專利名稱：具有改變的凈電荷、在去污劑中使用的多點置換的蛋白酶變體的制作方法
相關(guān)申請本申請是1998年10月23日提交的美國專利中請08／956，323、1998年10月23日提交的美國專利申請08／956，564和1998年10月23日提交的美國專利申請08／956，324的部分繼續(xù)申請，所有這些申請在此都完整引用。
背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶是羰基水解酶的一個亞組。其包括多種類別的具有廣泛特性和生物功能的酶。Stroud，R．，科學(xué)美國人(Sci．Amer．)13174-88。盡管其功能的多樣性，但絲氨酸蛋白酶的催化機制至少由兩種遺傳分離的酶家族來完成1)枯草桿菌蛋白酶和2)哺乳動物胰凝乳蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶及同源細(xì)菌絲氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶和灰色鏈霉菌(S．gresius)胰蛋白酶)。這兩個絲氨酸蛋白酶家族顯示非常相似的催化機理。Kraut，J．(1977)，生物化學(xué)年述(Annu．Rev．Biochem．)，46331-358。此外，盡管一級結(jié)構(gòu)不相關(guān)，但這兩個酶家族的三級結(jié)構(gòu)存在由絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸組成的氨基酸保守催化三聯(lián)體。
枯草桿茵蛋白酶是由多種芽孢桿菌屬的種及其它微生物大量分泌的絲氨酸蛋白酶(分子量約為27，500)。已經(jīng)測定了芽孢桿茵屬至少九個不同種的枯草桿菌蛋白酶的蛋白質(zhì)序列。Markland，F(xiàn)．S．等人(1983)，Hooppe-Seyler’s Z．Physiol．Chem．，3641537-1540。曾經(jīng)報道了來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿茵(Bacilluslicheniformis)和遲緩芽孢桿菌(B．lentus)幾種天然變體的枯草桿菌蛋白酶的三維晶體結(jié)構(gòu)。這些研究表明，盡管枯草桿菌蛋白酶與哺乳動物絲氨酸蛋白酶在遺傳上是不相關(guān)的，但它具有相似的活性部位結(jié)構(gòu)。含有共價結(jié)合的肽抑制劑的枯草桿菌蛋白酶(Robertus，J．D．等人(1972)，生物化學(xué)(Biochemistry)，112439-2449)或產(chǎn)物復(fù)合物(Robertus，J．D．等人(1976)，生物化學(xué)雜志(J．Biol．Chem．)，2511097-1103)的x-射線晶體結(jié)構(gòu)也提供了關(guān)于枯草桿菌蛋白酶的活性部位和推斷的底物結(jié)合裂隙的信息。另外，曾經(jīng)報道了關(guān)于枯草桿菌蛋白酶的大量動力學(xué)和化學(xué)修飾研究(Svendsen，B．(1976)，Carlsberg研究通訊(Carlsberg Res．Commun．)，41237-291；Markland，F(xiàn)．S．，同前)，并且至少有一條報道，其中枯草桿菌蛋白酶殘基222的甲硫氨酸的側(cè)鏈被過氧化氫轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸-亞砜(Stauffer， D．C．等人(1965)，生物化學(xué)雜志，2445333-5338)，并進行了廣泛的位點專一誘變(Wells和Estell(1988)TIBS13291-297)。
在用于去污劑制劑的蛋白酶變體的開發(fā)中，一個常見的問題是洗滌條件的多樣性，包括可在其中使用蛋白酶變體的不同去污劑制劑。例如，在不同領(lǐng)域中使用的去污劑配方在洗滌用水(wash water)中含有不同濃度的有關(guān)成分。例如，歐洲去污劑體系一般在洗滌用水中含有大約4500-5000ppm的去污劑成分，而日本去污劑體系一般在洗滌用水中含有大約667ppm的去污劑成分。在北美洲，尤其在美國，去污劑體系一般在洗滌用水中含有約975ppm的去污劑成分。令人驚奇地，發(fā)展了一種可用于低去污劑濃度體系、高去污劑濃度體系和／或中去污劑濃度體系以及可用于所有這三種去污劑濃度體系的蛋白酶變體的合理設(shè)計方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的在于提供在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換的蛋白酶變體，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強或正電性更弱，因此該蛋白酶變體在低去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。一種低去污劑濃度體系是在洗滌用水中存在少于約800ppm的去污劑成分的洗滌體系。
本發(fā)明的另一個目的在于提供在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換的蛋白酶變體，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強或負(fù)電性更弱，因此該蛋白酶變體在高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。一種高去污劑濃度體系是在洗滌用水中存在超過約2000ppm的去污劑成分的洗滌體系。
本發(fā)明的另一個目的在于提供在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換的蛋白酶變體，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強或負(fù)電性更弱，因此該蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。一種中去污劑濃度體系是在洗滌用水中存在約800ppm到約2000ppm的去污劑成分的體系。
