專利名稱：用于工業(yè)過程的獲自褐色高溫單孢菌的纖維素酶的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的方法包括纖維素酶在工業(yè)過程中的用途以及用于此目的之組合物的用途。特別的，本發(fā)明涉及用源于褐色高溫單孢菌(Thermomonospora fusca)的特別適合于此目的之纖維素酶來處理紡織品，例如漿洗和加工。本發(fā)明還涉及源于褐色高溫單孢菌的纖維素酶用于增強(qiáng)動物飼料的可消化性的用途，用于去污劑中的用途，用于紙漿和紙的處理中的用途，以及用于淀粉的生產(chǎn)及其副產(chǎn)品的處理中的用途。
纖維素酶是水解纖維素(β-1,4-D葡聚糖鍵)并產(chǎn)生葡萄糖、纖維二糖和纖維寡糖為主要產(chǎn)物的酶。纖維素酶可由許多微生物產(chǎn)生并且包含一些不同的酶種類，包括已鑒定為外切纖維二糖水解酶(CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)的那些酶(M.Schulein，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology),160卷，235-242頁(1988))。目前理論認(rèn)為這些種類中的酶能被分離成單個組分。例如，微生物纖維素酶組合物可能由一種或多種CBH組分、一種或多種EG組分以及可能的β-葡糖苷酶組成。包含CBH、EG和BG組分的完整的纖維素酶體系協(xié)同作用將晶態(tài)纖維素轉(zhuǎn)換成葡萄糖。外切纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶共同作用將纖維素水解成小的纖維寡糖。纖維寡糖(主要是纖維二糖)隨后被占主要部分的β-葡糖苷酶水解為葡萄糖。
已知單獨(dú)或聯(lián)合使用的纖維素酶及其各組分可用于去污劑組合物和處理紡織品。紡織品工業(yè)中，已知在含棉織物生產(chǎn)過程之中或其后不久，用纖維素酶處理此織物可賦予織物期望的特性。此處理的一個目的是去除絨毛(即從紗線或織物表面伸出的解開的纖維末端)以及纖維絨球(即由一根或多根纖維固定于織物表面的糾纏的纖維束或團(tuán))。因而，紡織品工業(yè)中，纖維素酶已被用于改善含棉織物的手感和/或外觀，從含棉針織物上去除表面纖維，并且也用于賦予粗斜紋棉布石洗外觀。特別是日本專利申請?zhí)?8-36217和58-54032以及Ohishi等，“纖維素酶對棉織物的改造”和“新成果——減重處理以軟化棉織物的手感”日本紡織品新聞(Japan Textile News),(1988年12月)都公開了用纖維素酶處理含棉織物導(dǎo)致織物手感的改善。通常認(rèn)為，這種纖維素酶處理去除了棉絨毛和/或表面纖維，從而減少了織物重量。這些效果綜合起來賦予織物改善的手感。
由纖維素織物制成的布例如棉粗斜紋棉布，由于存在為方便衣服的制造、搬運(yùn)和包裝的上漿組合物而使其質(zhì)地堅硬，且一般有新且深的染色外觀。靛藍(lán)染色的粗斜紋棉布一個期望的特征是用白線改變?nèi)旧木€，這給予粗斜紋棉布上藍(lán)色的外觀。例如，持續(xù)穿著和漿洗一段時間后，衣服特別是粗斜紋棉布，在飾條和線縫中會出現(xiàn)顏色的深度或密度降低的多個局部區(qū)域。另外，常常出現(xiàn)衣服的普遍褪色、線縫起皺和織物飾條起折。近年來這種破舊的或“石洗的”外觀，特別在粗斜紋棉布衣服上，對相當(dāng)一部分公眾來說很有吸引力。
以前用于產(chǎn)生故意磨損外觀的方法包括在大桶中用顆粒大小約1到10英寸的浮石和用由加工過程的研磨性質(zhì)所產(chǎn)生的更小的浮石來石洗一件或多件衣服。典型的情況下，衣服在濕時用浮石滾翻足夠時間以使浮石磨損織物，在織物飾條中產(chǎn)生顏色較淺的局部磨損區(qū)域，以及在線縫產(chǎn)生類似的淺色區(qū)域。另外，浮石軟化織物并產(chǎn)生與由于織物持續(xù)穿著和漿洗產(chǎn)生的相似的絨毛表面。
使用浮石有一些缺點，包括對機(jī)器發(fā)動機(jī)的超負(fù)荷損傷、對運(yùn)輸機(jī)械和清洗圓桶的機(jī)械損壞、產(chǎn)生的沙礫造成的環(huán)境廢料問題和與人工將石頭從衣服口袋去除相關(guān)的高勞動力成本?？紤]到與浮石石洗相關(guān)的問題，用纖維素酶溶液代替浮石，在攪動和沖流條件下，即在滾桶洗滌機(jī)中，以給予粗斜紋棉布“石洗”外觀(美國專利號4,832,864)。
已發(fā)現(xiàn)了源于嗜熱、絲狀、土壤細(xì)菌褐色高溫單孢菌的纖維素酶體系并研究了此體系及其組分的生化特征(Wilson，生物工程評述Critical Reviews in Biotechnology,12卷，45-63頁(1992))。褐色高溫單孢菌體系一個特異性的內(nèi)切葡聚糖酶組分E5已被測序(Lao等，細(xì)菌雜志(J.Bacter.),173卷，3397-3407頁(1991))，并描述了其二硫鍵排列和功能結(jié)構(gòu)域(McGinnis等，生物化學(xué)(Biochemistry),32卷，8157-8161頁(1993))。McGinnis公開了用獲自淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)的蛋白酶處理E5，產(chǎn)生一個14kD的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個有催化活性的已失去纖維素結(jié)合能力的32kD片段。純的有催化活性的淺青紫鏈霉菌蛋白酶處理的E5顯示出的活性與完整的酶對CMC的活性相似。然而，當(dāng)與獲自褐色高溫單孢菌的完整E3或者與獲自Trichoderma reesei的完整E3和CBHI聯(lián)用時，包含有催化活性的E5片段的混合物比包含完整E5而非此片段的類似混合物顯示出效能降低(PCT公開文本96/00281)。
盡管大量研究涉及工業(yè)過程中纖維素酶的用途，本領(lǐng)域中已知和已使用的纖維素酶顯示出明顯的缺陷。例如，許多纖維素酶存在低活性、堿或酸穩(wěn)定性差、溫度穩(wěn)定性差和氧化穩(wěn)定性差等問題。令人驚奇的是，申請者發(fā)現(xiàn)E5纖維素酶擁有與之相符合的特性，因而使其尤其適用于特定的工業(yè)應(yīng)用。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了一種處理纖維素類材料的方法，其包含用獲自褐色高溫單孢菌的相應(yīng)于E5、截短的E5或其衍生物的纖維素酶接觸纖維素類材料。在本發(fā)明的一個工藝實施方案中，纖維素類材料包含含纖維素的織物，并且該方法的結(jié)果是產(chǎn)生石洗效果或改善織物手感和/或外觀。在本發(fā)明的另一工藝實施方案中，將含纖維素的織物與含去污劑組合物的水溶液相接觸，該去污劑組合物含有獲自褐色高溫單孢菌的相應(yīng)于E5、截短的E5或其衍生物的纖維素酶。在本發(fā)明的另一個工藝實施方案中，纖維素類材料包含木紙漿，纖維素酶的加入促進(jìn)了以其生產(chǎn)紙產(chǎn)品。在本發(fā)明的另一個工藝實施方案中，纖維素類材料包含動物飼料，并且其方法增強(qiáng)了該動物飼料的可消化性或價值。在本發(fā)明另一實施方案中，纖維素類材料包含用于生產(chǎn)食物、淀粉、酒精或糖的谷物或谷物副產(chǎn)品。
