專利名稱：一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域技，尤其涉及一種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
血清蛋白參與機(jī)體免疫、凝血、物質(zhì)交換、運(yùn)輸、代謝、生長(zhǎng)信號(hào)調(diào)節(jié)等多種重要的生理功能，尤其是低豐度蛋白質(zhì)的組成和數(shù)量變化往往受一些病理狀態(tài)的影響。血清蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)比較某種疾病血清中表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，尋找和鑒定有顯著差異的蛋白，進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和功能，為研究疾病致病機(jī)理、生物標(biāo)記物、藥物作用靶點(diǎn)開辟新的途徑。相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術(shù)可同時(shí)對(duì)八個(gè)樣本中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確鑒定、定量和比較。該試劑已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域，包括生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及翻譯后修飾研究、基因與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)分析、細(xì)胞膜與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析和藥物靶點(diǎn)分析等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明可以提供一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型和一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型的構(gòu)建方法，為應(yīng)用蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜技術(shù)，尋找血清生物標(biāo)志物提供新的途徑。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型包括肺結(jié)核與健康對(duì)照組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，由上調(diào)蛋白I3DLI1、C4BPA、⑶14、SAA、IGHD, IGHM、SHBG, PPIA、PZP、MASP2、PEPD, ZYX、VffF, FLNA, TAGL2、FCN2、CD5L、F13A、FHR5、HBD、IBP2、HBB、GPV1、HYOUl、TTHY、HBA、LDHB、TLNl、NPC2、TENA、HABP2、TRMLl、CAH2、ITBl、C4BPB、HPT、FCGBP, PROFl、FIBB、4F2、ITIH3、SODE, FETUB_HUMAN、CALR、TIMPl 和下調(diào)蛋白PLF4、RET4、AP0M、LYSC、IL1AP、IBP5、FINC、AP0D、ANGT、ALBU、C1R、AP0C1、HGFA、N0E1、SAMP、MME、CHLE、CPN2、TRY1、CBG、LUM、IBPl、PEDF、BTD、TETN、KLKBl、ATRN、K1C10、LYVEl、PONl、TRFE, LMAN2、NGAL, LCAT, IPSP, APOF, NRPl、GPV, K2C1、P0N3、AP0A1、PHLD、ICAM2、FAl1、ANAG, C04B、GPX3、K1C9、TRFL, AFAM、C0L11、SAA4、AP0C2、CNDPl、AP0C4 構(gòu)成。肺結(jié)核與肺炎組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，由上調(diào)蛋白SAMP、CBPB2、IC1、HEP2、FLNA、AFAM、ZA2G、ANT3、KNGl、PLSL、THBG、C05、A2AP、LUM、MASPl、LBP、HABP2、GPX3、HYOUl、PROC、CHLE、APOH、C07、FKBIA、ATRN、TAGL2、CFA1、PROF1、RET4、CIQB、KLKB1、BTD、NEO1、PPIA、GPV、CBG, C1R、PROZ, SHBG, ANGT、PDIAl、F13B、ZP1、QS0X1、TLNl、C08B、HRG, KAIN、LYSC, C02、GP1BA、TETN、CPN2、CYTC, C06A3、MBL2、PEDF、NGAL, VffF, HGFL, APOCl、TRMLl、PRG4、FETUB,CAHl、CRIS3、C1RL、AMPN、PEPD, C08G、CD14、HGFA, FCG3B、1433Z、BGH3、FCGBP、4F2、D0P0,CALR、ZYX、CRACl、S0DE、PTCDS、FA10、FHRl、C1QA、PDLI1、IGF2、PLTP、EGLN、BSTl、NOEl 和下調(diào)蛋白 IGHAl、HPT、IGHG3、LAC2、IGKC、SAA、ALBU、IGHM、HBA、HBB、HPTR、PLF4、HBD、C4BPA、SAA4、CRP, TTHY, IGJ, CATA、PHLD、SLP1、LG3BP、PVR、FINC、IGLL5、APOM、FIBA、TENA、AP0L1、LCAT、KlClO、APOF、IBPl、PRDX2、ANAG、MAlAl、SEPPl、PODXL、SRCRL、PONl、CLUS、GGH、CXCL7構(gòu)成。