專利名稱：：多重pcr產(chǎn)物的懸浮芯片檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種對多重PCR產(chǎn)物的懸浮芯片檢測方法，本發(fā)明還涉及對懸浮芯片檢測方法中條件的改進。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)簡稱PCR,是一種模擬天然DNA復制的體外擴增法。PCR技術(shù)的問世給分子診斷帶來一場革命。PCR技術(shù)已經(jīng)成為分子診斷的基礎(chǔ)。目前PCR產(chǎn)物的檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠僅約可區(qū)分相差lOObp的DNA片段。片段長度相差不大或者相等的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖;疑膠電泳將無能無力。另外，瓊脂糖凝膠電泳通過紫外光激發(fā)熒光染料產(chǎn)生焚光來判斷是否存在PCR產(chǎn)物，檢測靈敏度相對較低。且瓊脂糖凝膠電泳通過片段的大小對產(chǎn)物進行判斷，特異性差，對非特異擴增的大小相似的片段不能區(qū)分。而且常用的染料如澳化乙錠等具有致癌性，常操作對身體健康不利。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片(iiquidarray,liquidchip),是一種非常靈活的多功能技術(shù)平臺，可以進行蛋白、核酸等生物大分子檢測、受體和配體識別分析等研究。懸浮芯片主要通過可偶聯(lián)探針的萸光編碼微球與兩束激光檢測，對被測物的定性和定量分析，一個反應孔內(nèi)可以完成IOO種不同的生物學反應。可實現(xiàn)對核酸的多重檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種多重PCR產(chǎn)物的懸浮芯片檢測方法，該方法利用懸浮芯片技術(shù)結(jié)合核酸探針技術(shù)對標記上生物素的PCR產(chǎn)物進行特異性的識別，；險測靈敏度高，特異性好，尤其適用于多重PCR產(chǎn)物相似長度片段的區(qū)分，且理論上可對100種不同的PCR產(chǎn)物進行區(qū)分，實現(xiàn)100種不同因子的檢測。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種多重PCR產(chǎn)物的懸浮芯片檢測方法，該方法包括首先PCR擴增引物標記生物素，再根據(jù)PCR擴增區(qū)域內(nèi)的核苦酸序列設(shè)計特異性捕獲探針，并提交GENEBANK檢測探針的特異性；所述捕獲探針分別與相應的編碼微球偶聯(lián)；該捕獲探針在一定的條件下特異的捕獲生物素化的PCR產(chǎn)物；然后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白與《鼓球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，利用懸浮芯片LUMIMX系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面經(jīng)特異性反應結(jié)合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析。本發(fā)明還提供一種多重PCR產(chǎn)物的懸浮芯片檢測方法，包括以下步驟1、PCR引物標記生物素，2、根據(jù)待檢測的PCR產(chǎn)物，選擇設(shè)計位于擴增區(qū)域內(nèi)的特異的捕獲探針；3、相應的探針偶聯(lián)微球；4.捕獲探針捕獲待檢測的PCR產(chǎn)物并檢測。在本發(fā)明的方法中，首先據(jù)待檢測的PCR產(chǎn)物，設(shè)計位于擴增區(qū)域內(nèi)的特異的捕獲探針，每條探針長20-30bp,在合成時連接C12或"-20個poly(T)作為加臂，氨基化修飾，以便與微球偶聯(lián)。在將相應的探針與微球偶聯(lián)時，例如，包括以下步驟a)分別選取不同編號的編碼微球，用漩渦振蕩器振蕩微球懸液，使微球混合均勻，轉(zhuǎn)移至離心管，14000g離心，小心吸出上清；b)加入2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩超聲，使微球重懸；c)用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針稀釋；將稀釋的探針加于微球懸浮液中，振蕩混勻；d)加入新鮮配制的EDC溶液至4改球與探針的混和液中，振蕩混勻；避光，漩渦振蕩器上振蕩，室溫孵育30分鐘；再次加入新鮮配制的EDC;再次在旋渦振蕩器上振蕩，室溫避光孵育；e)用0.02%PBSTlml洗滌，14000g下離心；移棄上清，孩么球重懸于0.1%SDS中，洗滌，離心；f)移棄上清，微球重懸于100ulpH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測微球。