專利名稱：來自糖絲菌的內(nèi)切－β－1,4－葡聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自糖絲菌菌株的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶制劑，編碼內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的分離多核苷酸分子，用重組技術(shù)產(chǎn)生的分離酶，以及這些制劑或酶在洗滌劑、紙和紙漿、石油鉆探、石油提煉、酒和果汁、食品配料、動物飼料和紡織工業(yè)中的用途。發(fā)明背景纖維素是由β-1，4-糖苷鍵連接的葡萄糖多聚體。纖維素鏈形成許多分子內(nèi)和分子間氫鍵，這導(dǎo)致形成不溶性纖維素微絲。從纖維素到葡萄糖的微生物水解過程涉及以下三種主要種類的纖維素酶(i)隨機(jī)裂解纖維素分子內(nèi)的β-1，4-糖苷鍵的內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)；(ii)從非還原末端消化纖維素并釋放纖維二糖的纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)；及(iii)水解纖維二糖和低分子量纖維糊精并釋放葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。纖維素酶由許多微生物產(chǎn)生，并常以多種形式出現(xiàn)。纖維素酶促降解之經(jīng)濟(jì)重要性的認(rèn)識促進(jìn)了廣泛尋找可供工業(yè)使用的微生物纖維素酶。因此研究了大量纖維素酶的酶促特性和一級結(jié)構(gòu)。基于催化結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的疏水簇分析結(jié)果，已將這些纖維素酶歸于糖基水解酶的不同家族；真菌和細(xì)菌糖基水解酶已分成35個家族(Henrissat et.al.(1991)，(1993))。大部分纖維素酶由纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)和催化結(jié)構(gòu)域(CAD)組成，它們之間由可能富含脯氨酸和羥氨基殘基的連接子間隔開?；谒鼈僀BD的相似性(Gilkes等，(1991))，建立了纖維素酶的另外分類，即劃分為糖基水解酶的5個家族(I-V)。
纖維素酶由包括真菌、放線菌、粘細(xì)菌和真細(xì)菌在內(nèi)的許多微生物合成，也可由植物合成。尤其是已鑒定了有廣泛特異性的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶。許多細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶已有描述(Henrissat(1993)；Gilbert等，(1993)。
按照NCBI分類學(xué)瀏覽器(網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.Nih。gov/Taxonomy/tax.html)，分類學(xué)上的假諾卡氏菌科屬于革蘭氏陽性菌綱(硬壁菌門)放線菌目，包括放線動孢菌、放線多孢菌、無枝酸菌、擬無枝酸菌、擬孢囊菌、假諾卡氏菌、糖單孢菌、糖多孢菌、糖絲菌和熱密卷菌等屬。按涉及核糖體數(shù)據(jù)方案的細(xì)菌和Archaea的分類學(xué)(B.L.Maidak等，(1996)核酸研究2482-85)，革蘭氏陽性菌門、高G+C摩爾百分比亞門包括鏈霉菌屬種群(如世田北里孢菌，白淺灰鏈霉菌，淺青紫鏈霉菌，纖維黃鏈霉菌(Streptomyces celluflavus)，黃灰鏈霉菌和灰色鏈霉菌、節(jié)桿菌屬種群(如糞肥纖維單孢菌，凝膠纖維單孢菌，產(chǎn)黃纖維單孢菌和潮濕纖維單孢菌)和糖多孢菌屬種群(如彎曲高溫單孢菌，中溫簇形高溫單孢菌，肌醇小單孢菌，澳大利亞糖絲菌，長孢糖絲菌，易變糖絲菌，地中海擬無枝酸菌和白擬諾卡氏菌)。
纖維素分解酶的一項重要工業(yè)用途是用于處理纖維素紡織品或織物，如作為洗滌劑組合物或織物柔軟劑組合物的成分、用于新織物(服裝整理)的生物拋光及用于獲得含纖維素織物，尤其是粗紋斜棉布的“石洗”外觀，已提出了進(jìn)行這些處理的多種方法，如在GB-A-1 368599、EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876、WO91/17243、WO91/10732、WO91/17244、PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132中。纖維素分解酶的另一重要工業(yè)用途是用于紙漿的處理，如用于改善排水或用于再循環(huán)紙的脫墨。
一直需要有新型纖維素酶或酶制劑可用于纖維素酶(優(yōu)選內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶)的活性是合乎需要的應(yīng)用中。
本發(fā)明的目的是提供在弱酸至堿性條件下具實(shí)質(zhì)性的纖維素分解活性，并在紙漿加工、紡織品處理、洗衣過程、抽提過程或動物飼料中具改善特性的新型酶或酶組合物；優(yōu)選的是可用或用重組技術(shù)高產(chǎn)率產(chǎn)生的具這種新型良好特性的內(nèi)切葡聚糖酶。發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)屬于糖絲菌屬的許多菌株產(chǎn)生具實(shí)質(zhì)性的纖維素分解活性的酶，即糖絲菌內(nèi)源的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，發(fā)明者已成功地克隆和表達(dá)了編碼該酶的DNA序列。
因此，本發(fā)明首先涉及含具內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性之酶的酶制劑，該酶可獲自糖絲菌屬菌株或是其內(nèi)源酶，優(yōu)選選自以下種類的菌株澳大利亞糖絲菌、德克薩斯糖絲菌、外外安德糖絲菌、喜冷糖絲菌、黃糖絲菌、淡藍(lán)褐糖絲菌、長孢糖絲菌、易變糖絲菌莢膜亞種、氣生菌落糖絲菌、易變糖絲菌易變亞種、丁香糖絲菌、糖絲菌之種。其次，本發(fā)明涉及編碼具內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性之酶或酶核心(即酶的催化活性結(jié)構(gòu)域)的分離多核苷酸分子，優(yōu)選DNA分子，其選自以下分子(a)含SEQ ID NO1第676-1470位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子，(b)所編碼多肽與SEQ ID NO2第226-490位氨基酸序列具至少80％同一性的多核苷酸分子，及(c)(a)或(b)的簡并核苷酸序列；優(yōu)選在中度嚴(yán)格條件下可與變性雙鏈DNA探針雜交的多核苷酸分子，其中的探針選自含SEQ ID NO1第676-1470位所示序列的DNA探針和含SEQ ID NO1第676-1470位的亞序列、長度至少約為100個堿基對的DNA探針。
含編碼本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶之DNA序列的質(zhì)粒pSJ1678已被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株中，該菌株由發(fā)明者按為專利步驟目的而定的國際公認(rèn)微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年3月17日保藏于德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig，聯(lián)邦德國，保藏號DSM11476。
在第三、四和五方面，本發(fā)明提供了含有DNA區(qū)段的表達(dá)載體，所述DNA區(qū)段例如是本發(fā)明的多核苷酸分子；含該DNA區(qū)段或該表達(dá)載體的細(xì)胞；及產(chǎn)生具纖維素分解活性之酶的方法，該方法包括在允許此酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收此酶。
在另一方面，本發(fā)明提供了具纖維素分解活性的分離酶，其特征在于(i)無同源雜質(zhì)及(ii)由上述方法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，它或者是由澳大利亞糖絲菌IFO 14444產(chǎn)生的多肽，或者是含SEQ ID NO2第226-490位所示氨基酸序列的多肽，或是與這些多肽中任一種至少有75％同源性的類似物，或是通過一個或幾個氨基酸的取代、刪除或添加而衍生自這些多肽中任一種的多肽，或是與針對純化形式的這些多肽中任一種產(chǎn)生的多克隆抗體具免疫反應(yīng)性的多肽。
此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明酶和酶制劑在工業(yè)應(yīng)用中的用途，諸如用于在家用或工業(yè)用傳統(tǒng)洗衣過程中所需的洗滌劑組合物或織物柔軟劑組合物中；用于工業(yè)清洗過程中；用于紡織工業(yè)中以改善纖維素纖維或織物的性能或提供斜紋粗棉布的石洗外觀。
本發(fā)明還涉及含纖維素酶編碼DNA序列的大腸桿菌菌株DSM11476之分離的基本上純的生物培養(yǎng)物(克隆到大腸桿菌DSM11476內(nèi)質(zhì)粒pSJ1678中的DNA序列之纖維素酶編碼部分衍生自澳大利亞糖絲菌)，或所說大腸桿菌菌株的任何突變體。發(fā)明詳述本發(fā)明的酶或酶制劑可獲自糖絲菌屬菌株或是其內(nèi)源酶，優(yōu)選以下種類澳大利亞糖絲菌、德克薩斯糖絲菌、外外安德糖絲菌、喜冷糖絲菌、黃糖絲菌、淡蘭褐糖絲菌、長孢糖絲菌、易變糖絲菌莢膜亞種、氣生菌落糖絲菌、易變糖絲菌易變亞種、丁香糖絲菌、糖絲菌之種。有用菌株的實(shí)例是澳大利亞糖絲菌IFO 14444、德克薩斯糖絲菌NRRL B-16134、外外安德糖絲菌NRRL B-16159、喜冷糖絲菌NRRL B-16238、糖絲菌之種IFO 13785、黃糖絲菌ATCC 29533、淡藍(lán)褐糖絲菌(青藍(lán)褐馬杜拉放線菌)ATCC 35108或DSM 43679、長孢糖絲菌(長孢馬杜拉放線菌)ATCC 31109或DSM 43749、易變糖絲菌易變亞種ATCC31520、氣生菌落糖絲菌ATCC 23870、易變糖絲菌莢膜亞種ATCC 23892、易變糖絲菌DSM 40225或DSM 43853、丁香糖絲菌DSM 43886。
本發(fā)明的酶和酶制劑在一寬pH范圍內(nèi)是有活性的，優(yōu)選在大約pH4-11之間有活性，更優(yōu)選在大約pH5.5-10之間有活性。
在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的酶或酶制劑屬于糖基水解酶家族6(Henrissat等，文獻(xiàn)同上)。
在本篇上下文中，術(shù)語“表達(dá)載體”指含目的多肽編碼區(qū)段及與其可操作相連提供其轉(zhuǎn)錄的額外區(qū)段的線性或環(huán)狀DNA分子。這些額外區(qū)段可能包括啟動子和終止子序列，并可選擇性地包括一個或多個復(fù)制起點(diǎn)、一個或多個選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號，等等。表達(dá)載體通常來源于質(zhì)粒或病毒DNA，或可包括二者的元件在內(nèi)。本發(fā)明的表達(dá)載體可以是任何便于進(jìn)行重組DNA操作的表達(dá)載體，載體的選擇常決定于它將引入的宿主細(xì)胞。因而，該載體可為自主復(fù)制型載體，即作為一染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒?；蛘撸d體可以是這樣一種形式，當(dāng)將其引入宿主細(xì)胞時，可以整合入宿主細(xì)胞基因組中并與其整合入的染色體一起復(fù)制。
此處有關(guān)多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)時所用的術(shù)語“重組體表達(dá)”或“重組表達(dá)”是按本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)定義限定的。蛋白質(zhì)的重組表達(dá)通常是利用上文剛提到的表達(dá)載體進(jìn)行的。
當(dāng)用于多核苷酸分子時，術(shù)語“分離的”表示已脫離天然環(huán)境因而無其它外源或不希望有的編碼序列的多核苷酸，它處于適用于基因工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)的形式。這種分離分子是那些分離自其天然環(huán)境的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子不含通常與它們相關(guān)的其它基因，但可以包括諸如啟動子和終止子之類的天然5′和3′非翻譯區(qū)。相關(guān)區(qū)域的鑒定對本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員將是明顯的(見例如Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。術(shù)語“分離的多核苷酸”或者可稱為“克隆的多核苷酸”。
當(dāng)用于蛋白質(zhì)/多肽時，術(shù)語“分離的”表明該蛋白質(zhì)處于非其天然環(huán)境下的狀態(tài)。在優(yōu)選的形式中，該分離的蛋白質(zhì)基本上不含其它蛋白質(zhì)，尤其是無其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(見下文))。優(yōu)選提供純度高于40％的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選提供純度超過60％的蛋白質(zhì)。
甚至更優(yōu)選提供高度純化形式的蛋白質(zhì)，即用SDS-PAGE測定純度高于80％，更優(yōu)選純度高于95％，還更優(yōu)選純度高于99％。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)/多肽”或者可稱為“純化的蛋白質(zhì)/多肽”。
術(shù)語“同源雜質(zhì)”意指來自最初得到本發(fā)明多肽的同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(如除本發(fā)明多肽之外的其它多肽)。
此處所用與特定微生物來源相關(guān)的術(shù)語“獲自”指由該特定來源產(chǎn)生的多核苷酸和/或多肽，或已插入此來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸和/或多肽。
當(dāng)指DNA區(qū)段時，術(shù)語“可操作連接”表示該區(qū)段被連接在一起的方式使得它們所起作用與它們原預(yù)期目的一致，如轉(zhuǎn)錄起始于啟動子，通過編碼部分直到終止子。
術(shù)語“多核苷酸”表示以5′到3′末端閱讀的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈多聚體。多核苷酸包括RNA和DNA，可分離自天然來源、體外合成或制備自天然和合成分子聯(lián)合體。
術(shù)語“多核苷酸分子的互補(bǔ)物”是指與參照序列相比具互補(bǔ)堿基序列并反向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′與5′CCCGTGCAT3′互補(bǔ)。
術(shù)語“簡并核苷酸序列”是指包括一個或多個簡并密碼子(與編碼多肽的參照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。簡并密碼子包括不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(即，GAU和GAC三聯(lián)體均編碼天冬氨酸)。
術(shù)語“啟動子”表示基因的一部分，它所包括的DNA序列可用于結(jié)合RNA聚合酶并起始轉(zhuǎn)錄。啟動子序列通常，但并非總是，存在于基因的5′非編碼區(qū)。
術(shù)語“分泌信號序列”表示編碼多肽(“分泌肽”)的DNA序列，該多肽作為更大多肽的一個組分，可指導(dǎo)該更大多肽穿過合成它的細(xì)胞的分泌途徑。在通過分泌途徑的時候，該更大的肽通常被裂解去除了分泌肽。多核苷酸在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的分離多核苷酸在至少是中度嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO1相似大小區(qū)域或其互補(bǔ)序列雜交。
具體地說，本發(fā)明的多核苷酸在至少是中度嚴(yán)格條件下、優(yōu)選如下詳述的高度嚴(yán)格條件下可與下述變性雙鏈DNA探針雜交包含SEQ IDNO1第676-1470位所示全長序列的探針，或含SEQ ID NO1中至少長為約100個堿基對的亞序列的任何探針。測定中度或高度嚴(yán)格條件下核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間雜交情況的合適實(shí)驗條件包括將含有需雜交之DNA片段或RNA的濾膜預(yù)浸泡于5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等，1989)10分鐘，并于5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲處理鮭精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中預(yù)雜交該濾膜，然后在含10ng/ml隨機(jī)引發(fā)的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)1326-13)、32P-dCTP標(biāo)記的(比活性高于1×109cpm/μg)探針的同樣溶液中約45℃雜交12小時。濾膜隨后在2×SSC、0.5％SDS中洗兩次，每次30分鐘，洗滌溫度至少60℃(中度嚴(yán)格條件)，更優(yōu)選至少65℃(中/高度嚴(yán)格條件)，還更優(yōu)選至少70℃(高度嚴(yán)格條件)，更優(yōu)選至少75℃(極高嚴(yán)格條件)。
用X-射線膠片檢測在這些條件下與寡核苷酸探針能雜交上的分子。
如前面所提到的，本發(fā)明的分離多核苷酸包括DNA和RNA。分離DNA和RNA的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的?？捎帽绢I(lǐng)域已知方法從基因庫或DNA文庫中克隆編碼目的基因的DNA和RNA。
