專利名稱：一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米纖維膜的制備及應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法。
背景技術(shù)：
糖與蛋白質(zhì)，脂類和核酸一樣，是構(gòu)成生物體的重要成分。在細(xì)胞的構(gòu)建，細(xì)胞的生物合成和細(xì)胞生命活動的調(diào)控中，糖均扮演著重要的角色。廣泛存在的糖綴合物，包括糖蛋白，蛋白聚糖和糖脂，參與了蛋白的靶向，細(xì)胞識別一屆抗體-抗原相互作用等重要生理過程。近年來對其結(jié)構(gòu)和功能的研究成了繼DNA和蛋白之后又一重要課題而備受人們的重視。人們嘗試將糖基固定到不同載體表面來模擬糖的各種生物功能，從而深入研究糖與蛋白質(zhì)的親和性相互作用，實(shí)現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的檢測和分離。N-異丙基丙烯酰胺為丙烯酰胺衍生物的單體，由于分鐘內(nèi)有親水性的酰胺基和疏水性的異丙基，其均相聚合物具有較低的臨界溶解溫度(LCST)等良好的特性。由于其聚合物具有在32°C以上呈水不溶性這一特殊的溶解特性，正在開發(fā)用于制造某些感溫性聚合物凝膠的原料。N-異丙基丙烯酰胺用通常的自由基聚合引發(fā)劑容易單獨(dú)聚合，也容易共聚。因此，其成為當(dāng)前熱敏性高分子材料研究的熱點(diǎn)。靜電紡絲是一種利用帶電荷的高分子溶液或熔體在靜電場中流動與變形制備納米到亞微米尺寸聚合物纖維的技術(shù)。相對于一般方法制備的聚合物纖維，靜電紡制備的纖維具有極大的比表面積，以及纖維表面具有小孔等特殊形態(tài)。靜電紡絲還具有簡單、方便、廉價等特點(diǎn)，從而激起了人們對其進(jìn)行深入研究的濃厚興趣。糖基化納米纖維的制備，目前主要有兩種途徑:一是通過含糖不飽和單體聚合合成含糖聚合物，再通過靜電紡絲方法得到，這種方法可以很好的將納米纖維的優(yōu)點(diǎn)和糖基的功能性結(jié)合起來進(jìn)而用于蛋白質(zhì)的分離；二是通過大分子反應(yīng)將糖基固定到納米纖維的表面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，該方法操作簡單、產(chǎn)物易處理且經(jīng)濟(jì)環(huán)保，該納米纖維膜含有豐富的可反應(yīng)親水活性功能基團(tuán)并且具有接近于體溫的相變溫度，提高了材料表面的非特異性吸附并且改善材料表面的生物相容性的同時，在相變特性的基礎(chǔ)上可以有很多潛在的應(yīng)用，如可以通過局部過熱處理方法實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的溫敏控制釋放，也可以制備具有相變的組織工程支架。本發(fā)明的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，包括(I)將摩爾比為1-4:1的壬二酸二乙烯酯與半乳糖溶于無水吡啶，加入堿性蛋白酶，在40-60°C條件下，反應(yīng)3-5天，分離提純，得到半乳糖乙烯脂；其中堿性蛋白酶和壬二酸二乙烯酯與半乳糖的吡啶溶液的質(zhì)量體積比為0.5-1.5g:50-100ml ；
(2)將上述半乳糖乙烯脂中加入N-異丙基丙烯酰胺、引發(fā)劑和溶劑，然后在55-60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)3-8h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物；其中N-異丙基丙烯酰胺與半乳糖乙烯脂的摩爾比為1-50:1，引發(fā)劑占半乳糖乙烯脂和N-異丙基丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.2-2% ；
(3 )將上述半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL加入溶劑中，攪拌，得半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物紡絲液，然后進(jìn)行靜電紡絲，干燥，即得半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜，其中半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL質(zhì)量和占紡絲溶液的質(zhì)量百分比為3wt%-30wt%，半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL的摩爾比為1:1。
所述步驟(I)中反應(yīng)在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為210rpm。