在此申請者鑒定了獲自褐色高溫單孢菌的一種特異性的纖維素酶，在文獻(xiàn)中已知為E5，此酶有大量令人驚奇的特性特別有益于紡織品加工(特別包括粗斜紋棉布石洗和生物上光)、清潔用產(chǎn)品和去污劑、紙漿和紙的生產(chǎn)、食物加工以及作為動物飼料的添加劑。特別是申請者已發(fā)現(xiàn)E5對不溶性底物有尤其廣的pH/活性范圍，在從約pH5.0到10.5的pH范圍內(nèi)有活性，在堿性區(qū)域活性降低極小。而且，E5在溫和的pH和溫度時具有顯著的活性水平，在延長的時間期間和超過80℃的溫度下保持穩(wěn)定，基本上對許多緩沖液組分和強(qiáng)度不敏感，長時間的蛋白酶裂解后仍有活性，并且在有氧化劑例如過硼酸鹽和過硼酸/TAED共同存在下以及在去污劑中保持穩(wěn)定。在E5尤其令人驚奇的特性中，其中之一是與其對可溶性底物的活性相比，它對不溶性底物例如棉織物具有異常的高pH下的活性，而對可溶性底物的活性在超過其約6.0的最佳pH后顯著降低。因而，E5特別適合于高pH的紡織品應(yīng)用，例如同時進(jìn)行的漂白和生物上光或在用于漿洗去污劑以及為高pH配制的前或后處理。另一令人驚奇的特性是褐色高溫單孢菌在液體去污劑中保持幾乎不受溫育影響的能力。本發(fā)明另外一個新奇的特性是截短的E5也具有許多與E5一樣的異常特點。例如，申請者發(fā)現(xiàn)截短的E5酶能表現(xiàn)出與E5幾乎相同的表面纖維去除活性。
現(xiàn)有技術(shù)未提出E5或截短的E5在工業(yè)應(yīng)用中重要的優(yōu)點。通過參考下列詳細(xì)說明以及附圖，可以最好地理解此發(fā)明本身和進(jìn)一步的目的以及具有的優(yōu)點。
附圖簡述

圖1闡明了E5在70℃對可溶性底物的pH曲線。
圖2闡明了E5在從40℃到80℃對可溶性底物的活性。
圖3闡明了E5在20℃,20ppm,pH8和10時的穩(wěn)定性。
圖4闡明了E5在37℃,20ppm,pH6、pH8和pH10的穩(wěn)定性。
圖5闡明了E5在50℃,20ppm,pH6、pH8和pH10的穩(wěn)定性。
圖6闡明了在有0ppm、90ppm、250ppm、500ppm和900ppm濃度的過硼酸鹽存在下E5的穩(wěn)定性。
圖7闡明了E5在pH6、pH7.5、pH8.5和pH9.5時的表面纖維去除活性。
圖8闡明了有蛋白酶存在下在50℃和pH7時E5的活性。
圖9闡明了在38℃與商業(yè)途徑可得的和經(jīng)熱處理的Cheer相比E5的pH反應(yīng)。
圖10闡明了在60℃與商業(yè)途徑可得的和經(jīng)熱處理的Cheer相比E5的pH反應(yīng)。
圖11闡明了與獲自T.longibrachiatum的代表性纖維素酶相比，E5在Wisk強(qiáng)效洗滌液中35天以上的穩(wěn)定性。
發(fā)明詳述“含棉織物”是指經(jīng)縫紉或未經(jīng)縫紉的由純棉或棉混紡紗制成的織物、紗線或纖維，包括棉機(jī)織纖維、棉針織物、棉粗斜紋棉布、棉紗線、原棉及類似物。當(dāng)采用棉混紡紗時，織物中棉的量優(yōu)選至少約占棉重量的35％。當(dāng)作為棉混紡紗使用時，織物中采用的伴隨材料可包括一或多種包括纖維素類或合成纖維的非棉纖維，例如聚酰胺纖維(例如，6號尼龍和66號尼龍)、丙烯酸纖維(例如，聚丙烯腈纖維)，以及聚酯纖維(例如，聚對苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇纖維(例如，維尼侖)、聚氯乙烯纖維、聚偏二氯乙烯纖維、聚氨基甲酸乙酯纖維、聚脲纖維和芳族聚酰胺纖維。
“含纖維素的織物”是指任何經(jīng)縫紉或未經(jīng)縫紉的由含棉或不含棉纖維素或者含棉或不合棉纖維素混紡紗制成的織物、紗線或纖維，包括天然纖維素類和人造纖維類(例如黃麻、亞麻、苧麻、人造絲和lyocell)。含人造纖維素的織物類中包括本領(lǐng)域眾所周知的再生織物例如人造絲。其它含人造纖維素的織物包括化學(xué)改良的纖維素纖維(例如，纖維素的乙酸酯衍生物)和溶紡纖維素纖維(例如，lyocell)。在含纖維素的織物的定義中尤其包括任何由這樣的材料制成的紗線或纖維。
“石洗組合物”是指用于石洗含纖維素的織物的制劑。石洗組合物被用于在遞呈給消費(fèi)者售賣前，即，在生產(chǎn)過程中改良含纖維素的織物。與之相反，去污劑組合物意在用于清潔弄臟的衣服。
“石洗”是指用纖維素酶溶液在攪動和沖流條件下，即在滾桶洗衣機(jī)中處理含纖維素的織物，以賦予粗斜紋棉布“石洗”外觀。根據(jù)本發(fā)明，纖維素酶溶液將在功能上全部或部分地取代石頭在這一領(lǐng)域認(rèn)可的方法中的應(yīng)用。美國專利號4,832,864中描述了賦予粗斜紋棉布石洗外觀的方法，在此完整地引入作為參考。通常，石洗技術(shù)被應(yīng)用于靛藍(lán)染色的棉粗斜紋棉布。
“去污劑組合物”是指意在用于清洗弄臟的含纖維素的織物的清洗介質(zhì)中使用的混合物。本發(fā)明的正文中，這樣的組合物除纖維素酶和表面活性劑之外，可包括另加的水解酶、助洗劑、漂白劑、漂白激活劑、上藍(lán)劑和熒光染料、結(jié)塊抑制劑、掩蔽劑、纖維素酶激活劑、抗氧化劑以及增溶劑。與石洗組合物相反，這樣的組合物通常被用于清潔弄臟的衣服而不用于生產(chǎn)過程中。在例如，Clarkson等，美國專利號5,290,474和歐洲公開號271004中描述了含有纖維素酶的去污劑組合物，在此引入作為參考。
“衍生物”是指通過在C-末端和N-末端中的一端或兩端添加一個或多個氨基酸、在氨基酸序列中的一個或多個不同位點替換一個或多個氨基酸、在蛋白質(zhì)的一端或兩端或在氨基酸序列中的一個或多個位點刪除一個或多個氨基酸、或者在氨基酸序列中的一個或多個位點插入一個或多個氨基酸而從前體蛋白質(zhì)(例如，天然蛋白質(zhì))衍生得到的蛋白質(zhì)。優(yōu)選通過修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列，將此DNA序列轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主，以及表達(dá)經(jīng)修飾的DNA序列以形成衍生的酶來完成酶衍生物的制備。本發(fā)明的衍生物包括含有與前體酶氨基酸序列(例如，野生型或天然狀態(tài)的酶)相比改變了的氨基酸序列的肽類，此肽保留前體酶的特征性酶特性，但在一些特定方面具有改變的特性。例如，改變了的E5或改變了的截短的E5可具有升高的最佳pH或增強(qiáng)的溫度或氧化穩(wěn)定性，但會保留其特征性的纖維素分解活性。相似地，依據(jù)本發(fā)明的衍生物包括一個纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它或者已被全部去除，或者以這樣的方式被修飾以嚴(yán)重?fù)p傷其纖維素結(jié)合能力。經(jīng)考慮后認(rèn)為，根據(jù)本發(fā)明的衍生物可源于編碼E5或截短的E5之DNA片段(如下所述)，其中表達(dá)的E5衍生物或截短的E5之功能活性被保留。例如，編碼截短的E5之DNA片段還可包括編碼附著于截短的E5DNA序列5’或3’端的鉸鏈或連接頭的DNA序列或其一部分，其中編碼截短的E5結(jié)構(gòu)域的功能活性被保留。衍生物還包括通過化學(xué)修飾以改變酶的特性。
術(shù)語“截短的E5”指含有保留了纖維素分解活性的完整E5酶之衍生物(通常是縮短的)的蛋白質(zhì)。完整形式的E5被認(rèn)為包含了催化核心和結(jié)合結(jié)構(gòu)域。催化核心和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以協(xié)同方式一起發(fā)揮作用以影響功效，并且時常有害地水解含纖維素的織物中的纖維素纖維，從而常常導(dǎo)致不期望的強(qiáng)度喪失。無功能結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短的E5可包括其它不合可歸于纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纖維素結(jié)合活性的實體。例如，特別考慮的是連接頭或鉸鏈的存在。相似地，也特別考慮到另一酶實體或非E5纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域共價結(jié)合到截短的E5上。當(dāng)都在相似條件下進(jìn)行分析并基于相似的蛋白量的給予劑量時，預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的截短的E5或其衍生物將保留至少10％的E5所表現(xiàn)的活性。
