專利名稱：儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的裝置和方法。
背景技術(shù)：
與長(zhǎng)期儲(chǔ)存蛋白質(zhì)有關(guān)的一個(gè)問題是由于分子降解它們隨時(shí)間推移而失去生物特性?，F(xiàn)有技術(shù)中已開發(fā)了儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的方法以解決該問題。
例如，日本專利申請(qǐng)JP-A-63-092671(Kanebo)介紹了一種儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的方法，絲質(zhì)蛋白或膠原蛋白被溶解在水溶液中。將水解酶加入溶液中，然后加入螯合劑。調(diào)節(jié)混合物的pH值在4.5～7.5，用帶有約1um或更小孔的過濾器過濾該溶液。最后干燥溶液得到平均聚合度在200～600的聚合物。
盡管如此，希望能在蛋白質(zhì)的自然狀態(tài)下儲(chǔ)存它，不需酶處理或用螯合劑處理。
實(shí)際上，已知幾種儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的方法。天然絲是蠶(Bombyx mori)和其它無(wú)脊椎動(dòng)物從儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)濃液或儲(chǔ)料生產(chǎn)的纖細(xì)的有光澤的細(xì)絲。與通常用來(lái)生產(chǎn)材料的合成聚合物相比，天然絲有些優(yōu)點(diǎn)，它們的性能基本不受蛋白質(zhì)漿液在生物腺體中長(zhǎng)期儲(chǔ)存的影響。例如，某些蜘蛛牽引絲的強(qiáng)度和韌性可超過最韌和最強(qiáng)的人造纖維-KevlarTM纖維的。蜘蛛絲還具有高的熱穩(wěn)定性。許多天然絲還生物可降解，不持續(xù)留在環(huán)境中。它們是可回收的，可僅用水作溶劑在低壓低溫工藝下高效生產(chǎn)。天然紡絲工藝是引人注目的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的水溶液被轉(zhuǎn)換成堅(jiān)韌的和高度不溶的材料。蜘蛛和蠶的紡絲工藝已經(jīng)在Vollrath和Knight發(fā)表在Nature(2001，410卷29期，541-548頁(yè))的文章“Liquid crystalline spinning of spider silk”中簡(jiǎn)要描述。作者指出從蜘蛛和蠶儲(chǔ)存它們的蛋白質(zhì)漿液和將漿液紡成強(qiáng)絲的行為中學(xué)習(xí)知識(shí)。文章綜述了蜘蛛天然紡絲的原理包括添加H離子和鉀離子，在紡出漿液向下通過紡絲管時(shí)移去鈉離子。
在Knight和Vollrath寫的文章“Biological Liquid Crystal Elastomers”(Trans.Phil.R.Soc.B.357，155-163(2002))中，作者指出蜘蛛絲蛋白和蠶絲蛋白組合形成韌性絲主要依據(jù)下列事實(shí)絲的主要組織蛋白、蠶中的蠶絲蛋白和蜘蛛中的蜘蛛絲蛋白是重復(fù)雙極性(ABAB型)嵌段共聚物，這里A代表疏水段，B是不太疏水的部分。
發(fā)現(xiàn)蜘蛛絲蛋白和蠶絲蛋白存在兩種狀態(tài)第一是安全儲(chǔ)存狀態(tài)，非常長(zhǎng)的蛋白質(zhì)鏈折疊成短的而不是壓縮的棒狀分子。在第一種狀態(tài)下的蠶絲蛋白和蜘蛛絲蛋白具有主要隨機(jī)纏繞的和/或螺旋的二次結(jié)構(gòu)。第二種狀態(tài)是主要β結(jié)晶二次結(jié)構(gòu)的固體狀態(tài)，該第二狀態(tài)是含有大量直徑約5nm長(zhǎng)納米纖維的納米纖維復(fù)合材料。納米纖維基本平行于韌性絲的長(zhǎng)軸取向，被認(rèn)為含有全部或大多數(shù)β型結(jié)晶體。β型結(jié)晶體的寬度約5nm，平行于納米纖維長(zhǎng)軸方向排列。更小的結(jié)晶體含量少，較多無(wú)規(guī)的材料形成納米纖維之間的基體。