肺結(jié)核與肺癌組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，由上調(diào)蛋白TAGL2、FLNA, TRMLU ALBU,PROFU SHBG, ZYX、PDLIU FETUB, CYTC, KNGl、SAA、TLNl、GPV1、CXCL7、C06A3、CRIS3、DOPO,SODE, NGAL, PPIA、PROZ, LYAMl、GP1BA、F13A、TENX, F13B、TTHY, BTD、NPC2、NCAMl、CALR、CFAD, HYOUl、CHLl、C07、CD14 和下調(diào)蛋白 HPT、HPTR、HBB、HBA、C4BPA、IGHG3、LAC2、PLF4、HBD、CADH5、FINC、LG3BP、AP0C2、IGHM、TRFL, SAA4、C4BPB、LBP、SLP1、PHLD, ITIH3、K2C1、A1AG2、CRP、AlAGl、ANGT、C06、APOLl、PROS、MAlAl、IGHAl、ATRN、FCN2、COIAl、C1R、CATD,PCSK9、C0L11、LCAT、C08B、FA5、APMAP、FIBB、SAMP、APOD、PLTP, HEP2、APOCl、K1C10、HGFL,SEPP1、C08A、CD5L_、CPN2、LMAN2、CFA1、ICAMU TRYl 構(gòu)成。肺結(jié)核與COPD組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，由上調(diào)蛋白ALBU、TAGL2、⑶14、FLNA,FETUB、PROF1、TENX、SODE、COMP、ZYX、TRML1、FAIO、PD IA1、KNG1、CRIS 3、TLNl、PROP、GPV1、PDLI1、PPIA、FKB1A, CBG, GPlBA、CRACl、FHRl、F13A、NPC2、ΙΒΡ5、VASN、1433Ζ、C04B、EGLN、PRG4、GGH、CFAD、CALR 和下調(diào)蛋白 HPT、IGHM、IGHG3、LAC2、HBB、HPTR、HBA、PLF4、C4BPA、HBD、IGKC、FINC、IGHAl、SAA、IGLL5、LBP、CRP、C4BPB、SAA4、ADIPO、AP0C2、A1AG2、TRFL, FIBB、ITIH3、PHLD、COLl1、CADH5、APOCl、APOD、C06、IGJ、C1R、ICAM2、AlAGl、CATA、ATRN、ANGT,FIBA、AP0C3、CLUS、LG3BP、PZP、PONU ALDOB, APOL1、SEPP1、C07、APOF、C08B、IGHD、PRDX2、C08A、LYVEl、CFA1、ENPL、GPNMB, CAH2、TENA、FA5、PROS、ICU MIME, ILlAP, FCGBP, K1C10、MRC1、CPN2、C05、GPX3、APMAP、CAHU VffF, AFAM、CATD, FBLN3 構(gòu)成。蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜由相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素標(biāo)記血清全蛋白，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測(cè)蛋白質(zhì)譜，再通過(guò)軟件ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA) Software統(tǒng)計(jì)分析報(bào)告離子的相對(duì)定量。在相對(duì)定量分析中，采用質(zhì)荷比114報(bào)告離子峰面積，以質(zhì)荷比113、115、116、117的報(bào)告離子峰為對(duì)照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，選擇比值^ 1.25^0.8的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告，其中，比值彡1. 25的為蛋白表達(dá)上調(diào)，比值彡0. 8的為蛋白表達(dá)下調(diào)。本發(fā)明實(shí)施例的另一目 的在于提供一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟分別采集活動(dòng)性肺結(jié)核組、健康對(duì)照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的血清標(biāo)本，分別對(duì)血清進(jìn)行高豐度蛋白的去除和蛋白濃度的測(cè)定，將蛋白進(jìn)行還原、封閉、烷基化、酶解消化，用相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素ITRAQ標(biāo)記，得到相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素ITRAQ標(biāo)記的肽段。再將多肽進(jìn)行強(qiáng)陽(yáng)離子交換和反向液相色譜分離，再進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和相對(duì)定量分析，得到活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型。串聯(lián)質(zhì)譜鑒定過(guò)程中，采用噴霧電壓2. 2kV，MS掃描范圍400-1500U，MS/MS掃描范圍100-2000u,并增加20%碰撞能量(collision energy)使iTRAQ的報(bào)告離子更易分離。