截短的E5可用任何制備截短的酶的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。特別有效的方法包括使用蛋白酶或化學(xué)裂解(例如，溴化氰)來裂解酶，或用基因工程方法直接在微生物宿主中表達(dá)截短的E5。McGinnis等(出處同前)建議淺青紫鏈霉菌蛋白酶在E5酶的N-端切下120個氨基酸，酶的剩余部分作為催化活性核心。因而，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案考慮使用不同于E5的截短的E5，不同之處在于此酶長度少于121個氨基酸的N端片段被刪除掉，優(yōu)選的不同于E5之處在于截短的E5包含由完整E5的121位殘基的蘇氨酸開始的序列。在本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案中，截短的E5與E5的不同之處在于其1-120位氨基酸區(qū)域的氨基酸序列被改變以降低或消除纖維素結(jié)合活性。
根據(jù)本發(fā)明，提供了處理纖維素類材料的方法，其包含使纖維素類材料與獲自褐色高溫單孢菌的相應(yīng)于E5、截短的E5或其衍生物的纖維素酶接觸。在本發(fā)明的工藝實施方案中，纖維素類材料包含含纖維素的織物，并且此方法的結(jié)果是使織物產(chǎn)生石洗效果或改善其手感和/或外觀。在本發(fā)明另一可選的工藝實施方案中，使含纖維素的織物與含去污劑組合物的水溶液相接觸，此組合物含有獲自褐色高溫單孢菌的相應(yīng)于E5、截短的E5或其衍生物的纖維素酶。在本發(fā)明另一工藝實施方案中，纖維素類材料包含木紙漿，并且纖維素酶的加入促進(jìn)了以其生產(chǎn)紙產(chǎn)品。在本發(fā)明另一工藝實施方案中，纖維素類材料包含動物飼料，并且其方法引起該動物飼料可消化性或價值的增加。此處使用的E5指具有約45-47kD分子量(由氨基酸序列推導(dǎo)出來并經(jīng)SDS膠證實)和約pH4.5-4.8的等電點(在IEF膠上測定)，并且是獲自褐色高溫單孢菌的纖維素酶。褐色高溫單孢菌是嗜熱的、絲狀、在土壤中發(fā)現(xiàn)的放線菌，在腐敗的有機(jī)物質(zhì)例如腐爛的木頭中很常見。在Lao等(出處同前)中描述了E5的序列。根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶可由褐色高溫單孢菌通過在文獻(xiàn)中已描述的條件下進(jìn)行培養(yǎng)而生產(chǎn)，從而產(chǎn)生可從中純化E5的發(fā)酵培養(yǎng)基(見例如，Walker等，生物技術(shù)生物工程(Biotechnol.Bioeng.),40卷，1019-1026頁(1992))?；蛘?，如例如McGinnis等(出處同前)中用已被進(jìn)行了基因修飾以生產(chǎn)E5或截短的E5的微生物可產(chǎn)生E5。如此處采用的，纖維素酶意在包括E5、截短的E5或其衍生物。優(yōu)選地，此截短的E5包含催化結(jié)構(gòu)域且缺乏明顯的纖維素結(jié)合活性。
一般說來，根據(jù)本發(fā)明的含纖維素酶的組合物可以通過建立于本發(fā)明的纖維素酶的已知特性和特點基礎(chǔ)上的純化技術(shù)而得到。特別是，在根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶是培養(yǎng)的生物體產(chǎn)生的纖維素酶混合物的一部分的情況下，全部纖維素酶混合物(全纖維素酶)能通過在文獻(xiàn)中公開的已被認(rèn)可的分離技術(shù)純化成基本上純凈的組分，包括在適當(dāng)pH下的離子交換層析法、親和層析法和體積排阻層析法。例如，在離子交換層析法中(通常為陰離子交換層析法)，通過用pH梯度或鹽梯度或者pH及鹽梯度洗脫來分離纖維素酶組分是可行的。純化后，再混合所需組分以得到必需的量?；蛘撸捎没蚬こ碳夹g(shù)來調(diào)節(jié)產(chǎn)生的纖維素酶混合物，例如通過使用纖維素酶基因缺失的菌株，其中將編碼根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶的基因轉(zhuǎn)化到其它纖維素酶缺失的宿主菌株并被表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的紡織品的處理方法考慮用含纖維素酶的組合物進(jìn)行紡織品加工或清潔。這樣的處理方法包括但不限于石洗，修飾結(jié)構(gòu)、修飾含纖維素的織物手感和/或外觀，或其它在生產(chǎn)或清潔/重整合纖維素的織物的過程中使用的其它技術(shù)。另外，本發(fā)明正文中的處理方法考慮從纖維素織物或纖維中去除“不成熟”或“死亡”的棉，即比成熟棉更加無定形的不成熟棉。已知死亡棉能導(dǎo)致染色不均因而是不想要的。因而，本發(fā)明中構(gòu)思的組合物包括意在清洗弄臟的、生產(chǎn)出來的含纖維素的織物所使用的纖維素酶組分。例如，纖維素酶可被使用于清洗衣服的去污劑組合物中。根據(jù)本發(fā)明的有用的去污劑組合物包括專用制劑，例如預(yù)洗、預(yù)浸和家用的色彩還原組合物。這樣的處理組合物，如此處所描述，可以采用需要稀釋的濃縮物的形式，或采用稀釋溶液的形式，或采用能直接應(yīng)用于含纖維素的織物的形式。在例如歐洲專利公開號220016和英國申請?zhí)?,368,599和2,095,275中描述了用于紡織品之纖維素酶處理的本領(lǐng)域中已知的常用處理技術(shù)。
為本領(lǐng)域中已知的目的，根據(jù)本發(fā)明的纖維素類材料的處理還考慮到動物飼料、紙漿和/或紙、食物和谷物的處理。例如，已知纖維素酶增加動物飼料的價值、改善木紙漿的瀝水能力、強(qiáng)化食物以及在谷物濕磨加工或干磨加工過程中減少谷物中的纖維。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，上述的纖維素酶組合物可被用作石洗組合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的石洗包括制備含有效量的纖維素酶連同可選成分的水溶液，可選成分包括例如緩沖液、表面活性劑和擦洗劑。有效量的纖維素酶酶組合物具有滿足其設(shè)想目的之纖維素酶濃度。因此根據(jù)本發(fā)明的石洗組合物中纖維素酶的“有效量”是指能提供所需的處理(例如石洗)的量。采用的纖維素酶的量也依賴于所采用設(shè)備、所采用的加工參數(shù)(纖維素酶處理液的溫度、暴露于纖維素酶溶液的時間等)和纖維素酶的活性(例如，特定的溶液將需要較低的纖維素酶濃度，此處采用了較高活性纖維素酶組合物而不是較低活性的纖維素酶組合物)。其中將加入被石洗之織物的處理水溶液中的纖維素酶之確切濃度能被熟練技術(shù)人員很容易地依據(jù)以上因素以及所需結(jié)果確定。優(yōu)選地，纖維素酶采用從1到5,000ppm總蛋白質(zhì)的濃度，最優(yōu)選從10到200ppm。
可以選擇地，緩沖液被用于石洗組合物中，以使緩沖液的濃度足夠維持溶液pH在所采用的纖維素酶能表現(xiàn)活性的范圍內(nèi)，而此pH則依賴于所采用的纖維素酶的性質(zhì)。所采用的緩沖液的確切濃度依賴于技術(shù)人員能很容易考慮到的一些因素。例如，在一優(yōu)選實施方案中，選擇緩沖液和緩沖液的濃度以維持最終纖維素酶溶液的pH在最佳纖維素酶活性所要求的范圍內(nèi)。因為E5對不溶性底物有從約5.0直到約10.5的寬pH范圍，所以依據(jù)紡織品加工者的特定需要，纖維素酶可被用于微酸、中性或堿性pH中而具最佳活性。在E5活性范圍內(nèi)pH下的合適緩沖液為本領(lǐng)域的技術(shù)人員周知。