所述步驟(I)中分離提純?yōu)?用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為體積比為17:3:1的乙酸乙酯、甲醇和水，用12顯色。
所述步驟(2)中引發(fā)劑為偶氮二異丁腈AIBN，溶劑為無水乙醇，半乳糖乙烯酯和N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量和的無水乙醇溶液的濃度為2-3mol/L。
所述步驟(2)中聚合反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物經(jīng)3500D透析膜除去沒反應(yīng)的半乳糖乙烯脂。所述步驟(3)中的溶劑為無水乙醇。
所述步驟(3)中半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物中，半乳糖乙烯脂與異丙基丙烯酰胺的摩爾比為5:1，10:1或15:1。
所述步驟(3)中靜電紡絲工藝參數(shù)為:注射器規(guī)格為5ml，針頭內(nèi)徑為0.4 0.7mm,噴出流速0.8 2ml/h，靜電壓10 18kV，接收屏采用鋁箔接地接收，接受距離為10 20cm，采用正交方法(改變某一參數(shù)，固定其他的參數(shù))調(diào)節(jié)紡絲參數(shù)進(jìn)行電紡。
所述步驟(3)中干燥溫度為30_60°C，干燥時間為24 48h。
所述步驟(3)所得的半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化、研究糖類和蛋白質(zhì)特異性吸附機(jī)理。
糖基修飾丙溫敏性納米纖維在蛋白質(zhì)的分離純化中的應(yīng)用。
將糖基修飾丙烯腈基納米纖維膜浸入蛋白質(zhì)混合溶液中，25°C和37°C下震蕩吸附2小時，濾出，清洗。利用糖基與特定蛋白質(zhì)的特異性吸附作用，納米纖維會選擇性的吸附蛋白質(zhì)，用高濃度的糖溶液可以把蛋白質(zhì)從纖維上洗脫下來，從而實(shí)現(xiàn)混合液中蛋白質(zhì)的分離。
糖是生物分子中的一種，廣泛存在于生物體內(nèi)，是一類多羥基化合物，具有極強(qiáng)的親水性，因此，把糖引入材料的表面，將有效改善材料表面的生物相容性。因此，含糖聚合物經(jīng)常被用來改善材料的親水性及抑制蛋白質(zhì)等物質(zhì)在材料表面的非特異性吸附。
溫敏性含糖共聚物在腫瘤治療中的應(yīng)用。
將溫敏性材料引入含糖物質(zhì)中，可以實(shí)現(xiàn)對材料的溫敏性控制，它與疏水高分子的嵌段共聚物常被用來制備膠束藥物載體，可使共聚物的LCST達(dá)到37°C甚至更高，將其與脂肪族聚酯嵌段共聚后并制備成載藥膠束，結(jié)合局部過熱處理方法可實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的溫敏控制釋放。
本發(fā)明將N-異丙基丙烯酰胺和半乳糖乙烯脂共聚進(jìn)行電紡，獲得直徑和孔徑在納米級半乳糖乙烯脂/丙烯腈共聚物納米纖維膜。這種膜材料含有豐富的可反應(yīng)親水活性功能基團(tuán)，提高了材料表面的非特異性吸附及改善材料表面的生物相容性，具有應(yīng)用其做后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析的潛力，并且具有可控的LCST值，具有實(shí)現(xiàn)藥物的靶向釋放等應(yīng)用潛力。本發(fā)明主要利用溫敏性共聚物納米纖維膜高的比表面積以及優(yōu)良的熱學(xué)相變性能等優(yōu)點(diǎn)，將其作為糖基化的載體材料，摻入表面的生物相容性良好的合成半乳糖乙烯脂，通過調(diào)整溶劑及相關(guān)紡絲條件參數(shù)，成功的實(shí)現(xiàn)了電紡，為新型納米生物活性材料的研發(fā)提供借鑒。有益.效果(I)本發(fā)明采用水相沉淀聚合方法制備了半乳糖乙烯脂均聚物，制備方法操作簡單、產(chǎn)物易處理且經(jīng)濟(jì)環(huán)保；(2)本發(fā)明中N-異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維制備簡單，是一類比表面，高孔隙率的載體材料；(3)本發(fā)明的膜材料含有豐富的可反應(yīng)親水活性功能基團(tuán)并且具有接近于體溫的相變溫度，由于其表面含有特異性的糖基，因此提高了材料表面的糖基和凝集素的特異性吸附性能并改善材料表面的生物相容性，具有應(yīng)用其做后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析的潛力，在相變特性的基礎(chǔ)上可以有很多潛在的應(yīng)用，如可以通過局部過熱處理方法實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的溫敏控制釋放，也可以制備具有相變的組