一個(gè)譜圖選擇20個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行串級(jí)掃描。相對(duì)定量分析使用軟件為ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA) Software。相對(duì)定量分析過(guò)程中設(shè)定蛋白置信度大于95 %或ProtScore (unused)大于1. 5。相對(duì)定量分析過(guò)程中，采用質(zhì)荷比114報(bào)告離子峰面積，以質(zhì)荷比113、115、116、117的報(bào)告離子峰為對(duì)照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，選擇比值彡1. 25 ^ O. 8的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告，其中，比值彡1. 25的為蛋白表達(dá)上調(diào)，比值彡O. 8的為蛋白表達(dá)下調(diào)。根據(jù)分析報(bào)告，通過(guò)活動(dòng)性肺結(jié)核組與健康對(duì)照組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜、活動(dòng)性肺結(jié)核組與肺炎組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜、活動(dòng)性肺結(jié)核組與肺癌組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜、活動(dòng)性肺結(jié)核組與COPD組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，建立活動(dòng)性肺結(jié)核的表達(dá)差異質(zhì)譜模型。上述得到的活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型，為應(yīng)用相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素標(biāo)記血清全蛋白，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測(cè)蛋白質(zhì)譜，提供了新的方案。本發(fā)明提供了一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法，通過(guò)比較活動(dòng)性肺結(jié)核組與健康對(duì)照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，獲得活動(dòng)性肺結(jié)核的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜。此外，本發(fā)明還涉及活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型構(gòu)建的新方法，利用相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素ITRAQ標(biāo)記及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，能有效地對(duì)血清里的蛋白進(jìn)行鑒定和相對(duì)定量，采用該技術(shù)能獲得活動(dòng)性肺結(jié)核病人血清中的蛋白表達(dá)差異質(zhì)
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖
及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。血清蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)比較某種疾病血清中表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，尋找有顯著差異的蛋白，鑒定疾病相關(guān)蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和功能，為研究疾病致病機(jī)理、生物標(biāo)記物、藥物作用靶點(diǎn)開辟新的途徑。相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記技術(shù)，可同時(shí)對(duì)八個(gè)樣本中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確鑒定、定量和比較。該試劑已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域，包括生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及翻譯后修飾研究、基因與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)分析、細(xì)胞膜與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析和藥物祀點(diǎn)分析等。本實(shí)施提供了一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型的構(gòu)建方法，具體步驟如下分別采集活動(dòng)性肺結(jié)核組、健康對(duì)照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的血清標(biāo)本，分別對(duì)血清進(jìn)行高豐度蛋白的去除和蛋白濃度的測(cè)定，將蛋白進(jìn)行還原、封閉、烷基化、酶解消化，用相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素ITRAQ標(biāo)記，得到相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素ITRAQ標(biāo)記的肽段。