本發(fā)明屬于茶樹品種抗蟲性鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種的方法。

背景技術(shù)：

假眼小綠葉蟬以成、若蟲刺吸茶樹新梢汁液為害，雌蟲產(chǎn)卵于嫩梢、葉脈或葉肉組織中，常年發(fā)生嚴(yán)重，是茶園中最重要的吸汁性害蟲。茶樹受害后，芽葉沿葉緣黃化，葉脈紅暗，葉片卷曲，嚴(yán)重時(shí)枝梢紅褐焦枯，芽葉生長(zhǎng)停滯、脫落，以夏、秋茶受害較重。年發(fā)生10代以上，世代重疊嚴(yán)重，難于防治。假眼小綠葉蟬的為害嚴(yán)重影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)，在我國(guó)長(zhǎng)江中、下游茶區(qū)，一般年份可使夏茶、秋茶損失10%~15%，重災(zāi)年份可達(dá)50%以上。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)假眼小綠葉蟬的有效防治還主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥。然而，化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用導(dǎo)致了農(nóng)藥殘留、抗藥性以及害蟲再猖獗等問(wèn)題的出現(xiàn)，如福建福安茶場(chǎng)的小綠葉蟬對(duì)目前主要防治用藥吡蟲啉的抗性指數(shù)已達(dá)到中抗水平，對(duì)啶蟲脒和聯(lián)苯菊酯已達(dá)高抗水平。如何科學(xué)而有效地防治假眼小綠葉蟬已經(jīng)成為茶樹植保工作者的研究熱點(diǎn)之一。

眾所周知，抗蟲品種選育是害蟲綜合治理的基礎(chǔ)，也是所有綜合治理技術(shù)中防效最長(zhǎng)的一個(gè)方面，曾經(jīng)在水稻、玉米和棉花等很多作物的多種害蟲綜合治理方面取得過(guò)輝煌的成績(jī)。茶樹是多年生的木本經(jīng)濟(jì)作物，自身特點(diǎn)導(dǎo)致茶樹抗蟲品種選育水平顯著落后于其他作物。目前，不同品種對(duì)葉蟬抗性的評(píng)價(jià)多采用田間調(diào)查、室內(nèi)取食和產(chǎn)卵行為研究、葉蟬在不同品種上的生長(zhǎng)發(fā)育速率等多種方法。但是，上述方法的研究周期長(zhǎng)，且受地理?xiàng)l件、氣候因素和人為干擾的影響大。目前，尚無(wú)一種茶樹品種抗蟲性的快速鑒定方法。大量研究結(jié)果表明，植物揮發(fā)物在植食性昆蟲的寄主定位過(guò)程中具有重要作用。并且，植物的品種、種類和生育期等因素也會(huì)影響揮發(fā)物的種類和釋放量。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)感蟲品種的小麥植株綠葉揮發(fā)物的釋放量顯著高于抗性品種，并由此提高了對(duì)害蟲鋸蠅的引誘能力?；趯?duì)不同茶樹品種綠葉揮發(fā)物的釋放量、綠葉揮發(fā)物合成途徑關(guān)鍵合成酶基因表達(dá)量以及綠葉揮發(fā)物生態(tài)功能等方面的研究結(jié)果，本發(fā)明提出一種基于電子鼻zNose^TM技術(shù)，利用順-3-己烯基醋酸酯快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種的方法的技術(shù)方案。

所述的一種快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）準(zhǔn)確稱取順-3-己烯基醋酸酯，用色譜級(jí)二氯甲烷配成0.6 ng μl^-1、1.2 ng μl^-1、2.4 ng μl^-1、3.6 ng μl^-1、4.8 ng μl^-1和9.6 ng μl^-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用移液器準(zhǔn)確稱取1μl標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1.5ml樣品瓶中，充分氣化后進(jìn)入電子鼻zNose^TM檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析后，得到zNose^TM檢測(cè)器響應(yīng)值與順-3-己烯基醋酸酯量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=324.7x-2.741, R²=0.999，其中y為響應(yīng)值，x為順-3-己烯基醋酸酯含量；

2）選取茶樹的芽下1葉和1葉至4葉之間的嫩莖為樣品，芽下1葉的處理方法是使用針簇避開主脈連續(xù)2次刺透葉片，并在30s內(nèi)放入 45ml樣品瓶密封3min后泵吸進(jìn)樣；嫩莖的處理方法為使用單面不銹鋼刀片將嫩莖切成10段后，在30s內(nèi)放入 45ml樣品瓶密封3min后泵吸進(jìn)樣；