隨后用例如雜交或PCR方法鑒定和分離編碼本發(fā)明具內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了來自不同細(xì)菌菌株的多肽和多核苷酸對應(yīng)物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。特別感興趣的是來自革蘭氏陽性嗜堿菌株，包括糖絲菌屬菌株的內(nèi)切葡聚糖酶多肽。
將本發(fā)明提供的信息和組合物與常規(guī)克隆技術(shù)相結(jié)合可克隆本發(fā)明具內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的物種同系物。例如，本發(fā)明的DNA序列可用來自表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞類型的染色體DNA進(jìn)行克隆?？捎冒创颂幑_序列設(shè)計的探針通過探測RNA印跡鑒別DNA的合適來源。隨后從陽性細(xì)胞系的染色體DNA制備文庫。編碼具內(nèi)切葡聚糖酶活性之多肽的本發(fā)明DNA序列可隨后用各種方法分離，諸如用按本說明書和權(quán)利要求書中公開序列設(shè)計的探針進(jìn)行探測，或用基于公開序列的一套或多套簡并探針進(jìn)行探測。本發(fā)明的DNA序列也可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR(Mullis，美國專利號4,683,202)，用設(shè)計自本文公開序列的引物進(jìn)行克隆。在另外的方法中，可用DNA文庫轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并用針對內(nèi)切葡聚糖酶的抗體(單克隆或多克隆抗體)檢測目的DNA的表達(dá)，該內(nèi)切葡聚糖酶克隆自澳大利亞糖絲菌IFO14444，按材料和方法及實(shí)施例1和3中所述方法表達(dá)和純化；或者可通過涉及有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的活性測定檢測目的DNA的表達(dá)。
克隆入大腸桿菌DSM 11476中質(zhì)粒pSJ 1678的DNA序列的內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分和/或本發(fā)明的類似DNA序列可克隆自產(chǎn)生具內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的澳大利亞糖絲菌菌株，優(yōu)選菌株IFO 14444，或克隆自如本文所述的其它或相關(guān)生物。
或者，以可獲自大腸桿菌DSM 11476中質(zhì)粒的DNA序列(被認(rèn)為與附加的SEQ ID NO1完全相同)為基礎(chǔ)可構(gòu)建類似序列，如是它的亞序列，并且/或者可通過引入核苷酸取代而構(gòu)建類似序列，這些核苷酸取代不會使該DNA序列編碼的甘露聚糖酶的氨基酸序列不同，但符合預(yù)期用于生產(chǎn)該酶的宿主生物的密碼子用法，或者可通過引入會產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代而構(gòu)建類似序列(即本發(fā)明甘露聚糖降解酶的變體)。多肽SEQ ID NO2中氨基酸第226-490位的序列是催化活性結(jié)構(gòu)域的成熟內(nèi)切葡聚糖酶序列。
本發(fā)明還提供與SEQ ID NO2多肽基本同源的內(nèi)切葡聚糖酶多肽及其物種同系物(直向同系物或共生同系物)。此處所用的術(shù)語“基本同源”表示多肽與SEQ ID NO2的氨基酸第226-490位的序列或者它們的直向同系物或共生同系物的序列同一性達(dá)75％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％的多肽。這些多肽將更優(yōu)選與SEQ ID NO2的氨基酸第226-490位或它的直向同系物或共生同系物所示序列至少具95％同一性的多肽，最優(yōu)選具98％或更大同一性的多肽。序列同一性百分率是用常規(guī)方法，通過本領(lǐng)域已知的計算機(jī)程序進(jìn)行測定的，諸如GCG程序包(Wisconsin Package的程序手冊，第8版，1994年8月，遺傳計算機(jī)組，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)提供的GAP，該程序包公開于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物學(xué)雜志，48，443-453，在此全文引用作為參考。GAP與以下設(shè)置一起用于多肽序列比較缺田產(chǎn)生罰分3.0及缺口延伸罰分0.1。
通過相似方法測定多核苷酸分子的序列同一性，將帶以下設(shè)置的GAP用于DNA序列比較缺口產(chǎn)生罰分5.0及缺口延伸罰分0.3。
基本同源的蛋白質(zhì)和多肽其特征在于具有一個或多個氨基酸取代、刪除或添加。這些改變優(yōu)選影響較小的變換，即保守氨基酸取代(見表2)及其它不會嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)或多肽的折疊和活性的取代；小的刪除，通常是1-約30個氨基酸的小刪除；及小的氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端甲硫氨酸殘基，長達(dá)約20-25個殘基的小連接肽，或便于純化的小延伸(親和標(biāo)記)，如多組氨酸束、蛋白A(Nilsson等，EMBOJ.41075，1985；Nilsson等，酶學(xué)方法，1983，1991)。通常參閱，F(xiàn)ord等人，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化295-107，1991，在此引用作為參考。編碼親和標(biāo)記的DNA可從產(chǎn)品供應(yīng)商處購買到(如，PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)。
然而，即便上述優(yōu)選的變化是影響較小的改變，這些改變也可以是影響較大的改變，如將長達(dá)300個氨基酸或更長的較大多肽作為氨基或羧基端延伸融合到具內(nèi)切葡聚糖酶活性的本發(fā)明多肽上。表1保守氨基酸取代堿性氨基酸 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性氨基酸 谷氨酸天冬氨酸極性氨基酸 谷氨酰胺天冬酰胺疏水性氨基酸亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族氨基酸苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小氨基酸甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸除20種基本氨基酸之外，也可用非基本氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)取代本發(fā)明多肽的氨基酸殘基。也可用有限數(shù)量的非保守氨基酸、非遺傳密碼編碼的氨基酸及非天然氨基酸取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷币言诘鞍踪|(zhì)合成后被修飾，且/或在它們側(cè)鏈上有不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸可以化學(xué)合成，或優(yōu)選地購買得到，包括六氫吡啶羧酸、四氫噻唑羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、及3，3-二甲基脯氨酸。
本發(fā)明之內(nèi)切葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸可按本領(lǐng)域已知步驟進(jìn)行鑒別，如定位誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085，1989)。在后一技術(shù)中，在分子的每個殘基位置處引入單個丙氨酸突變，檢測所產(chǎn)生的突變分子的生物學(xué)活性(即內(nèi)切葡聚糖酶活性)以鑒別對分子活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。也可參閱，Hilton等，生物化學(xué)雜志2714699-4708，1996。酶的活性位點(diǎn)或其它生物學(xué)相互作用也可通過對用諸如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記之類技術(shù)測定的結(jié)構(gòu)的物理分析連同假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變進(jìn)行測定。參閱，例如，de Vos等人，科學(xué)255306-312，1992；Smith等人，分子生物學(xué)雜志224899-904，1992；Wlodaver等人，F(xiàn)EBS Lett.30959-64，1992。必需氨基酸的位置也可從涉及本發(fā)明多肽的多肽同源性分析中推斷。
可用已知的誘變、重組和/或重排方法及隨后的相關(guān)篩選步驟進(jìn)行多個氨基酸取代和檢測，這些方法例如有Reidhaar-Olson和Sauer(科學(xué)24153-57，1988)、Bowie和Sauer(美國國家科學(xué)院院報862152-2156，1989)、WO 95/17413或WO 95/22625所公開的技術(shù)。簡要地說，這些作者公開了使多肽中兩個或多個位置同時隨機(jī)化，或進(jìn)行不同突變的重組/重排(WO95/17413，WO95/22625)，隨后從功能上選擇多肽，然后將誘變多肽測序以測定每個位置可允許取代的范圍。其它可用的方法包括噬菌體展示(如Lowman等，生物化學(xué)3010832-10837，1991；Ladner等，美國專利號5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和定位誘變(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
上面公開的誘變/重排方法可與大容量、自動篩選方法結(jié)合，以檢測宿主細(xì)胞中克隆的誘變多肽的活性。編碼活性多肽的誘變DNA分子可從宿主細(xì)胞中回收，并用現(xiàn)代設(shè)備迅速測序。這些方法可快速測定目的多肽中各個氨基酸殘基的重要性，并可用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
利用上述方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能鑒定和/或制備與SEQ IDNO2之226-490位殘基基本同源并保留野生型蛋白質(zhì)之內(nèi)切葡聚糖活性的各種多肽。
除含催化結(jié)構(gòu)域的酶核心外，本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶還可包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，該纖維素結(jié)合結(jié)合域和該酶的酶核心(催化活性結(jié)構(gòu)域)可操作連接。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)可作為所編碼之酶的內(nèi)在部分存在，或者可將另一來源的CBD引入內(nèi)切葡聚糖酶中，從而產(chǎn)生酶雜合體。在本文中，術(shù)語“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”應(yīng)按Peter Tomme等人[《不溶性碳水化合物的酶促降解》一書中，“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分類和特性”，John N.Saddler和Michael H.Penner(編)，ACSSymposium Series，No.618，1996]的定義理解。這一定義將120種以上的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域歸為10個家族(I-X)，并證實(shí)在諸如纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和殼多糖酶之類的多種酶中有CBD。在藻類，如紅藻Porphyra purpurea中也已找到了作為非水解性多糖結(jié)合蛋白質(zhì)的CBD，參閱Tomme等人，出處同前。然而，大部分CBD是來自纖維素酶和木糖聚酶，CBD可存在于蛋白質(zhì)的N和C末端或在其內(nèi)部。參閱如WO90/00609和WO95/16782，本領(lǐng)域已知有酶雜合體的形式，通過將含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的編碼DNA至少一個片段、及通過或不通過連接子與之相連的內(nèi)切葡聚糖酶編碼DNA序列的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并培養(yǎng)此宿主細(xì)胞以表達(dá)融合基因，可制備酶雜合體。酶雜合體可用以下公式描述CBD-MR-X其中CBD是相應(yīng)于至少為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)域；MR是中間區(qū)域(連接子)，可以是一個鍵，或一個短的連接基團(tuán)，優(yōu)選約2-100個碳原子長的，更優(yōu)選2-40個碳原子長；MR或者優(yōu)選約2-100個氨基酸長，更優(yōu)選2-40個氨基酸長；而X是本發(fā)明第一或第二DNA序列所編碼多肽的N-末端或C-末端區(qū)域。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多核苷酸分子進(jìn)一步包含編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的部分DNA序列。這樣的部分DNA序列的例子有，相應(yīng)于SEQ ID NO1第60-435位核苷酸的序列或克隆至大腸桿菌DSM 11476內(nèi)質(zhì)粒pSJ1678中的DNA序列的CBD編碼部分。本發(fā)明之分離多核苷酸分子可進(jìn)一步含有編碼連接區(qū)的部分核苷酸序列，該連接區(qū)與所述分離多核苷酸分子所含核苷酸序列編碼的酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)和催化活性結(jié)構(gòu)域(CAD)可操作連接。優(yōu)選地，連接區(qū)由約2-120個氨基酸殘基組成，尤其是由10-80個氨基酸殘基組成。
包括上述部分DNA序列在內(nèi)的本發(fā)明多核苷酸分子可用標(biāo)準(zhǔn)方法例如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗室手冊，冷泉港實(shí)驗室；冷泉港，紐約)所述的那些方法，克隆自大腸桿菌菌株DSM11476。
本發(fā)明的多核苷酸分子和它的部分DNA序列還可用任何普通方法進(jìn)行克隆，包括_在合適載體中克隆來自任何生物的DNA文庫，優(yōu)選原核生物，更優(yōu)選來自細(xì)菌，更優(yōu)選來自革蘭氏陽性細(xì)菌，尤其是來自放線菌綱的菌株，更特別是來自假諾卡氏菌科的菌株，例如來自糖絲菌屬，特別是來自澳大利亞糖絲菌的DNA文庫，所述生物體預(yù)期會產(chǎn)生目的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，_用所說載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，_在合適的條件中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，以表達(dá)由DNA文庫中克隆所編碼的任何目的酶，_通過測定這些克隆所產(chǎn)生之酶的纖維素分解活性篩選陽性克隆，并_從這樣的克隆中分離編碼該酶之DNA。
或者，按照眾所周知的步驟，通過使用依據(jù)可獲自大腸桿菌DSM11476內(nèi)質(zhì)粒的DNA序列制備的合成寡核苷酸探針，可從合適來源，如下述任一種生物，方便地克隆本發(fā)明編碼纖維素酶的DNA。
怎樣使用本發(fā)明的序列來得到其它的相關(guān)序列此處所公開的涉及編碼本發(fā)明內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶之多核苷酸序列的序列信息可作為工具用于鑒別其它同源甘露聚糖酶。例如，可用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，從多種微生物來源，特別是各種糖絲菌擴(kuò)增編碼其它同源甘露聚糖酶的序列。免疫交叉反應(yīng)性可通過使用純化的纖維素分解酶制備將用于測定免疫交叉反應(yīng)性的多克隆抗體，尤其是單特異性的多克隆抗體。更具體地說，可按以下文獻(xiàn)所述步驟通過免疫接種兔子(或其它嚙齒類)得到抗本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶的抗血清N.Axelsen等，《定量免疫電泳操作指南》，Blackwell科學(xué)出版社，1973，第23章；或A.Johnstone和R.Thorpe，實(shí)踐免疫化學(xué)，Blackwell科學(xué)出版社，1982(更明確的是第27-31頁)?？蓮目寡逯蝎@取純化的免疫球蛋白，例如通過鹽析(硫酸銨)，隨后用透析和離子交換層析，如用DEAE-Sephadex進(jìn)行?？捎肙utcherlony雙向擴(kuò)散分析(O.Ouchterlony，《實(shí)驗免疫學(xué)手術(shù)》(D.M.Weir編)，Blackwell科學(xué)出版社，1967，第655-706頁)或交叉免疫電泳(N.Axelsen等，見上，第3、4章)或火箭免疫電泳(N.Axelsen等，第2章)進(jìn)行蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)鑒定。
微生物的來源為了本發(fā)明的目的，此文就特定來源所用的術(shù)語“獲自”或“可獲自”意思是該酶產(chǎn)生自或可產(chǎn)生自特定來源或已插入該來源的基因的細(xì)胞。
目前認(rèn)為本發(fā)明的纖維素酶可獲自屬于假諾卡氏菌科的革蘭氏陽性細(xì)菌，尤其是糖絲菌屬的菌株，特別是澳大利亞糖絲菌菌株。