再將多肽進(jìn)行強(qiáng)陽(yáng)離子交換和反向液相色譜分離，再進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和相對(duì)定量分析，得到活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型。實(shí)施例1 :樣本的采集及資料整理肺結(jié)核病人清晨空腹抽血，抽取前臂靜脈全血5ml于一次性未經(jīng)過(guò)抗凝處理的真空采血管，并在2-3小時(shí)內(nèi)分離血清。不抗凝的血4°C、3000g/min離心IOmin取血清并分裝，置_80°C冰箱內(nèi)保存。活動(dòng)性肺結(jié)核組女5例，男5例，平均年齡37. 00±11. 85 ；健康對(duì)照組女5例，男5例，平均年齡36. 20±8. 44 ;肺炎組女6例，男4例，平均年齡40. 90±9. 28 ;肺癌組女2例，男8例，平均年齡57. 50±9. 36 ;C0PD組女4例，男6例，平均年齡59. 50±4. 70。標(biāo)本采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者本人或家屬的知情同意。實(shí)施例2 :血清高豐度蛋白的去除用安捷倫多重親和去除系統(tǒng)Agilent multiple affinity removal LCcolumn-Human 14 (MARS)去除人血清中的高豐度蛋白。Buffer A與Buffer B為該柱子自帶緩沖液。血清混合物用Buffer A稀釋4倍，通過(guò)裝有O. 22um孔徑濾膜的離心管16000Xg離心Imin過(guò)濾去除顆粒雜質(zhì)。以O(shè). 125mL/min的速度進(jìn)樣200ul稀釋的血清,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm/280nm，于5-7.5min收集流出的低豐度蛋白組分，儲(chǔ)存于-20°C。用100% BufferB以流速為1. OmL/min洗脫約5. 5min。再用100% Buffer A以1. OmL/min的流速平衡柱子9min。收集第一個(gè)峰(低豐度蛋白組分)，用Millipore的3K分子量截留超濾，去除洗脫液中的鹽成分。用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例3 ITRAQ標(biāo)記選用Applied Biosystem的ITRAQ試劑盒標(biāo)記。取各組樣品各IOOug,每管加入預(yù)冷的丙酮(丙酮樣品體積比=5 I), -20°C沉淀lh。然后12000rpm離心15min,棄上清。用試劑盒中自帶的溶解液20uL溶解緩沖液(含有O. 5M TEABtriethylammoniumbicarbonate)和Iul變性劑(含有2% SDS)充分混懸溶解樣品。加入2ul還原試劑(含有 50mM TCEP tris (2-carboxyethyl) phosphine)，60°C還原 lh。再加入 Iul 半胱氨酸封閉試劑(含有 20mM MMTS s-methyl methanethiosulfonate),混合后室溫?zé)?IOmin 后，按照酶蛋白質(zhì)=I 20的比例加入Trypsin酶(TPCK處理過(guò)的)，混合后37°C酶解過(guò)夜。將5種標(biāo)記試劑離心，各加入異丙醇60uL混勻，加入各自對(duì)應(yīng)樣品液中，混勻離心，室溫靜置2h。標(biāo)記和樣品對(duì)應(yīng)關(guān)系如下113-健康對(duì)照組，114-肺結(jié)核病組，115-大葉性肺炎組，116-肺癌組，117-C0PD組。合并各管標(biāo)記好的樣品，真空冷凍干燥。實(shí)施例4 2D LC-MS/MS 分析采用waters公司 的Sep-Pak Vac C18柱子脫鹽。即將標(biāo)記過(guò)程中的標(biāo)記試劑和相關(guān)buffer的鹽除去，以便 于后續(xù)分析。首先是100 %乙腈沖洗柱子3次，然后用0. 1%TFA (水溶)，沖洗柱子三次。用400uL O. 1% TFA溶解樣品，加載到柱子上，0. 1% TFA沖洗柱子3-5次后，用50%乙腈0.1% TFA 400uL洗脫下樣品。將樣品冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)分析。第一維強(qiáng)陽(yáng)離子柱(SCX)分離所用的柱子為Polysulfoethyl column,