本發(fā)明的另一個目的在于提供在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換的蛋白酶變體，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強或正電性更弱，因此該蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。一種中去污劑濃度體系是在洗滌用水中存在約800ppm到約2000ppm的去污劑成分的洗滌體系。
本發(fā)明另外一個目的在于提供編碼這些蛋白酶變體的DNA序列，以及含有這些變異體DNA序列的表達載體。
更進一步，本發(fā)明的另一目的在于提供用這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及能夠表達這種DNA而在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生蛋白酶變體的宿主細(xì)胞。
進一步提供一種含有本發(fā)明的蛋白酶變體的清潔用組合物。
另外，也提供一種含有本發(fā)明的蛋白酶變體的動物飼料。
進一步提供一種產(chǎn)生在低、中及高去污劑濃度體系中都比前體蛋白酶更有效的蛋白酶變體的方法，包括a)置換一個或多個殘基位置處的氨基酸，其中該置換改變了該位置的電荷，使得其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強或負(fù)電性更弱；b)置換一個或多個殘基位置處的氨基酸，其中該置換改變了該位置的電荷，使得其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強或正電性更弱；c)檢測該變體，以測定它在高、中及低去污劑濃度體系中與前體蛋白酶相比的有效性；及d)必要時重復(fù)步驟a)-c)，以產(chǎn)生在低、中及高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效的蛋白酶變體，其中步驟a)和b)能以任意順序進行。
附圖簡述

圖1A-C描述解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的DNA及氨基酸序列，和該基因的部分限制酶切圖譜。
圖2描述解淀粉芽孢桿菌(BPN)’和遲緩芽孢桿菌(野生型)枯草桿菌蛋白酶之間的保守氨基酸殘基。
圖3A和3B描述四種枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。最上一行代表來源于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(有時也稱為枯草桿菌蛋白酶BPN’)的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。第二行描述來源于枯草芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。第三行描述來源于地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。第四行描述來源于遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶(在PCT WO89／06276中也稱為枯草桿菌蛋白酶309)的氨基酸序列。符號*表示與枯草桿菌蛋白酶BPN’相比特定氨基酸殘基缺如。
發(fā)明詳述如上所述，特定地區(qū)具有特定的洗滌條件，因而使用不同類型的去污劑。例如，日本使用低去污劑濃度體系，而歐洲使用高去污劑濃度體系。如前所述，美國使用中去污劑濃度體系。我們發(fā)現(xiàn)，在這些不同的去污劑制劑中表現(xiàn)最佳的蛋白酶變體各不相同。然而，由這些觀察的結(jié)果可以預(yù)料，發(fā)現(xiàn)一種適用于所有這三種去污劑類型中的蛋白酶是不可能的。令人驚奇地，情況并非如此。已經(jīng)發(fā)展了一種方法，用于合理設(shè)計可在低去污劑濃度體系或高去污劑濃度體系乃至中去污劑濃度體系中使用的蛋白酶變體，以及在所有這三種去污劑濃度體系都適用的蛋白酶變體。我們發(fā)現(xiàn)，為了產(chǎn)生在低去污劑濃度體系中更有效的蛋白酶變體，用帶負(fù)電荷殘基或中性殘基替換帶正電殘基和／或用帶負(fù)電殘基替換中性殘基是必要的。相反，我們注意到，為了產(chǎn)生在高去污劑濃度體系中更有效的蛋白酶變體，用帶正電殘基或中性殘基替換帶負(fù)電殘基和／或用帶正電殘基替換中性殘基是必要的。此外，我們發(fā)現(xiàn)，在低去污劑濃度體系和／或高去污劑濃度體系中有用的許多蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中也有效。通過平衡這些變化，可能產(chǎn)生在低去污劑濃度體系、低及中去污劑濃度體系、中及高去污劑濃度體系、高去污劑濃度體系或所有這三種去污劑濃度體系中有出色表現(xiàn)的蛋白酶變體。
假定在水溶液中具有酸性或堿性功能的任何離子化氨基酸側(cè)鏈的靜電電荷是pH的函數(shù)。酸性殘基Glu和Asp在平衡過程中由于在pH3-6之間解離而失去一個質(zhì)子，由此得到一個負(fù)電荷。His、Lys和Arg分別在pH5-8、pH8．5-11．5和pH11-14之間以相似的方式逐步去質(zhì)子化，由此失去一個正電荷。Tyr OH的質(zhì)子在pH8．5-11．5之間逐漸解離，Tyr由此得到一個負(fù)電荷。羧基端的解離范圍是pH1-4，產(chǎn)生一個負(fù)電荷，對于氨基端是pH8-11，伴隨著一個正電荷的丟失。對于此處列出的氨基酸側(cè)鏈，解離范圍是多種蛋白質(zhì)的平均值，但公知在某些蛋白質(zhì)中它受異常結(jié)構(gòu)構(gòu)型的影響。
所有電荷的累積效應(yīng)決定了一種蛋白質(zhì)在特定的pH時是具有凈正電荷還是凈負(fù)電荷。正電荷和負(fù)電荷等效并使蛋白質(zhì)處于靜電中性狀態(tài)時的pH稱為等電點(pI)。當(dāng)pH改變或者添加或去除含有離子化側(cè)鏈殘基的氨基酸時，蛋白質(zhì)將失去或得到電荷。通過將在特定pH時帶負(fù)電的殘基替換為不帶電的或帶正電的殘基，分別導(dǎo)致+1及+2的形式電荷改變，能實現(xiàn)凈正電荷的增加。通過將不帶電側(cè)鏈殘基替換為在特定pH時質(zhì)子化的殘基，形式電荷改變將為+1。同樣，將在觀測pH時帶正電及不帶電的側(cè)鏈替換為帶負(fù)電的側(cè)鏈，能增加凈負(fù)電荷，并分別得到-1和-2的負(fù)電荷形式增加。