除纖維素酶和緩沖液外，石洗組合物任選地含有表面活性劑。合適的表面活性劑包括任何與纖維素酶和織物相適合的表面活性劑，包括例如陰離子、非離子和兩性表面活性劑。此處使用的合適的陰離子表面活性劑包括線性或有分支的烷基苯磺酸鹽；含線性或分支烷基基團(tuán)或鏈烯基基團(tuán)的烷基或鏈烯基醚硫酸鹽；烷基或鏈烯基硫酸鹽；烯屬磺酸鹽；烷基磺酸鹽等。對于陰離子來說合適的配對離子包括堿性金屬離子例如鈉和鉀；堿土金屬離子例如鈣和鎂；銨離子；以及含1到3個碳原子數(shù)為2或3的烷醇基團(tuán)的鏈烷醇胺。兩性表面活性劑包括季銨鹽磺酸酯和甜菜堿型兩性表面活性劑。這樣的兩性表面活性劑在同一分子中有正和負(fù)電荷基團(tuán)。非離子表面活性劑通常包含聚氧乙烯醚，以及高級脂肪酸烷醇酰胺或其氧化烯加成化合物和脂肪酸甘油單酯。也能按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法采用表面活性劑的混合物。
在優(yōu)選的實施方案中，可制備濃縮的石洗組合物以用于此處描述的各種方法。這樣的濃縮物含有濃縮量的上述纖維素酶組合物、緩沖液和表面活性劑，優(yōu)選在水溶液中。當(dāng)如此配制時，石洗濃縮物可以很容易地用水稀釋以快速并準(zhǔn)確地制備根據(jù)本發(fā)明的石洗組合物，并且具有這些添加物所需的濃度。當(dāng)配制水性濃縮物時，這些濃縮物能被稀釋以達(dá)到如上指出的纖維素酶溶液中的組分所需的濃度。因此顯而易見，這樣的石洗濃縮物將使纖維素酶溶液易于配制，并且使此濃縮物易于運(yùn)輸?shù)狡渌褂玫牡攸c。此石洗濃縮物可以采用本領(lǐng)域認(rèn)可的任何形式，例如，液體、乳液、凝膠或糊劑。這樣的形式為本領(lǐng)域的技術(shù)人員周知。
當(dāng)采用固態(tài)石洗濃縮物時，纖維素酶組合物可為顆粒劑、粉末、團(tuán)塊或固體片。當(dāng)使用顆粒劑時，顆粒劑優(yōu)選地進(jìn)行配制以含有纖維素酶保護(hù)劑。參見例如，美國系列號07/642,669(在1991年1月17日提交，代理卷號No.010055-073，題目為“含有酶和酶保護(hù)劑的顆粒劑以及含有此顆粒劑的去污劑組合物”)，該申請在此完整引入作為參考。類似地，顆粒劑可以如此進(jìn)行配制以使其含有能降低顆粒劑在清洗介質(zhì)中的溶解速率的物質(zhì)。美國專利號5,254,283公開了這樣的物質(zhì)和顆粒劑，在此完整引入作為參考。
其它物質(zhì)也能按需要與本發(fā)明的石洗組合物合用或放置于其中，包括石頭、浮石、填料、溶劑、酶激活劑和抗再沉積劑。
通過混合處理組合物與石洗組合物，使含纖維素的織物與含有效量纖維素酶的石洗組合物接觸，因而將纖維素酶帶到織物周圍。隨后，攪動含纖維素酶的水溶液和織物。如果處理組合物是水溶液，則可直接將織物浸于溶液中。相似地，在石洗組合物是濃縮物的情況下，濃縮物在有含纖維素的織物的水中被稀釋。當(dāng)石洗組合物為固體形式時，例如預(yù)洗凝膠或固體棒，可通過直接將組合物應(yīng)用于織物或清洗液中使織物接觸石洗組合物。
在有效地允許酶發(fā)揮作用以賦予含纖維素的織物石洗外觀的條件下將含纖維素的織物與石洗組合物一起溫育。例如，在石洗過程中，可將pH、液體比率、溫度和反應(yīng)時間調(diào)整到使石洗組合物起作用的最佳條件?！坝行l件”必須指允許纖維素酶與含纖維素的織物進(jìn)行有效反應(yīng)的pH、液體比率和溫度。本發(fā)明的石洗組合物的有效反應(yīng)條件基本上類似于眾所周知的現(xiàn)有技術(shù)中的纖維素酶組合物的使用方法。因此，利用本領(lǐng)域范圍內(nèi)的技術(shù)可以將使用根據(jù)本發(fā)明的石洗組合物的條件擴(kuò)大到最大限度。
石洗中此處采用的液體比率，即石洗組合物溶液的重量(即，清洗液)與織物重量的比率，通常是足夠獲得所需的粗斜紋棉布織物石洗效果的量，并且取決于所采用工藝。優(yōu)選地，液體比率從約4∶1到約50∶1；更優(yōu)選地從5∶1到約20∶1；最優(yōu)選地從約10∶1到約15∶1。
用本石洗組合物進(jìn)行石洗過程中的反應(yīng)溫度由兩個競爭因素支配。第一，較高的溫度通常相當(dāng)于反應(yīng)動力學(xué)增強(qiáng)，即更快的反應(yīng)，與較低反應(yīng)溫度下所需的反應(yīng)時間相比它容許較少的反應(yīng)時間。因此，反應(yīng)溫度通常是至少約10℃和更高。第二，纖維素酶是當(dāng)超過給定反應(yīng)溫度時則失去活性的蛋白質(zhì)，此溫度依賴于所用纖維素酶的性質(zhì)。因而，如果容許反應(yīng)溫度太高，纖維素酶變性的結(jié)果導(dǎo)致喪失了纖維素分解活性。因為E5顯示了出色的熱穩(wěn)定性，所以石洗溫度可以相當(dāng)高，即必要時可超過80℃。然而，本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)溫度通常是35℃到65℃的范圍內(nèi)，這也適合本發(fā)明的纖維素酶。
反應(yīng)時間依賴于進(jìn)行石洗的特定條件。例如，pH、溫度和纖維素酶的濃度都將影響最佳反應(yīng)時間。通常，反應(yīng)時間是從約5分鐘到約5小時，優(yōu)選從約10分鐘到約3小時，更優(yōu)選從約20分鐘到約1小時。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案，上述纖維素酶組合物可被用于去污劑組合物中。根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物可用作預(yù)洗組合物、預(yù)浸組合物或用于常規(guī)清洗或漂洗循環(huán)中的清潔。優(yōu)選地，本發(fā)明的去污劑組合物包含有效量的纖維素酶、表面活性劑以及任選地包括下述的其它成分。
本發(fā)明去污劑組合物中采用的纖維素酶的有效量，是足夠賦予含纖維素的織物所需效果的量，所需效果已知由纖維素酶產(chǎn)生，例如為去球、軟化、抗起球、去除表面纖維和清潔。優(yōu)選地，去污劑組合物中采用的纖維素酶濃度為去污劑的約10ppm到約20,000ppm。
優(yōu)選地選擇去污劑中采用的纖維素酶的濃度，是使其在清洗介質(zhì)中稀釋時，纖維素酶濃度在約0.01到約1000ppm總蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)，優(yōu)選從約0.02ppm到約500ppm，最優(yōu)選從約0.5ppm到約250ppm總蛋白質(zhì)。去污劑組合物中采用的纖維素酶的量將依賴于去污劑加入到水中以形成清洗液的稀釋程度。
本發(fā)明的去污劑組合物可采用本領(lǐng)域認(rèn)可的任何形式，例如，液態(tài)稀釋劑，顆粒劑、乳液、凝膠或糊劑。這樣的形式為熟練技術(shù)人員周知。采用固態(tài)去污劑組合物時，纖維素酶優(yōu)選配制成顆粒劑。優(yōu)選地，配制此顆粒劑以使其另外含有纖維素酶保護(hù)劑。參見，例如，美國序列號07/642,669(在1991年1月17日提交，代理卷號010055-073，題目為“含有酶和酶保護(hù)劑的顆粒劑以及含有此顆粒劑的去污劑組合物”)，在此完整引入該申請作為參考。同樣地，顆粒劑可以如此進(jìn)行配制以使其含有能降低顆粒劑在清洗介質(zhì)中的溶解速率的物質(zhì)。美國專利號5,254,283公開了這樣的物質(zhì)和顆粒劑，在此完整引入作為參考。
本發(fā)明的去污劑組合物采用了表面激活劑，即表面活性劑，包括用于去污劑組合物中的眾所周知的陰離子、非離子和兩性表面活性劑。