首先，儲(chǔ)存狀態(tài)是亞穩(wěn)態(tài)。認(rèn)為它轉(zhuǎn)變成第二納米纖維態(tài)包括分子的凝聚和二次結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化。認(rèn)為構(gòu)象變化發(fā)生在大多數(shù)重復(fù)雙極性嵌段共聚物中疏水段，它從無(wú)規(guī)線團(tuán)/α螺旋型變?yōu)棣陆Y(jié)晶結(jié)構(gòu)。在自然條件下，至少五個(gè)因素參與凝聚和構(gòu)象變化形成韌性纖維pH值降低、蛋白質(zhì)中添加鉀離子、從蛋白質(zhì)中移去鈉離子、失去水分和使用機(jī)械應(yīng)變形成絲。此外，多羥基分泌物和表面活性劑可促進(jìn)轉(zhuǎn)變。在蜘蛛紡絲管線的最終部分，具有低表面能的細(xì)的徑向脊有助于促進(jìn)蛋白質(zhì)漿液轉(zhuǎn)變成固態(tài)絲。一旦短納米纖維形成，可作為種子引發(fā)進(jìn)一步凝聚和蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變，這樣增強(qiáng)了轉(zhuǎn)變的總速率。
如果無(wú)處理地移出蠶絲蛋白或蜘蛛絲蛋白的第一儲(chǔ)存狀態(tài)溶液，它們立即轉(zhuǎn)變成不溶的β結(jié)晶態(tài)，這樣過早地形成不溶的絮狀物或凝膠體，不能被擠出或紡織成有用的絲。轉(zhuǎn)變可非常快，通常1-3天完成。當(dāng)從蠶絲蛋白擠出或紡出絲時(shí)這是一個(gè)問題。通過切斷蛋白質(zhì)成為構(gòu)象或結(jié)晶容易變化的短的縮氨酸的細(xì)菌降解對(duì)玻璃管中的這種轉(zhuǎn)變起一定的作用?；蛘咄ㄟ^移去阻止凝聚或構(gòu)象變化的保護(hù)性域，蛋白質(zhì)水解可促進(jìn)這種轉(zhuǎn)變。通過已經(jīng)轉(zhuǎn)變成β結(jié)晶態(tài)的材料作種子也可促進(jìn)天然蠶絲蛋白或蜘蛛絲蛋白溶液轉(zhuǎn)變成不溶態(tài)。將天然絲溶解在離液劑，如溴化鋰、硫氰酸鋰、硫氰酸鈉、氯化鈣、硝酸鈣中，當(dāng)離液劑被分離移去時(shí)，制備再生的蠶絲蛋白和蜘蛛絲蛋白溶液也逐漸經(jīng)歷絮狀物和類似凝膠的形成。當(dāng)試圖從再生絲紡出或擠出材料時(shí)還存在一個(gè)問題。
在蠶腺體的后部和中間區(qū)及蜘蛛的類似A區(qū)發(fā)現(xiàn)第一儲(chǔ)存狀態(tài)。在各自腺體的這些區(qū)，蛋白質(zhì)以非常高的濃度(20～40％w/v)被儲(chǔ)存。蜘蛛中，蛋白質(zhì)以高粘度液晶態(tài)溶膠形式儲(chǔ)存，它在絲腺管的第一、第二和第三肢的大部分存在。蠶中，蛋白質(zhì)以凝膠態(tài)被儲(chǔ)存在新?lián)Q毛的最終中間蠶的絲腺的后部和中間區(qū)，但在輸送管中在蛋白質(zhì)剛被紡之前轉(zhuǎn)變成溶膠(較前區(qū)的較前部分)。之后從凝膠態(tài)到溶膠的轉(zhuǎn)變向后擴(kuò)展到分泌腺路徑以能使在中間和較后區(qū)儲(chǔ)存的物料向前流動(dòng)，這樣在管的前部(末梢部分)可向下拉伸成絲。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的裝置和方法。
通過提供儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的裝置包括儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的第一倉(cāng)和儲(chǔ)存堿性緩沖劑的第二倉(cāng)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這些和其它目的。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施實(shí)施例中，第二倉(cāng)盛裝含有氯化鈣的堿性緩沖劑。第二倉(cāng)與第一倉(cāng)流體(如液體或氣體)連接。儲(chǔ)存在第一倉(cāng)的蛋白質(zhì)呈堿性含有鈣離子，在這種條件下它比直接從生物體移出的未處理的蜘蛛絲蛋白或蠶絲蛋白或?qū)⒅┲虢z或蠶絲溶解在離液劑中制備的溶液要更穩(wěn)定。從而，由蛋白質(zhì)的β態(tài)形成的β片材形式的分解或未成熟形成被大大拖延。
發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，從下列堿中選擇堿性緩沖劑氨水、醋酸胺、甲酸胺、檸檬酸胺、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris/HCL)、HEPES、PIPES、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀或它們的混合物。