織工程支架；(4)本發(fā)明中糖基化納米纖維用于蛋白質(zhì)的特異性識別，高效，快速，有利于保持生物大分子的活性，并且可以多次重復(fù)使用，易于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為對比例I所得的溫敏性含糖共聚物納米纖維膜的掃描電鏡照片(絲電壓為10kv，接收距離為15cm，噴射流速為1.0ml/h)；圖2為實(shí)施例1所得的溫敏性含糖共聚物納米纖維膜的掃描電鏡照片(絲電壓為10kv，接收距離為15cm，噴射流速為1.0ml/h)；圖3為實(shí)施例2所得的溫敏性含糖共聚物納米纖維膜的掃描電鏡照片(絲電壓為10kv，接收距離為15cm，噴射流速為1.0ml/h)；圖4為實(shí)施例3所得的溫敏性含糖共聚物納米纖維膜的掃描電鏡照片(絲電壓為10kv，接收距離為15cm，噴射流速為1.0ml/h)；圖5為BSA吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6為對比例1，實(shí)施例1-3在a:25°C ;b:37°C條件下的BSA吸附曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例1
( I)將壬二酸二乙烯酯與半乳糖按一定的比例(4:1，摩爾比)溶解在無水吡啶中，利用酶促合成技術(shù)合成半乳糖乙烯脂。反應(yīng)結(jié)束后，粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇和水(17:3:1，v/v/v)，用I2顯色。將上述糖脂放于微量聚合管中，加入一定量的N-異丙基丙烯酰胺(與葡萄糖乙烯脂的摩爾比為7:1)，用偶氮二異丁腈(AIBN)(占半乳糖乙烯脂和N-異丙基丙烯酰胺總質(zhì)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0)作為引發(fā)劑，加入無水乙醇作溶劑(單體濃度為2.5mol/L無水乙醇)，密封，用油泵抽真空后通氮?dú)?，反?fù)多次。將體系置于50 60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)6h。
(2)將一定質(zhì)量的溫敏性半乳糖乙烯脂共聚物和PLCL按照摩爾比為1:1加入無水乙醇中，共聚物中半乳糖脂與NIPAM的摩爾比為5: 1，攪拌數(shù)小時至完全溶解，靜置數(shù)小時使紡絲液中氣泡完全消失，攪拌形成均一紡絲液。
(3)用注射器抽取溫敏性含糖共聚物，固定于靜電紡絲裝置上，控制噴出流速1.0ml/h，靜電壓10kV，接收屏采用鋁箔接地接收，針頭與接收屏的距離為10 20cm，采用正交方法(改變某一參數(shù)，固定其他的參數(shù))調(diào)節(jié)不同紡絲參數(shù)進(jìn)行電紡，得到溫敏性含糖共聚物超細(xì)納米纖維膜；放入真空干燥箱中30 60°C恒溫干燥36h，制成再生納米復(fù)合膜，其電鏡照片如圖2所示。
(4)半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL混紡納米纖維膜對BSA的吸附
在O 100ug/mL范圍內(nèi)繪制BSA溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液分別制備系列濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用Bradford方法，用紫外分光光度計595nm處檢測不同濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。然后以吸光度為縱坐標(biāo)，BSA濃度為橫坐標(biāo)，制的該濃度范圍的BSA吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5。
將實(shí)施例1制備的半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL混紡納米纖維膜先后用PBS緩沖溶液預(yù)處理(20 30min)，以除去膜表面的污染物，取0.5mg待測膜，剪碎后放入試管中，分別加入I IOmL相同濃度的BSA溶液，在25°C和37°C往返水域恒溫振蕩器恒溫24h。待吸附平衡后，取出膜，測定試管中溶液在595nm處的吸收。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，記下該吸光值所對應(yīng)的濃度。根據(jù)濃度的減少，來計算單位質(zhì)量的膜上BSA吸附的量；吸附曲線如圖6。
實(shí)施例2