3）根據(jù)樣品中順-3-己烯基醋酸酯的響應(yīng)值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，確定每毫克芽下1葉和嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的釋放量，當(dāng)芽下1葉順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≤1.22±0.05ng或嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≤0.84±0.52ng時(shí)，茶樹品種可以鑒定為假眼小綠葉蟬的抗性品種；當(dāng)芽下1葉順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≥2.19±0.49ng或嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≥2.24±0.36ng時(shí)，茶樹品種可以鑒定為假眼小綠葉蟬的感性品種。

所述的一種快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種的方法，其特征在于所述的電子鼻zNose^TM檢測(cè)器程序設(shè)置為：進(jìn)樣口溫度200℃，閥溫165℃，色譜柱起始溫度40℃，以10℃每秒升溫至180℃，保留6s。

所述的一種快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種的方法，其特征在于所述的電子鼻zNose^TM檢測(cè)器每采集完一個(gè)樣品，設(shè)置檢測(cè)器烘焙30s。

所述的一種快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種的方法，其特征在于所述的電子鼻zNose^TM檢測(cè)器得到的數(shù)據(jù)經(jīng)由軟件Microsense software，5.44版進(jìn)行分析。

所述的順-3-己烯基醋酸酯在快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種中的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)茶樹芽下1葉順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≤1.22±0.05ng或嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≤0.84±0.52ng時(shí)，茶樹品種可以鑒定為假眼小綠葉蟬的抗性品種；當(dāng)茶樹芽下1葉順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≥2.19±0.49ng或嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≥2.24±0.36ng時(shí)，茶樹品種可以鑒定為假眼小綠葉蟬的感性品種。

上述的的一種快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種的方法，設(shè)計(jì)合理，通過(guò)該方法能夠快速鑒定假眼小綠葉蟬抗性茶樹品種，可靠性強(qiáng)，同時(shí)本發(fā)明提供了順-3-己烯基醋酸酯的一種新用途。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1：試驗(yàn)方法

1）器具清洗：1.5ml和45ml樣品瓶（安捷倫，配有特氟龍（Teflon）墊片和塑料旋蓋）、針簇（由80根3號(hào)標(biāo)本針組成）、單面不銹鋼刀片、鑷子、不銹鋼進(jìn)樣針等器具全部浸泡在乙醇中超聲波清洗20分鐘，用蒸餾水沖洗直至無(wú)乙醇味為止，35℃干燥箱內(nèi)烘干24h，備用。

2）儀器設(shè)備和參數(shù)設(shè)置：電子鼻zNose^TM（Model 4200, Electronic Sensor Technology, Newbury Park, CA, USA）由氣體收集裝置（Tenax?吸附劑）連接小型氣象色譜裝置構(gòu)成，檢測(cè)器為表面聲波石英檢測(cè)器。樣品采集時(shí)，泵吸10s，樣品經(jīng)吸附劑富集后250℃熱解析，由氦氣（3ml/min）帶入色譜柱（DB-5, 1m×0.25mm i.d., 0.25μm film thickness, EST）中分離，最后傳遞至檢測(cè)器進(jìn)行分析。程序設(shè)置為：進(jìn)樣口溫度200℃，閥溫165℃，色譜柱起始溫度40℃，以10℃每秒升溫至180℃，保留6s。每采集完一個(gè)樣品，設(shè)置檢測(cè)器烘焙30s。數(shù)據(jù)由軟件Microsense software (5.44版)進(jìn)行分析。

3）順-3-己烯基醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：順-3-己烯基醋酸酯購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社，純化后用于測(cè)試。準(zhǔn)確稱取順-3-己烯基醋酸酯，用色譜級(jí)二氯甲烷配成0.6 ng μl^-1、1.2 ng μl^-1、2.4 ng μl^-1、3.6 ng μl^-1、4.8 ng μl^-1和9.6 ng μl^-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液器準(zhǔn)確稱取1μl標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1.5ml樣品瓶中，充分氣化后按照步驟2設(shè)置的參數(shù)進(jìn)樣。zNose^TM檢測(cè)器SAW的響應(yīng)值與順-3-己烯基醋酸酯的量呈線性關(guān)系，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=324.7x-2.741, R²=0.999，y為響應(yīng)值，x為順-3-己烯基醋酸酯含量。

4）樣品處理：選取茶樹的芽下1葉和1葉至4葉之間的嫩莖為樣品，芽下1葉的處理方法是使用針簇避開主脈連續(xù)2次刺透葉片，并在30s內(nèi)放入 45ml樣品瓶密封3min后泵吸進(jìn)樣，進(jìn)樣完成后用電子天平對(duì)樣品進(jìn)行稱重；嫩莖的處理方法為使用單面不銹鋼刀片將嫩莖切成10段后，其他操作同芽下1葉。