本發(fā)明優(yōu)選的方法包括以下步驟g)分別選取不同編號的編碼微球，用漩渦振蕩器振蕩微球懸液，使微球混合均勻。h)分別取上述微球大約1.25xl(T個，分別轉(zhuǎn)移至離心管，14000g離心3-5min，小心吸出上清。i)加入50ul0.lmol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩20-30S，超聲20-30s，使微球重懸。j)用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針稀釋到0.lmmol/L。k)將lul稀釋的探針加于微球懸浮液中，振蕩混勻。1)加入2.5ul新鮮配制的10mg/mL的EDC溶液至樣U求與4笨針混和液中，振蕩混勻。m)用鋁箔包裹離心管避光，漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫孵育30分鐘。n)再次加入新鮮配制的10mg/mLEDC。o)再次在漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫避光孵育30分鐘。p)用0.02%PBSTlml洗滌l次，離心14000g3-5min.q)移棄上清，微球重懸于lml0.r/。SDS中，洗滌，離心。r)移棄上清，微球重懸于100ulpH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測微球。在本發(fā)明的用上述捕獲探針捕獲待檢測的PCR產(chǎn)物的過程中，例如，包括1.取已經(jīng)偶聯(lián)好的檢測探針每種各3500個于雜交液中，使其總量為33根據(jù)微球計數(shù)結(jié)果計算相應加入量；2.向各管中加5~17ul五種細菌混合模板的PCR產(chǎn)物使其終體積為50ul，吹打混勻。3.95'C變性10分鐘。4.雜交溫度下雜交一定時間。5.轉(zhuǎn)移至濾板抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物。6.再向各孔加75ul4ng/ulSA-PE的1xTMAC液，室溫避光孵育10min,抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE。7.再向各孔加入75uilxTMAC溶液，振蕩使微球重懸。8.反應結(jié)束后上機檢測。Bio-PlexTMsystem進行檢測，通過激發(fā)微3求基質(zhì)上的紅色分類熒光，對微球的編號進行識別；通過激發(fā)微球表面的藻紅蛋白，對結(jié)合的PCR產(chǎn)物進行定量分析。本發(fā)明與傳統(tǒng)的PCR檢測方法相比，優(yōu)點在于51.通過儀器的信號放大系統(tǒng)和生物素親和素的放大作用，本發(fā)明對PCR產(chǎn)物的檢測靈敏度高于瓊脂糖凝膠電泳。2.通過特異性探針捕獲PCR產(chǎn)物，檢測特異性遠好于用片段長度對PCR產(chǎn)物進行判斷。3.對片段長度大小相似或者一樣的片段，同樣可以進行區(qū)分識別，從而使多重PCR引物的設(shè)計趨于靈活。圖1為DNA濃度一一編碼微球表面的焚光強度劑量反應曲線。編碼微球表面熒光強度與加入的模板量在一定的范圍內(nèi)成正相關(guān)，其中橫坐標為多重PCR時管中加入的模板DNA的量，縱坐標代表相應編碼微球表面的熒光強度?？梢酝ㄟ^擬合的標準曲線實現(xiàn)對核酸的半定量分析。圖2表示用本發(fā)明建立的方法對7抹炭疽芽孢桿菌，4抹鼠疫菌，3抹布魯菌，2抹土拉弗朗西斯菌，2抹類鼻疽伯克霍爾德菌進行檢測的結(jié)果。其中，X軸表示檢測樣品，Y軸表示檢測微球，Z軸表示檢測焚光信號(MFI)與背景焚光信號(BFI)之比亦即信噪比。17003-15,17003-11，17003-28,17003-32，17003-54，17003-10:五抹炭疽芽孢桿菌強毒抹；Sterne:炭疽芽孢桿菌sterne抹；ypl2，ypl6，ypl7:三抹鼠疫耶爾森菌自然分離抹；Ev76:鼠疫耶爾森Ev76抹；S2:布魯氏菌疫苗抹S2;S19:布魯氏菌疫苗抹S19;M5:布魯氏菌疫苗株M5;FT-2，F(xiàn)T-5:兩抹土拉弗朗西絲菌；BP-2，BP-5:兩抹類鼻疽伯克霍爾德菌。具體實施例方式實施例1:PCR產(chǎn)物的懸浮芯片檢測方法用于五種生物恐怖因子炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌、土拉弗朗西斯菌、類鼻疽伯克霍爾德菌的六重PCR產(chǎn)物的檢測1.確定上述五種細菌的診斷片段，炭疽的選擇capB和染色體上的一段標識序列，鼠疫選擇染色體上的一段標識序列，布魯菌選擇布魯氏屬特異性的片段BCSP31,通過NCBI的GeneBank獲取候選基因序列，利用軟件設(shè)計引物，并合成相關(guān)序列，下游引物5，端生物素標記，見表l,并將這些引物稀釋成10Wnol/L。