( I)將壬二酸二乙烯酯與半乳糖按一定的比例(4:1，摩爾比)溶解在無水吡啶中，利用酶促合成技術(shù)合成半乳糖乙烯脂。反應(yīng)結(jié)束后，粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇和水(17:3:1，v/v/v)，用I2顯色。加入一定量的N-異丙基丙烯酰胺(與半乳糖乙烯脂的摩爾比為7:1 )，用偶氮二異丁腈(AIBN)(占半乳糖乙烯脂和N-異丙基丙烯酰胺總質(zhì)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0)作為引發(fā)劑，加入無水乙醇作溶劑(單體濃度為2.5mol/L無水乙醇)，密封，用油泵抽真空后通氮?dú)?，反?fù)多次。將體系置于55 60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)6h。
(2)將一定質(zhì)量的溫敏性半乳糖乙烯脂共聚物和PLCL按照摩爾比為1:1加入無水乙醇中，共聚物中半乳糖脂與NIPAM的摩爾比為10:1，攪拌數(shù)小時至完全溶解，靜置數(shù)小時使紡絲液中氣泡完全消失，攪拌形成均一紡絲液。
(3)用注射器抽取溫敏性含糖共聚物，固定于靜電紡絲裝置上，控制噴出流速1.0ml/h，靜電壓10kV，接收屏采用鋁箔接地接收，針頭與接收屏的距離為10 20cm，采用正交方法(改變某一參數(shù)，固定其他的參數(shù))調(diào)節(jié)不同紡絲參數(shù)進(jìn)行電紡，得直徑為80 250nm的溫敏性含糖共聚物超細(xì)納米纖維膜；放入真空干燥箱中60 80°C恒溫干燥24h，制成再生納米復(fù)合膜，其電鏡照片如圖3所示。(4)半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL混紡納米纖維膜對BSA的吸附在O 100ug/mL范圍內(nèi)繪制BSA溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液分別制備系列濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用Bradford方法，用紫外分光光度計595nm處檢測不同濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。然后以吸光度為縱坐標(biāo)，BSA濃度為橫坐標(biāo)，制的該濃度范圍的BSA吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5。將實(shí)施例1制備的半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL混紡納米纖維膜先后用PBS緩沖溶液預(yù)處理(20 30min)，以除去膜表面的污染物，取0.5mg待測膜，剪碎后放入試管中，分別加入I IOmL相同濃度的BSA溶液，在25°C和37°C往返水域恒溫振蕩器恒溫24h。待吸附平衡后，取出膜，測定試管中溶液在595nm處的吸收。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，記下該吸光值所對應(yīng)的濃度。根據(jù)濃度的減少，來計算單位質(zhì)量的膜上BSA吸附的量；吸附曲線如圖6。實(shí)施例3( I)將壬二酸二乙烯酯與半乳糖按一定的比例(4:1，摩爾比)溶解在無水吡啶中，利用酶促合成技術(shù)合成半乳糖乙烯脂。反應(yīng)結(jié)束后，粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇和水(17:3:1，v/v/v)，用I2顯色。將上述糖脂放于微量聚合管中，加入一定量的N-異丙基丙烯酰胺(與半乳糖乙烯脂的摩爾比為7:1)，用偶氮二異丁腈(AIBN)(占半乳糖乙烯脂和N-異丙基丙烯酰胺總質(zhì)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0)作為引發(fā)劑，加入無水乙醇作溶劑(單體濃度為2.5mol/L無水乙醇)，密封，用油泵抽真空后通氮?dú)猓磸?fù)多次。將體系置于50 60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)6h。(2)將一定質(zhì)量的溫敏性半乳糖乙烯脂共聚物和PLCL按照摩爾比為1:1加入無水乙醇中，共聚物中半乳糖脂與NIPAM的摩爾比為15:1，攪拌數(shù)小時至完全溶解，靜置數(shù)小時使紡絲液中氣泡完全消失，攪拌形成均一紡絲液。(3)用注射器抽取溫敏性含糖共聚物，固定于靜電紡絲裝置上，控制噴出流速