用于本發(fā)明的去污劑中的合適的陰離子表面活性劑包括線性或分支的烷基苯磺酸鹽；含線性或分支烷基基團(tuán)或鏈烯基基團(tuán)的烷基或鏈烯基醚硫酸鹽；烷基或鏈烯基硫酸鹽；烯屬磺酸鹽；和烷基磺酸鹽等。陰離子的合適的配對離子包括堿性金屬離子例如鈉和鉀；堿土金屬離子例如鈣和鎂；銨離子；以及含1到3個碳原子數(shù)為2或3的烷醇基團(tuán)的鏈烷醇胺。兩性表面活性劑包括季銨鹽磺酸酯和甜菜堿型兩性表面活性劑。這樣的兩性表面活性劑在同一分子中有正和負(fù)電荷基團(tuán)。非離子表面活性劑通常包含聚氧乙烯醚，以及高級脂肪酸烷醇酰胺或其氧化烯加成化合物、脂肪酸甘油單酯等。在英國專利號2094826A中公開了本發(fā)明中適用的表面活性劑，此處引入公開內(nèi)容作為參考。也可以采用這樣的表面活性劑的混合物。表面活性劑或表面活性劑的混合物通常用于本發(fā)明的去污劑組合物中，其用量從占總?cè)ノ蹌┙M合物的約1個重量百分比到約95個重量百分比，優(yōu)選從占總?cè)ノ蹌┙M合物的約5個重量百分比到約45個重量百分比。除纖維素酶組合物和表面活性劑之外，本發(fā)明的去污劑組合物可以任選地含有一種或多種下列組分除纖維素酶外的水解酶合適的水解酶包括作用于酯鍵的羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸單酯水解酶和磷酸二酯水解酶；作用于糖基化合物的葡萄糖苷水解酶；水解N-糖基化合物的酶；作用于酯鍵的硫酯水解酶；以及作用于肽鍵的α-氨酰肽水解酶、肽酰基氨基酸水解酶、?；被崴饷浮⒍乃饷负碗孽；乃饷浮Ｋ鼈冎袃?yōu)選的有羧酸酯水解酶、葡萄糖苷水解酶和肽酰基肽水解酶。合適的水解酶包括(1)屬于肽?；乃饷傅牡鞍酌咐缥傅鞍酌?、胃蛋白酶B、腎素、胰蛋白酶、糜蛋白酶A、糜蛋白酶B、彈性蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶C、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、無花果蛋白酶、凝血酶、纖維蛋白溶酶、腎素、枯草桿菌蛋白酶、曲霉菌肽酶A、膠原酶、梭菌肽酶B、激肽釋放酶、胃泌素、組織蛋白酶D、菠蘿蛋白酶、角蛋白酶、糜蛋白酶C、胃蛋白酶C、曲霉菌肽酶B、尿激酶、羧肽酶A和B以及氨肽酶；(2)葡萄糖苷水解酶(從此組中排除了作為必需成分的纖維素酶)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、溶菌酶、果膠酶、殼多糖酶和葡聚糖酶。它們中優(yōu)選的是α-淀粉酶和β-淀粉酶。它們在酸性至中性體系中能發(fā)揮作用，但是獲自細(xì)菌的一種水解酶在堿性體系中顯示了高活性；(3)羧酸酯水解酶包括羧酸酯酶、脂肪酶、果膠酯酶和葉綠素酶。它們中特別有效的是脂肪酶。
根據(jù)目的所要求的盡可能將除纖維素酶以外的水解酶引入去污劑組合物中。以純化蛋白質(zhì)而言，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選的引入量為0.001到5個重量百分比，更優(yōu)選為0.02到3個重量百分比。此酶應(yīng)當(dāng)以由粗品酶單獨(dú)制成的或其與去污劑組合物中的其它組分共同制成的顆粒的形式被使用。粗品酶顆粒以純化酶占顆粒中0.001到50的重量百分比這樣的量被使用。顆粒以0.002到20的重量百分比的量被使用，優(yōu)選為0.1到10的重量百分比。和應(yīng)用纖維素酶一樣，這些顆?？梢匀绱诉M(jìn)行配制以使其含有酶保護(hù)劑和溶解延緩劑物質(zhì)。陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽該陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽包括飽和或不飽和脂肪酸鹽、烷基或鏈烯基醚羧酸鹽、磺基脂肪酸鹽或酯、氨基酸型表面活性劑、磷酸酯表面活性劑、包括含3到4個烷基取代基和被最多1個苯基取代的烷基取代基的季銨鹽。在英國專利號2094826A中公開了合適的陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽，在此引入其公開內(nèi)容作為參考。組合物可含有從約1到約20的重量百分比的該陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽。助洗劑A．二價螯合劑此組合物可含有從約0到約50的重量百分比的一種或多種助洗劑組分，此組分選自下列化合物的堿性金屬鹽和烷醇胺鹽磷酸、膦酸、膦酰羧酸鹽、氨基酸鹽、氨基多乙酸鹽高分子電解質(zhì)、非解離聚合物、二羧酸鹽和硅鋁酸鹽。在英國專利申請?zhí)?094826A中公開了合適的二價螯合劑，在此引入其公開內(nèi)容作為參考。B．堿性或無機(jī)電解質(zhì)此組合物可含有從約1到約50重量百分比的，優(yōu)選從約5到約30重量百分比的，基于一或多種堿性金屬鹽成分的下列堿性或無機(jī)電解質(zhì)化合物硅酸鹽、碳酸鹽和硫酸鹽以及有機(jī)堿，例如三乙醇胺、二乙醇胺、單乙醇胺和三異丙醇胺?？乖俪练e劑此組合物可含有從約0.1到約5重量百分比的一或多種下列抗再沉淀劑化合物聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纖維素。
在它們之中，羧甲基纖維素和/或聚乙二醇與本發(fā)明的纖維素酶組合物合用可提供一種特別有用的去垢組合物。漂白劑本發(fā)明的纖維素酶與漂白劑例如單過硫酸鉀、過碳酸鈉、過硼酸鈉、硫酸鈉/過氧化氫加成化合物和氯化鈉/過氧化氫加成化合物或/和光敏感漂白劑例如磺化酞菁染料的鋅鹽或鋁鹽一起使用，進(jìn)一步提高去污效果。類似的，可使用如EP684304中描述的漂白劑和漂白催化劑。上藍(lán)劑和熒光染料如果需要，可在組合物中引入各種上藍(lán)劑和熒光染料。在英國專利申請?zhí)?094826A中公開了合適的上藍(lán)劑和熒光染料，此處引入其公開內(nèi)容作為參考。結(jié)塊抑制劑可在粉末去污劑中引入下列結(jié)塊抑制劑對甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、乙酸鹽、硫代琥珀酸鹽、滑石粉、磨成微細(xì)粉末的二氧化硅、無定形二氧化硅、粘土、硅酸鈣(例如Johns Manville公司的MicroCell)、碳酸鈣和氧化鎂。抑制纖維素酶活性因素的掩蔽劑本發(fā)明的纖維素酶組合物在一些有銅、鋅、鉻、汞、鉛、鎂或銀離子或它們的化合物存在的情況下失活。多種金屬絡(luò)合劑和金屬沉淀劑有效地抵抗這些抑制劑。它們包括，例如上面關(guān)于可選擇性添加物項中列出的二價金屬離子螯合劑以及硅酸鎂和硫酸鎂。
纖維二糖、葡萄糖和葡萄糖酸內(nèi)酯有時起抑制劑作用。優(yōu)選地盡可能避免這些糖類與纖維素酶共存。萬一共存不可避免時，必須通過例如包被它們的方法來避免糖類與纖維素酶直接接觸。
在一些情況下長鏈脂肪酸鹽和陽離子表面活性劑起抑制劑作用。然而，如果通過一些方法例如制錠或包被來阻止它們的直接接觸，那么這些物質(zhì)與纖維素酶的共存是允許的。
如果需要，在本發(fā)明中可采用上述掩蔽劑和方法。纖維素酶激活劑激活劑依賴?yán)w維素酶不同而不同。在有蛋白質(zhì)、鈷及其鹽、鎂及其鹽以及鈣及其鹽、鉀及其鹽、鈉及其鹽或單糖例如甘露糖和木糖存在時，纖維素酶被激活并且它們的去污能力顯著提高。抗氧化劑抗氧化劑包括，例如，叔丁基羥甲苯、4,4’-亞丁基雙(6-叔丁基-3-甲基酚)、2,2’-亞丁基雙(6-叔丁基-4-甲基酚)、單苯乙烯甲酚、二苯乙烯甲酚、單苯乙烯酚、二苯乙烯酚和1,1-雙(4-羥苯基)環(huán)己烷。增溶劑增溶劑包括，例如，低級醇例如乙醇、苯磺酸鹽、低級烷基苯磺酸鹽例如對甲苯磺酸鹽、二元醇例如丙二醇、乙酰苯基磺酸鹽、乙酰胺、吡啶二羧酸酰胺、苯甲酸鹽和尿素。
