(zhì)總重為2861g，整個液體培養(yǎng)基總重為1002.9kg。2、將上述整個培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中進(jìn)行高溫滅菌30分鐘，裝料量為60_75%發(fā)酵罐容積，保持發(fā)酵罐中溫度為120-124t:，壓力為0.08-0.12Mpa;冷卻發(fā)酵罐，通入除菌空氣保持發(fā)酵罐壓力0.08Mpa左右，當(dāng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)基降溫至28-32t:左右時，接種熒光假單孢桿菌(Pseudomanasfluorescens)，接種量大約為每毫升液體培養(yǎng)基接種活菌體1.5X107個(接種量為12X107個均可)，接種熒光假單孢桿菌后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)初期(8小時內(nèi))罐壓保持在O.04Mpa左右，通氣量為0.3-0.5VVM，培養(yǎng)中期(8_26小時內(nèi))罐壓保持在0.08-0.12Mpa，通氣量為0.6_1.2VVM，培養(yǎng)后期(26小時后到放罐)保持罐壓0.05Mpa左右，通氣量為0.4VVM左右，培養(yǎng)溫度為30±2°C;3、經(jīng)4872小時培養(yǎng)后，顯微鏡檢查發(fā)酵液單位體積活菌數(shù)，待發(fā)酵液中每毫升活菌數(shù)達(dá)到大約5-10X108個時放罐，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH7左右，沉淀池靜置2天，去掉上層澄清液體，向下層渾濁液體600kg(大約600L)添加占渾濁液總重5kg的工業(yè)纖維素(0.5-l^均可)，20kg的麥麩或米糠(2-5X均可)，25kg的粘土或凹凸棒土(1_6%均可)，拌勻，用工業(yè)離心機(jī)以300-500轉(zhuǎn)/分鐘速度離心處理10分鐘，收集沉淀熒光假單孢桿菌混合物，為粘稠液體產(chǎn)物，即為最終產(chǎn)品(大約150kg)。實(shí)施例二熒光假單孢桿菌發(fā)酵制品在降解五氯酚鈉上的應(yīng)用1.熒光假單孢桿菌發(fā)酵制品降解水中五氯酚鈉試驗(yàn)設(shè)不加熒光假單孢桿菌發(fā)酵制品對照、加發(fā)酵制品10mL、20mL、40mL三個處理，三次重復(fù)，考察5天、10天、15天、20天、30天降解結(jié)果，試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，環(huán)境溫度2fC左右，在1000ml燒杯中加入500ml水，添加200mg五氯酚鈉，使全部溶解，攪勻后加入上述熒光假單孢桿菌發(fā)酵制品，再次攪拌均勻，每個燒杯通入一根軟管，用增氧泵供應(yīng)空氣，同時攪拌液體。不同時間段取樣檢測溶液中的五氯酚鈉含量，其結(jié)果如表1所示，一個月后的最大降解效果達(dá)到91%。表1.熒光假單孢桿菌發(fā)酵制品降解水中五氯酚鈉效果(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*表中為實(shí)際測定水中殘留五氯酚鈉含量2.熒光假單孢桿菌發(fā)酵制品降解滅菌土壤中五氯酚鈉試驗(yàn)設(shè)不加熒光假單孢桿菌發(fā)酵制品對照、加發(fā)酵制品lOmL/100克土壤、加發(fā)酵制品30mL/100克土壤、加發(fā)酵制品60mL/100克土壤三個處理，三次重復(fù)，考察5天、10天、15天、20天、30天降解結(jié)果，試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，環(huán)境溫度24t:左右，在塑料盆缽中加入5千克滅菌土壤，添加2000mg五氯酚鈉，徹底拌勻；加入上述熒光假單孢桿菌酵制品，拌勻，澆入大約200ml無菌水，每3天澆一次無菌水，保持土壤濕潤，但不積水。不同時間段取樣檢測土壤中殘留的五氯酚鈉含量，其結(jié)果如表2所示，一個月后的五氯酚鈉的最大降解效果達(dá)到82%。表2.熒光假單孢桿菌發(fā)酵制品降解滅菌土壤中五氯酚鈉效果(mg/kg)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*表中為實(shí)際測定滅菌土壤中殘留五氯酚鈉含量權(quán)利要求一種熒光假單孢桿菌制品，其特征在于，由以下步驟制備首先將培養(yǎng)基置入培養(yǎng)容器內(nèi)，滅菌后，控制培養(yǎng)溫度為28-32℃，接種熒光假單孢桿菌按每毫升液體培養(yǎng)基接種活菌體1～2×107個，培養(yǎng)48-72小時后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值6.5-7.5，沉淀池靜置1-3天，去掉上層澄清液，向下層渾濁液中分別添加占渾濁液體總重0.5-1％的工業(yè)纖維素，2-5％的麥麩或米糠和1-6％的粘土或凹凸棒土，離心處理，收集沉淀物即得熒光假單孢桿菌產(chǎn)制品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單孢桿菌制品，其特征在于，培養(yǎng)基的組成為:每lOOOmL水中加入五氯酚鈉20-100mg，牛肉膏100-500mg，KH2P04200-600mg，K2HP041200_2000mg，MgS040.04_0.09mg，F(xiàn)eS042.5_3.5mg，CuS040.05_0.08mg，(NH4)2S04500-1500mg，pH6.5-7.5;滅菌條件為滅菌溫度為115120°C，壓力為0.10.15MPa，時間為2040分鐘。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單孢桿菌制品，其特征在于，在熒光假單孢桿菌的培養(yǎng)過程中，0-8小時保持培養(yǎng)壓力為0.03-0.05Mpa，通氣量為0.3_0.5VVM，8_26小時保持培養(yǎng)壓力為0.08-0.12Mpa，通氣量為0.6-1.2VVM，6小時到培養(yǎng)結(jié)束保持培養(yǎng)壓力為0.04-0.06Mpa，通氣量為0.3-0.5VVM。4.權(quán)利要求1所述熒光假單孢桿菌制品在生物降解五氯酚鈉方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種熒光假單孢桿菌制品及其應(yīng)用。該熒光假單孢桿菌制品由以下步驟制備首先將培養(yǎng)基置入培養(yǎng)容器內(nèi)，滅菌后，控制培養(yǎng)溫度為28-32℃，接種熒光假單孢桿菌至培養(yǎng)基，48-72小時培養(yǎng)完成后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值6.5-7.5，沉淀池靜置1-3天，去掉上層澄清液，取下層渾濁液添加0.5％-1％工業(yè)纖維素、2-5％麥麩或米糠及1-6％粘土或凹凸棒土，離心，收集沉淀物即得熒光假單孢桿菌產(chǎn)制品。將所得熒光假單孢桿菌制品加入20-50倍體積的水，拌勻，均勻噴灑在農(nóng)田地表、河流、五氯酚鈉化工廠廢水中，用于生物降解五氯酚鈉，效果好，作用持續(xù)時間長。文檔編號A62D3/02GK101724593SQ200910264510公開日2010年6月9日申請日期2009年12月25日優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日發(fā)明者吳洪生申請人:南京信息工程大學(xué)