1.0ml/h，靜電壓10kV，接收屏采用鋁箔接地接收，針頭與接收屏的距離為10 20cm，采用正交方法(改變某一參數(shù)，固定其他的參數(shù))調(diào)節(jié)不同紡絲參數(shù)進(jìn)行電紡，得直徑為80 250nm的溫敏性含糖共聚物超細(xì)納米纖維膜；放入真空干燥箱中60 80°C恒溫干燥24h，制成再生納米復(fù)合膜，其電鏡照片如圖4所示。(4)半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL混紡納米纖維膜對BSA的吸附在O 100ug/mL范圍內(nèi)繪制BSA溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液分別制備系列濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用Bradford方法，用紫外分光光度計595nm處檢測不同濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。然后以吸光度為縱坐標(biāo)，BSA濃度為橫坐標(biāo)，制的該濃度范圍的BSA吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5。將實(shí)施例1制備的半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL混紡納米纖維膜先后用PBS緩沖溶液預(yù)處理(20 30min)，以除去膜表面的污染物，取0.5mg待測膜，剪碎后放入試管中，分別加入I IOmL相同濃度的BSA溶液，在25°C和37°C往返水域恒溫振蕩器恒溫24h。待吸附平衡后，取出膜，測定試管中溶液在595nm處的吸收。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，記下該吸光值所對應(yīng)的濃度。根據(jù)濃度的減少，來計算單位質(zhì)量的膜上BSA吸附的量；吸附曲線如圖6。
對比例I
(I)將N-異丙基丙烯酰胺溶解在無水乙醇中，加入偶氮二異丁腈(AIBN)作為引發(fā)齊U(占N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%)，密封，用油泵抽真空后通氮?dú)?，反?fù)多次。將體系置于55 60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚沉淀，去除沒有反應(yīng)的單體。
(2)將一定質(zhì)量的聚-異丙基丙烯酰胺和PLCL按照摩爾比為1:1溶于無水乙醇中。攪拌數(shù)小時至完全溶解，靜置數(shù)小時使紡絲液中氣泡完全消失，攪拌形成均一紡絲液，得到濃度為20g/ml的聚-異丙基丙烯酰胺紡絲溶液。
(3)用注射器抽取聚-異丙基丙烯酰胺紡絲溶液，固定于靜電紡絲裝置上，控制噴出流速1.0 1.5ml/h，靜電壓10 18kV，接收屏采用鋁箔接地接收，針頭與接收屏的距離為10 20cm，采用正交方法(改變某一參數(shù)，固定其他的參數(shù))調(diào)節(jié)不同紡絲參數(shù)進(jìn)行電紡，得直徑為80 250nm的聚-異丙基丙烯酰胺超細(xì)納米纖維膜；放入真空干燥箱中60 80°C恒溫干燥24h，制成再生納米復(fù)合膜，其電鏡照片如圖1所示。
(4)半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL混紡納米纖維膜對BSA的吸附
在O 100ug/mL范圍內(nèi)繪制BSA溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液分別制備系列濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用Bradford方法，用紫外分光光度計595nm處檢測不同濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。然后以吸光度為縱坐標(biāo)，BSA濃度為橫坐標(biāo)，制的該濃度范圍的BSA吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5。
將實(shí)施例1制備的半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL混紡納米纖維膜先后用PBS緩沖溶液預(yù)處理(20 30min)，以除去膜表面的污染物，取0.5mg待測膜，剪碎后放入試管中，分別加入I IOmL相同濃度的BSA溶液，在25°C和37°C往返水域恒溫振蕩器恒溫24h。待吸附平衡后，取出膜，測定試管中溶液在595nm處的吸收。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，記下該吸光值所對應(yīng)的濃度。根據(jù)濃度的減少，來計算單位質(zhì)量的膜上BSA吸附的量；吸附曲線如圖6。
權(quán)利要求
