一種轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種轉(zhuǎn)葡糖巧酶的制備方法，具體設(shè)及一種高轉(zhuǎn)巧能力的轉(zhuǎn)葡糖巧酶 的制備方法，屬于酶制劑領(lǐng)域和食品添加劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)葡糖巧酶化lucosyltransferase，EC2.4.1.24)，也稱α-轉(zhuǎn)移葡萄糖巧酶、α-葡 萄糖轉(zhuǎn)巧酶、某些場合也稱作a-D-葡萄糖巧酶(a-D-glucosidase，EC 3.2.1.20)、α-葡萄糖 巧酶、麥芽糖酶。轉(zhuǎn)葡糖巧酶可W切開麥芽糖和低聚麥芽糖等糖分子結(jié)構(gòu)中α-1，4糖巧鍵， 并將游離出來a-D-葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個a-D-葡萄糖分子或麥芽糖分子中的α-1，6位 上，是生產(chǎn)低聚異麥芽糖的關(guān)鍵酶制劑。
[0003] 低聚異麥芽糖（ΙΜ0)是一種功能性低聚糖，具水溶性膳食纖維功能、低熱量、預(yù)防 離齒等特性，現(xiàn)已成為大多數(shù)健康食品的必需成分，隨著低聚糖需求量日益增加，同時轉(zhuǎn)葡 糖巧酶的用量也大幅度增加，對轉(zhuǎn)葡糖巧酶的產(chǎn)量和質(zhì)量等提出了更高的要求。
[0004] 目前國內(nèi)市場的轉(zhuǎn)葡糖巧酶產(chǎn)品存在的兩方面的不足： 第一，生產(chǎn)過程中使用的轉(zhuǎn)葡糖巧酶制劑在國內(nèi)生產(chǎn)領(lǐng)域幾乎處于空白，主要依賴進 口，價格昂貴、來源不穩(wěn)定;第二，工業(yè)所用的轉(zhuǎn)葡糖巧酶在低聚異麥芽糖生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)化率較 低，一般在30%-50%，如日本天野制藥-株式會社屬首家生產(chǎn)轉(zhuǎn)葡糖巧酶制劑，生產(chǎn)工藝及其 成熟，但其轉(zhuǎn)葡糖巧酶制劑對低聚異麥芽糖轉(zhuǎn)化率也只有50%，工業(yè)上生產(chǎn)低聚異麥芽糖 時，必須提取、純化、加工轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)品，才能得到高純度的低聚異麥芽糖。因此，國內(nèi)低聚 異麥芽糖產(chǎn)品只有50%純度的ΙΜ0-500和90%純度的ΙΜ0-900兩種型號。
[000引轉(zhuǎn)葡糖巧酶催化生成低聚異麥芽糖的效率稱為轉(zhuǎn)巧率，企業(yè)用轉(zhuǎn)葡糖巧酶的轉(zhuǎn)巧 率一般為30%-50%，因此高轉(zhuǎn)巧率的轉(zhuǎn)葡糖巧酶有利于降低生產(chǎn)成本，提高低聚麥芽糖的產(chǎn) 量。因此急需開發(fā)一種可生產(chǎn)高純度低聚異麥芽糖的轉(zhuǎn)葡糖巧酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種高轉(zhuǎn)巧率的轉(zhuǎn)葡糖巧酶的制備方法，使用該方法可制得 轉(zhuǎn)巧率高達65%的轉(zhuǎn)葡糖巧酶粗液，W解決低聚異麥芽糖生產(chǎn)中轉(zhuǎn)巧率低的問題。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種轉(zhuǎn)葡糖巧酶的制備方法， W黑曲霉菌株（中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，CGMCC No. 3.6478) 為出發(fā)菌株，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)方式，經(jīng)過大量發(fā)酵基配方優(yōu)化實驗，得到轉(zhuǎn)巧率高的轉(zhuǎn)葡 糖巧酶制劑，具體操作步驟如下： (1) 斜面培養(yǎng) 在裝有察氏固體培養(yǎng)基的試管中接入黑曲霉菌株，30°C靜置培養(yǎng)7天，制得成熟抱子， 加無菌水制得斜面抱子懸浮液； (2) 搖瓶擴大培養(yǎng) 在裝有PDY培養(yǎng)基的搖瓶中接入斜面抱子懸浮液，在32°C、150r/min條件下培養(yǎng)，得搖 瓶抱子懸浮液； (3) 液體深層發(fā)酵 按10%質(zhì)量百分濃度搖瓶抱子懸浮液的量接種于經(jīng)高壓滅菌后的優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基 進行培養(yǎng);其中：所述的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方由下述重量百分含量組成:薦糖5-12%，蛋白腺 