低去污劑濃度體系包括在洗滌用水中存在低于大約800ppm的去污劑成分的去污劑。日本去污劑一般被認(rèn)為是低去污劑濃度體系，因為它們在洗滌用水中存在大約667ppm的去污劑成分。
中去污劑濃度包括在洗滌用水中存在大約800ppm到約2000ppm的去污劑成分的去污劑。北美去污劑一般被認(rèn)為是中去污劑濃度體系，因為它們在洗滌用水中存在大約975ppm的去污劑成分。巴西的體系一般在洗滌用水中存在大約1500ppm的去污劑成分。
高去污劑濃度體系包括在洗滌用水中存在高于大約2000ppm的去污劑成分的去污劑。歐洲去污劑一般被認(rèn)為是高去污劑濃度體系，因為它們在洗滌用水中存在大約4500-5000ppm的去污劑成分。
拉丁美洲去污劑一般是高泡沫磷酸鹽助洗去污劑，在拉丁美洲使用的去污劑范圍可能處于中及高去污劑濃度，因為在洗滌用水中它們有1500ppm到6000ppm的去污劑成分。如上所述，巴西的體系一般在洗滌用水中含有大約1500ppm的去污劑成分。然而，其它高泡沫磷酸鹽助洗去污劑地區(qū)，不限于其它拉丁美洲國家，可能有在洗滌用水中存在可達大約6000ppm的去污劑成分的高去污劑濃度體系。
根據(jù)前述，顯然典型洗滌溶液中去污劑組合物的濃度在全世界范圍內(nèi)各不相同，從低于大約800ppm的去污劑組合物(“低去污劑濃度地區(qū)”)，例如在日本為大約667ppm，到約800ppm-約2000ppm(“中去污劑濃度地區(qū)”)，例如在美國約為975ppm、在巴西約為1500ppm，到高于大約2000ppm(“高去污劑濃度地區(qū)”)，例如在歐洲為大約4500ppm-約5000ppm，在高泡沫助洗劑地區(qū)約為6000ppm。
典型洗滌溶液的濃度由經(jīng)驗確定。例如，在美國，一種典型的洗滌機可容納大約64．4升體積的洗滌溶液。因此，為了獲得在洗滌溶液中大約975ppm去污劑的濃度，必須向64．4升洗滌溶液中加入大約62．79克去污劑組合物。這種量是由消費者用去污劑所帶量杯測量的加入洗滌用水中的典型量。
蛋白酶是通常用來切割蛋白質(zhì)或肽的肽鍵的羰基水解酶。在此使用時，“蛋白酶”意思是天然存在的蛋白酶或重組蛋白酶。天然存在的蛋白酶包括α-氨酰肽水解酶、肽酰氨基酸水解酶、?；被饷浮⒔z氨酸羧基肽酶、金屬羧基肽酶、巰基蛋白酶、羧基蛋白酶和金屬蛋白酶。包括絲氨酸、金屬、巰基和酸性蛋白酶，以及內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶。
本發(fā)明包括非天然存在的羰基水解酶變體的蛋白酶(蛋白酶變體)，與衍生出該變體氨基酸序列的前體羰基水解酶相比，其具有不同的蛋白水解活性、穩(wěn)定性、底物特異性、pH分布曲線和／或性能特征。特別是，這些蛋白酶變體具有自然界中未知的氨基酸序列，它是由于前體蛋白酶的大多數(shù)氨基酸殘基被替換為不同氨基酸而產(chǎn)生的。前體蛋白酶可以是天然存在的蛋白酶或重組蛋白酶。
此處有用的蛋白酶變體包含19種天然存在的L-氨基酸中任一種在指定氨基酸殘基位置處的置換。這些置換能在任何前體枯草桿菌蛋白酶(原核、真核、哺乳動物等)中進行。在整個申請中，以常用的單字母及三字母密碼的形式提及不同的氨基酸。這些密碼由Dale，M．W．(1989)，《細(xì)茵分子遺傳學(xué)》(Molecular Genetics of Bacteria)，John Wiley & Sons，Ltd．，附錄B確定。
此處有用的蛋白酶變體優(yōu)選地來源于芽孢桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶。更優(yōu)選地，蛋白酶變體來源于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和／或枯草桿菌蛋白酶309。
枯草桿菌蛋白酶是一般用來切割蛋白質(zhì)或肽的肽鍵的細(xì)菌或真菌蛋白酶。在此使用時，“枯草桿菌蛋白酶”意思是天然存在的枯草桿菌蛋白酶或重組枯草桿菌蛋白酶。已知一系列天然存在的枯草桿菌蛋白酶是由不同微生物種產(chǎn)生且常常為分泌的。該系列成員的氨基酸序列不是完全同源的。然而，該系列中的枯草桿菌蛋白酶顯示相同或相似類型的蛋白水解活性。該類絲氨酸蛋白酶具有一種共同的氨基酸序列，該序列定義了有別于胰凝乳蛋白酶相關(guān)種類絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體?？莶輻U菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶都含有包括天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三聯(lián)體。在枯草桿菌蛋白酶相關(guān)蛋白酶中，這些氨基酸從氨基端向羧基端閱讀的相對順序是天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸。但是，在胰凝乳蛋白酶相關(guān)蛋白酶中相對順序為組氨酸-天冬氨酸-絲氨酸。因此，枯草桿菌蛋白酶在此是指含有枯草桿菌蛋白酶相關(guān)蛋白酶的催化三聯(lián)體的絲氨酸蛋白酶。實例包括但不限于此處圖3中所確定的枯草桿菌蛋白酶。一般而言，并且對于本發(fā)明，蛋白酶中氨基酸的編號對應(yīng)于分配給圖1所示成熟解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶序列的編號。
“重組枯草桿菌蛋白酶”或“重組蛋白酶”是指一種枯草桿菌蛋白酶或蛋白酶，其中編碼枯草桿菌蛋白酶或蛋白酶的DNA序列受到修飾，產(chǎn)生一種變異(或突變)DNA序列，該序列編碼天然存在的氨基酸序列中一種或多種氨基酸的置換、缺失或插入。產(chǎn)生這種修飾、并且可與此處公開的方法結(jié)合的適當(dāng)方法包括美國專利RE34，606、美國專利5，204，015和美國專利5，185，258、美國專利5，700，676、美國專利5，801，038和美國專利5，763，257中公開的方法。
“非人類的枯草桿菌蛋白酶”及其編碼DNA可以從多種原核及真核生物中獲得。原核生物的合適實例包括革蘭氏陰性生物如大腸桿菌或假單胞菌(Pseudomonas)、革蘭氏陽性菌如微球菌(Micrococcus)或芽孢桿菌?？蓮闹蝎@得枯草桿菌蛋白酶及其基因的真核生物的實例包括酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、真菌如曲霉(Aspergillus)屬的種。