在一個(gè)實(shí)施例中，除堿性緩沖劑外，疊氮化鈉被加入蛋白質(zhì)中。或者，可加入苯硫脲、氰化鈉或氰化鉀。
在一個(gè)實(shí)施例中，在堿性緩沖劑中還加入100-700mM的鈣離子，最好是氯化鈣。在這些環(huán)境下，堿性緩沖劑可不含碳酸或磷酸離子。
當(dāng)鈣離子被加入堿性緩沖劑時(shí)，造成濃縮的絲蛋白溶液或它們的相似物凝膠。這種方法產(chǎn)生的凝膠比絲蛋白溶液的溶膠狀態(tài)更穩(wěn)定。在擠出、紡絲或其它形成絲之前，這種方法造成的凝膠態(tài)可重新轉(zhuǎn)換成溶膠態(tài)，用含有20-100mM乙烯基二氨四醋酸(用氨水或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0-7.8)的滲析溶液滲析可實(shí)現(xiàn)凝膠態(tài)向溶膠態(tài)的轉(zhuǎn)變。這種處理移去鈣離子?；蛘?，用去離子水滲析移去鈣離子。在任一例子中，聚乙烯基乙二醇或另一水溶性聚合物可被加入滲析液中通過反滲析以保持或增加蛋白質(zhì)的濃度。
在優(yōu)選的實(shí)施例中至少部分第一儲(chǔ)存?zhèn)}的內(nèi)壁表面由低表面能材料形成或用低表面能的材料涂覆，如聚四氟乙烯、硅烷、尼龍、聚乙烯或聚碳酸酯，它們還有利于阻止蛋白質(zhì)的β片未成熟形成。
在裝置中，堿性緩沖劑是氣態(tài)或溶液形式。如果以氣態(tài)形式使用，它可被直接施加在蛋白質(zhì)溶液的表面或允許通過多孔或半滲透的表面擴(kuò)散進(jìn)入。如果堿性緩沖劑以溶液形式使用，通過多孔或半透膜它可被從蛋白質(zhì)中分離出來(lái)，或分離的緩沖劑流被施加在蛋白質(zhì)溶液流中，然后從蛋白質(zhì)溶液表面導(dǎo)出。如果堿性緩沖劑以氣態(tài)形式使用，它可直接擴(kuò)散進(jìn)入蛋白質(zhì)溶液使它呈堿性。如果通過多孔或半透膜將堿性緩沖劑從蛋白質(zhì)中分離，然后可能含有的緩沖劑和鈣離子可通過所述的膜擴(kuò)散進(jìn)入蛋白質(zhì)溶液。
在發(fā)明的另一實(shí)施例，當(dāng)有助于保持蛋白質(zhì)在溶膠狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)直接與堿性溶液混合。鈣離子可被直接加入堿性溶液中。
在發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，疊氮化鈉被加入pH為7.4的緩沖劑中以使最終濃度大于0.0001M。
儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)可以是通過解剖動(dòng)物獲得的天然蛋白，或遺傳工程獲得的再結(jié)合蛋白或溶解蠶或絲纖維在離液劑(chaotropic agent)中(之后被滲析除去)制備的再生絲溶液，或前面提到的蛋白或蛋白類似物的混合物。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明在儲(chǔ)存蠶絲蛋白或蜘蛛絲蛋白或它們的相似物或再生的蠶絲和/或蜘蛛絲蛋白方面是有用的。
通常，儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)是含有帶電基團(tuán)和通過化學(xué)合成或基因工程制備的重復(fù)雙極性嵌段共聚蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類似物。
通過提供儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的方法實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，包括第一步將蛋白質(zhì)放入第一儲(chǔ)存?zhèn)}。第二步，將蛋白質(zhì)暴露在堿性緩沖劑(建議含有鈣離子和疊氮化鈉)一段時(shí)間。第三步，將蛋白質(zhì)維持在第一儲(chǔ)存?zhèn)}中的堿性環(huán)境中。
提供長(zhǎng)期儲(chǔ)存的絲蛋白溶液或類似物和再生絲溶液。


圖1示出適合儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的裝置的第一實(shí)施例的示意圖。
圖2示出適合儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的裝置的第二實(shí)施例的示意圖。