在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的纖維素酶獲自澳大利亞糖絲菌菌株IFO14444。目前認(rèn)為與本發(fā)明之酶同源的酶的DNA編碼序列可獲自屬于糖絲菌屬的其它菌株。
可產(chǎn)生本發(fā)明之內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的澳大利亞糖絲菌菌株分離物可公開獲自發(fā)酵研究所(IFO)，17-85 Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka 532，日本，保藏號IFO 14444。
此外，含編碼本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶之DNA序列的質(zhì)粒pSJ1678已被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株并進(jìn)行了保藏，保藏號為DSM 11476。
重組表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明所述酶的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是一種自主復(fù)制的載體，即以染色體外實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制過程，例如質(zhì)粒?；蛘?，載體可以是這樣一種類型，當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時，會部分或全部整合到宿主細(xì)胞基因組中，并與其整合入的染色體一起復(fù)制。
載體優(yōu)選是一種表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操縱地連接了DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加片段。一般來說，表達(dá)載體來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或者可以含有兩者的成分。術(shù)語“可操縱地連接”表明各片段的排列方式使其功能與它們的預(yù)期用途一致，例如，使轉(zhuǎn)錄在啟動子內(nèi)起始并貫穿編碼酶的DNA序列。
啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞內(nèi)顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可以來自編碼宿主細(xì)胞同源或異源蛋白質(zhì)的基因。
適用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的啟動子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖源淀粉酶基因的啟動子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子，枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的啟動子，或者短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動子，或者噬菌體λPR或PL啟動子，或大腸桿菌lac，trp或tac啟動子。
在必要時，編碼本發(fā)明酶的DNA序列也可以可操縱地連接合適的終止子。
本發(fā)明的重組載體還可以再含有使載體能在所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
載體也可以含有一個選擇性標(biāo)記，例如，一個其產(chǎn)物可補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，或者編碼抗例如卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等抗生素的基因，或者重金屬或除草劑的抗性基因。
為了指導(dǎo)本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供一個分泌信號序列(也稱為前導(dǎo)序列，前體序列或前序列)。分泌信號序列以正確閱讀框加接在編碼酶的DNA序列中。分泌信號序列通常置于編碼酶的DNA序列的5’端。它可以是正常情況下就與該酶相關(guān)聯(lián)的或者可以來自編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。
將編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動子和任選的終止子和/或分泌信號序列分別連接，或者通過合適的PCR擴(kuò)增方案組合這些序列，并將它們插入含有復(fù)制或整合必需信息的合適載體中的步驟，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見例如，Sambrook等，出處同前)。
宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞的克隆DNA序列可以是該選定宿主細(xì)胞的同源或異源序列。如果是宿主細(xì)胞的同源序列，即宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生的，一般將它可操縱連接另外的啟動子序列，或者，如果可行，則連接另外的分泌信號序列和/或終止子序列，而不是其天然的狀態(tài)。術(shù)語“同源”意指包括編碼所選宿主細(xì)胞內(nèi)源的酶的DNA序列。術(shù)語“異源”意指包括天然情況下宿主細(xì)胞不表達(dá)的DNA序列。因此，該DNA序列可以是來源于另一種微生物，或者可以是合成序列。
克隆DNA分子或者重組載體被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞可以是能夠表達(dá)所述酶的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。
經(jīng)過培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子是革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌屬的菌株，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；乳桿菌屬菌株；鏈球菌屬菌株；鏈霉菌屬的菌株，特別是淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌菌株。
細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或用感受態(tài)細(xì)胞依照已知方式進(jìn)行(參見Sambrook等，出處同前)。
當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)時，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，通常以不溶性顆粒存在(稱為包涵體)，或者可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)空間。前一種情況下，裂解細(xì)胞，收集顆粒，變性，隨后稀釋變性劑使酶重新折疊。后一種情況下，可以在例如超聲破碎或滲透壓休克破碎細(xì)胞以釋放壁膜間隙成分后，再回收酶，從而由壁膜間隙收集酶。
當(dāng)在如芽孢桿菌或鏈霉菌菌株等革蘭氏陽性細(xì)菌中表達(dá)酶時，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，或者被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到胞外培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)時可產(chǎn)生本發(fā)明之酶的真菌宿主細(xì)胞的例子是例如曲霉屬或鐮孢屬菌株，尤其是泡盛曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和尖鐮孢的菌株，或者是木霉屬菌株，優(yōu)選Trichoderma harzianum、Trichoderma reesei和綠色木霉。
可通過包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及細(xì)胞壁的再生在內(nèi)的過程以已知方式轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。曲霉屬菌株作為宿主細(xì)胞的用途可見于EP 238 023(Novo Nordisk A/S)中，此文內(nèi)容在此引入作為參考。
培養(yǎng)中能產(chǎn)生本發(fā)明酶的酵母來源宿主細(xì)胞的實(shí)例是如漢森酵母屬之種的菌株、克魯維酵母之種的菌株，尤其是乳酸克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母，畢赤酵母屬之種的菌株，酵母屬菌株，尤其是卡爾酵母、釀酒酵母、克魯弗酵母和葡萄汁酵母，裂殖酵母屬之種的菌株，尤其是非洲粟酒裂殖酵母，還有Yarrowia屬之種的菌株，尤其是Yarrowia lipolytica。
培養(yǎng)中能產(chǎn)生本發(fā)明酶的植物來源宿主細(xì)胞例子是如馬鈴薯或煙草的植物細(xì)胞。
生產(chǎn)纖維素分解酶的方法本發(fā)明提供一種生產(chǎn)本發(fā)明的分離酶的方法，其中，在允許該酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化了編碼該酶的DNA序列的合適宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收得到的酶。
如本文中的定義，一種分離的多肽(例如酶)是基本不含其它多肽的多肽，例如經(jīng)SDS-PAGE測定，至少約20％純，優(yōu)選至少約40％純，更優(yōu)選約60％純，甚至更優(yōu)選約80％純，最優(yōu)選約90％純，最最優(yōu)選約95％純。
術(shù)語“分離多肽”也可稱為“純化多肽”。
當(dāng)將含有編碼該酶的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到異源宿主細(xì)胞中時，就有可能異源重組生產(chǎn)本發(fā)明的酶。
由此，有可能制備很純或單組分的纖維素分解組合物，其特征在于不含同源雜質(zhì)。
本文中，同源雜質(zhì)是指來源于最初獲得本發(fā)明酶的同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(例如本發(fā)明酶之外的多肽)。
本發(fā)明的同源宿主細(xì)胞可以是澳大利亞糖絲菌的一個菌株。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于所選宿主細(xì)胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基。表達(dá)的纖維素分解酶可以方便地分泌到培養(yǎng)基中，并可以通過熟知的程序從中回收，包括通過離心或過濾將細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離出來，用鹽(例如硫酸銨)沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，隨后進(jìn)行如離子交換層析、親和層析等層析技術(shù)。
酶組合物更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及含有上述具纖維素分解活性的酶的酶組合物。
本發(fā)明的酶組合物，除包含本發(fā)明的纖維素酶之外，還可以含有一或多種其它酶類，例如半纖維素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶，其他纖維素酶或內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶組分，殼多糖酶、脂肪酶、酯酶、果膠酶、角質(zhì)酶、肌醇六磷酸酶、氧化還原酶(過氧化物酶，鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)，氧化酶，漆酶)、蛋白酶、淀粉酶、還原酶、酚氧化酶、木質(zhì)素酶(ligninase)、支鏈淀粉酶、果膠酸酯分解酶(pectate lyase)、木糖葡聚糖酶(xyloglucanase)、果膠乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、果膠分解酶、果膠甲酯酶、纖維素二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，或者其混合物。
酶組合物可以依照本領(lǐng)域已知方法制備，可以是液態(tài)或干性組合物形式。例如，酶組合物可以是顆?；蛭⒘Ｐ问?。包含在組合物中的酶可以用本領(lǐng)域已知方法穩(wěn)定化。
內(nèi)切葡聚糖酶在許多工業(yè)和應(yīng)用領(lǐng)域都有潛在的用途。以下給出了本發(fā)明酶組合物的優(yōu)選用途的例子。本發(fā)明酶組合物的劑量和它的其它使用條件可以依據(jù)本領(lǐng)域已知方法測定。
依照本發(fā)明的酶組合物可以用于下列目的中的至少一種。
用途在洗滌和穿著過程中，染色織物或服裝上的染料通常會從織物上滲出，這使得織物看起來比較陳舊和褪色。除去織物表面上的纖維可部分恢復(fù)織物的原色和外觀。本文所用的術(shù)語“顏色清晰化”是指通過多次洗滌循環(huán)而部分恢復(fù)織物或服裝的原色。
術(shù)語“去小球”指除去織物表面上的小球。
術(shù)語“浸泡液”是指可在進(jìn)行常規(guī)洗滌過程之前浸泡衣物的水溶液。浸泡液可含有洗滌或洗衣過程中常規(guī)使用的一種或多種成分。
術(shù)語“洗滌液”指在其中洗滌衣物的水溶液，這種衣物洗滌通常是通過手工或在洗衣機(jī)中聯(lián)合進(jìn)行化學(xué)和機(jī)械作用。洗滌液通常是粉狀或液態(tài)洗滌劑組合物的水溶液。
術(shù)語“漂洗液”指衣物在洗滌之后立即泡入或在其中處理以漂洗衣物(即基本上除去衣物上的洗滌劑溶液)的水溶液。漂洗液中可含有織物調(diào)理或柔軟化組合物。
可用本發(fā)明方法處理的衣物可以是常規(guī)的可洗滌衣物。優(yōu)選衣物的主要部分是由棉花、棉混紡紗或者天然或人工纖維素(如來源于含木聚糖之纖維素纖維，如來自紙漿)或其混合物制成的已縫制或未縫制的織物，包括針織物、機(jī)織物、粗斜紋布、紗線和毛巾布。混合物的例子是棉或人造絲/粘膠絲與一種或多種配對材料的混合物，所述配對材料例如是羊毛，合成纖維(如聚酰胺纖維，丙烯酸纖維，聚酯纖維，聚乙烯醇纖維，聚氯乙烯纖維，聚偏二氯乙烯纖維，聚氨基甲酸乙酯纖維，聚脲纖維，芳族聚酰胺纖維)，和含纖維素的纖維(如人造絲/粘膠絲，苧麻，大麻，亞麻/亞麻布，黃麻，醋酸纖維素纖維，lyocell)。
洗滌劑的公開內(nèi)容和實(shí)例本發(fā)明的洗滌劑組合物中含有表面活性劑體系，其中表面活性劑可以選自非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑和/或陽離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑和/或半極性表面活性劑。
表面活性劑一般以0.1-60％重量的量存在。
優(yōu)選將表面活性劑配制成與組合物中存在的酶組分相容。在液體或凝膠組合物中，最優(yōu)選以這樣的方式配制表面活性劑，致使它促進(jìn)或至少是不降低這些組合物中的任何酶的穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選體系包括本文中所述的作為表面活性劑的一種或多種非離子和/或陰離子表面活性劑。
烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯縮合物適合用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑，聚氧乙烯縮合物是優(yōu)選的。這些化合物包括具有含約6-14個碳原子，優(yōu)選約8-14個碳原子直鏈或支鏈構(gòu)型烷基的烷基酚與烯化氧的縮合產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)氧乙烷存在的量相當(dāng)每摩爾烷基酚約2-25摩爾，更優(yōu)選約3-15摩爾的環(huán)氧乙烷。這類市售的非離子表面活性劑包括由GAF Corporation銷售的IgepalTMCO-630；和均由Rohm & Haas Company銷售的TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102。這些表面活性劑通常被稱之為烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物(AE)適合用作本發(fā)明的非離子表面活性劑。該脂族醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈的、伯或仲的，并且通常含有約8-22個碳原子。優(yōu)選的是具有含約8-20個碳原子，更優(yōu)選約10-18個碳原子之烷基的醇與每摩爾醇約2-10摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。所述的縮合產(chǎn)物中每摩爾醇有約2-7摩爾的環(huán)氧乙烷，最優(yōu)選2-5摩爾的環(huán)氧乙烷?？蓮氖袌錾腺彽玫倪@類非離子表面活性劑的例子包括由Union Carbide Corporation銷售的TergitolTM15-S-9(C11-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)和TergitolTM24-L-6 NMW(C12-C14伯醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的窄分子量分布的縮合產(chǎn)物)；和由Shell Chemical Company銷售的NeodolTM45-9(C14-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM23-3(C12-C13直鏈醇與3.0摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-7(C14-C15直鏈醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-5(C14-C15直鏈醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；由Procter & Gamble Company銷售的KyroTMEOB(C13-C15醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；和由Hoechst銷售的Genapol LA050(C12-C14醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)。這些產(chǎn)物的HLB的優(yōu)選范圍是8-11，最優(yōu)選8-10。