“蛋白酶變體”具有由“前體蛋白酶”的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。前體蛋白酶包括天然存在的蛋白酶和重組蛋白酶。蛋白酶變體的氨基酸序列通過前體氨基酸序列中一種或多種氨基酸的置換、缺失或插入而由前體蛋白酶氨基酸序列“衍生”。這種修飾是編碼前體蛋白酶氨基酸序列的“前體DNA序列”的修飾，而不是前體蛋白酶自身的操作。對前體DNA序列進行這種操作的適當(dāng)方法包括此處公開的方法，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(參見，例如，EP 0 328299、WO89／06279和已經(jīng)在此引用的美國專利及申請)。
這些氨基酸位置編號是指那些分配給圖1所示成熟解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶序列的編號。然而，本發(fā)明不限于該特定枯草桿菌蛋白酶的突變，而是擴展到在一定位置處含有這樣的氨基酸殘基的前體蛋白酶，該殘基“等同”于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中特別確定的殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，前體蛋白酶是遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶，并在遲緩芽孢桿菌中對應(yīng)于以上所列位點的等同氨基酸殘基位置處進行置換。
如果前體蛋白酶的殘基(氨基酸)位置與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的特定殘基或該殘基的一部分同源(即，在一級或三級結(jié)構(gòu)中位置相對應(yīng))或類似(即，具有相同或相似的化學(xué)結(jié)合、反應(yīng)或相互作用的功能能力)，則它相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的殘基。
為了建立與一級結(jié)構(gòu)的同源性，將前體蛋白酶的氨基酸序列直接與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶一級序列相比較，特別與公知在序列已知的枯草桿菌蛋白酶中不變的一組殘基相比較。例如，在此圖2顯示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶與遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶之間的保守殘基。對比保守殘基，為維持序列對比進行必要的插入和缺失(即，避免保守殘基由于任意缺失和插入而消除)之后，確定等同于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶一級序列中特定氨基酸的殘基。保守殘基的對比優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)保持100％的這些殘基。然而，超過75％或低至50％的保守殘基的對比也足以確定等同的殘基。催化三聯(lián)體Asp32／His64／Ser221的保守性應(yīng)當(dāng)保持。Siezen等人(1991)蛋白質(zhì)工程(Protein Eng．)4(7)719-737顯示了大量絲氨酸蛋白酶的序列對比。Siezen等人將此分組稱為枯草桿菌酶(Subtilase)或枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。例如，圖3中，排列對比了解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(carlsbergensis)和遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶之氨基酸序列，以提供氨基酸序列之間最大量的同源性。這些序列的比較顯示，在每種序列中含有許多保守殘基。圖2中確定了這些保守殘基(BPN’與遲緩芽孢桿菌之間)。
因此，可用這些保守殘基確定其它枯草桿菌蛋白酶，諸如遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(1989年7月13日公布的PCT公開文本W(wǎng)O89／06279)、此處優(yōu)選的蛋白酶前體酶或被稱為PB92的枯草桿菌蛋白酶(EP 0 328 299，它與優(yōu)選的遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶高度同源)中與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相應(yīng)的等同氨基酸殘基。在圖3A和3B中將這些枯草桿菌蛋白酶中某些氨基酸序列與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的序列相對比，產(chǎn)生保守殘基的最大同源性。如所能看到的，與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相比，遲緩芽孢桿菌序列中存在大量缺失。因此，例如，在其它枯草桿菌蛋白酶中與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的Val165等同的氨基酸對于遲緩芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌而言是異亮氨酸。
也可以通過測定已經(jīng)通過x-射線晶體分析法確定三級結(jié)構(gòu)的前體蛋白酶在三級結(jié)構(gòu)水平上的同源性，來確定“等同的殘基”。等同的殘基被定義為前體蛋白酶和解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶特定氨基酸殘基的兩個或多個主鏈原子的原子坐標(biāo)(N對N、CA對CA、C對C和O對O)經(jīng)對比后在0．13nm優(yōu)選地0．1nm之內(nèi)的殘基。在定向并定位最佳模型之后完成對比，得到所述蛋白酶與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的非氫蛋白質(zhì)原子的原子坐標(biāo)的最大重疊。最佳模型是在可獲得的最高分辨力時對于實驗衍射數(shù)據(jù)可得到最低R因子的晶體模型。