圖3示出堿性緩沖劑和疊氮離子對(duì)濃縮天然蠶絲蛋白溶液儲(chǔ)存時(shí)間的影響。
發(fā)明詳細(xì)描述圖1是說(shuō)明適合儲(chǔ)存蛋白質(zhì)20的裝置10的第一個(gè)實(shí)施例的示意圖。裝置10具有放置蛋白質(zhì)20的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存?zhèn)}30。蛋白質(zhì)儲(chǔ)存?zhèn)}30通過管35與堿液儲(chǔ)存?zhèn)}40相連接。堿液儲(chǔ)存?zhèn)}40儲(chǔ)存堿性溶液50。蛋白質(zhì)儲(chǔ)存?zhèn)}30較適合部分或基本上所有的內(nèi)壁用低表面能的材料制成或涂覆低表面能材料，如聚四氟乙烯，聚乙烯或聚碳酸酯。
在儲(chǔ)存?zhèn)}30中的蛋白質(zhì)20可是天然的蛋白質(zhì)，如通過解剖動(dòng)物獲得的。這些天然蛋白質(zhì)的例子包括，但不局限于，從蜘蛛的主要腺體獲得的蜘蛛絲蛋白或從蠶(Brombyx mori)或其它蠶獲得的蠶絲蛋白。本發(fā)明還適用于這些蛋白的類似物或基因工程獲得的再組合蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步適用于將絲溶解在含有離液劑的溶液中制備的再生絲溶液。通常，認(rèn)為本發(fā)明適用于任一蛋白質(zhì)或具有重復(fù)雙極性嵌段共聚物的蛋白質(zhì)類似物的儲(chǔ)存，它們含有帶電基團(tuán)，盡管這些材料不是本發(fā)明的限制。在堿液儲(chǔ)存?zhèn)}40中，可使用幾種不同的堿性溶液。例如，堿可是氨水/醋酸，醋酸胺、乙酸胺或甲酸胺。這些緩沖劑具有揮發(fā)性，在蛋白質(zhì)儲(chǔ)存?zhèn)}30中創(chuàng)造堿性環(huán)境。三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、HEPES或PIPES可被使用，但這些緩沖劑沒有揮發(fā)性。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，從下列堿中選擇堿性緩沖劑氨水、醋酸胺、甲酸胺、檸檬酸胺。磷酸鉀和碳酸鉀也適合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，堿性緩沖劑含有100-700mM的鈣離子，最好添加氯化鈣。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，除堿性緩沖劑外，還向第一儲(chǔ)存?zhèn)}的蛋白質(zhì)20中添加疊氮化鈉。在另一實(shí)施例中，苯硫脲、氰化鈉或氰化鉀可被加入蛋白質(zhì)20中。
在發(fā)明的另一實(shí)施例中，如圖2所示，通過半透膜或多孔膜60，蛋白質(zhì)儲(chǔ)存?zhèn)}30可與堿液儲(chǔ)存?zhèn)}40分離。半透膜或多孔膜60允許離子通過以改變儲(chǔ)存在蛋白質(zhì)儲(chǔ)存?zhèn)}30中的蛋白質(zhì)20的pH值。在使用半透膜的條件下，聚乙烯基乙二醇可被加入到大于70％w/v的堿性緩沖劑中，以通過反滲析的方法移去蛋白質(zhì)儲(chǔ)存?zhèn)}中的蛋白質(zhì)溶液的水。在這些環(huán)境下，所使用的聚乙烯基乙二醇的分子量必須大于半透膜阻截的分子量?？墒褂盟苄缘暮陀凶銐虼蟮某叽绲钠渌酆衔镆苑乐顾鼈兺ㄟ^滲析膜。
這樣，蛋白質(zhì)20在第一倉(cāng)30中處理一段時(shí)間短的如1分鐘，但建議至少20分鐘，可防止未成熟的凝聚。處理時(shí)間根據(jù)蛋白質(zhì)20的量、起始pH值、溫度和暴露在堿性緩沖劑中蛋白質(zhì)20的表面積、減性緩沖劑擴(kuò)散達(dá)到所有蛋白質(zhì)20所通過的距離和蛋白質(zhì)20和堿性緩沖劑的緩沖能力確定。
在優(yōu)選的發(fā)明實(shí)施例中，蛋白質(zhì)20與堿性緩沖溶液，如pH值大于7.4，濃度等于或大于0.1M的醋酸胺或甲酸胺混合。在發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，堿性緩沖溶液含有100-700mM的鈣離子，大于0.0001的疊氮化鈉。