2.5u, 200A, The Nest Group, Inc. MA。流動(dòng)相 A 液含 10mmol/LKH2P04 和 25%ACN(acetonitrile)，pH 2. 6 ；B 液含 lOmmol/L KH2P04、350mmol/L KCl 和 25 % ACN, pH2.6?；旌蠘悠酚藐?yáng)離子交換加載緩沖液BuffferA SOuL溶解并上樣。設(shè)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm/280nm，流速為 200uL/min。線性梯度洗脫程序?yàn)?_40min，5% -25% B ;40_45min，25% -80% B ；45-50min,80% B ；50-60min,0% B。根據(jù)峰形和時(shí)間共收取20個(gè)梯度，真空離心濃縮(rotation vacuum concentrators, Christ RVC 2-25, Christ, Germany)后，每餾分用50uL反相液相色譜的A相溶解，進(jìn)行第二維分析。第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS :流動(dòng)相A液為5% (體積分?jǐn)?shù))ACN和0.1 %甲酸溶液，流動(dòng)相B液為95% ACN和0.1 %甲酸溶液。第一維的每組餾分真空干燥后，用反相液相色譜的A相溶解,通過(guò)QSTAR質(zhì)譜儀(Applied Biosystem, USA)進(jìn)行分析。肽段先經(jīng)裝有反相分離柱 ZORBAX 300SB-C18 column (5 μ m, 300A, 0.1x 150mm, microm, USA)的反相
液相色譜RPLC (島津20AD)進(jìn)行分離,色譜分離120min。流速為300nL/min。RPLC柱梯度洗脫程序?yàn)?-5min，上樣；5-90min,5% -35% B ；90-95min, 35% -80% B ；95-100min, 80%B ；100-105min,80% -5% B ；120min 停止。質(zhì)譜鑒定納噴霧針直接連接于反相色譜柱末端作為噴霧接口，噴霧電壓2. 2kV。MS掃描范圍400-1800u, MS/MS掃描范圍100_2000u，并增加20 %碰撞能量(collisionenergy)使iTRAQ的報(bào)告離子更易分離。一個(gè)譜圖選擇4個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行串級(jí)掃描。實(shí)施例5 :質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析通過(guò)ProteinPilot 3. O軟件檢索SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索參數(shù)為物種為H. sapiens,消化酶為trypsin,燒化劑為甲基甲燒巰基磺酸(MMTS, MethylMethanethiosulfonate),樣品采用iTRAQ標(biāo)記賴氨酸和氨基末端。鑒定的原始結(jié)果經(jīng)thePro Group Algorithm (Applied Biosystems)處理后導(dǎo)出。根據(jù)軟件對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)打分，設(shè)定報(bào)告閾值。鑒定蛋白所采用的置信Cutoff值為 ProtScore (unused) >1. 5, Confidence Interval > 95 %,滿足 EF (error factor)< 2，且!) < 0.05。軟件依據(jù)同位素報(bào)告基團(tuán)的相對(duì)含量進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，選擇差異顯著(P ( O. 05)的結(jié)果報(bào)告。鑒定的蛋白比值彡1. 25或者< O. 8被認(rèn)為存在表達(dá)差異。結(jié)果分析肺結(jié)核組與健康對(duì)照組的比較蛋白質(zhì)組學(xué)與健康對(duì)照組相比，肺結(jié)核組有45個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)表I ;55個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)表2。表I肺結(jié)核組與健康對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型，其特征在于，該活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型包括 肺結(jié)核與健康對(duì)照組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，由上調(diào)蛋白PDLI1、C4BPA、⑶14、SAA、IGHD、IGHM、SHBG, PPIA、PZP、MASP2、PEPD, ZYX、VffF, FLNA, TAGL2、FCN2、CD5L、F13A、FHR5、HBD、IBP2、HBB、GPV1、HYOU1、TTHY、HBA、LDHB、TLN1、NPC2、TENA、HABP2、TRML1、CAH2、ITB1、C4BPB、HPT、FCGBP, PROFl、FIBB、4F2、ITIH3、SODE, FETUB_HUMAN、CALR、TIMPl 和下調(diào)蛋白 PLF4、RET4、AP0M、LYSC、IL1AP、IBP5、FINC、AP0D、ANGT、ALBU、C1R、AP0C1、HGFA、N0E1、SAMP、MME、CHLE、CPN2、TRYU CBG, LUM、IBP1、PEDF、BTD、TETN、KLKBl、ATRN、K1C10、LYVEl、PONl、TRi7E、LMAN2、NGAL、LCAT、I PSP、APOF、NRP1、GPV、K2C1、PON 3、APOA1、PHLD、ICAM2、FA11、ANAG、C04B、GPX3、K1C9、TRFL, AFAM、C0L11、SAA4、AP0C2、CNDPl、AP0C4 構(gòu)成； 