R因子=(貼11頁第4行公式)與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶特定殘基功能類似的等同殘基被定義為前體蛋白酶的如下氨基酸，它們可采取一種構(gòu)象，使得它們以一種確定的方式改變、修飾或貢獻于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合或催化，且其歸因于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定殘基。此外，它們是前體蛋白酶的那類殘基(通過x-射線晶體分析法已獲得其三級結(jié)構(gòu))，其占據(jù)了類似位點，使得盡管基于占據(jù)同源位點，特定殘基的主鏈原子也許不能滿足等同的標(biāo)準(zhǔn)，但該殘基的至少兩個側(cè)鏈原子之原子坐標(biāo)位于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相應(yīng)側(cè)鏈原子的0．13nm內(nèi)。在EPO公開文本0 251 446(相當(dāng)于美國專利5，182，204，其公開內(nèi)容在此引用作為參考)中闡述了解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)，并能如上所述用來在三級結(jié)構(gòu)水平上確定等同的殘基。
為了置換所確定的某些殘基是保守殘基，而其它的則不是。對于不保守的殘基而言，一種或多種氨基酸的置換限于產(chǎn)生這樣一種變體的置換，該變體具有一種與自然中所發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列不對應(yīng)的序列。對于保守殘基而言，這些置換不能產(chǎn)生天然存在的序列。本發(fā)明的蛋白酶變體包括蛋白酶變體的成熟形式，以及這些蛋白酶變體的原-形式和前原-形式。前原-形式是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)，因為其有利于蛋白酶變體的表達、分泌和成熟。
“原序列”是指與蛋白酶成熟形式的N端部分結(jié)合的氨基酸序列，當(dāng)它被去除后，導(dǎo)致該蛋白酶“成熟”形式的出現(xiàn)。實質(zhì)上發(fā)現(xiàn)許多蛋白水解酶為翻譯酶原產(chǎn)物，在不存在翻譯后加工的情況下以該方式表達。用于產(chǎn)生蛋白酶變體的一種優(yōu)選原序列是解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的推定的原序列，盡管也可使用其它蛋白酶原序列。
“信號序列”或“前序列”是指與蛋白酶N端部分結(jié)合或與原蛋白酶N端部分結(jié)合的任何氨基酸序列，它們可能參與蛋白酶成熟形式或原形式的分泌。信號序列的這種定義是一種功能性定義，意為包括蛋白酶基因N端部分所編碼的所有氨基酸序列，其在天然條件下參與蛋白酶分泌的實現(xiàn)。本發(fā)明利用這些序列實現(xiàn)此處所述蛋白酶變體的分泌。一種可能的信號序列包含枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶信號序列的前7個氨基酸殘基，這些殘基與遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶信號序列(ATCC21536)的剩余部分相融合。
蛋白酶變體的“前原”形式由含有與蛋白酶氨基端有效連接的原序列的蛋白酶成熟形式和與原序列氨基端有效連接的“前”序列或“信號”序列組成。
“表達載體”是指一種DNA構(gòu)建體，其含有與能實現(xiàn)該DNA在適當(dāng)宿主中表達的適當(dāng)控制序列有效連接的DNA序列。這類控制序列包括實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制這種轉(zhuǎn)錄的任意操縱子序列、編碼適當(dāng)mRNA核糖體結(jié)合位點的序列和控制轉(zhuǎn)錄與翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒，或者僅僅是有效的基因組插入片段。一旦轉(zhuǎn)化到適當(dāng)宿主中，載體可不依賴于宿主基因組復(fù)制并起作用，或者在某些情況中可能整合到基因組自身中。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時交換使用，因為質(zhì)粒是目前最常用的載體形式。然而，本發(fā)明意在包括表達載體的其它形式，它們具有等同的功能，并且是或者可成為本領(lǐng)域所公知的。
本發(fā)明中所用的“宿主細(xì)胞”通常是原核或真核宿主，它們優(yōu)選地用美國專利RE 34，606中公開的方法操作，以使其不能分泌酶促活性的內(nèi)切蛋白酶。表達蛋白酶的一種優(yōu)選宿主細(xì)胞是芽孢桿菌株BG2036，它缺乏具有有酶活性的中性蛋白酶和堿性蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶)。美國專利5，264，366中詳述了菌株BG2036的構(gòu)建。表達蛋白酶的其它宿主細(xì)胞包括枯草芽孢桿菌I168(在美國專利RE 34，606和美國專利5，264，366中也有描述，其公開內(nèi)容在此引用作為參考)，以及任何合適的芽孢桿菌屬的菌株，如地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌等。
用以重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能復(fù)制編碼蛋白酶變體的載體或表達希望的蛋白酶變體。對于編碼蛋白酶變體前-形式或前原-形式的載體而言，這些變體當(dāng)表達時一般由宿主細(xì)胞向宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌。
當(dāng)描述兩個DNA區(qū)域之間的關(guān)系時，“有效連接”僅意味著它們在功能上彼此相關(guān)。例如，如果一種前序列作為信號序列參與蛋白質(zhì)成熟形式的分泌，最可能的是參與信號序列的切割，則該前序列與肽有效連接。如果一種啟動子控制一種編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子與該序列有效連接；如果一種核糖體結(jié)合位點位于一定位置使得翻譯成為可能，則它與編碼序列有效連接。