促進(jìn)蛋白質(zhì)20穩(wěn)定的不同堿性溶液的適合能力以兩種方式評(píng)價(jià)第一，大于4周時(shí)間內(nèi)，用不同的堿性緩沖溶液滲析濃縮的蛋白質(zhì)溶液小液滴，間隔一定的時(shí)間確定蛋白質(zhì)溶液的凝膠或溶膠狀態(tài)。一般結(jié)果如圖3所示。第二，用少量的與堿性緩沖劑接觸不同時(shí)間的蛋白質(zhì)溶液的紡絲纖維確定這種趨勢(shì)的有效性。在第二種方法中，使用PCT申請(qǐng)WO-A-01/38614中描述的通用型的仿生紡絲裝置，將此在這里列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。用仿生紡絲裝置的測(cè)試表明與1M氫氧化氨溶液得到的飽和蒸氣氣氛接觸1周后，儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)20仍可紡織成絲、纖維或細(xì)絲。
該裝置和方法不僅可被用來(lái)儲(chǔ)存天然和再結(jié)合的蛋白質(zhì)，它還可用來(lái)儲(chǔ)存再生的蠶絲蛋白和蜘蛛絲蛋白溶液，通過溶解這些蛋白制成的絲較合適的含有離液劑(氫鍵斷裂)的溶液中。該離液劑的例子是50∶50v/v飽和溴化鋰和純乙醇混合物。
實(shí)施例1儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)在下列實(shí)施例中，對(duì)于從蠶(Bombyx mori)的絲腺中得到的含有蠶絲蛋白的蛋白質(zhì)溶液、再生蠶(Bombyx mori)溶液或從Nephila蜘蛛的主切除腺得到的濃縮的蜘蛛絲蛋白溶液的儲(chǔ)存時(shí)間被延長(zhǎng)。
第一步，蛋白質(zhì)溶液被傳送到滲析袋(MWCO5-8kDa)中，用含有20％w/vPEG(MW15-20kDa)和0.1mM pH值為7.8醋酸胺的緩沖劑在4℃下反滲析1小時(shí)濃縮。疊氮化鈉可被加入滲析液中使最終濃度為0.001mM以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
得到的凝膠可在4℃下儲(chǔ)存至少4周。
在擠出和其它方式形成制品之前，用蒸餾水和水溶性100mM乙烯基二胺四醋酸溶液滲析可使得到的凝膠再轉(zhuǎn)變成溶膠。
實(shí)施例2紡絲前蠶絲蛋白作為凝膠儲(chǔ)存在Bombyx mori蠶體內(nèi)的證明。
在雙目顯微鏡下解剖不同發(fā)展期的蠶Bombyx mori以評(píng)價(jià)蠶絲腺的后部、中間和前部的較后部分的蠶絲蛋白狀態(tài)。從蠶體迅速移去的腺體被傳送到蠶的林格氏溶液(pH＝7.8)中以觀察。腺體內(nèi)腔的材料表明在所有的階段它起始作為溶膠存在，直到最后中間態(tài)的幾天在繭紡絲開始之前，之后作為凝膠被儲(chǔ)存直到繭紡絲的起始階段。通過橫切割管(前部的前部分)，觀察是否有蠶絲蛋白滴流出，表明僅在紡絲前和紡絲中，蠶絲蛋白以溶膠態(tài)存在分隔區(qū)。一旦紡絲開始，隨著絲腺尺寸在紡絲中消失，溶膠形成顯示出逐漸向后擴(kuò)展通過絲滴。這說(shuō)明凝膠形成對(duì)安全儲(chǔ)存絲是必須的和溶膠形成對(duì)紡絲滴向下流動(dòng)是必須的。
實(shí)施例3添加和移去鈣離子對(duì)儲(chǔ)存天然蠶絲蛋白的溶膠/凝膠態(tài)的影響用1ml含有10mM疊氮化鈉和100mM EDTA，pH＝7.8濃縮的氨水溶液或醋酸的100mM醋酸胺緩沖劑稀釋中間區(qū)的高含量，得到蠶絲蛋白液滴溶液。添加1體積的1M氯化鈣到1體積的蠶絲蛋白液滴溶液中或用500nM氯化鈣溶液滲析，可迅速凝膠質(zhì)化該溶液。用蒸餾水或100mM醋酸胺緩沖劑(pH＝7.8)滲析或用含500mMEDTA的100mM醋酸胺緩沖劑(pH＝7.8)快速滲析，蛋白質(zhì)可回到溶膠態(tài)。這說(shuō)明加入鈣離子可引發(fā)溶膠/凝膠轉(zhuǎn)化，移去鈣離子凝膠可轉(zhuǎn)換成溶膠。在凝膠條件下儲(chǔ)存數(shù)天甚至幾星期后，鈣引起的轉(zhuǎn)變?nèi)燥@示出可逆性。
實(shí)施例4鈣離子添加或移去對(duì)天然蠶絲蛋白溶液儲(chǔ)存的影響如實(shí)施例3描述的加入1M氯化鈣，可得到濃縮的蠶絲蛋白溶液，并凝膠化。測(cè)試了凝膠在某一狀態(tài)可被穩(wěn)定儲(chǔ)存的時(shí)間，移出鈣離子它可轉(zhuǎn)變回溶膠。凝膠在4℃放置不同時(shí)間，制備凝膠樣品，然后立即用500mM EDTA的100mM醋酸胺緩沖劑(pH＝7.8)滲析。這些觀測(cè)報(bào)告表明在儲(chǔ)存至少4周后，鈣-蠶絲蛋白凝膠可被安全轉(zhuǎn)化成溶膠。相反，在鈣離子存在下形成的溶膠在4℃下僅可儲(chǔ)存5-8天，在形成加入另外的EDTA也不可再轉(zhuǎn)變成溶膠的聚合材料前。在9.6M溴化鋰中溶解脫膠絲，含有100mM鋰、20％w/v聚乙烯基乙二醇(平均分子量15Kda)滲析制備的再生絲溶液在低分子量阻斷的滲析袋(Spectropor 10Kda)的合成溶液得到相似的結(jié)果。與通過凝膠化天然蠶絲蛋白得到的凝膠相比，如上所述通過在溶液中添加鈣離子制備的凝膠具有相對(duì)低的剛性。