肺結(jié)核與肺炎組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，由上調(diào)蛋白SAMP、CBPB2、IC1、HEP2、FLNA、AFAM、ZA2G、ANT3、KNG1、PLSL、THBG、⑶5、A2AP、LUM、MASP1、LBP、HABP2、GPX3、HYOU1、PROC、CHLE、APOH、C07、FKBIA、ATRN、TAGL2、CFA1、PROF1、RET4、CIQB、KLKB1、BTD、ΝΕΟ1、PPIA、GPV、CBG、C1R、PROZ, SHBG, ANGT、PDIAl、F13B、ZP1、QSOXl、TLNl、C08B、HRG, ΚΑΙΝ、LYSC, C02、GPlBA、TETN、CPN2、CYTC, C06A3、MBL2、PEDF, NGAL, VffF, HGFL, APOCl、TRMLl、PRG4、FETUB, CAHl、CRIS3、C1RL、AMPN、PEPD, C08G、CD14、HGFA, FCG3B、1433Z、BGH3、FCGBP、4F2、DOPO, CALR、ZYX、CRACl、SODE、PTCDS、FAlO、FHRl、C1QA、PDLI1、IGF2、PLTP、EGLN、BSTl、ΝΟΕΙ 和下調(diào)蛋白 IGHAl、HPT、IGHG3、LAC2、IGKC、SAA, ALBU, IGHM、HBA, HBB、HPTR、PLF4、HBD、C4BPA、SAA4、CRP, TTHY, IGJ, CATA、PHLD、SLP1、LG3BP、PVR、FINC、IGLL5、APOM、FIBA、TENA, AP0L1、LCAT,K1C10、AP0F、IBPl、PRDX2、ANAG, MAlAl、SEPPl、PODXL, SRCRL, PONl、CLUS、GGH、CXCL7 構(gòu)成；肺結(jié)核與肺癌組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，由上調(diào)蛋白TAGL2、FLNA, TRMLl、ALBU, PR0F1、SHBG, ZYX、PDLI K FETUB, CYTC, KNGl、SAA、TLNl、GPV1、CXCL7、C06A3、CRIS3、D0P0, SODE,NGAL, PPIA、PROZ, LYAMl、GP1BA、F13A、TENX, F13B、TTHY, BTD、NPC2、NCAMl、CALR、CFAD,HY0U1、CHLl、C07、CD14 和下調(diào)蛋白 HPT、HPTR、HBB、HBA、C4BPA、IGHG3、LAC2、PLF4、HBD、CADH5、FINC、LG3BP、AP0C2、IGHM、TRFL, SAA4、C4BPB、LBP、SLPI, PHLD, ITIH3、K2C1、A1AG2、CRP、AlAGl、ANGT、C06、AP0L1、PROS、MAlAl、IGHAU ATRN, FCN2、C0IA1、C1R、CATD, PCSK9、C0L1U LCAT、C08B、FA5、APMAP、FIBB、SAMP、APOD、PLTP、HEP2、APOC1、KICIO、HGFL、SEPP1、C08A、CD5L_、CPN2、LMAN2、CFA1、I CAMl、TRYl 構(gòu)成； 肺結(jié)核與COPD組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，由上調(diào)蛋白ALBU、TAGL2、⑶14、FLNA, FETUB,PROF1、TENX、SODE、COMP、ZYX、TRML1、FAIO、PD IA1、KNG1、CRI S3、TLN1、PROP、GPV1、PDL11、PPIA、FKB1A, CBG, GP1BA、CRACl、FHRl、F13A、NPC2、ΙΒΡ5、VASN、1433Z、C04B、EGLN、PRG4、GGH、CFAD、CALR 和下調(diào)蛋白 HPT、IGHM、IGHG3、LAC2、HBB、HPTR、HBA、PLF4、C4BPA、HBD、IGKC、FINC、IGHAl、SAA、IGLL5、LBP、CRP, C4BPB、SAA4、ADIP0、AP0C2、A1AG2、TRFL, FIBB、ITIH3、PHLD、COLl1、CADH5、APOCl、APOD、C06、IGJ、C1R、ICAM2、AlAGl、CATA、ATRN、ANGT, FIBA、AP0C3、CLUS、LG3BP、PZP、PONU ALDOB, APOL1、SEPP1、C07、APOF, C08B、IGHD、PRDX2、C08A、LYVEl、CFA1、ENPL、GPNMB, CAH2、TENA, FA5、PROS、ICU MIME, ILlAP, FCGBP, K1C10、MRCl、CPN2、C05、GPX3、APMAP、CAHU VffF, AFAM、CATD, FBLN3 構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型，其特征在于，蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜由相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素標(biāo)記血清全蛋白，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測(cè)蛋白質(zhì)譜，再統(tǒng)計(jì)分析報(bào)告離子的相對(duì)定量。
3.如權(quán)利要求1所述的活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型，其特征在于， 在相對(duì)定量分析中，采用質(zhì)荷比114報(bào)告離子峰面積，以質(zhì)荷比113、115、116、117的報(bào)告離子峰為對(duì)照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，選擇比值^ 1.25^0.8的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告，其中，比值彡1. 25的為蛋白表達(dá)上調(diào)，比值彡O. 8的為蛋白表達(dá)下調(diào)。