編碼天然存在的前體蛋白酶的基因可依照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的通用方法獲得。這些方法一般包括合成含有編碼目標(biāo)蛋白酶區(qū)推定序列的標(biāo)記探針、由表達該蛋白酶的生物制備基因組文庫，以及通過與該探針雜交為了獲得目標(biāo)基因篩選該文庫。然后對陽性雜交克隆作圖并測定。
然后用克隆的蛋白酶轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以表達該蛋白酶。然后將蛋白酶基因連接于高拷貝數(shù)質(zhì)粒中。該質(zhì)粒在宿主中復(fù)制，在此意義上它含有質(zhì)粒復(fù)制所必需的眾所周知的元件與所述基因有效連接的啟動子(如果它可被宿主識別，即轉(zhuǎn)錄，則可作為基因本身的同源啟動子)、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)和聚腺苷酸化區(qū)(在某些真核宿主細(xì)胞中，它對于由宿主從蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性是必需的)，它是外源的或由蛋白酶基因的內(nèi)源終止區(qū)所提供的，質(zhì)粒中還期望含有選擇性基因，如抗生素抗性基因，它使得質(zhì)粒感染的宿主細(xì)胞通過在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長以維持連續(xù)培養(yǎng)成為可能。高拷貝數(shù)質(zhì)粒也含有宿主的復(fù)制起點，從而能在細(xì)胞質(zhì)中不受染色體限制地產(chǎn)生大量質(zhì)粒。然而，宿主基因組中整合多拷貝的蛋白酶基因也處于本發(fā)明之內(nèi)。利用對同源重組特別敏感的原核和真核生物利于此過程。
該基因可能是天然遲緩芽孢桿菌基因。此外，也可以產(chǎn)生編碼天然存在的或突變的前體蛋白酶的合成基因。這種方法中，測定前體蛋白酶的DNA和／或氨基酸序列。之后合成多個、重疊的合成單鏈DNA片段，雜交并連接后產(chǎn)生編碼前體蛋白酶的合成DNA。在美國專利5，204，015的實施例3中描述了合成的基因構(gòu)建體的一個實例，其公開內(nèi)容在此引用作為參考。
一旦克隆了天然存在的或合成的前體蛋白酶基因，即進行大量修飾，以增強天然存在的前體蛋白酶合成之外的基因用途。這些修飾包括如美國專利RE 34，606和EPO公布號0 251 446所公開的重組蛋白酶的產(chǎn)生和此處所述的蛋白酶變體的產(chǎn)生。
可用下列盒式誘變法促進本發(fā)明的蛋白酶變體的構(gòu)建，盡管也可使用其它方法。首先，獲得天然存在的編碼蛋白酶的基因，并全部或部分測序。然后為了尋找希望在編碼的酶中進行一個或多個氨基酸突變(缺失、插入或置換)的位點，掃描該序列。評價側(cè)翼于該位點的序列是否存在估計限制酶切位點的存在，用于將基因的短片段替換為表達時編碼不同突變體的寡核苷酸集合體。這些限制酶切位點優(yōu)選地是蛋白酶基因內(nèi)的唯一位點，以便于基因片段的置換。然而，可使用在蛋白酶基因中不過度豐余的任何適宜的限制酶切位點，只要限制酶切消化產(chǎn)生的基因片段能夠在適當(dāng)?shù)男蛄兄兄匦卵b配即可。如果在與所選位點適當(dāng)距離內(nèi)(10-15個核苷酸)的位置處不存在限制酶切位點，則可通過以在最終構(gòu)建中不改變讀框也不改變所編碼氨基酸的方式置換基因中的核苷酸來產(chǎn)生這些位點。為了改變其序列以符合目標(biāo)序列，基因突變依照公知的方法通過M13引物延伸來實現(xiàn)。根據(jù)遺傳密碼的豐余性、基因的限制酶圖譜和大量不同的限制酶，常規(guī)進行定位適當(dāng)側(cè)翼區(qū)并估計所需改變以得到兩種適宜的限制酶切位點序列的工作。注意到如果可獲得適宜的側(cè)翼限制酶切位點，則上述方法需要僅僅與不合該位點的側(cè)翼區(qū)結(jié)合應(yīng)用。
一旦克隆了天然存在的DNA或合成的DNA，即用同源的限制酶消化側(cè)翼于待突變位點的限制酶切位點，并將多數(shù)末端互補的寡核苷酸盒連接于該基因中。該方法簡化了誘變，因為能合成所有寡核苷酸使其具有相同的限制酶切位點，且合成的接頭不是產(chǎn)生限制酶切位點所必需的。
在此使用時，蛋白水解活性被定義為每毫克活性酶的肽鍵水解率。測定蛋白水解活性有許多眾所周知的方法(K．M．Kalisz，“微生物蛋白酶”《生物化學(xué)工程／生物技術(shù)進展》(Advances in BiochemicalEngineering／Biotechnology)，A．Fiechter編，1988)。除了改進的蛋白水解活性之外，或者作為一種備擇，本發(fā)明的變異蛋白酶可能具有其它改進的性質(zhì)，如Km、kcat或kcat／Km比值和／或改進的底物特異性和／或改進的pH活性分布曲線。這些酶能量身定做般地用于例如預(yù)計在肽制劑中存在的特定底物，或適于水解過程如洗衣用途。
本發(fā)明的一個方面，目的在于獲得一種與前體蛋白酶相比具有改變的蛋白水解活性的變異蛋白酶，因為提高這種活性(數(shù)字上的變大)使得酶更有效地作用于靶底物的用途成為可能。同樣需要的是與前體相比具有改變的熱穩(wěn)定性和／或改變的底物特異性的變異酶。在有些情況中，可能希望較低的蛋白水解活性，例如，在需要蛋白酶合成活性時(對于合成肽)蛋白水解活性的降低可能是有用的。人們可希望降低該蛋白水解活性，該活性能破壞這種合成的產(chǎn)物。相反，在某些情況中，可能希望提高變異酶與其前體相比的蛋白水解活性。此外，變體穩(wěn)定性-堿穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性-的提高或降低(改變)可能是所希望的。kcat、Km或kcat／Km的增加或降低對于用來測定這些動力學(xué)參數(shù)的底物是特異性的。
本發(fā)明的另一方面，發(fā)現(xiàn)如下的蛋白酶變體在低去污劑濃度中比前體蛋白酶更有效，該蛋白酶變體在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強或正電性更弱。