1.一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，包括: (1)將摩爾比為1-4:1的壬二酸二乙烯酯與半乳糖溶于無水吡啶，加入堿性蛋白酶，在40-60°C條件下，反應(yīng)3-5天，分離提純，得到半乳糖乙烯脂；其中堿性蛋白酶和壬二酸二乙烯酯與半乳糖的吡啶溶液的質(zhì)量體積比為0.5-1.5g:50-100ml ； (2)將上述半乳糖乙烯脂中加入N-異丙基丙烯酰胺、引發(fā)劑和溶劑，然后在55-60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)3-8h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物；其中N-異丙基丙烯酰胺與半乳糖乙烯脂的摩爾比為1-50:1，引發(fā)劑占半乳糖乙烯脂和N-異丙基丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.2-2% ； (3)將上述半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL加入溶劑中，攪拌，得半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物紡絲液，然后進(jìn)行靜電紡絲，干燥，即得半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜，其中半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL占紡絲溶液的質(zhì)量百分比為3wt%-30wt%，半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物和PLCL的摩爾比為1:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中反應(yīng)在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為210rpm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中分離提純?yōu)?用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為體積比為17:3:1的乙酸乙酯、甲醇和水，用I2顯色。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中引發(fā)劑為偶氮二異丁腈AIBN，溶劑為無水乙醇，半乳糖乙烯酯和N-異丙基丙烯酰胺質(zhì)量和的無水乙醇溶液的濃度為2-3mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中聚合反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物經(jīng)3500D透析膜除去沒反應(yīng)的半乳糖乙烯脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中的溶劑為無水乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物中，半乳糖乙烯脂與異丙基丙烯酰胺的摩爾比為5:1，10:1或15:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中靜電紡絲工藝參數(shù)為:注射器規(guī)格為5ml，針頭內(nèi)徑為0.4 0.7mm,噴出流速0.8 2ml/h，靜電壓10 18kV，接收屏采用鋁箔接地接收，接受距離為10 20cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中干燥溫度為30-60°C，干燥時間為24 48h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)所得的半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜在蛋白質(zhì)的分離純化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種半乳糖乙烯酯/異丙基丙烯酰胺共聚物納米纖維膜的制備方法，包括將壬二酸二乙烯酯與半乳糖溶于無水吡啶，加入堿性蛋白酶，反應(yīng)，分離提純，得到半乳糖乙烯脂；將上述半乳糖乙烯脂中加入N-異丙基丙烯酰胺、引發(fā)劑和溶劑，然后氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到半乳糖乙烯脂/異丙基丙烯酰胺共聚物；將上述共聚物和PLCL加入溶劑中，攪拌，得紡絲液，然后進(jìn)行靜電紡絲，干燥，即得。該方法操作簡單、產(chǎn)物易處理且經(jīng)濟(jì)環(huán)保，該膜表面固定半乳糖后，用于分離和純化蛋白質(zhì)，并且具有溫敏性質(zhì)，有更多的潛在應(yīng)用。
文檔編號D04H1/4326GK103173934SQ20131012589
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者朱利民, 王蕾, 權(quán)靜 申請人:東華大學(xué)