4.一種權(quán)利要求1的活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型的構(gòu)建方法，其特征在于，該構(gòu)建方法包括以下步驟 分別采集活動(dòng)性肺結(jié)核組、健康對(duì)照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的血清標(biāo)本，分別對(duì)血清進(jìn)行高豐度蛋白的去除和蛋白濃度的測(cè)定，將蛋白進(jìn)行還原、封閉、烷基化、酶解消化，用相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素ITRAQ標(biāo)記，得到相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素ITRAQ標(biāo)記的肽段；再將多肽進(jìn)行強(qiáng)陽(yáng)離子交換和反向液相色譜分離，再進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和相對(duì)定量分析，得到活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型。
5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，串聯(lián)質(zhì)譜鑒定過(guò)程中，采用噴霧電壓2. 2kV, MS掃描范圍400-1500U，MS/MS掃描范圍100_2000u，并增加20 %碰撞能量(collision energy)使iTRAQ的報(bào)告離子更易分離；一個(gè)譜圖選擇20個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行串級(jí)掃描。
6.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，相對(duì)定量分析使用軟件為ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA)Software。
7.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，相對(duì)定量分析過(guò)程中設(shè)定蛋白置信度大于 95 %或 ProtScore (unused)大于1. 5。
8.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，相對(duì)定量分析過(guò)程中，采用質(zhì)荷比114報(bào)告離子峰面積，以質(zhì)荷比113、115、116、117的報(bào)告離子峰為對(duì)照，按照114 113、114 115,114 116,114 117的比值，選擇比值彡1. 25彡O. 8的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告，其中，比值>1. 25的為蛋白表達(dá)上調(diào)，比值< O. 8的為蛋白表達(dá)下調(diào)。
9.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，根據(jù)分析報(bào)告，通過(guò)活動(dòng)性肺結(jié)核組與健康對(duì)照組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜、活動(dòng)性肺結(jié)核組與肺炎組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜、活動(dòng)性肺結(jié)核組與肺癌組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜、活動(dòng)性肺結(jié)核組與COPD組的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜，建立活動(dòng)性肺結(jié)核的表達(dá)差異質(zhì)譜模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法，通過(guò)比較活動(dòng)性肺結(jié)核組與健康對(duì)照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，獲得活動(dòng)性肺結(jié)核的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜。此外，本發(fā)明還涉及活動(dòng)性肺結(jié)核蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜模型構(gòu)建的新方法，利用相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素ITRAQ標(biāo)記及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，能有效地對(duì)血清里的蛋白進(jìn)行鑒定和相對(duì)定量，采用該技術(shù)能獲得活動(dòng)性肺結(jié)核病人血清中的蛋白表達(dá)差異質(zhì)譜。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103065065SQ20121049963
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月18日
發(fā)明者李繼承, 徐丹丹 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)