表l引物序列檢測把標炭疽菌布魯菌土拉菌鼠疫菌類鼻疽菌引物對序列(5'-3，)BA-l-.FTGGACGCATACGAGACATAATBA-1-RTGCTTTAGCGGTAGCAGAGGBA-2-FTTTCATAATCATGGATTTCCCGBA-2-RTTACCCAACATCATCTTCGCABru-FTGGCTCGGTTGCCAATATCAABru-RGCGCTTGCCTTTCAGGTCTGFT-FGGGCAAATCTAGCAGGTCAAGFT-RGCTGTAGTCGCACCATTATCCTYP-FACTCAATGTTGTGACGAGGATGYP-RTTACTTCTAATGCCATCAGGTAGCBP-FCGATCTCGTCAAGGTGTCGGBP—RCCCCAGTTCATCTGATACTTGC2.使用以上引物的多重PCR反應擴增以上五種待檢測細菌。3.根據(jù)擴增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列，設(shè)計的五種細菌特異性探針如下，探針序列如表2:表2病原菌多重檢測體系探針序列探針名稱探針序列(5'-3')BA-1GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGTBA-.2CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCCYp--2AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATABru'-2TTACGCAGTCAGACGTTGCCTATFt--2TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGGBp—2AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT上述探針連接C12，或15個T，或20個T,或18個T,效果一致。上述五鐘病原體的懸浮芯片檢測結(jié)果見表3.其中Type為樣本類型，B代表陰性對照，C代表已知樣本，X代表未知樣本；BA-l為炭疽芽孢桿菌探針l,BA-2為炭疽芽孢桿菌探針2，BSA為陰性對照，Yp-2為鼠疫耶7爾森菌探針，Bru-2為布魯氏菌探針，F(xiàn)t-2為土拉弗朗西斯菌4冢針，Bp-2為類鼻疽伯克霍爾德菌探針，Biotin(045)為生物素陽性對照；Cl、C2、C4為炭疽芽孢桿菌樣本，C6、C7、C8為鼠疫耶爾森菌樣本，C9、C10為布魯氏菌樣本，Cll為陰性樣本；檢測熒光值大于等于三倍本底熒光值判為陽性，因此已知樣本全部正確識別，未知樣本X1、X2均為炭疽芽孢桿菌強陽性，類鼻疽伯克霍爾德弱陽性。表3檢查五種病原體的懸浮芯片檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例2:相應探針與微球的偶聯(lián)1)分別選取不同編號的編碼微球，用漩渦振蕩器振蕩微球懸液，使微球混合均勻。2)分別取上述微球大約1.25xl0'個，分別轉(zhuǎn)移至離心管，l徹0g離心3-5Min,小心吸出上清。3)加入50ui0.lmoI/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩20—30S，超聲20-30s,使微球重懸。4)用蒸餾水將合成的寡核芬酸探針稀釋到0.lmmol/L。5)將lul稀釋的探針加于微球懸浮液中，振蕩混勻。6)加入2.5ul新鮮配制的10mg/raL的EDC溶液至微球與4笨4十混和液中，振蕩混勻。7)用鋁箔包裹離心管避光，漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫孵育30分鐘。8)再次加入新鮮配制的10mg/mLEDC。9)再次在漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫避光孵育30分鐘。10)用0.02%PBSTlml洗滌l次，離心14000g3-5min.11)移棄上清，微球重懸于lml0.r/。SDS中，洗滌，離心。12)移棄上清，微球重懸于100ulpH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測微球。實施例3:捕獲探針對待檢測的PCR產(chǎn)物的捕獲和檢測i.取已經(jīng)偶聯(lián)好的檢測探針每種各3500個于雜交液中，使其總量為33)il(根據(jù)微球計數(shù)結(jié)果計算相應加入量)ii.向各管中加5~17ul五種細菌混合模板的PCR產(chǎn)物使其終體積為50ul,吹打混勻。iii.95。C變性10分鐘。iv.雜交溫度下雜交一定時間。v.轉(zhuǎn)移至濾板抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物。vi.再向各孔加75ul4ng/ulSA-PE的1xTMAC液，室溫避光醉育10min,抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE。vii.再向各孔加入75ullxTMAC溶液，振蕩使微球重懸。viii.反應結(jié)束后上枳4全測。Bio-PlexTMsystem進〗亍4企測，通過達t發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光，對微球的編號進行識別；通過激發(fā)微球表面的藻紅蛋白，對結(jié)合的PCR產(chǎn)物進行定量分析。