本發(fā)明的去污劑組合物能被使用于從酸到堿性pH的寬pH范圍內(nèi)。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的去污劑組合物能被使用于有從pH5以上到不超過約pH12的微酸、中性或堿性去污劑清洗介質(zhì)中。
除上面的成分以外，如果需要，香料、緩沖液、防腐劑、染料等能和本發(fā)明的去污劑組合物共用。這些組分常規(guī)地采用本領(lǐng)域中在此以前使用的量。
當(dāng)本發(fā)明中使用的去污劑基質(zhì)為粉劑形式，它可以是通過任何已知的制備方法包括噴霧干燥法和制粒法來制備的。優(yōu)選尤其通過噴霧干燥法、聚集法、干混合法或非塔路徑法得到的去污劑基質(zhì)。至于制備條件，通過噴霧干燥法得到的去污劑基質(zhì)沒有限制。通過噴霧干燥法得到的去污劑基質(zhì)是通過將耐熱成分例如表面活性劑和助洗劑的水漿噴進(jìn)熱空間而得到的中空顆粒。噴霧干燥后，可加入香料、酶、漂白劑、有機(jī)堿助洗劑。在基質(zhì)制備后，各種成分也可與通過例如噴霧干燥制粒法或聚集法得到的高密度的顆粒狀去污劑基質(zhì)共同加入。
當(dāng)去污劑基質(zhì)為液體時，它可以是勻漿溶液或非勻漿分散劑。為了去除去污劑中纖維素酶對羧甲基纖維素的分解作用，期望羧甲基纖維素在引入組合物中之前被制成顆粒或被包被。
本發(fā)明的去污劑組合物在工業(yè)和家庭使用時可與含纖維素的織物，例如弄臟的織物在這些環(huán)境中常規(guī)采用的溫度、反應(yīng)時間和液體比率下共同溫育。溫育條件，即用根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物處理含纖維素的織物的有效條件，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易確定。因此，用該去污劑進(jìn)行處理的合適的有效條件相當(dāng)于使用類似的含已知纖維素酶的去污劑組合物時的那些條件。
根據(jù)本發(fā)明的去污劑還可在中間pH下于合適的溶液中制成預(yù)洗劑，其存在足夠的活性以提供所需的改善效果如軟化、去球、阻止起球、去除表面纖維或清潔。當(dāng)去污劑組合物是作為液體、噴霧、凝膠或糊劑組合物的預(yù)浸(例如，預(yù)洗或預(yù)處理)組合物時，通常采用占預(yù)浸或預(yù)處理組合物總重量的從約0.0001到約1重量百分比之截短的纖維素酶。在這樣的組合物中，可選擇性地采用表面活性劑并且當(dāng)其被采用時，通常以占預(yù)浸劑總重量的從約0.005到約20的重量百分比的濃度存在。組分的其它部分包括以其常規(guī)濃度用于預(yù)浸劑中的常規(guī)組分，即稀釋劑、緩沖液、其它酶(蛋白酶)等。
考慮后認(rèn)為，此處描述的含截短的纖維素酶的組合物能作為單獨(dú)使用的適合于使褪色織物顏色復(fù)原的組合物用于家庭用途(參見，例如，美國專利號4,738,682，此處完整引入作為參考)以及用于斑點去除劑和用于去球和抗起球(阻止起球)。
根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶可以特別有效地用于飼料添加劑和紙漿和紙的加工。例如，PCT公開號95/16360和芬蘭授權(quán)專利號87372中分別描述了這些另外的工業(yè)應(yīng)用。
為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明及其優(yōu)點，給出以下具體實施例以闡明本發(fā)明，并且任何情況下其都不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1E5的制備與純化按照McGinnis等人，生物技術(shù)(Biotechnology)32卷，8157-8161頁(1993)制備的克隆被用于在淺青紫鏈霉菌中表達(dá)E5，并且應(yīng)當(dāng)在適合于此質(zhì)粒表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后按照Walker等人，生物技術(shù)，生物工程(Biotechnol.Bioeng)卷40,1019-1026頁(1992)與Irwin等人，生物技術(shù)與生物工程(Biotechnology and.Bioengineering)，出處同前，卷42,1002-1013頁(1993)中敘述的方法從所獲發(fā)酵上清液中純化E5酶。或者，E5糊狀物可溶于緩慢旋轉(zhuǎn)的pH7的MOPS中并制得保存的上清液(粗品E5)。對松散的粒狀沉淀進(jìn)行再次重新溶解和旋轉(zhuǎn)，總回收率約為75％。上清液在冷室中攪拌的條件下用0.65M硫酸銨沉淀后進(jìn)行離心(用SS-34轉(zhuǎn)子14000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘)。粒狀沉淀重新溶解于含0.25M硫酸銨、5mM KP,pH6.0的緩沖液中。為消除泡敵(使過濾更容易進(jìn)行)，溶液被加熱到室溫進(jìn)行離心(用SS-34轉(zhuǎn)子15000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘)。從頂部除去白色膜，混合物用可拆卸型過濾裝置在真空下通過0.45微米濾膜進(jìn)行過濾。用0.25M硫酸銨、5mM KP,pH6來預(yù)平衡苯基瓊脂糖凝膠柱。經(jīng)過濾的E5上柱，然后用平衡緩沖液洗柱直到流出液吸收值降回低水平。然后用一倍體積0.125M硫酸銨、5mM KP,pH6來洗柱(觀察到低吸收值)。用5mM KP,pH6洗脫E5，收集小級分。吸收值降低到背景后，再用水洗脫柱并收集級分。從可能感興趣的各級分中取出少量樣品于旋轉(zhuǎn)柱中濃縮，水洗，濃縮3-4倍。而后用IEF凝膠分析這些級分，最純的級分是接近于5mM KP洗脫末端和水洗脫開始的那些。無論用小柱(25ml)還是大柱(450ml)，從上述步驟獲得的最純的級分合并后產(chǎn)生的活性為總活性的30％。這些級分或者在銀染IEF上只有一條帶，或者還包括有兩條小帶。
活性水平的分析按如下進(jìn)行以足夠提供終溶液所需量的酶的濃度加入5到20μl合適的酶溶液。加入250μl RBB-CMC(RemazolBrilliant Blue R-羧甲基纖維素，可以從Mega Zyme,North Rocks，澳大利亞以商業(yè)途徑獲得)重量百分比為2的50mm,pH5.5的乙酸鈉緩沖液。渦旋振蕩且在40℃下溫育30分鐘。冰浴中冷卻5-10分鐘。加入1000μl含0.3M乙酸鈉和0.02M乙酸鋅的80％乙醇。渦旋并放置5-10分鐘。離心并加上清液于比色杯中，在590nm測各杯中溶液的光密度。高水平的光密度相應(yīng)于較高的酶活性。用BCA方法以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)按照供應(yīng)商指南(Pierce,BCA Protein Assay Reagent,Prod.No.23225)進(jìn)行蛋白質(zhì)測定。經(jīng)測定粗品E5(再次溶解的糊狀物)的比活性為約1.6單位/毫克蛋白質(zhì)，純化的E5的比活性約為11單位/毫克。實施例2蛋白酶處理E5以得到截短的E5按照實施例1溶解和純化的完整的E5，被用幾種蛋白酶處理以產(chǎn)生截短的E5。五種均具有不同催化方式的蛋白酶，Alcalase(可獲自于Novo Nordisk，丹麥)，Purafect(可獲自于Genencor International,Inc.)和三種不同的變體細(xì)菌蛋白酶(BA、B1和B2)，可用于產(chǎn)生一系列不同的切割樣式。0.5或5mg/ml濃度的E5與2.5mg/ml的蛋白酶溫育，溫育在溫度20、37和50℃,pH5(NaOAc緩沖液)、pH7(TES緩沖液)和pH9(甘氨酸緩沖液)中進(jìn)行。加入終濃度為15gpg(克每加侖)的Ca2+，在時間為0、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時和24小時時取出等份樣品迅速冷凍。按照實施例1所述用IEF凝膠分析蛋白酶處理的樣品(考馬斯亮藍(lán)染色)并測對RBB-CMC的活性。