本發(fā)明的再另一方面，發(fā)現(xiàn)如下的蛋白酶變體在高去污劑濃度中比前體蛋白酶更有效，該蛋白酶變體在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強或負(fù)電性更弱。
此外，我們發(fā)現(xiàn)，在低去污劑濃度體系和／或高去污劑濃度體系中有用的許多蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中也是有效的。
這些置換優(yōu)選地在遲緩芽孢桿菌(重組的或天然型)枯草桿菌蛋白酶中進行，盡管該置換也可在任何芽孢桿菌蛋白酶，優(yōu)選地在芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中進行。
根據(jù)用變異蛋白酶獲得的篩選結(jié)果，解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的顯著突變對于這些酶的蛋白水解活性、性能和／或穩(wěn)定性以及這些變異酶的清潔或洗滌能力至關(guān)重要。
本發(fā)明的許多蛋白酶變體可用于配制不同的去污劑組合物或個人護理制劑如洗發(fā)劑或洗滌劑。許多公知的化合物是在含有本發(fā)明之蛋白酶突變體的組合物中有用的適當(dāng)表面活性劑。其包括非離子、陰離子、陽離子或兩性離子去污劑，如Barry J．Anderson的US 4，404，128和Jiri Flora等人的US 4，261，868中所公開的。一種合適的去污劑制劑是美國專利5，204，015(前文引用作為參考)的實施例7中所述的制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉能用作清潔用組合物的不同制劑。除了典型的清潔用組合物之外，易于理解本發(fā)明的蛋白酶變體也可用于使用天然或野生型蛋白酶的任何目的。因此，例如，這些變體能用于固體肥皂或液體肥皂的用途、餐具清潔(dishcare)劑、隱形眼鏡清潔液或產(chǎn)品、肽水解、廢物處理、紡織品用途、用作蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的融合-切割酶，等等。本發(fā)明的變體可在去污劑組合物中具有增強的性能(與前體相比)。在此使用時，在去污劑中的增強性能定義為某些酶敏感性污跡如草或血液的清除加強，如在標(biāo)準(zhǔn)洗滌循環(huán)后通過通用評估所測定的。
本發(fā)明的蛋白酶能以大約0．01％到大約5％(優(yōu)選地0．1％-0．5％)的重量百分比水平配制于已知的pH6．5-12．0的粉末及液體去污劑中。這些去污劑清潔用組合物也能包含其它的酶如已知的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶或糖苷內(nèi)切酶，以及助洗劑和穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的蛋白酶向常規(guī)清潔用組合物中的添加不產(chǎn)生任何特殊的應(yīng)用限制。換句話說，適合于去污劑的任何溫度和pH也適合于該組合物，只要pH位于上述范圍之內(nèi)，而溫度低于所述蛋白酶的變性溫度。另外，本發(fā)明的蛋白酶也能在不含去污劑的清潔用組合物中使用，單獨或與助洗劑和穩(wěn)定劑結(jié)合使用。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的蛋白酶變體的清潔用組合物。清潔用組合物另外也可含有常用于清潔用組合物的添加劑。其能選自但不限于漂白劑、表面活性劑、助洗劑、酶和漂白催化劑。本領(lǐng)域的一名普通技術(shù)人員可容易地理解何種添加劑適合包含于組合物中。此處提供的列表絕不是完全的，而只是作為適當(dāng)添加劑的實例。本領(lǐng)域的一名普通技術(shù)人員可容易地理解，應(yīng)當(dāng)只使用那些與該組合物中的酶及其它成分如表面活性劑相適合的添加劑。
制成后，清潔用組合物中存在的添加劑的量為大約0．01％-約99．9％，優(yōu)選地約1％-約95％，更優(yōu)選地約1％-約80％。
本發(fā)明的變異蛋白酶能包含于動物飼料中，如作為動物飼料添加劑部分，例如，如US 5，612，055、US 5，314，692和US 5，147，642所述。
本發(fā)明的一個方面是含有本發(fā)明的變異蛋白酶的用于紡織品處理的組合物。如出版物如RD 216，034、EP 134，267、US 4，533，359和EP 344，259中所述，能用該組合物處理如絲綢或毛。
以下以實施例的方式描述，而不應(yīng)理解為對權(quán)利要求書范圍的限制。
此處引用的所有出版物和專利在此都完全引入作為參考。實施例1用本領(lǐng)域眾所周知的方法生產(chǎn)并純化大量蛋白酶變體。所有突變都在遲緩芽孢桿菌GG36枯草桿菌蛋白酶中進行。
用美國系列號60／068，796“一種測定優(yōu)選的酶和／或優(yōu)選的去污劑組合物的改進方法”中所述的微觀(microswatch)測定法檢測產(chǎn)生的蛋白酶變體在兩種去污劑及洗滌條件中的表現(xiàn)。
表1-13列出了所測定的變異蛋白酶和在兩種不同去污劑中檢測的結(jié)果。所有數(shù)值都是與表中所示第一種蛋白酶比較而得出的(即，1．32的值表示，與表中第一種變體的100％相比釋放132％的污物的能力)。
A欄顯示變體的電荷差異。對于B欄，去污劑是0．67 g／l過濾的ArielUltra(Procter & Gamble，Cincinnati，OH，美國)，溶于每加侖含有3格令混合Ca2+／Mg2+硬度的溶液中，25℃下每孔使用0．3ppm的酶(低濃度去污劑體系)。對于C欄，去污劑是3．38 g／l過濾的Ariel Futur(Procter &Gamble，cinciNNati，OH，美國)，溶于每加侖含有15格令混合Ca2+／Mg2+硬度的溶液中，40℃下每孔使用0．3ppm的酶(高濃度去污劑體系)。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
表12
表13
實施例2如實施例1所述制備并檢測下列蛋白酶變體。