實施例4:定量檢測待檢目標核酸系列稀釋，一般設(shè)6個以上稀釋度，同上面的PCR程序和反應條件進行PCR反應，同上面的反應進行PCR產(chǎn)物的檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，運用Bio-PlexVersion4.0分析系統(tǒng)提供的方程擬合標準曲線，根據(jù)標準曲線，代入各個待測樣品的MFI值，即可實現(xiàn)待檢樣品核酸的定量分析。如鼠疫耶爾森菌EV76抹基因組DNA10倍系列稀釋，2.8fg280ng,按確定的方法進行PCR擴增和檢測，擬合曲線，曲線動態(tài)范圍28fg~280pg，曲線方程FI=—25.2499+(663.894+25.2499)/((l+(Conc/20599.2)A-4.5687))八0.0999957，從標準曲線推算檢出限為50fg/test，鼠疫基因組大小4826100bp，則相當于9cfu/test。當PCR模板濃度在280pg以上時，雜交達到飽和。樣品編號空白1_23_45_濃度blank2.828280280028000280000(fg/test)_MFI59.555.5209.530787421272236實施例5:定量檢測用建立的方法對7抹炭疽芽孢桿菌，4林鼠疫菌，3抹布魯菌，2株土拉弗朗西斯菌，2抹類鼻疽伯克霍爾德菌進行檢測，結(jié)果如圖2。結(jié)果分析檢測時，同時以PCR陰性對照進行雜交檢測做為檢測本底。對于每個檢測體系和檢測本底，儀器輸出的數(shù)據(jù)是相應反應體系內(nèi)一種編號微球群的熒光強度中位值(MedianFluorescenceIntensUy，MFI)，亦即讀取的這種編號的微球群(100個或以上)的每個微球信號強度的統(tǒng)計平均值。通過Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取各孔熒光值(MFI)以及本底熒光值(BackgroundMFI，BFI)。結(jié)果判斷當待檢測樣本的MFI值為本次檢測背景信號強度三倍以上時即判為陽性。10權(quán)利要求1、一種對多重PCR產(chǎn)物的檢測方法，其中該方法包括首先PCR引物標記生物素，根據(jù)PCR擴增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設(shè)計特異性捕獲探針，并提交GENEBANK檢測探針的特異性；所述捕獲探針在合成時加臂，再分別與相應的編碼微球偶聯(lián)；該捕獲探針在一定的條件下特異的捕獲生物素化的PCR產(chǎn)物；然后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，利用LUMINAX系統(tǒng)進行檢測，通過激發(fā)微球基質(zhì)上的紅色分類熒光和微球表面的藻紅蛋白。2、權(quán)利要求l所述的檢測方法，其中該方法使用的引物經(jīng)生物素標記。3、權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其中該方法捕獲探針連接c12或15-20個n，作為改構(gòu)加臂，以便與編碼微球偶聯(lián)。4、權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中該方法包括步驟1)待檢測樣本核酸的提取，2)多重pcr反應，配制一定組分濃度的30m1pcr反應體系，3)捕獲探針捕獲pcr產(chǎn)物將偶聯(lián)有探針的微球與生物素化標記的多重pcr產(chǎn)物混合，在95。c變性5~10分鐘，45~60。c雜交10~30分鐘，探針即可特異性捕獲對應的pcr產(chǎn)物，然后再加入鏈親和素-藻紅蛋白，4)結(jié)合物經(jīng)懸浮芯片luminax系統(tǒng)檢測分析。全文摘要本發(fā)明公開了一種PCR產(chǎn)物懸浮芯片的檢測方法，芯片主要由編碼微球、生物素化的引物、捕獲探針、鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，所述方法包括所述捕獲探針分別與相應的各號微球偶聯(lián)，以紅色激光激發(fā)其球形基質(zhì)上的分類熒光，依據(jù)其球形基質(zhì)色彩不同確定類型；其中所述的生物素化引物表示進行PCR時的引物需生物素化標記；偶聯(lián)上探針的微球可以特異性地和擴增的生物素標記的PCR產(chǎn)物結(jié)合；所述的鏈霉親和素-藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，以綠色激光激發(fā)藻紅蛋白，測定球形基質(zhì)上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球形基質(zhì)上結(jié)合的PCR產(chǎn)物的含量。文檔編號C12Q1/68GK101560558SQ20091007881公開日2009年10月21日申請日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者劉衡川,孫肖紅,文海燕,宇楊,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學研究院