5）根據(jù)樣品中順-3-己烯基醋酸酯的響應(yīng)值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，確定每毫克芽下1葉和嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的釋放量，當(dāng)芽下1葉順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≤1.22±0.05ng或嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≤0.84±0.52ng時(shí)，茶樹品種可以鑒定為假眼小綠葉蟬的抗性品種；當(dāng)芽下1葉順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≥2.19±0.49ng或嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的釋放量≥2.24±0.36ng時(shí)，茶樹品種可以鑒定為假眼小綠葉蟬的感性品種。

試驗(yàn)例1

采用舉巖與恩標(biāo)兩個(gè)茶樹品種，按照實(shí)施例1的具體步驟采集芽下1葉和嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的含量，測(cè)試結(jié)果表明恩標(biāo)芽下1葉中順-3-己烯基醋酸酯含量為2.19ng，是舉巖（1.22ng）的1.8倍，恩標(biāo)嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯含量為2.24ng，是舉巖（0.32ng）的7倍。根據(jù)實(shí)施例1記載的判斷標(biāo)準(zhǔn)可知恩標(biāo)為感性品種，舉巖為抗性品種。判定結(jié)果與上述兩個(gè)品種在田間的抗感能力相符（洪北邊和樓云芬等，1995；金珊等，2012）。結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 利用順-3-己烯基醋酸酯含量判定舉巖和恩標(biāo)對(duì)假眼小綠葉蟬的抗感能力

χ²-test: *P< 0.05.

試驗(yàn)例2

采用實(shí)施例2中的舉巖與斑竹園兩個(gè)茶樹品種，按照實(shí)施例1的具體步驟采集芽下1葉和嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的含量，測(cè)試結(jié)果表明斑竹園芽下1葉中順-3-己烯基醋酸酯含量為3.19ng，是舉巖（1.22ng）的2.6倍，斑竹園嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯含量為2.4ng，是舉巖（0.32ng）的7.5倍。根據(jù)實(shí)施例1記載的判斷標(biāo)準(zhǔn)可知斑竹園為感性品種，舉巖為抗性品種。判定結(jié)果與上述兩個(gè)品種在田間的抗感能力相符（洪北邊和樓云芬等，1995；金珊等，2012）。結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 利用順-3-己烯基醋酸酯含量判定舉巖和斑竹園對(duì)假眼小綠葉蟬的抗感能力

χ²-test: *P< 0.05.

試驗(yàn)例3

采用長(zhǎng)興紫筍與斑竹園兩個(gè)茶樹品種，按照實(shí)施例1的具體步驟采集芽下1葉和嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的含量，測(cè)試結(jié)果表明斑竹園芽下1葉中順-3-己烯基醋酸酯含量為3.19ng，是長(zhǎng)興紫筍（0ng）的3.2倍，斑竹園嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯含量為2.4ng，是長(zhǎng)興紫筍（0.84ng）的2.9倍。根據(jù)實(shí)施例1記載的判斷標(biāo)準(zhǔn)可知斑竹園為感性品種，長(zhǎng)興紫筍為抗性品種。判定結(jié)果與上述兩個(gè)品種在田間的抗感能力相符（洪北邊和樓云芬等，1995；金珊等，2012）。結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 利用順-3-己烯基醋酸酯含量判定長(zhǎng)興紫筍與斑竹園對(duì)假眼小綠葉蟬的抗感能力

χ²-test: *P< 0.05.

試驗(yàn)例4

采用長(zhǎng)興紫筍與恩標(biāo)兩個(gè)茶樹品種，按照實(shí)施例1的具體步驟采集芽下1葉和嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯的含量，測(cè)試結(jié)果表明恩標(biāo)芽下1葉中順-3-己烯基醋酸酯含量為2.19ng，是長(zhǎng)興紫筍（0ng）的2.19倍，恩標(biāo)嫩莖中順-3-己烯基醋酸酯含量為2.24ng，是長(zhǎng)興紫筍（0.84ng）的2.7倍。根據(jù)實(shí)施例1記載的判斷標(biāo)準(zhǔn)可知恩標(biāo)為感性品種，長(zhǎng)興紫筍為抗性品種。判定結(jié)果與上述兩個(gè)品種在田間的抗感能力相符（洪北邊和樓云芬等，1995；金珊等，2012）。結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4利用順-3-己烯基醋酸酯含量判定長(zhǎng)興紫筍與恩標(biāo)對(duì)假眼小綠葉蟬的抗感能力

χ²-test: *P< 0.05。