在所有這些溫育步驟中，當(dāng)用IEF分析時出現(xiàn)了兩條等電點略高于E5的新帶。用RBB-CMC覆蓋其上證明至少其中之一總具有活性。Alcalase能在最短時間作用于E5產(chǎn)生條帶，因而對E5具有最強(qiáng)的效果。例如，給定濃度為1∶5的E5∶Alcalase(按毫克蛋白/毫升計算)，在37℃和pH7和pH9的條件下，在30分鐘后形成IEF凝膠上所有的三條帶，8小時后最高等電點的條帶占優(yōu)勢。其它蛋白酶攻擊效果較弱。Purafect在pH5,37℃下對E5只有微弱的活性。在pH7和pH9時，至少需要溫育2小時才能出現(xiàn)明顯的高等電點的條帶。BA和B1對E5表現(xiàn)的效果弱于Alcalase和Purafect的對E5的效果，至少需要溫育4小時才能出現(xiàn)明顯的高等電點的條帶。BA酶解E5產(chǎn)生其它條帶，但也可能進(jìn)一步降解E5(條帶變得很弱)。在37℃和pH9條件下用Purafect、B2和Alcalase按照1∶1的E5∶蛋白酶(按毫克蛋白/毫升計算)進(jìn)行酶解。依然是Alcalase酶解E5最快，8小時后產(chǎn)生一條帶；用Purafect和B2時，新的條帶都在30小時后出現(xiàn)，說明這些蛋白酶酶解E5要慢于Alcalase。
E5對Purafect隨時間的穩(wěn)定性見圖8。圖8還顯示出，在50℃,pH7條件下超過25小時后，E5還保留有對RBB-CMC的大部分原有活性。此外，其它處理E5混合物的每一種蛋白酶都保留有至少50％的活性。實施例3E5的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、保存穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性E5的pH范圍通過在70℃將粗品E5的各等份與RBB-CMC溫育30分鐘進(jìn)行測定。從pH4-9用檸檬酸-磷酸緩沖液，pH9-11用甘氨酸緩沖液。通過測量620nm的吸收值測定活性，結(jié)果見圖1。如圖1所示，E5對RBB-CMC的最適pH約為6。
粗品E5的各等份在pH5.5 0.05M乙酸鈉緩沖液中與RBB-CMC在40℃至80℃之間的不同溫度下進(jìn)行溫育，然后通過測量590nm的吸收值測定活性，結(jié)果見圖2。如圖2所示，E5最適溫度范圍為70-75℃。
延長的時間區(qū)段后E5的pH穩(wěn)定性通過在稀釋濃度(20ppm)下，在20℃、37℃和50℃和在pH6(50mM MOPS緩沖液)、pH8(50mMMOPS緩沖液)和pH10(50mM甘氨酸緩沖液)時進(jìn)行測定。經(jīng)過九天的過程，取出等份樣品并按照實施例1所述用RBB-CMC活性測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3-5。如圖3-5所示，在37℃和50℃及pH6時，九天后至少剩余60-70％的活性。pH8時，九天后沒有任何一種溫育物的活性損失超過20％，在pH10時，在20℃和37℃下活性無明顯損失，而在50℃溫育九天后活性損失50％。從圖3-5的結(jié)果可以看出，E5在每一檢測延長的時間區(qū)段條件下都很穩(wěn)定。
E5的氧化穩(wěn)定性通過將15ppm粗品E5與90至900ppm過硼酸鹽在MOPS緩沖液(pH7)中40℃預(yù)溫育進(jìn)行測定。在30分鐘的時間區(qū)段內(nèi)取出等份的樣品并按照實施例1用RBB-CMC檢測活性。與任何一種溫育物中的對照相比，都沒有可檢測到的活性損失(圖6)。相對比，來源于Trichoderma longibrachiatum的EGⅢ在pH5.5及50℃下被約500ppm過硼酸鹽+170ppm TAED完全失活。
過硼酸鹽存在下E5的活性也可以用耐洗牢度試驗儀通過表面纖維去除實驗來測定。通過將粗品纖維素酶在60℃,pH9與棉樣布接觸一小時來進(jìn)行此測定。結(jié)果表明用過硼酸鹽可能會有少量的活性損失，但這不依賴于過硼酸鹽的濃度。即使與900ppm的過硼酸鹽溫育也表現(xiàn)出很好的表面纖維去除效果。作為對照的沒有酶的900ppm過硼酸鹽表現(xiàn)了較弱的表面纖維去除效果。實施例4不同緩沖液對E5活性的效果在具有不同pH的不同緩沖液中將E5與RBB-CMC溫育來測定每一種緩沖液對活性的效果。每一種緩沖液以20、100和200mM進(jìn)行檢測。在pH5時用檸檬酸鹽、琥珀酸鹽及乙酸鈉；在pH7時用磷酸鹽、MOPS及TES；在pH9時用硼酸鹽及CHES。含有E5的緩沖液與RBB-CMC的溶液在40℃溫育30分鐘，然后按照實施例1所述分析纖維素酶的活性。在每一種緩沖液條件下活性都標(biāo)準(zhǔn)化到20mM緩沖液濃度。如下面表1所示，證明E5對所用的緩沖液或濃度相對不敏感。
表1pH5的活性緩沖液濃度，mM 乙酸鈉檸檬酸鹽琥珀酸鹽20 100100 10010084 87 9510078 65 88pH7的活性緩沖液濃度，mM MOPS 磷酸鉀 TES20 100100 100100127118 12020012983 117pH9的活性緩沖液濃度，mM 硼酸鹽 CHES20 100100100100113200130129實施例5E5和蛋白酶處理過的E5的表面纖維去除作用在60℃用400ml pH6、pH7.5、pH8.5和pH9.5緩沖液中的100、300、500和1000RBB-CMC單位來檢測E5。觀察到一個劑量反應(yīng)，在500或1000單位時都具有很好的表面纖維去除(SFR)活性。E5在一個至少從約pH6.0至pH9.5寬的范圍內(nèi)具有最佳活性。這些結(jié)果概述于圖7。如圖7所示，E5與不溶性底物的pH范圍明顯地不同于圖1中所示的E5與RBB-CMC的pH范圍。
用E5進(jìn)行兩組耐洗牢度試驗，所有試驗均在耐洗牢度試驗儀中含350單位的纖維素酶。首先，在加入耐洗牢度試驗儀之前E5先與蛋白酶預(yù)溫育。所選的兩種代表性蛋白酶為Purafect和Alcalase。對于預(yù)溫育，將40mg蛋白酶(1000ppm，在耐洗牢度試驗儀中稀釋后為100ppm)在37℃及pH9(甘氨酸緩沖液)時與纖維素酶及15ppm的鈣放置20小時，申請者已經(jīng)按照足以將E5切成截短的E5蛋白建立了所用的條件。用不含蛋白酶進(jìn)行預(yù)溫育的E5制備一種對照，并且單獨(dú)用緩沖液制備第二種對照(不加酶)。在60℃,pH9(甘氨酸緩沖液)下用預(yù)溫育的混合物對棉樣布進(jìn)行1小時的耐洗牢度試驗，然后用衣物干燥機(jī)干燥布料(jeans)，并讓一組4名評估者評定等級。表面纖維去除的等級范圍從1(表面絨毛最多)至5(表面絨毛最少)，結(jié)果見表2。如表2所示，與不含蛋白酶溫育的E5相比，與兩種蛋白酶的任一種預(yù)溫育的E5樣品未表現(xiàn)出明顯的表面纖維去除活性的降低。
表2
在第二組耐洗牢度試驗中，E5樣品不進(jìn)行預(yù)處理，但與1、10或50ppm的Purafect或Alcalase加入到耐洗牢度實驗儀中。無蛋白酶的E5、無蛋白酶的EGⅡ(Trichoderma longibrachiatum)、緩沖液，以及單獨(dú)的Alcalase或Purafect作為實驗對照提供了可比較的結(jié)果，結(jié)果見表3。如表3所示，與無蛋白酶的E5相比，E5和蛋白酶處理的樣布的評估定級僅表現(xiàn)出很少的表面纖維去除活性降低。
表3