2-8%，酵母提取物0.1-0.5%，K2HP04 0.1-1%，NaCl 0.1-1%，MgS〇4 0.01-0.05%，并特別添 加誘導(dǎo)物N-甲基-D-葡萄糖胺0.01-0.05%，然后溶于純水，經(jīng)混合均勻制得;所述搖瓶發(fā)酵 溫度在28-32°C，180r/min;優(yōu)選的配方為：薦糖7%，蛋白腺5%，酵母提取物0.3%，K2冊〇4 0.5%，NaCl 0.5%，MgS〇4 0.02%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，余量純水； (4) 發(fā)酵液經(jīng)高速離屯、，取上清液即得轉(zhuǎn)葡糖巧酶粗酶液。
[0008] 利用本發(fā)明制得的轉(zhuǎn)葡糖巧酶有如下特征： 1、 pH穩(wěn)定性:該酶在溫度55°C，pH范圍4.5-7.0時可穩(wěn)定30min，最適P冊.5; 2、 熱穩(wěn)定性:該酶在pH值6.0條件下，分別W不同溫度處理30min所得結(jié)果:55°C時該酶 仍保留其初始活性的90%，而在70°C時則為70%。
[0009] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明特別添加誘導(dǎo)物N-甲基-D-葡萄糖胺，可刺激黑曲霉大 量分泌轉(zhuǎn)葡糖巧酶。該酶可應(yīng)用于低聚異麥芽糖生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟-轉(zhuǎn)化階段，明顯提高了反 應(yīng)速率，低聚異麥芽糖轉(zhuǎn)化率約為65%，遠(yuǎn)高于一般轉(zhuǎn)葡糖巧酶的50%轉(zhuǎn)化率，縮短了反應(yīng)時 間，也為后續(xù)的提純工序節(jié)約了成本，減少生產(chǎn)時間，降低了企業(yè)生產(chǎn)成本，解決了低聚異 麥芽糖生產(chǎn)中轉(zhuǎn)化率低的問題。
【附圖說明】
[0010] 圖1為本發(fā)明制備方法流程圖。
[0011] 圖2為低聚異麥芽糖生產(chǎn)工藝流程示意圖。
【具體實施方式】 [001引實施例1 如圖1所示，一種轉(zhuǎn)葡糖巧酶的制備方法，按
【發(fā)明內(nèi)容】
所述的生產(chǎn)步驟，黑曲霉經(jīng)斜面 培養(yǎng)7天后，制得成熟抱子，加無菌水制得斜面抱子懸浮液，接入裝有PDY培養(yǎng)基搖瓶中，在 32°C，150r/min條件下培養(yǎng)4她，按10%的比例在裝有100ML液體培養(yǎng)基的500ML搖瓶中接入 搖瓶抱子懸浮液。其中優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分的重量百分含量如下:薦糖10%，蛋白腺2%， 酵母提取物0.3%，K2HP04 0.5%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，NaCl 0.15%，MgS04 0.02%，其余為 水，經(jīng)混合均勻制得，初始抑6.05，分別在28°C、29°C、30°C、31°C、32°C，180r/min條件下培 養(yǎng)60h，取發(fā)酵液離屯、5000r/min，2分鐘，取上清液檢測酶活力，如表1。酶活檢測方法(依據(jù) 地2525-2001《食品添加劑α-葡萄糖轉(zhuǎn)巧酶》）（下同）進行測定。
[0013] 表1不同溫度下發(fā)酵培養(yǎng)對酶活的影響_^^_
' 從表1可W看出，溫度在28-32°C培養(yǎng)對酶活無明顯差別，培養(yǎng)的溫度可W控制在28-321 °C 實施例2 如圖1所示，一種轉(zhuǎn)葡糖巧酶的制備方法，按
【發(fā)明內(nèi)容】
所述的生產(chǎn)步驟，黑曲霉經(jīng)斜面 培養(yǎng)7天后，制得成熟抱子，加無菌水制得斜面抱子懸浮液，接入裝有PDY培養(yǎng)基搖瓶中，在 32°C，150r/min條件下培養(yǎng)4她，按10%的比例在裝有100ML液體培養(yǎng)基的500ML搖瓶中接入 搖瓶抱子懸浮液。其中優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分的重量百分含量如下:薦糖12%，蛋白腺2%， 酵母提取物〇.1%瓜冊〇4 0.1%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，化C1 0.5%，MgS〇4 0.02%，其余為 水，經(jīng)混合均勻制得，初始抑6.02，在32°C，180r/min條件下培養(yǎng)60h。取發(fā)酵液離屯、5000r/ min,2分鐘，取上清液檢測酶活力，同時采用不同誘導(dǎo)物N