也可用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是在US4565647中公開的烷基多糖，該多糖具有含約6-30，優(yōu)選約10-16個碳原子的疏水基團(tuán)和含約1.3-10，優(yōu)選約1.3-3，最優(yōu)選約1.3-2.7個糖單元的多糖如多糖苷親水基團(tuán)。可以使用任何含有5或6個碳原子的還原糖，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分代替葡萄糖基部分(任選地，在2-，3-，4-等位連接疏水基團(tuán)從而得到對應(yīng)于葡萄糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。該糖間鍵可以在，例如，附加糖單元的1位和前一糖單元的2-，3-，4-，和/或6-位之間。
優(yōu)選的烷基多糖苷具有下式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2選自烷基、烷基苯基、羥基烷基、羥基烷基苯基、和其混合物，其中烷基含有約10-18，優(yōu)選約12-14個碳原子；n是2或3，優(yōu)選2；t是0-約10，優(yōu)選0；x是約1.3-10，優(yōu)選約1.3-3，最優(yōu)選約1.3-2.7。該糖基優(yōu)選是從葡萄糖衍生的。為了制備這些化合物，先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)，從而形成葡糖苷(在1-位連接)。然后另外的糖基單元在其1-位置與前面的糖基單元2-，3-，4-，和/或6-位置，優(yōu)選主要在2-位之間連接。
環(huán)氧乙烷與通過環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合形成的疏水基之間的縮合產(chǎn)物也適合用作本發(fā)明的附加非離子表面活性劑體系。這些化合物的疏水部分的分子量優(yōu)選為約1500-1800并顯示出水不溶性。將聚氧乙烯部分加成到該疏水部分會增加整個分子的水溶性，在聚氧乙烯含量不超過該縮合產(chǎn)物總重量的約50％(相當(dāng)于與多達(dá)約40摩爾的環(huán)氧乙烷縮合)時，仍能保持該產(chǎn)品的液體性質(zhì)。這類化合物的例子包括某些可從市場上購得的由BASF銷售的PluronicTM表面活性劑。
也適合用作本發(fā)明非離子表面活性劑體系的非離子表面活性劑是環(huán)氧乙烷與從環(huán)氧丙烷和乙二胺反應(yīng)得到的產(chǎn)物的縮合產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的疏水部分由乙二胺和過量環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物組成，并且分子量一般是約2500-3000。該疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合，縮合程度為該縮合產(chǎn)物含有約40-80％重量的聚氧乙烯并且分子量為約5000-11000。這類非離子表面活性劑的例子包括某些可從市場上購得的由BASF銷售的TetronicTM化合物。
優(yōu)選用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是烷基酚的聚氧乙烯縮合物、伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、烷基多糖、和其混合物。最優(yōu)選的是具有3-15個乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10個乙氧基的C8-C18(優(yōu)選平均為C10)醇乙氧基化物、和其混合物。
非常優(yōu)選的非離子表面活性劑是下式的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑
其中R1是H，或R1是C1-4烴基、2-羥基乙基、2-羥基丙基或其混合物，R2是C5-31烴基，Z是具有直鏈烴基鏈、至少3個羥基直接連接到該鏈上的多羥基烴基，或其烷氧基化的衍生物。優(yōu)選地，R1是甲基，R2是直鏈C11-15烷基或C16-18烷基或鏈烯基鏈，例如椰油烷基，或其混合物，Z是在還原性胺化反應(yīng)中從還原糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖衍生的。
非常優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷基烷氧基化的硫酸鹽表面活性劑。其例子是式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羥基烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，A是乙氧基或丙氧基單元，m大于0，一般為約0.5-6，更優(yōu)選約0.5-3，M是H或陽離子，該陽離子可以是例如金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂離子等)、銨或取代銨陽離子。本文也涵蓋烷基乙氧基化硫酸鹽以及烷基丙氧基化硫酸鹽。取代銨陽離子的具體例子包括甲基、二甲基、三甲基銨陽離子和季銨陽離子如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子和從烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些陽離子等。舉例說明的表面活性劑是C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸鹽(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸鹽(C12-C18E(2.25)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸鹽(C12-C18E(3.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸鹽(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地選自鈉和鉀。
適用的陰離子表面活性劑是烷基酯磺酸鹽表面活性劑，包括按照“The Journal of the American Oil Chemists Society”，52(1975)，pp.323-329用氣態(tài)SO3磺化的C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直鏈酯。合適的原料包括從牛脂、棕櫚油等衍生的天然脂類物質(zhì)。
優(yōu)選的烷基酯磺酸鹽表面活性劑(尤其是用于洗衣用途的)包括下面結(jié)構(gòu)式的烷基酯磺酸鹽表面活性劑
其中R3是C8-C20烴基，優(yōu)選烷基，或其混合物，R4是C1-C6烴基，優(yōu)選烷基，或其混合物，M是與烷基酯磺酸根形成水溶性鹽的陽離子。合適的成鹽陽離子包括金屬陽離子(如鈉、鉀和鋰)和取代或未取代的銨陽離子(例如單乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。優(yōu)選地，R3是C10-C16烷基，R4是甲基、乙基或異丙基。特別優(yōu)選的是甲基酯磺酸鹽，其中R3是C10-C16烷基。
其它合適的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽表面活性劑，它們是式ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選是C10-C24烴基，優(yōu)選具有C10-C20烷基部分的烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，M是H或陽離子，例如堿金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰)，或銨或取代銨(如甲基、二甲基和三甲基銨)陽離子和季銨陽離子(例如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子，和從烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺和其混合物衍生的季銨陽離子)等。一般地，對于較低的洗滌溫度(例如低于約50℃)，C12-C16烷基鏈?zhǔn)莾?yōu)選的，而對于較高的洗滌溫度(例如高于約50℃)，C16-C18烷基鏈?zhǔn)莾?yōu)選的。
其它對洗滌目的有用的陰離子表面活性劑也可以包括在本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。它們可以包括皂的鹽(包括，例如鈉、鉀、銨、和取代的銨如單、二和三乙醇胺鹽)、C8-C22伯或仲烷烴磺酸鹽、C8-C24烯烴磺酸鹽、通過堿土金屬檸檬酸鹽熱解產(chǎn)物的磺化制備的磺化多羧酸(例如，如在英國專利說明書號1082179中所述的)、C8-C24烷基聚二醇醚硫酸鹽(含有多達(dá)10摩爾的環(huán)氧乙烷)；烷基甘油磺酸鹽、脂肪酰基甘油磺酸鹽、脂肪油基甘油硫酸鹽、烷基酚氧乙烯醚硫酸鹽、石蠟烴磺酸鹽、烷基磷酸鹽、羥乙磺酸鹽如?；u乙磺酸鹽、N-?；；撬猁}、烷基琥珀酰胺酸鹽和磺基琥珀酸鹽、磺基琥珀酸的單酯(特別是飽和和不飽和C12-C18單酯)和磺基琥珀酸的二酯(特別是飽和和不飽和C6-C12二酯)、?；“彼猁}、烷基多糖的硫酸鹽例如烷基多葡糖苷(下面所述的非離子型非硫酸化的化合物)的硫酸鹽、支鏈伯烷基硫酸鹽、和烷基多乙氧基羧酸鹽例如那些式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的鹽，其中R是C8-C22烷基，k是1-10的整數(shù)，M是形成水溶性鹽的陽離子。樹脂酸及氫化的樹脂酸也是合適的，例如松香酸、氫化松香酸，以及存在于或衍生于松漿油的樹脂酸和氫化樹脂酸。
烷基苯磺酸鹽是非常優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中烷基優(yōu)選含有10-18個碳原子。
其它例子描述于“Surface Active Agents and Detergents”(Vol.I and II，Schwartz，Perry and Berch)中。各種這樣的表面活性劑也一般性地公開于US3929678中(第23欄58行-第29欄23行，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)。
當(dāng)包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有約1-40％，優(yōu)選約3-20％重量的上述陰離子表面活性劑。
本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物也可以含有陽離子、兩性、兩性離子和半極性表面活性劑，以及上文中并未述及的非離子和/或陰離子表面活性劑。
適用于本發(fā)明洗衣洗滌劑組合物中的陽離子洗滌表面活性劑是具有一個長鏈烴基的那些表面活性劑。這樣的陽離子表面活性劑的例子包括銨表面活性劑例如烷基三甲基銨鹵化物，和具有下式的那些表面活性劑[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-其中R2是在烷基鏈中具有約8-18個碳原子的烷基或烷基芐基，每個R3選自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-、和其混合物；每個R4選自C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、由兩個R4連接在一起形成的芐基環(huán)結(jié)構(gòu)、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是己糖或分子量低于約1000的己糖聚合物，并且當(dāng)y不是0時為氫)；R5與R4所述相同或是烷基鏈，其中R2+R5的總碳原子數(shù)不大于約18；每個y是0-約10，且該y值的和是0至約15；X是任何相容的陰離子。
非常優(yōu)選的陽離子表面活性劑是具有下式的、在本發(fā)明組合物中有用的水溶性季銨鹽化合物R1R2R3R4N+X-(i)其中R1是C8-C16烷基，每個R2、R3和R4各自獨(dú)立地是C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、芐基和-(C2H4O)xH(其中x的值為2-5)，X是陰離子。R2、R3、R4中不多于1個是芐基。
R1的優(yōu)選烷基鏈長度是C12-C15，當(dāng)該烷基是從椰油或棕櫚仁脂衍生的鏈長度的混合物，或是通過烯烴合成或OXO醇合成而合成衍生的時尤為如此。
用于R2、R3和R4的優(yōu)選基團(tuán)是甲基和羥基乙基，陰離子X可以選自鹵素離子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根離子。
用于本文中的合適的式(I)季銨化合物的例子是
氯化或溴化椰油基三甲基銨；氯化或溴化椰油基甲基二羥基乙基銨；氯化癸基三乙基銨；氯化或溴化癸基二甲基羥基乙基銨；氯化或溴化C12-15二甲基羥基乙基銨；氯化或溴化椰油基二甲基羥基乙基銨；甲基硫酸肉豆蔻基三甲基銨；氯化或溴化月桂基二甲基芐基銨；氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4銨；膽堿酯(式(i)的化合物，其中R1是
烷基，R2、R3、R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。
其它在本文中有用的陽離子表面活性劑也描述于US4228044和EP000224中。
當(dāng)包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有約0.2-25％，優(yōu)選約1-8％重量的上述陽離子表面活性劑。
兩性表面活性劑也適用于本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可以概括地描述為仲或叔胺的脂族衍生物，或者雜環(huán)仲或叔胺的脂族衍生物，其中脂族基團(tuán)可以是直鏈或支鏈的。其中1個脂族取代基含有至少約8個碳原子，一般約8-18個碳原子，并且至少一個脂族取代基含有陰離子水型增溶基團(tuán)，例如羧基、磺酸基、硫酸基。見US3929678(第19欄18-35行)的兩性表面活性劑的例子。
當(dāng)包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有約0.2-15％重量，優(yōu)選約1-10％重量的上述兩性表面活性劑。
兩性離子表面活性劑也適用于本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可以概括地描述為仲或叔胺的衍生物，雜環(huán)的仲或叔胺的衍生物，或者季銨、季鏻或叔锍化合物的衍生物。見US3929678(第19欄38行-22欄48行)的兩性離子表面活性劑的例子。
當(dāng)包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有約0.2-15％重量，優(yōu)選約1-10％重量的上述兩性離子表面活性劑。
半極性非離子表面活性劑是一特殊類型的非離子表面活性劑，它們包括含有1個約10-18個碳原子的烷基部分和選自含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基的2個部分的水溶性氧化胺；含有1個約10-18個碳原子的烷基部分和選自含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基的2個部分的水溶性氧化膦；和含有1個約10-18個碳原子的烷基部分和1個選自含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基部分的水溶性亞砜。
半極性非離子表面活性劑包括具有下式的氧化胺表面活性劑
其中R3是含有約8-22個碳原子的烷基、羥基烷基、或烷基苯基，或其混合物；R4是含有約2-3個碳原子的亞烷基或羥基亞烷基或其混合物；x是0-約3；每個R5是含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基，或含有約1-3個氧乙烯基團(tuán)的多氧乙烯基。R5基團(tuán)可以彼此連接，例如通過氧或氮原子，從而形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
特別地，這些氧化胺表面活性劑包括氧化C10-C18烷基二甲基胺和氧化C8-C12烷氧基乙基二羥基乙基胺。
當(dāng)包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物一般含有約0.2-15％重量，優(yōu)選約1-10％重量的上述半極性非離子表面活性劑。
助洗劑體系本發(fā)明的組合物還可含有助洗劑體系。任何常規(guī)助洗劑體系都適用于本文中，其包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、多羧酸鹽和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸鹽的材料、金屬離子螯合劑例如氨基多膦酸特別是乙二胺四亞甲基膦酸和二乙三胺五亞甲基膦酸。盡管由于明顯的環(huán)境原因并不優(yōu)選，但本文中也可以使用磷酸鹽助洗劑。
合適的助洗劑可以是無機(jī)離子交換材料，通常是無機(jī)水合的硅鋁酸鹽材料，更具體地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。
另一種合適的無機(jī)助洗劑材料是層狀硅酸鹽例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的結(jié)晶層狀硅酸鹽。