權(quán)利要求
1.一種用于儲(chǔ)存蛋白質(zhì)(20)的裝置，包括儲(chǔ)存蛋白質(zhì)(20)的第一倉(cāng)(30)和儲(chǔ)存堿性緩沖劑(50)的第二倉(cāng)(40)，第二倉(cāng)(40)與第一倉(cāng)(30)流體連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中堿性緩沖劑(50)含有鈣離子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的裝置，其中堿性緩沖劑選自包括氨水溶液、醋酸胺、甲酸胺、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、HEPES、PIPES、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀或它們的混合物組成的堿性緩沖劑的組。
4.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中堿性緩沖劑(50)含有50-700mM的鈣離子。
5.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中堿性緩沖劑(50)還含有疊氮化鈉。
6.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中至少第一倉(cāng)(30)的內(nèi)壁表面的一部分由低表面能的材料形成或涂覆有低表面能的材料。
7.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中堿性緩沖劑(50)以氣體狀態(tài)存在。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一所述的裝置，其中用滲析膜(60)將堿性緩沖劑(50)與蛋白質(zhì)(20)分離。
9.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中蛋白質(zhì)(20)與堿性溶液混合。
10.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中蛋白質(zhì)(20)與至少一種或多種堿性緩沖鹽混合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其中至少一種或多種堿性緩沖鹽還含有疊氮化鈉、苯基硫脲、氰化鈉或氰化鉀。
12.根據(jù)權(quán)利要求9到11中任一所述的裝置，其中堿性溶液是0.1M的氫氧化胺、醋酸胺、甲酸胺、檸檬酸胺、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、PIPES、HEPES、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀緩沖劑或pH值大于7.4的緩沖劑的混合物。
13.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中堿性緩沖劑(50)的PH值大于7.4。
14.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中堿性緩沖劑(50)或組合緩沖劑的濃度等于或大于0.025M。
15.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中蛋白質(zhì)(20)是天然的、再生的或再組合的蛋白質(zhì)、天然蛋白質(zhì)的混合物、再生蛋白質(zhì)的混合物或再組合蛋白質(zhì)的混合物。
16.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中蛋白質(zhì)(20)是蠶絲蛋白或蜘蛛絲蛋白或它們的同族物。
17.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的裝置，其中蛋白質(zhì)(20)是重復(fù)雙極性嵌段共聚蛋白質(zhì)或含有帶電基團(tuán)的蛋白質(zhì)相似物和用化學(xué)合成或基因工程制備的蛋白質(zhì)。