如上所表明的，E5被蛋白酶酶解得到的截短的蛋白，其對RBB-CMC(見圖8)和棉表面纖維都具有很好的活性。此結(jié)果在耐洗牢度試驗儀實驗中尤其明顯，該實驗表明即使在與樣品進(jìn)行的1小時溫育中存在高水平的蛋白酶，E5依然有活性。實施例6用E5和截短的E5進(jìn)行的粗斜紋棉布磨損實驗用粗品E5在粗斜紋棉布上測試磨損情況以確定E5在石洗應(yīng)用中的效果。石洗實驗在Unimac中進(jìn)行。將酶(與Alcalase溫育得到的13500RBB-CMC單位的E5或截短的E5)加入到含有20mM MOPS、9.5gTriton X-100、pH7.0，以及八個預(yù)先脫漿的粗斜紋棉布牛仔褲褲腿的溶液中，溫度為60℃。60分鐘后取出4個牛仔褲樣品在冷水中漂洗。30分鐘后放回Unimac。此時，在70℃用50g去污劑進(jìn)行洗后清潔。然后用衣物干燥機(jī)干燥牛仔布料并讓一組評估者評定等級。等級范圍是一組磨損程度從1(無磨損)到10(磨損非常多)的粗斜紋棉布樣布。
表4
表5
從表4和表5可以看出，E5在經(jīng)過60和90分鐘后都具有出色的磨損效果。更令人驚奇的是，在此實驗中，截短的E5的磨損效果沒有降低。實施例7同時脫漿和漂白用12種大小經(jīng)測定的牛仔布來證實E5在同時進(jìn)行脫漿和漂白過程中的效果。這些牛仔布共同放置于含有最終緩沖液濃度為40mM的MOPS,pH7以及還含有10g Triton X-100的溶液中。在其中加入14000單位的粗品E5和5ml地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的α-淀粉酶，65℃以36轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)。30分鐘后取出一半牛仔布樣品用冷水漂洗，其余的繼續(xù)作用直到60分鐘，不進(jìn)行洗后清潔。干燥后，牛仔布讓一組評估者評定等級。等級范圍是一組磨損程度從l(無磨損)到10(磨損非常多)的粗斜紋棉布樣布。
表6
令人驚奇的是，磨損的程度和樣式類似于用E5石洗之前先脫漿的牛仔布樣品獲得的結(jié)果(參見，如實施例6)。實施例8E5在去污劑中的效果E5對棉樣布的表面纖維去除作用的評價在Terg-O-Tometer中進(jìn)行，所用條件包括溫度100°F或140℃，以125轉(zhuǎn)/分的攪拌速度水中旋轉(zhuǎn)2.5小時，150ppm的水硬度(CaCO3)。每個測試杯中加8個樣布(4個針織物，4個機(jī)織物)。測試兩種織物獲自于Burling Mills北卡羅萊納州的棉布雙羅紋針織物，和獲自于Testfabrics,Inc.新澤西州的400型機(jī)織棉布料。
所有測試均采用商業(yè)途徑獲得的購于當(dāng)?shù)爻壥袌龅腃heer“free”液體衣服去污劑。95℃加熱此液體去污劑30分鐘以破壞纖維素酶的活性(HT Cheer)，然后按照5mg/l的濃度加入E5。同樣的條件應(yīng)用于作為對比實驗的不加熱處理的Cheer和加熱處理的無E5的Cheer中。
讓給出表面外觀等級得分的一組評估者比較處理的樣布和一組標(biāo)準(zhǔn)等級的樣布。標(biāo)準(zhǔn)等級的樣布范圍從0=(表面絨毛及起球最多)到7=(無表面絨毛及起球)。結(jié)果經(jīng)過平均顯示于圖9和10。實施例9E5在液體去污劑中的穩(wěn)定性測試E5在液體去污劑中的穩(wěn)定性。E5或獲自于Trichodermalongibrachiatum的經(jīng)分離的纖維素酶分別以1300mg/l和695mg/l的濃度在溫度為38℃時與Wisk去污劑溫育。在不同時間點取出樣品，按照M.Lever，生物化學(xué)分析(Anal.Biochem)，卷47,273-279頁(1979)所述用PAHBAH方法測定殘留纖維素酶活性(測定條件包括12mg/mlCMC底物，12mM MOPS緩沖液，40℃溫育30分鐘)。
結(jié)果見圖11。如圖11所示，溫育35天后E5的殘留活性基本未變，而在少于15天內(nèi)獲自于T.longibrachiatum的纖維素酶的殘留活性降到接近于零。
當(dāng)然可以理解的是，上述優(yōu)選實施方案能進(jìn)行范圍很廣的改變和修飾。因而試圖將上述詳細(xì)描述在后面的權(quán)利說明書的內(nèi)容中能被理解，包括用于限定本發(fā)明范圍的各條款。
權(quán)利要求
1．一種處理纖維素類材料的方法，其包含用獲自褐色高溫單孢菌的相應(yīng)于E5、截短的E5或其衍生物的纖維素酶接觸該材料。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該截短的E5通過蛋白酶解切割獲得。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該截短的E5通過基因工程技術(shù)獲得。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該纖維素類材料包括含纖維素的織物。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中該含纖維素的織物經(jīng)過處理以發(fā)揮石洗的效果。
6．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中該含纖維素的織物經(jīng)過處理以改善該織物的外觀和/或手感。
7．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中該纖維素酶摻入到一種去污劑組合物中。
8．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中該含纖維素的織物包含褪色的染色織物，并且所述改善包含通過恢復(fù)其上的顏色來改善該褪色的染色織物的外觀。
9．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述改善包含使該織物更柔軟和光滑。
10．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該纖維素類材料包含木紙漿。
11．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該纖維素類材料包含動物飼料或谷物。
12．一種石洗組合物，其包含選自E5、截短的E5或其衍生物的纖維素酶。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中還包含一種表面活性劑。
14．根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中該組合物是一種濃縮物。
15．一種去污劑組合物，其包含選自E5、截短的E5或其衍生物的纖維素酶。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的去污劑組合物，其中該纖維素酶以至少10ppm的濃度存在。
17．一種飼料添加劑，其包含E5、截短的E5或其衍生物。
18．根據(jù)權(quán)利要求12或15的組合物，其中該截短的E5與E5的不同之處在于，其具有E5氨基酸殘基1-120中的任意片段的缺失。
19．根據(jù)權(quán)利要求15的去污劑組合物，其中該去污劑為液體。
全文摘要
公開了一種處理纖維素類材料的方法,其包括用獲自褐色高溫單孢菌的相應(yīng)于E5或其衍生物的纖維素酶與纖維素類材料接觸。尤其優(yōu)選的方法包括棉織物的石洗和去污劑清潔,紙類產(chǎn)品的生產(chǎn),作為動物飼料的添加劑以及用于食物、淀粉、酒精和糖的生產(chǎn)。
文檔編號D06P5/02GK1237200SQ97199187
公開日1999年12月1日 申請日期1997年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月25日
發(fā)明者K·A·克拉克森, B·史萬森, D·溫尼茨基 申請人:金克克國際有限公司