合適的含有1個羧基的多羧酸包括乳酸、乙醇酸和其醚衍生物，如在比利時專利號831368、821369和821370中所公開的。含有2個羧基的多羧酸鹽包括琥珀酸、丙二酸、(亞乙二氧基)二乙酸、馬來酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富馬酸的水溶性鹽，以及在德國專利2446686和2446687及US3935257中所述的醚羧酸鹽，和在比利時專利號840623中所述的亞硫?；人猁}。含有3個羧基的多羧酸鹽包括具體地，水溶性檸檬酸鹽、烏頭酸鹽(aconitrate)和檸康酸鹽以及琥珀酸鹽衍生物，例如，在英國專利號1379241中所述的羧基甲氧基琥珀酸鹽，在荷蘭申請7205873中所述的乳氧琥珀酸鹽(lactoxysuccinate)，和氧多羧酸鹽材料例如在英國專利號1387447中所述的2-氧雜-1，1，3-丙三羧酸鹽。
含有4個羧基的多羧酸鹽包括在英國專利號1261829中公開的氧聯(lián)二琥珀酸鹽、1，1，2，2-乙四羧酸鹽、1，1，3，3-丙四羧酸鹽和1，1，2，3-丙四羧酸鹽。含有磺基取代基的多羧酸鹽包括在英國專利號1398421和1398422和US3936448中公開的磺基琥珀酸鹽衍生物、和在英國專利號1082179中所述的磺化的熱解檸檬酸鹽，而英國專利號1439000中公開了含有膦取代基的多羧酸鹽。
脂環(huán)和雜環(huán)多羧酸鹽包括環(huán)戊烷-順，順，順-四羧酸鹽、環(huán)戊二烯五羧酸鹽(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氫呋喃-順，順，順-四羧酸鹽、2，5-四氫呋喃-順-二羧酸鹽、2，2，5，5-四氫呋喃-四羧酸鹽、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸鹽和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸鹽包括苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和在英國專利號1425343中公開的苯二甲酸衍生物。
在上面的多羧酸鹽中，優(yōu)選的多羧酸鹽是每分子含有最多達(dá)3個羧基的羥基羧酸鹽，更具體地是檸檬酸鹽。
用于本發(fā)明組合物中的優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑例如沸石A或?qū)訝罟杷猁}(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸鹽螯合劑例如檸檬酸。
包括在本發(fā)明洗滌劑組合物中的合適的螯合劑包括乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其堿金屬、堿土金屬、銨或取代銨鹽，或其混合物。優(yōu)選的EDDS化合物是游離酸形式的和其鈉或鎂鹽。這樣的優(yōu)選EDDS鈉鹽的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。這樣的優(yōu)選EDDS鎂鹽的例子包括MgEDDS和Mg2EDDS。鎂鹽是最優(yōu)選包括在本發(fā)明組合物中的。
優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑例如沸石A和水溶性羧酸鹽螯合劑例如檸檬酸的混合物。
可以形成用于粒狀組合物的助洗劑體系中一部分的其它助洗劑材料包括無機(jī)材料例如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽，和有機(jī)材料例如有機(jī)膦酸鹽、氨基多亞烷基膦酸鹽和氨基多羧酸鹽。
其它合適的水溶性有機(jī)鹽是均聚或者共聚的酸或其鹽，其中該聚羧酸包括兩兩之間被不多于2個碳原子分開的至少兩個羧基。
這類聚合物公開于GB-A-1596756中。這類鹽的例子是MW 2000-5000的聚丙烯酸鹽和其與馬來酸酐的共聚物，這樣的共聚物具有20000-70000，特別是約40000的分子量。
洗滌助洗劑鹽的量通常為組合物重量的5-80％。用于液體洗滌劑的助洗劑的優(yōu)選量是5-30％。
酶除了本發(fā)明的酶制劑外，優(yōu)選洗滌劑組合物還含有提供清洗性能和/或織物護(hù)理益處的其它酶。
這樣的酶包括其它的蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
蛋白酶可以使用任何適用于堿性溶液的蛋白酶。合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的。微生物來源是優(yōu)選的。包括化學(xué)或基因改性的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是從芽孢桿菌衍生的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO 89/06270中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和描述于WO 89/06270中的鐮孢屬蛋白酶。
優(yōu)選的市售蛋白酶包括由Novo Nordisk A/S(Denmark)以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase銷售的那些，由Genencor International以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、和Purafect OXP銷售的那些，和由SolvayEnzymes以商品名Opticlean和Optimase銷售的那些。按組合物重量計，可以以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將蛋白酶摻入到本發(fā)明的組合物中。
脂肪酶可以使用任何適用于堿性溶液的脂肪酶。合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)或基因工程改性的突變體。
有用的脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如描述于EP258068和EP305216中的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如描述于EP238023中的，假絲酵母屬脂肪酶例如C.antarctica脂肪酶，例如描述于EP214761中的C.antarctica脂肪酶A或B，假單胞菌屬脂肪酶例如描述于EP 218272中的產(chǎn)堿假單胞菌和類產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶、例如描述于EP 331376中的洋蔥假單胞菌脂肪酶、例如公開于GB1372034中的司徒茨氏假單胞菌脂肪酶，熒光假單胞菌脂肪酶，芽孢桿菌脂肪酶例如枯草芽孢桿菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophsica acta 1131，253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢桿菌脂肪酶(WO 91/16422)。
此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等在1991年《基因》103，61-67上描述的沙門氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化學(xué)雜志，106，383-388)，和各種根霉屬脂肪酶例如德列馬根霉脂肪酶(Hass，M.J.等，(1991)，Gene 109，117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，Biosci.Biotech.Biochem.56，716-719)和米根霉脂肪酶。
其它類型的脂類分解酶，如角質(zhì)酶也是有用的，例如WO88/09367所述來自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶，來自Fusarium solani pisi的角質(zhì)酶(如WO90/09446所述)。
特別合適的脂肪酶是下面這些脂肪酶例如M1 LipaseTM、LumafastTM和LipomaxTM(Genecor)，LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NovoNordisk A/S)，和Lipase P“Amano”(Amano Pharmacetical Co.Ltd.)。
按組合物重量計，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將脂肪酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
淀粉酶可以使用適用于堿性溶液的任何淀粉酶(a和/或b)。合適的淀粉酶包括細(xì)菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)或基因工程改性的突變體。淀粉酶包括例如，在GB1296839中詳細(xì)描述的從地衣芽孢桿菌特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(從Novo Nordisk A/S得到)和RapidaseTM和Maxamyl PTM(從Genencor得到)。
按組合物重量計，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將淀粉酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
纖維素酶可以使用適用于堿性溶液的任何纖維素酶。合適的纖維素酶包括細(xì)菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)或基因工程改性的突變體。合適的纖維素酶公開于US4435307(其中公開了從Humicolainsolens生產(chǎn)的真菌纖維素酶)，WO96/34108和WO96/34092(其中公開了來自芽孢桿菌的細(xì)菌嗜堿性纖維素酶BCE103)，WO94/21801、US5,475,101和US5,419,778(其中公開了木霉的EGIII纖維素酶)中。特別合適的纖維素酶是具有顏色護(hù)理益處的纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是描述于歐洲專利申請0495257中的纖維素酶和本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶。市售的纖維素酶包括從一株Humicola insolens生產(chǎn)的CelluzymeTM和CarezymeTM(Novo Nordisk A/S)，KAC-500(B)TM(Kao Corporation)，以及PuradaxTM(Genecor International)。
按組合物重量計，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將纖維素酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
過氧化物酶/氧化酶過氧化物酶與過氧化氫或其源(例如過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)一起使用。氧化酶與氧一起使用。兩種類型的酶均可用于“溶液漂白”，即在洗滌液中一起洗滌，優(yōu)選與例如WO 94/12621和WO 95/01426中所述的增強(qiáng)劑一起洗滌所述織物時，防止染料從染色的織物轉(zhuǎn)移到另一織物上。合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)或基因工程改性的突變體。
按組合物重量計，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將過氧化物酶和/或氧化酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
在本文中包括上述酶的混合物，特別是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纖維素酶的混合物。
按組合物重量計，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將本發(fā)明的酶或摻入到洗滌劑組合物中的其它任何酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
漂白劑可以包括在本發(fā)明洗滌劑組合物中的附加的任選組分包括漂白劑，例如粒徑為400-800微米的PB1、PB4和過碳酸鹽。這些漂白劑組分可以包括一種或多種氧漂白劑，并且根據(jù)所選擇的漂白劑，可包括一種或多種漂白活化劑。當(dāng)存在氧漂白化合物時，其存在的量一般是約1-25％。通常，在非液體配方例如粒狀洗滌劑中，漂白化合物是任選加入的組分。
用于本文中的漂白劑組分可以是任何在洗滌劑組合物中有用的漂白劑，包括氧漂白劑以及本領(lǐng)域已知的其它漂白劑。
適合于本發(fā)明的漂白劑可以是活化的或未活化的漂白劑。
一類可以使用的氧漂白劑包括過羧酸漂白劑和其鹽。這類試劑的合適的例子包括單過氧鄰苯二甲酸鎂六水合物，間氯過苯甲酸、4-壬氨基-4-氧代過氧丁酸和雙過氧十二烷雙酸的鎂鹽。這樣的漂白劑公開于US4483781、US740446、EP0133354和US4412934中。非常優(yōu)選的漂白劑也包括如在US4634551所述的6-壬氨基-6-氧代過氧己酸。
另一類可以使用的漂白劑包括鹵素漂白劑。例如，次鹵酸鹽漂白劑的例子包括三氯異氰脲酸，以及二氯異氰脲酸的鈉和鉀鹽，和N-氯代和N-溴代烷烴磺酰胺。這樣的材料通常以最終產(chǎn)品重量的0.5-10％、優(yōu)選1-5％的量加入。
可以將過氧化氫釋放劑與漂白活化劑一起使用，該漂白活化劑是例如四乙?；叶?TAED)、壬酰氧基苯磺酸鹽酯(NOBS，描述于US4412934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸鹽酯(ISONOBS，描述于EP120591中)或五乙?；咸烟?PAG)；將它們過水解后能形成過氧酸作為活性漂白物質(zhì)，導(dǎo)致改進(jìn)的漂白作用。另外，非常合適的是這些漂白活化劑C8(6-辛酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽酯、C9(6-壬酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽酯和C10(6-癸酰胺基己酰基)羥苯磺酸鹽酯或其混合物。還合適的活化劑是酰化的檸檬酸酯，例如在歐洲專利申請?zhí)?1870207.7所公開的。
可用于本發(fā)明清洗組合物中的有用的漂白劑，包括過氧酸和含有漂白活化劑和過氧漂白化合物的漂白體系描述于專利申請USSN08/136626中。
通過在洗滌和/或漂洗過程的開始或期間加入能夠生成過氧化氫的酶體系(即酶和其底物)，也可以存在過氧化氫。這樣的酶體系公開于歐洲專利申請EP0537381中。
除了氧漂白劑以外的漂白劑也是本領(lǐng)域已知的，并且可以在本文中使用。特別重要的一類非氧漂白劑包括光活化漂白劑，例如磺化的鋅和/或鋁酞菁。這些材料可以在洗滌期間沉積在被洗物上。當(dāng)存在氧時用光照射，例如通過將衣服掛出在日光中干燥時，該磺化的鋅酞菁被活化，結(jié)果該被洗物被漂白。優(yōu)選的鋅酞菁和光活化漂白方法描述于US4033718中。洗滌劑組合物一般含有約0.025-1.25％重量的磺化鋅酞菁。
漂白劑也可以包括錳催化劑。錳催化劑可以是例如在“低溫漂白的有效錳催化劑(Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching)”，自然369，1994，pp.637-639中所述的一種化合物。
抑泡劑另一個任選的組分是抑泡劑，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷通?？梢杂猛榛木酃柩跬椴牧蟻肀硎?，而二氧化硅一般以細(xì)分散形式使用，例如二氧化硅氣凝膠和干凝膠和各種類型的疏水二氧化硅。這些材料可以作為顆粒加入，其中抑泡劑有利地可釋放地?fù)饺氲剿苄曰蛩稚⑿缘摹⒒旧蠠o表面活性的洗滌劑不可滲透的載體中。另外，可以將抑泡劑溶解或分散在液體載體中并通過噴霧在一種或多種其它組分上來涂覆。
優(yōu)選的硅氧烷抑泡劑公開于US3933672中。其它特別有用的抑泡劑是德國專利申請DTOS2646126中所述的自乳化硅氧烷抑泡劑。這樣的化合物的例子是可從Dow Corning購得的DC-544，它是硅氧烷-二元醇共聚物。特別優(yōu)選的抑泡劑是含有硅油和2-烷基-鏈烷醇混合物的抑泡劑體系。合適的2-烷基-鏈烷醇是以商品名Isofol 12 R銷售的2-丁基-辛醇。
這樣的抑泡劑體系公開于歐洲專利申請EP0593841中。
特別優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑描述于歐洲專利申請92201649.8中。所述的組合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的無孔硅石例如AerosilR。
按組合物重量計，通常以0.001-2％，優(yōu)選0.01-1％的量使用上述的抑泡劑。
其它組分可以在洗滌劑組合物中使用的其它組分有例如污垢懸浮劑、污垢除去劑、熒光增白劑、磨料、殺菌劑、變色抑制劑、著色劑和/或包覆或未包覆的香料。
特別合適的包覆材料是由多糖基質(zhì)和多羥基化合物組成的水溶性膠囊，如在GB 1464616中所述的。
其它合適的水溶性包覆材料包括從取代二羧酸的未凝膠化淀粉酸酯衍生的糊精，例如在US3455838中所述的。這些酸酯糊精優(yōu)選是從諸如蠟質(zhì)玉米、蠟質(zhì)高粱、西米、木薯和馬鈴薯的淀粉制備的。所述的包覆材料的合適例子包括由National Starch生產(chǎn)的N-Lok。該N-Lok包覆材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖組成。該淀粉是通過加上單官能取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。
適合于本文中的防再污染劑和污垢懸浮劑包括纖維素衍生物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素，和均聚或共聚的聚羧酸或其鹽。這類聚合物包括上述作為助洗劑提到的聚丙烯酸鹽和馬來酸酐-丙烯酸共聚物，以及馬來酸酐與乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸的共聚物，該馬來酸酐至少構(gòu)成該共聚物的20％摩爾。按組合物重量計，這些材料通常以組合物重量的0.5-10％，更優(yōu)選0.75-8％，最優(yōu)選1-6％的量使用。