表14中的變體是具有以下兩種類型置換的蛋白酶變體改變一個位置處的電荷使其電荷與遲緩芽孢桿茵GG36相比負(fù)電性更強或正電性更弱的置換，和改變一個位置處的電荷使其電荷正電性更強或負(fù)電性更弱的置換，以及不影響特定殘基位置電荷的中性置換。這產(chǎn)生在低去污劑濃度體系(A欄；0.67g/l過濾的Ariel Ultra(Procter & Gamble，Cincinnati，OH,美國)，溶于每加侖含有3格令混合Ca2+/Mg2+硬度的溶液中，25℃下每孔使用0.3ppm的酶)和高去污劑濃度體系(B欄；3.38g/l過濾的ArielFutur(Procter & Gamble，Cincinnati,OH，美國)，溶于每加侖含有15格令混合Ca2+/Mg2+硬度的溶液中，40℃下每孔使用0。3ppm的酶)中都比標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)更好的蛋白酶變體。
表1權(quán)利要求
1．一種蛋白酶變體，其在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強或正電性更弱，并且該蛋白酶變體在低去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
2．權(quán)利要求1的蛋白酶變體，其中該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶變體，其來源于芽孢桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白酶變體，其來源于遲緩芽孢桿茵枯草桿菌蛋白酶。
5．一種編碼權(quán)利要求1的蛋白酶變體的DNA。
6．一種編碼權(quán)利要求5的DNA的表達載體。
7．一種用權(quán)利要求6的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8．一種含有權(quán)利要求1的蛋白酶變體的清潔用組合物。
9．一種含有權(quán)利要求1的蛋白酶變體的動物飼料。
10．一種含有權(quán)利要求1的蛋白酶變體的用于處理紡織品的組合物。
11．一種蛋白酶變體，其在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強或負(fù)電性更弱，并且該蛋白酶變體在高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
12．權(quán)利要求11的蛋白酶變體，其中該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
13．根據(jù)權(quán)利要求11的蛋白酶變體，其來源于芽孢桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的蛋白酶變體，其來源于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶。
15．一種編碼權(quán)利要求11的蛋白酶變體的DNA。
16．一種編碼權(quán)利要求15的DNA的表達載體。
17．一種用權(quán)利要求16的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
18．一種含有權(quán)利要求11的蛋白酶變體的清潔用組合物。
19．一種含有權(quán)利要求11的蛋白酶變體的動物飼料。
20．一種含有權(quán)利要求11的蛋白酶變體的用于處理紡織品的組合物。
21．權(quán)利要求1的蛋白酶變體，其中高去污劑濃度高于洗滌用水中2000ppm的濃度。
22．一種產(chǎn)生在低、中及高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效的蛋白酶變體的方法，包括a)置換一個或多個殘基位置的氨基酸，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強或負(fù)電性更弱；b)置換一個或多個殘基位置的氨基酸，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強或正電性更弱；c)檢測該變體，測定它在高、中及低去污劑濃度體系中與前體蛋白酶相比的有效性；及d)必要時重復(fù)步驟a)-c)，產(chǎn)生在低、中及高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效的蛋白酶變體。
23．一種蛋白酶變體，其在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強或負(fù)電性更弱，并且該蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
24．一種蛋白酶變體，其在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強或正電性更弱，并且該蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
全文摘要
公開了由天然存在的或重組的非人類蛋白酶的DNA序列衍生的新型蛋白酶變體。變異蛋白酶的獲得方法通常是,對編碼天然存在的或重組的蛋白酶的前體DNA序列進行體外修飾,在前體蛋白酶的氨基酸序列中引起多處氨基酸殘基的置換。提供了如下蛋白酶變體,其在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換,該置換改變了該位置的電荷。使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強或正電性更弱,因此該蛋白酶變體在低去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。也提供了如下蛋白酶變體,其在一個或多個殘基位置處含有氨基酸置換,該置換改變了該位置的電荷,使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強或負(fù)電性更弱,因此該蛋白酶變體在高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
文檔編號C11D7/42GK1279721SQ98811435
公開日2001年1月10日 申請日期1998年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月23日
發(fā)明者A·J·寶露斯, V·夏蘭伯格, J·T·小凱利斯, C·培馳, J·納德尼, D·P·納奇, R·M·卡爾德威爾, K·D·科里爾 申請人:金克克國際有限公司