18.一種儲(chǔ)存蛋白質(zhì)(20)的方法包括-第一步將蛋白質(zhì)放入第一儲(chǔ)存?zhèn)}(30)；-第二步使蛋白質(zhì)(20)暴露于堿性緩沖劑(50)；-第三步使第一儲(chǔ)存?zhèn)}(30)中的蛋白質(zhì)(20)保持在堿性環(huán)境中。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中蛋白質(zhì)(20)保持在第一儲(chǔ)存?zhèn)}(30)中至少一分鐘。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中堿性緩沖劑(50)含有鈣離子。
21.根據(jù)權(quán)利要求18到20中任一所述的方法，其中堿性緩沖劑(50)選自由氨水溶液、醋酸胺、甲酸胺、檸檬酸胺、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、HEPES、PIPES、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀或它們的混合物組成的堿性緩沖劑的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求18到21中任一所述的方法，其中堿性緩沖劑含有50-700mM的鈣離子。
23.根據(jù)權(quán)利要求18到22中任一所述的方法，其中堿性緩沖劑(50)以氣體狀態(tài)存在。
24.根據(jù)任一權(quán)利要求18到23中任一所述的方法，其中至少一種堿性緩沖鹽被加入蛋白質(zhì)(20)中。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中堿性緩沖鹽還含有疊氮化鈉、苯基硫脲、氰化鈉或氰化鉀。
26.根據(jù)權(quán)利要求18到25中任一所述的方法，其中用滲析膜(60)使緩沖劑(50)與蛋白質(zhì)分離。
27.根據(jù)權(quán)利要求18到26中任一所述的方法，其中堿性緩沖劑(50)的pH值大于7.4。
28.根據(jù)權(quán)利要求18到27中任一所述的方法，其中蛋白質(zhì)(20)與堿性溶液在儲(chǔ)存(50)前混合。
29.根據(jù)權(quán)利要求18到28中任一所述的方法，其中堿性緩沖劑(50)或組合緩沖劑的濃度等于或大于0.025M。
30.根據(jù)權(quán)利要求18到29中任一所述的方法，其中蛋白質(zhì)(20)是天然的、再生的或再結(jié)合的蛋白質(zhì)、天然蛋白質(zhì)的混合物、再生蛋白質(zhì)的混合物或再結(jié)合蛋白質(zhì)的混合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求18到30任一所述的方法，其中蛋白質(zhì)(20)是蠶絲蛋白或蜘蛛絲蛋白或它們的同族物。
32.根據(jù)權(quán)利要求18到31任一所述的方法，其中蛋白質(zhì)(20)是重復(fù)兩極性嵌段共聚蛋白質(zhì)或含有帶電基團(tuán)的蛋白質(zhì)相似物和用化學(xué)合成或基因工程制備的蛋白質(zhì)。
全文摘要
一種儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的裝置(20)包括儲(chǔ)存蛋白質(zhì)(20)的第一倉(cāng)(30)和儲(chǔ)存緩沖劑(50)的第二倉(cāng)(40)，描述了第二倉(cāng)(40)與第一倉(cāng)(30)的流體連接。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，堿性緩沖劑包括促進(jìn)蛋白質(zhì)(20)凝膠化的鈣離子。還描述了一種儲(chǔ)存蛋白質(zhì)(20)的方法。該方法包括第一步將蛋白質(zhì)放置在第一儲(chǔ)存?zhèn)}(30)；第二步將蛋白質(zhì)(20)暴露于堿性緩沖劑(50)；第三步保持蛋白質(zhì)(20)在第一儲(chǔ)存?zhèn)}(30)的堿性氣氛下。
文檔編號(hào)D01D1/02GK1729319SQ200380107239
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2003年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月23日
發(fā)明者戴維·菲利普·奈特, 拉里莎·平諾克 申請(qǐng)人:斯賓泰克工程股份有限公司