優(yōu)選的熒光增白劑是陰離子性的，其例子是4，4’-雙-(2-雙乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉鹽、4，4’-雙-(2-嗎啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉、4’，4”-雙-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一鈉、4，4’-雙-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)芪-22’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉、2(芪基-4”-(萘并-1’，2’4，5)-1，2，3-三唑-2”-磺酸鈉和4，4’-雙-(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯。
其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特別是分子量為1000-10000，更具體是2000-8000和最優(yōu)選是約4000的那些。以0.20-5％重量，更優(yōu)選0.25-2.5％重量的量使用這些聚合物材料。這些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸鹽對于存在過渡金屬雜質(zhì)時改進(jìn)白度，織物灰分沉積和對粘土、蛋白質(zhì)性可氧化污垢的清洗性能是重要的。
在本發(fā)明組合物中有用的污垢除去劑是對苯二甲酸與乙二醇和/或丙二醇單元各種排列的常規(guī)共聚物或三元共聚物。這樣的聚合物的例子公開于US4116885和US4711730及EP0272033中。根據(jù)EP0272033特別優(yōu)選的聚合物具有下式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)，T是(pOOC6H4CO)。
還非常有用的是作為二甲基對苯二甲酸酯、二甲基磺基間苯二酸酯、乙二醇和1，2-丙二醇無規(guī)共聚物的改性聚酯，該端基主要由磺基苯甲酸酯組成，還有一小部分是乙二醇和/或丙二醇的單酯。目的是“主要”得到在兩端由磺基苯甲酸基團(tuán)封端的聚合物，本文中是絕大多數(shù)本文所述共聚物是由磺基苯甲酸基團(tuán)封端的。然而，某些共聚物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的單酯組成，其“次要”地由這樣的物質(zhì)組成。
本文中選擇的聚酯含有約46％重量的二甲基對苯二甲酸，約16％重量的1，2-丙二醇，約10％重量的乙二醇，約13％重量的二甲基磺基苯甲酸和約15％重量的磺基間苯二酸，并且其分子量為約3000。該聚酯和其制備方法詳細(xì)地敘述于EP311342中。
柔軟劑可以將織物柔軟劑加入到本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。這些試劑在類型上可以是無機(jī)或有機(jī)的。無機(jī)柔軟劑的例子是在GB-A-1400898和US5019292中公開的綠土粘土。有機(jī)的織物柔軟劑包括如在GB-A-1514276和EP0011340中公開的水不溶性叔胺，其與單C12-C14季胺鹽的混合物(公開于EP-B 0026528中)，和如在EP-B 0242919中所公開的二長鏈酰胺。織物柔軟劑體系的其它有用有機(jī)組分包括高分子量的聚氧乙烯材料，如在EP 0299575和0313146中所公開的。
綠土粘土的含量一般在5-15％重量的范圍，更優(yōu)選8-12％重量，作為干混合組分材料加入到配方的其余部分中。以0.5-5％重量，一般1-3％重量的量加入有機(jī)織物柔軟劑，例如水不溶性叔胺或二長鏈酰胺材料，而以0.1-2％重量，一般0.15-1.5％重量的量加入高分子量聚氧乙烯材料和水溶性陽離子材料。盡管在某些情況下作為干混顆粒加入它們可能更方便，但一般將這些材料加到該組合物的噴霧干燥組分上，或者作為熔融的液體將它們噴霧到組合物的其它固體組分上。
聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑按照本發(fā)明的洗滌劑組合物還包括0.001-10％重量，優(yōu)選0.01-2％重量，更優(yōu)選0.05-1％重量的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑。一般將所述的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑加入到洗滌劑組合物中以便抑制染料從有色織物轉(zhuǎn)移到與其一起洗滌的其它織物上。在染料于洗滌中附著到其它物品上之前，這些聚合物會絡(luò)合或吸附從有色織物洗滌下來的短效染料。
特別合適的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。
加入這樣的聚合物也增強(qiáng)了本發(fā)明酶的性能。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是液體、膏狀、凝膠、條狀或粒狀形式。
可以按例如US4106991和US4661452(兩者均是Novo Industri A/S的專利)中所公開的生產(chǎn)無塵的顆粒，并且該顆?？梢匀芜x地用本領(lǐng)域已知的方法涂覆。蠟質(zhì)涂覆材料的例子是平均分子量為1000-20000的聚(氧乙烯)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中該醇含有12-20個碳原子并且其中有15-80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-、二-及三-甘油酯。在GB1483591中給出了適合于流化床技術(shù)涂覆的成膜涂覆材料的例子。
本發(fā)明的粒狀組合物也可以是“致密形式”的，即它們具有比常規(guī)的粒狀洗滌劑相對高的密度，即550-950g/l；在這樣的情況下，本發(fā)明的粒狀洗滌劑組合物將含有比常規(guī)顆粒洗滌劑更少量的“無機(jī)填料鹽”；一般的填料鹽是堿土金屬的硫酸鹽和氯化物，一般是硫酸鈉；“致密”的洗滌劑一般包括不多于10％的填料鹽。本發(fā)明的液體組合物也可以是“濃縮形式”的，在這樣的情況下，本發(fā)明的液體洗滌劑組合物將比常規(guī)的液體洗滌劑含有較低量的水。按組合物重量計，濃縮的液體洗滌劑的水含量一般低于30％，更優(yōu)選低于20％，最優(yōu)選低于10％。
例如，可以將本發(fā)明的組合物配制為手洗或機(jī)洗洗衣洗滌劑組合物，包括洗衣添加劑組合物和適用于臟織物預(yù)處理的組合物，漂洗時加入的織物柔軟劑組合物，和用于普通家庭硬表面清洗操作和洗碗碟操作的組合物。
下面的實(shí)例旨在舉例說明本發(fā)明的組合物，而不對本發(fā)明范圍作任何限制。
在洗滌劑組合物中，縮寫組分符號具有下面的意義LAS 直鏈C12烷基苯磺酸鈉TAS 牛脂烷基硫酸鈉XYAS C1X-C1Y烷基硫酸鈉SS式2-丁基辛酸的仲皂表面活性劑25EY 與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的主要為C12-C15的直鏈伯醇45EY 與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的主要為C14-C15的直鏈伯醇XYEZS 每摩爾與平均Z摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C1X-C1Y烷基硫酸鈉非離子由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404銷售的、平均乙氧基化程度為3.8和平均丙氧基化程度為4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇CFAA C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAA C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸鹽無定型硅酸鈉(SiO2∶Na2O比＝2.0)NaSKS-6 式d-Na2Si2O5的結(jié)晶層狀硅酸鹽碳酸鹽 無水碳酸鈉磷酸鹽 三磷酸鈉MA/AA 1∶4的馬來酸/丙烯酸共聚物，平均分子量約80000聚丙烯酸BASF GmbH以商品名PA30銷售的平均分子量為酯約8000的聚丙烯酸酯均聚物沸石A 式Na12(AlO2SiO2)12.27H2O的水合硅鋁酸鈉，主要粒徑為1-10微米檸檬酸鹽檸檬酸三鈉二水合物檸檬酸 檸檬酸過硼酸鹽無水過硼酸鈉一水合物漂白劑，經(jīng)驗式為NaBO2.H2O2PB4 無水過硼酸鈉四水合物過碳酸鹽經(jīng)驗式為2Na2CO3.3H2O2的無水過碳酸鈉漂白劑TAED四乙?；叶稢MC 羧甲基纖維素鈉DETPMP 由Monsanto以商品名Dequest 2060銷售的二乙三胺五(亞甲基膦酸)PVP 聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS鈉鹽形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]異構(gòu)體抑泡劑 25％熔點(diǎn)為50℃的石蠟，17％的疏水性二氧化硅，58％的石蠟油顆粒抑泡顆粒形式的12％硅氧烷/二氧化硅，18％硬脂劑醇，70％淀粉硫酸鹽 無水硫酸鈉HMWPEO 高分子量聚氧乙烯TAE 25 牛脂醇乙氧基化物(25)
洗滌劑實(shí)施例I可以按如下所示制備本發(fā)明粒狀織物清洗組合物線性C12烷基苯磺酸鈉 6.5硫酸鈉 15.0沸石A 26.0次氮基三醋酸鈉 5.0本發(fā)明的酶 0.1PVP0.5TAED 3.0硼酸 4.0過硼酸鹽 18.0苯酚磺酸鹽 0.1次要組份 至100洗滌劑實(shí)施例II可以按如下所示制備本發(fā)明的致密粒狀織物清洗組合物(密度800g/l)45AS8.025E3S 2.025E53.025E33.0TFAA2.5沸石A 17.0NaSKS-6 12.0檸檬酸 3.0碳酸鹽 7.0MA/AA 5.0CMC 0.4
本發(fā)明的酶 0.1TAED 6.0過碳酸鹽 22.0EDDS 0.3粒狀抑泡劑 3.5水/次要組份至100％洗滌劑實(shí)施例III按如下所示制備在洗滌彩色織物中特別有用的本發(fā)明粒狀織物清洗組合物L(fēng)AS 10.7 -TAS 2.4 -TFAA -4.045AS 3.1 10.045E7 4.0 -25E3S-3.068E111.8 -25E5 -8.0檸檬酸鹽 15.0 7.0碳酸鹽 -10檸檬酸 2.5 3.0沸石A32.1 25.0NaSKS-6 -9.0MA/AA5.0 5.0DETPMP 0.2 0.8本發(fā)明的酶 0.10 0.05硅酸鹽 2.5 -硫酸鹽 5.2 3.0PVP 0.5 -
聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物 - 0.2/乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物過硼酸鹽 1.0 -苯酚磺酸鹽0.2 -水/次要組份 至100％洗滌劑實(shí)施例IV可按如下所示制備本發(fā)明的提供具有“通過洗滌進(jìn)行軟化”的能力的粒狀織物清洗組合物45AS - 10.0LAS 7.6 -68AS 1.3 -45E7 4.0 -25E3 - 5.0氯化椰油烷基二甲基羥乙基銨1.4 1.0檸檬酸鹽 5.0 3.0NaSKS-6 - 11.0沸石A15.0 15.0MA/AA4.04.0DETPMP 0.40.4過硼酸鹽 15.0 -過碳酸鹽 - 15.0TAED 5.05.0綠土粘土 10.0 10.0HMWPEO - 0.1本發(fā)明的酶 0.10 0.05硅酸鹽 3.05.0碳酸鹽 10.0 10.0
粒狀抑泡劑1.04.0CMC 0.20.1水/次要組份 至 100％洗滌劑實(shí)施例V可按如下制備本發(fā)明的重垢液體織物清洗組合物I II酸形式的LAS - 25.0檸檬酸 5.0 2.0酸形式的25AS8.0 -酸形式的25AE2S 3.0 -25AE7 8.0 -CFAA5 -DETPMP 1.0 1.0脂肪酸 8 -油酸- 1.0乙醇4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0本發(fā)明的酶 0.100.05氯化椰油烷基二甲基羥乙基銨 - 3.0綠土粘土- 5.0PVP 2.0 -水/次要組份 至 100％在紡織業(yè)中的用途在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶在生物拋光加工中的用途。生物拋光是對紗線表面所作的一項特殊處理，可改善織物手感和外觀方面的性質(zhì)，但不會使織物可濕性受到損失。生物拋光最重要的效果可能在于絨毛和起球減少，光澤增加，織物手感改善，持久柔軟性增強(qiáng)，水吸收性改變。生物拋光通常是在針織和機(jī)織織物生產(chǎn)的濕加工中進(jìn)行的。濕加工包括一些步驟，例如脫漿、精煉、漂白、洗滌、染色/印花和整理。在各個處理步驟中，織物或多或少要進(jìn)行機(jī)械作用。通常，在針織或機(jī)織得到織物后，還對織物進(jìn)行脫漿，接著還進(jìn)行精煉操作等等。脫漿是除去紡織品上漿料的過程。在紡織機(jī)上紡織之前，常常會用淀粉漿料或淀粉衍生物包覆經(jīng)紗，以提高其抗張強(qiáng)度。紡織后，必須在對織物進(jìn)一步加工之前除去漿料涂層，以確保均勻和耐洗滌。眾所周知，為達(dá)到生物拋光效果，需要結(jié)合纖維素分解作用和機(jī)械作用。人們還知道，當(dāng)結(jié)合進(jìn)行纖維素酶處理和柔軟劑常規(guī)處理，還可達(dá)到“超柔軟性”。預(yù)計使用本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行纖維素織物的生物拋光比較有好處，例如可達(dá)到更徹底的拋光。也可應(yīng)用WO93/20278所述方法達(dá)到生物拋光目的。
石洗已知通過在浮石存在下洗滌染色織物制成的粗斜紋棉布或勞動布，使織物的顏色局部變淺，或者通過酶促處理織物，特別是用纖維素分解酶處理，可以使織物，尤其是粗斜紋棉布織物或勞動布獲得“石洗”外觀(局部顏色磨損)。可用本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶按例如US4832864所述單獨(dú)進(jìn)行處理，或者與比傳統(tǒng)工藝更少量的浮石一起使用，或者與如WO95/09225所述的珍珠巖一起使用。材料和方法生物體澳大利亞糖絲菌，IFO 14444，包含本發(fā)明纖維素酶編碼DNA序列。
大腸桿菌，DSM 11476，含有在克隆載體pSJ1678中包含本發(fā)明纖維素分解酶編碼DNA序列的質(zhì)粒。其它菌株大腸桿菌菌株制備大腸桿菌SJ2細(xì)胞(Diderichsen，B.等人，(1990))，并使用購自BIORAD公司的Gene PulserTM電擊儀，根據(jù)供應(yīng)商的說明，電穿孔轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pSJ1678(參閱WO 94/19454，在此引用作為參考)。普通分子生物學(xué)方法使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，(1989)；Ausubel等人，(1995)；Harwood等人，(1990))進(jìn)行DNA操作和轉(zhuǎn)化。
根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用用于DNA操作的酶。編碼本發(fā)明纖維素分解酶的DNA序列的分離包含SEQ ID NO.1所示編碼本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列可通過使用本領(lǐng)域眾所周知的方法(Sambrook等人，(1989))提取質(zhì)粒DNA，從保藏生物體大腸桿菌DSM 11476中得到。澳大利亞糖絲菌內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶基因的克隆染色體DNA的制備將澳大利亞糖絲菌菌株IFO 14444在TY-瓊脂培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)2～3天。從平板上刮下細(xì)胞，并用Pitcher等人描述的方法(1989)分離染色體DNA。對發(fā)表的方法的唯一改變是，往最初只含有溶菌酶的裂解緩沖液中加入30μg/ml變?nèi)芫?產(chǎn)品目錄編號M-9901，SIGMA，USA)。染色體文庫的構(gòu)建染色體DNA用限制性酶Sau3A部分消化，并用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離片段。將大小位于2-7kb的片段轉(zhuǎn)移至DEAE-纖維素膜上(Dretzen等人，(1981))。
將分離得到的DNA片段連接到BamHI消化的pSJ1678質(zhì)粒DNA上，并用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。
將細(xì)胞在含0.1％CMC(羧甲基纖維素鈉，Aqualon，法國)和9μg/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上涂板，并于37℃培養(yǎng)過夜。通過菌落雜交識別陽性克隆將如上文所述構(gòu)建于大腸桿菌中的DNA文庫，涂在含0.1％CMC(羧甲基纖維素鈉，Aqualon，法國)和9μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，并于37℃培養(yǎng)過夜。隨后將轉(zhuǎn)化子復(fù)制到同類培養(yǎng)基平板上，并將這些新的平板于37℃培養(yǎng)8小時或過夜。
原始平板用1mg/ml剛果紅(SIGMA，USA)染色。染色過程持續(xù)半小時，適度繞圈搖動，然后用1M NaCl清洗兩次(每次15分鐘)。
纖維素酶陽性克隆存在的地方會出現(xiàn)淡黃色的暈圈。在復(fù)制板上，這些陽性克隆被保留下來，將其在含0.1％CMC和9μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上重新劃線，并于37℃培養(yǎng)過夜。陽性克隆的鑒定從重新劃線的平板上，挑取內(nèi)切葡聚糖酶陽性克隆的單菌落，并提取質(zhì)粒。通過大腸桿菌SJ2的再轉(zhuǎn)化確認(rèn)表型，并通過限制性消化進(jìn)行質(zhì)粒鑒定。
使用Taq脫氧終端循環(huán)測序試劑盒(Perkin-Elmer公司，USA)，熒光標(biāo)記的終止物和5pmol引物#3507，通過DNA測序進(jìn)行內(nèi)切葡聚糖酶基因的鑒定5′-GGC TTT TAA GCC GTC TGT ACG-3′.
在另一個反應(yīng)中，使用引物#8392測定核苷酸序列5′-CTC ACG TTA AGG GAT TTT GGT CTG G-3′根據(jù)Devereux等人(1984)進(jìn)行序列數(shù)據(jù)的分析。此序列對應(yīng)于SEQ ID No 1顯示的DNA序列。根據(jù)從這種方法得到的這第一個DNA序列，設(shè)計用于內(nèi)切葡聚糖酶下一步測序的新引物，接著再設(shè)計用于再下一步測序的新引物，等等。培養(yǎng)基TY和LB瓊脂培養(yǎng)基(如Ausubel等人(1995)描述的)。纖維素分解活性的測定相對于分析標(biāo)準(zhǔn)測定內(nèi)切葡聚糖酶的纖維素分解活性，可以用ECU單位表示。
纖維素分解酶會水解CMC，因此降低培養(yǎng)混合物的粘性。造成的粘性降低可以用振動粘度計(例如MIVI 3000，Sofraser，法國)測定。
以ECU為單位的纖維素分解活性的測定，可以根據(jù)分析方法AF301.1進(jìn)行。索要時可由申請人提供。
ECU實(shí)驗通過測量樣品降低羧甲基纖維素(CMC)溶液粘性的能力來量化樣品中存在的催化活性的量。實(shí)驗在40℃，pH7.5條件下進(jìn)行，使用相對酶標(biāo)準(zhǔn)來測定CMC底物粘度的降低。
下列非限制性的實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明。實(shí)施例1澳大利亞糖絲菌IFO14444的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的克隆和表達(dá)按照材料和方法中描述的方法，進(jìn)行澳大利亞糖絲菌IFO 14444基因組DNA的制備、內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆和DNA測序。分離得到一陽性轉(zhuǎn)化株DSM 11476，其中含有攜帶約2,300bp插入物的質(zhì)粒pSJ1678。對這段插入物進(jìn)行部分DNA測序，顯示存在編碼內(nèi)切葡聚糖酶的基因序列。根據(jù)糖基水解酶的分類(Henrissat等人，1993)，內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖基水解酶的家族6。
SEQ ID NO 1列出了該核苷酸序列。
相應(yīng)于內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的DNA可由能得自保藏菌株DSM11476的質(zhì)粒中得到。實(shí)施例2來自各種糖絲菌菌株的內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶檢驗了下列菌株德克薩斯糖絲菌，NRRL B-16134，外外安德糖絲菌，NRRL B-16159，
喜冷糖絲菌，NRRL B-16238，糖絲菌屬之種，IFO 13785，黃糖絲菌，ATCC 29533，淡藍(lán)褐糖絲菌，ATCC 35108，長孢糖絲菌，ATCC 31109，易變糖絲菌易變亞種，ATCC 31520，氣生菌落糖絲菌，ATCC 23870，易變糖絲菌莢膜亞種，ATCC 23892，丁香糖絲菌，DSM 43886。A.糖絲菌菌株的DNA雜交檢驗基因組DNA的制備在TY-瓊脂培養(yǎng)基(含有2％可溶淀粉)上接種每一種糖絲菌菌株(參閱上文)，于25℃培養(yǎng)3-4天。收獲細(xì)胞，并用Pitcher等人描述的方法[Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J.，(1989)。用硫氰酸胍快速抽提細(xì)菌染色體DNA。微生物應(yīng)用通訊(Lett.Appl.Microbiol.)，8，151-156]分離染色體DNA。雜交條件用于測定核苷酸探針與同源DNA或RNA序列雜交的合適條件，包括將含有待雜交的DNA片段和RNA的濾膜在5×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液)中預(yù)先浸泡10分鐘，然后將濾膜在含5×SSC(Sambrook等人，1989)、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等人，1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性超聲波降解鮭魚精DNA(Sambrook等人，1989)的溶液中預(yù)雜交，接著在含有隨機(jī)起發(fā)(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.，1983，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)，1326-13)的32P-dCTP標(biāo)記(比活＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中于約45℃雜交12小時。然后將濾膜在2×SSC、0.5％SDS溶液中清洗兩次，30分鐘，洗滌溫度優(yōu)選至少55℃，更優(yōu)選至少60℃，更優(yōu)選至少65℃，甚至更優(yōu)選至少70℃，尤其是至少75℃。實(shí)驗方法探針pMB145的2.5kb片段(澳大利亞糖絲菌，IFO 14444)。結(jié)果所有菌株均與BamHI雜交。因此，所有菌株產(chǎn)生均屬于家族6的內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶。B.糖絲菌菌株的CMC-剛果紅實(shí)驗(通過菌落雜交鑒定陽性克隆)方法將菌株在麩皮培養(yǎng)基(麩皮4％，酵母提取物0.1％和瓊脂1.5％)中于30℃培養(yǎng)4天。將瓊脂栓放置在不同pH(pH5，7，9，10)的CMC實(shí)驗平板上(基本成分CMC 0.1％，瓊脂1.5％)。加入LAS(線性烷基硫酸鹽)至終濃度為0.1％。在pH7使用AZCL-HE。于40℃培養(yǎng)過夜。然后將平板用剛果紅染色，并且測量透明圈的直徑(mm)。結(jié)果(直徑，mm)
實(shí)施例3澳大利亞糖絲菌IFO 14444的內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶的純化和鑒定將實(shí)施例1的質(zhì)粒插入到大腸桿菌JM109中。將大腸桿菌菌株在超級肉湯培養(yǎng)基(酪蛋白胰消化物32g/L，酵母提取物20g/L和NaCl5g/L，pH調(diào)至7.0)中于37℃培養(yǎng)1天。收集細(xì)胞并用超聲波降解法破碎細(xì)胞。將上清液凍干。從13L發(fā)酵液中得到24克干粉，總活性4600ECU。純化將干粉溶解于175ml離子交換水。使用4℃的50克Avicel，加到50mM磷酸緩沖液，pH7.5的層析柱上，并用高鹽緩沖液(含0.5M NaCl的相同緩沖液)洗滌。用離子交換純化水將酶洗脫。得到共2550ECU。樣品中還有一些染料，用離子交換層析進(jìn)一步純化。用50mM Tris pH7.5平衡的HPQ柱結(jié)合洗脫的酶和染料，用NaCl梯度洗脫得到純酶。鑒定純化后的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中只顯示一條帶，分子量50kDa，pI在3.7左右。
對ECU的比活性為50ECU/mg蛋白質(zhì)。摩爾消光值113380是建立在氨基酸組成基礎(chǔ)上的，得到E280/E260的比值為1.8和使用50kDa分子量時，用來測定蛋白質(zhì)的濃度。
對磷酸溶脹的纖維素在pH8.5的催化活性，表觀kcat為22sec-1，表觀KM為0.6g/L。纖維素酶對PNP-β纖維素二糖苷沒有活性。緩沖液所有酶實(shí)驗在下列緩沖液中進(jìn)行pH 3.0-3.5 0.1M檸檬酸鈉pH 4.0-5.5 0.1M醋酸鈉pH 6.0 0.1M MES鈉緩沖液pH 6.5-7.5 0.1M MOPS鈉緩沖液pH 8.0-8.5 0.1M巴比妥緩沖液pH 9.0-10.00.1M甘氨酸緩沖液pH活性曲線使用CMC得到pH活性曲線。CMC的終濃度為7.5g/L，于40℃保溫20分鐘，使用從Lever(1972)改進(jìn)的對羥基苯甲酸酰肼(PHBAH)測定還原糖的形成。除1.5gPHBAH外，再加入5g酒石酸鉀鈉。最適pH為8.0，而且在pH6.5～9.0得到大于50％的相對活性。使用磷酸溶脹的纖維素(PASC)測定表觀動力學(xué)常數(shù)如下制備PASC儲存液取5g纖維素(Avicel)，用水弄濕，再加入150ml用冰預(yù)冷的正磷酸。在冰浴中緩慢攪動懸浮液1小時。在攪動中加入100ml用冰預(yù)冷的丙酮。將混合物轉(zhuǎn)移到裝有3號Pyrex耐熱玻璃燒結(jié)板的布氏漏斗中，用100ml用冰預(yù)冷的丙酮沖洗三次，每次沖洗后盡可能抽干。最后用500ml水沖洗兩次，每次沖洗后仍然盡可能抽干。將PASC與去離子水混合，至總體積300ml。(使用Ultra TurraxHomogenizer)混勻并在冰箱中儲存不超過1個月。
使用下列步驟用緩沖液平衡底物取20g磷酸溶脹的纖維素PASC儲存液以5000rpm速度離心20分鐘，倒掉上清液，將沉淀重懸于30ml緩沖液。以5000rpm速度離心20分鐘后，倒掉上清液，將沉淀重懸于緩沖液至30g。這相當(dāng)于10mg/L的底物濃度。
為了測量動力學(xué)參數(shù)，使用底物濃度0.2-8mg/ml。在8個不同底物濃度下測定速率兩次。使用Lever(1972)的方法測定還原性糖的量。
使用摩爾吸光度計算酶濃度。使用電腦程序GraFit(Leatherbarrow，1992)中的酶動力學(xué)方程計算表觀動力學(xué)常數(shù)KM(app.)，Vmax(app.)和kcat(app.)。實(shí)施例4用來自澳大利亞糖絲菌IFO 14444的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶處理織物引起抗張強(qiáng)度損失測定由于使用實(shí)施例3的純化內(nèi)切葡聚糖酶處理引起紡織品抗張強(qiáng)度的損失，并與真菌內(nèi)切葡聚糖酶家族6進(jìn)行比較。實(shí)驗步驟緩沖液0.05M磷酸鹽緩沖液pH7.0體積 100ml溫度 室溫紡織品預(yù)先老化的ED 9613829抹布5片，5×25cm劑量2x0，1000，10,000，100,000 ECU/L Carezyme59100 ECU/L MB1451900，19,000，190,000 ECU/L家族6纖維素酶時間7天暗處保存漂洗時間自來水沖洗10分鐘測量間隔20+/-3秒，在Instron儀器5564上測量抗張強(qiáng)度損失將預(yù)先老化的織物在磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中用不同劑量的酶處理一周。然后將織物用水漂洗，在空調(diào)室內(nèi)適應(yīng)24小時(60％RH，20℃)。在Instron儀器上測量抗張強(qiáng)度。與未經(jīng)消化的預(yù)老化織物(參照)相比，計算出抗張強(qiáng)度的損失。比較實(shí)驗包括空白(不加酶)和來自真菌Humicola insolens的EG VI(內(nèi)切葡聚糖酶家族6)。結(jié)果
本發(fā)明的酶不會使抗張強(qiáng)度受到損失。實(shí)施例5在Terg-O-meter中的顏色澄清在此實(shí)施例中，使用在小型洗衣機(jī)(100ml Terg-O-meter)中測定對棉布顏色的保護(hù)作用，即“顏色澄清”的方法，證明了本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶有復(fù)原棉織物顏色的能力。
將盛有100ml緩沖液(或洗滌劑)的250ml燒杯放置在Terg-O-Meter中，并平衡至35℃。然后將2片7×7cm的黑色機(jī)織棉布樣品加入每只燒杯中，開動攪拌器，最后加入酶A)空白，B)三種不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)品(例如商品化的酶制劑CelluzymeTM)，和C)兩種不同劑量的本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶。然后于35℃保溫30分鐘。
保溫30分鐘之后，將樣品用冷的自來水沖洗10分鐘，并在滾筒干燥器中干燥。
重復(fù)一次保溫、沖洗和干燥循環(huán)，或直到樣品在顏色和/或樣品表面絨毛方面有明顯區(qū)別。
最后與空白(不加酶)和標(biāo)準(zhǔn)(例如Celluzyme)樣品比較，給樣品評分。由一組經(jīng)過訓(xùn)練的評分員進(jìn)行視覺評分，并用免除(remission)分光計測量顏色。表1中給出了用每活性單位酶得到的樣品“顏色澄清”度(CC)表示的結(jié)果。表1<
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序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話45 4444 8888(H)傳真45 4449 3256(ii)發(fā)明題目來自糖絲菌的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(iii)序列數(shù)2(iv)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度1470個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGCACCCCC GCTCGAAGAG ACCCCTCACC ACCAGACGCA AGGTCGTCCC GGCCGTCGCG 60GCCGGAACCG TCCTCGCCGG CGGCGTCACC GCCCTGACCT CCAACATCGC GCAGGCCGCC120GCCGGCTGCC GCGTCGACTA CGCCGTGACG AGCCAGTGGC CCGGTGGCTT CGGTGCAGCC180GTCACCGTCA CGAACCTCGG CGACCCGCTC TCGTCCTGGG AGCTGAGCTG GACGTTCCCC 240GACGGCCAGG GCGTGCAGCA GCTCTGGAAC GGCGTGCACT CGACCTCCGG TTCGAACGTC 300ACCGTGAAAG AAATGTCGTG GAACGGTTCG GTCGGCACCA ACGCCAGCGT CCAGGTCGGC 360TTCAACGGCT CCTGGAACGG CGCGAACAAC GCGCCGACGT CCTTCACGCT CAACGGCACC 420TCGTGCAACG GTGCGGTCGG TGGCCCGACG ACGGAGCCGA CGCCCGAGCC GACCCCGGAG 480CCCACGCCCG AGCCGACGCC GGAGCCGACG CCCGAGCCGA CGCCGGAGCC CACGCCCGAG 540CCGACGCCGG AGCCCACGCC CGAGCCGACC CCGGAGCCCA CGCCCGAGCC CACGCCCGAG 600CCCACGCCCG AGCCCACGAT GCCGCCGGTC CAGGCCGGTC AGTTCCACGT CGACACCACG 660AACCAGTCGT ACCGCGCCTG GCAGGCGGCC AGCGGCTCCG ACAAGGACCT GCTGGCGAAG 720ATCGCCCTGA CGCCGCAGGC GTACTGGGTC GGCAACTGGA ACGAAGCCTC GCACGCGCAG 780CAGGAAGTCC GTGACATCAC GTCGGCCGCT GCGGCCGCCG GCAGGACCGC CGTGCTCGTC 840GTCTACGCCA TCCCGGGCCG CGACTGCGGC CAGCACTCCA GCGGCGGCGT GTCGACCTCC 900GAGTACGCGC AGTGGATCGA CACGGTCGCC CAGGGCATCG TCGGCAACCC GTGGGTGGTC 960CTCGACCCCG ACGCGCTGCC GATGCTCGGC GACTGCGACG GCCAGGGCGA CCGGGTCGGC 1020TTCCTCAAGT ACGCCGCGAA GTCCCTGACC GCCAAGGGTG CGCGCGTCTA CATCGACGCC 1080GGCCACTCGG CGTGGCTGTC GCCGTCGGAA GCCGCGAACC GCCTCAACCA GATCGGGTTC 1140GAGGACGCCG TGGGCTTCTC GATCAACGTC TCCAACTACC GCACGACGGC GGAGTCGAAG 1200ACCTGGGGTC AGCAGGTCTC GCAGCTGACC GGTGGCAAGA AGTTCGTCAT CGACACGTCG 1260CGCAACGGCA ACGGCCCGTC CGGGTCGGAA TGGTGCAACC CGAGCGGCCG CGCCCTCGGC 1320GAGCGCCCGA CGCTCGTGAA CGACCGCAGC GGGCTCGACG CGCTGCTGTG GATCAAGCTG 1380CCCGGTGAGT CGGACGGCGC CTGCAACGGC GGCCCGGGCG CCGGTCAGTG GTGGCACTCC 1440ATGGCACTGG CTGGCCGCAA CGCGAAGTGG 1470(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度490個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID N02Met His Pro Arg Ser Lys Arg Pro Leu Thr Thr Arg Arg Lys Val Val1 5 10 15Pro Ala Val Ala Ala Gly Thr Val Leu Ala Gly Gly Val Thr Ala Leu20 25 30Thr Ser Asn Ile Ala Gln Ala Ala Ala Gly Cys Arg Val Asp Tyr Ala35 40 45Val Thr Ser Gln Trp Pro Gly Gly Phe Gly Ala Ala Val Thr Val Thr50 55 60Asn Leu Gly Asp Pro Leu Ser Ser Trp Glu Leu Ser Trp Thr Phe Pro65 70 75 80Asp Gly Gln Gly Val Gln Gln Leu Trp Asn Gly Val His Ser Thr Ser85 90 95Gly Ser Asn Val Thr Val Lys Glu Met Ser Trp Asn Gly Ser Val Gly100 105 110Thr Asn Ala Ser Val Gln Val Gly Phe Asn Gly Ser Trp Asn Gly Ala115 120 125Asn Asn Ala Pro Thr Ser Phe Thr Leu Asn Gly Thr Ser Cys Asn Gly130 135 140Ala Val Gly Gly Pro Thr Thr Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu145 150 155 160Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu165 170 175Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu180 185 190Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Met Pro195 200 205Pro Val Gln Ala Gly Gln Phe His Val Asp Thr Thr Asn Gln Ser Tyr210 215 220Arg Ala Trp Gln Ala Ala Ser Gly Ser Asp Lys Asp Leu Leu Ala Lys225 230 235 240Ile Ala Leu Thr Pro Gln Ala Tyr Trp Val Gly Asn Trp Asn Glu Ala245 250 255Ser His Ala Gln Gln Glu Val Arg Asp Ile Thr Ser Ala Ala Ala Ala260 265 270Ala Gly Arg Thr Ala Val Leu Val Val Tyr Ala Ile Pro Gly Arg Asp275 280 285Cys Gly Gln His Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Ser Glu Tyr Ala Gln290 295 300Trp Ile Asp Thr Val Ala Gln Gly Ile Val Gly Asn Pro Trp Val Val305 310 315 320Leu Asp Pro Asp Ala Leu Pro Met Leu Gly Asp Cys Asp Gly Gln Gly325 330 335Asp Arg Val Gly Phe Leu Lys Tyr Ala Ala Lys Ser Leu Thr Ala Lys340 345 350Gly Ala Arg Val Tyr Ile Asp Ala Gly His Ser Ala Trp Leu Ser Pro355 360 365Ser Glu Ala Ala Asn Arg Leu Asn Gln Ile Gly Phe Glu Asp Ala Val370 375 380Gly Phe Ser Ile Asn Val Ser Asn Tyr Arg Thr Thr Ala Glu Ser Lys385 390 395 400Thr Trp Gly Gln Gln Val Ser Gln Leu Thr Gly Gly Lys Lys Phe Val405 410 415Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gly Asn Gly Pro Ser Gly Ser Glu Trp Cys420 425 430Asn Pro Ser Gly Arg Ala Leu Gly Glu Arg Pro Thr Leu Val Asn Asp435 440 445Arg Ser Gly Leu Asp Ala Leu Leu Trp Ile Lys Leu Pro Gly Glu Ser450 455 460Asp Gly Ala Cys Ash Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gln Trp Trp His Ser465 470 475 480Met Ala Leu Ala Gly Arg Asn Ala Lys Trp485 490
權(quán)利要求
1.包含具有內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶活性之酶的酶制劑，該酶可以從屬于糖絲菌屬的菌株得到或是其內(nèi)源酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中所述菌株選自澳大利亞糖絲菌，德克薩斯糖絲菌，外外安德糖絲菌，喜冷糖絲菌，黃糖絲菌，淡藍(lán)褐糖絲菌，長孢糖絲菌，易變糖絲菌莢膜亞種，氣生菌落糖絲菌，易變糖絲菌易變亞種，丁香糖絲菌，糖絲菌屬之種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的制劑，其中所述菌株為澳大利亞糖絲菌IFO14444，德克薩斯糖絲菌NRRL B-16134，外外安德糖絲菌NRRL B-16159，喜冷糖絲菌NRRL B-16238，黃糖絲菌ATCC29533，淡藍(lán)褐糖絲菌ATCC35108，長孢糖絲菌ATCC31109，易變糖絲菌莢膜亞種ATCC23892，氣生菌落糖絲菌ATCC23870，易變糖絲菌易變亞種ATCC31520，丁香糖絲菌DSM43886，或糖絲菌屬之種IFO 13785。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任何一項的制劑，其中內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶屬于糖基水解酶家族6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項的制劑，其中內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶在pH4-11范圍內(nèi)有活性，優(yōu)選在pH5.5-10.5范圍內(nèi)有活性。
6.一種內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶，它是(a)由澳大利亞糖絲菌IFO 14444產(chǎn)生的多肽，或(b)包含SEQ ID NO2第226-490位所示氨基酸序列的多肽，或(c)(a)或(b)定義的多肽的類似物，該類似物與所述多肽至少75％同源，或由所述多肽通過取代、刪除或添加一個或多個氨基酸而衍生得到，或與針對所述多肽的純化形式產(chǎn)生的多克隆抗體有免疫學(xué)反應(yīng)性。
7.編碼具有內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶活性的多肽的分離多核苷酸分子，其選自(a)包含SEQ ID NO1第676-1470位核苷酸所示序列的多核苷酸分子；(b)編碼與SEQ ID NO2第226-490位氨基酸殘基的序列至少80％相同的多肽的多核苷酸分子；和(c)(a)或(b)的簡并核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的分離多核苷酸分子，其中多核苷酸為DNA。
9.編碼具有內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶活性的多肽的分離多核苷酸分子，該多核苷酸分子與變性的雙鏈DNA探針在中度嚴(yán)格條件下可雜交，其中所述探針選自包含SEQ ID NO1第676-1470位所示序列的DNA探針和包含SEQ ID NO1第676-1470位序列的長度至少約100bp的亞序列的DNA探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的分離多核苷酸分子，該多核苷酸分子由原核生物，優(yōu)選細(xì)菌，更優(yōu)選革蘭氏陽性細(xì)菌的DNA文庫分離得到，或在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的分離多核苷酸分子，該多核苷酸分子由屬于放線菌綱，優(yōu)選假諾卡氏菌科，更優(yōu)選糖絲菌屬，特別是澳大利亞糖絲菌，尤其是澳大利亞糖絲菌IFO 14444的菌株的DNA文庫分離得到，或在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-11任何一項的分離多核苷酸分子，該多核苷酸分子分離自大腸桿菌DSM 11476。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-12任何一項的分離多核苷酸分子，該多核苷酸分子還包含編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的部分DNA序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的分離多核苷酸分子，其中編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的部分核苷酸序列相應(yīng)于SEQ ID NO1第60-435位核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的分離多核苷酸分子，該多核苷酸分子還包含編碼連接區(qū)的部分核苷酸序列，該連接區(qū)將所述分離多核苷酸分子所含核苷酸序列所編碼之酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)和催化活性結(jié)構(gòu)域(CAD)可操作連接在一起。
16.包含下列可操作連接元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄啟動子；DNA片段，其選自(a)編碼具有內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶活性的多肽、包含SEQID NO1第676-1470位核苷酸所示序列的多核苷酸分子，(b)編碼具有內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶活性，與SEQ ID NO2氨基酸序列第226-490位至少75％相同的多肽的多核苷酸分子，和(c)(a)或(b)的簡并核苷酸序列；和轉(zhuǎn)錄終止子。
17.導(dǎo)入了權(quán)利要求16的表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中該細(xì)胞表達(dá)該DNA片段編碼的多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞，該細(xì)胞為原核細(xì)胞，特別是細(xì)菌細(xì)胞，或具內(nèi)切葡聚糖酶活性之多肽的DNA編碼片段最初起源的內(nèi)源細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中該細(xì)胞屬于芽孢桿菌屬菌株，優(yōu)選枯草芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌菌株。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中該細(xì)胞屬于澳大利亞糖絲菌菌株，優(yōu)選澳大利亞糖絲菌IFO 14444菌株。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中該細(xì)胞屬于假單孢菌屬菌株，優(yōu)選熒光假單胞菌或門多薩假單胞菌菌株。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中該細(xì)胞屬于鏈霉菌屬菌株。
23.根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中該細(xì)胞屬于酵母屬菌株，優(yōu)選釀酒酵母菌株。
24.具有內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶活性的多肽的制備方法，包括培養(yǎng)已導(dǎo)入權(quán)利要求16的表達(dá)載體的細(xì)胞，所述細(xì)胞由此表達(dá)DNA片段所編碼的多肽；和回收該多肽。
25.包含權(quán)利要求6的純化多肽的酶制劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求1或25的制劑，其中還包括一種或多種選自下述的酶蛋白酶、纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角質(zhì)酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、果膠酸酯分解酶、木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果膠分解酶、其它甘露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；或其混合物。
27.具有內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶活性的分離酶，該酶(i)不含同源雜質(zhì)，且(ii)根據(jù)權(quán)利要求24的方法生產(chǎn)。
28.大腸桿菌DSM 11476菌株的基本上純的分離生物學(xué)培養(yǎng)物。
29.權(quán)利要求6或27的酶或者權(quán)利要求1-5，25和26中任何一項的酶制劑，在紡織業(yè)中改善纖維素纖維或織物的特性或者提供粗斜紋棉布的石洗外觀的用途；或在工業(yè)清洗過程中的用途。
30.包含權(quán)利要求6或27的酶或者權(quán)利要求1-5，25和26中任何一項的酶制劑的洗滌組合物。
31.包含權(quán)利要求6或27的酶或者權(quán)利要求1-5，25和26中任何一項的酶制劑的織物柔軟組合物。
全文摘要
含有具內(nèi)切－β－1,4－葡聚糖酶活性之酶的酶制劑,所述酶可獲自諸如澳大利亞糖絲菌,IFO14444之類糖絲菌屬菌株,或是其內(nèi)源酶;編碼具內(nèi)切－β－1,4－葡聚糖酶活性的酶或酶核心(酶的催化活性結(jié)構(gòu)域)的分離多核苷酸(DNA)分子,其選自:(a)含如SEQ ID NO:1第676—1470位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子;(b)所編碼多肽與SEQ ID NO:2第226—490位氨基酸殘基的氨基酸序列至少80%相同的多核苷酸分子;及(c)(a)或(b)的簡并核苷酸序列,所表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶和酶制劑可用于洗滌劑或織物柔軟組合物中,或用于紡織工業(yè)中用以改善纖維素纖維或織物的特性或提供斜紋粗棉布的石洗外觀。
文檔編號C11D3/00GK1261913SQ98806769
公開日2000年8月2日 申請日期1998年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月4日
發(fā)明者M·E·伯約恩瓦德, M·哈塔克亞馬, M·舒萊因, J·B·尼爾森 申請人:諾沃挪第克公司