一種流加預(yù)處理固態(tài)發(fā)酵油料作物輔助冷榨提油的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種提高菌株在固態(tài)發(fā)酵中所產(chǎn)酶活輔助提升冷榨提油出油率的工藝技術(shù)，旨在固態(tài)發(fā)酵工藝中，以微生物所產(chǎn)纖維素酶與蛋白酶為主，提升微生物所產(chǎn)酶的破壁能力，微生物處理后的油料有利于提升冷榨工藝的出油率，改善冷榨提油出油率低的缺陷。在最優(yōu)培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，通過(guò)流加工藝，進(jìn)一步提升破壁效率，以提升固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理油料的工藝效果。后續(xù)采用冷榨工藝，所得壓榨油色澤金黃，具有類似芝麻油的特殊香氣，無(wú)豆腥味，品質(zhì)均一穩(wěn)定。本發(fā)明是一種具極開(kāi)發(fā)前景的工藝路線，為冷榨技術(shù)的探索開(kāi)辟了一個(gè)全新的領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種流加預(yù)處理固態(tài)發(fā)酵油料作物輔助冷榨提油的工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及油料作物冷榨提油的預(yù)處理工藝領(lǐng)域，旨在通過(guò)固態(tài)發(fā)酵流加預(yù)處理工藝，提高微生物所產(chǎn)纖維素酶與蛋白酶能力，以進(jìn)一步提升生物法處理油料作物的破壁效率，提升固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理油料的工藝效果，進(jìn)而提高冷榨提油工藝的出油率，彌補(bǔ)冷榨提油出油率低的缺陷，為油料作物冷榨提油開(kāi)辟新工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]固態(tài)發(fā)酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固體支持物，其體系無(wú)水或接近于無(wú)水的任何發(fā)酵過(guò)程。固態(tài)發(fā)酵相對(duì)于液體大規(guī)模深層發(fā)酵具有其本身的優(yōu)點(diǎn)，在液體深層發(fā)酵技術(shù)中，許多小分子產(chǎn)品水溶性低，發(fā)酵液中含量多在10%上下，許多高價(jià)值大分子濃度更低，有些甚至低于1%，因此為獲取產(chǎn)品，產(chǎn)生了大量的廢液，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了嚴(yán)重的污染，而固態(tài)發(fā)酵則具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)，由于產(chǎn)品不需水相溶解獲得，高價(jià)值產(chǎn)物多數(shù)完全保留在發(fā)酵后的基質(zhì)中，大大提高產(chǎn)物獲取效率，且沒(méi)有廢水的排放，對(duì)環(huán)境污染破環(huán)很小，達(dá)到提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的目的，由于微生物的轉(zhuǎn)化作用，還可以將某些不易于人體消化吸收的低價(jià)值蛋白轉(zhuǎn)化為具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的菌體蛋白，近年來(lái)受到食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。與其他培養(yǎng)方式相比，固態(tài)發(fā)酵具有培養(yǎng)基簡(jiǎn)單且來(lái)源廣泛，投資少，能耗低，技術(shù)較簡(jiǎn)單；產(chǎn)物的產(chǎn)率較高，不需要廢水處理，環(huán)境污染較少，后處理加工方便等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]補(bǔ)料分批發(fā)酵也被稱為半連續(xù)發(fā)酵、半連續(xù)培養(yǎng)或者流加發(fā)酵，它是以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，間斷性或連續(xù)性的向發(fā)酵基質(zhì)中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)酵方式。流加發(fā)酵方式有著較長(zhǎng)的的應(yīng)用歷史，并且趨于完善，早在20世紀(jì)初，人們?cè)趹?yīng)用酵母培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體的過(guò)程中就發(fā)現(xiàn)，盡管麥芽汁可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖，但如果含量過(guò)高，則會(huì)起到相反的抑制菌體的作用，這是由于菌體生長(zhǎng)過(guò)旺，氧氣供給難以滿足菌體生長(zhǎng)需求，導(dǎo)致供氧不足，進(jìn)而轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵生成乙醇，使 菌體產(chǎn)量降低。而采用麥芽汁濃度較低的培養(yǎng)基又無(wú)法保證菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，同樣造成菌體產(chǎn)量不足，流加的培養(yǎng)方式隨即應(yīng)運(yùn)而生。
[0004]流加發(fā)酵采用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)初始濃度低，某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不十分豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物，使得菌體初始生長(zhǎng)不至太過(guò)旺盛，在發(fā)酵過(guò)程中，不斷補(bǔ)加菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)這一構(gòu)想的實(shí)踐，大大提高了當(dāng)時(shí)酵母的產(chǎn)量，阻止厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，這種工藝雖然降低了菌體的生長(zhǎng)速率，但使得細(xì)胞得率得到了提升。流加發(fā)酵工藝現(xiàn)在已經(jīng)在發(fā)酵工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，如單細(xì)胞蛋白、氨基酸、酶制劑、有機(jī)酸等的生產(chǎn)，幾乎涵蓋了整個(gè)發(fā)酵行業(yè)。
[0005]與簡(jiǎn)單的分批發(fā)酵相比，低基質(zhì)濃度的流加發(fā)酵有著明顯的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，它可以避免微生物由于迅速消耗碳源、氮源形成的阻遏效應(yīng)，使菌體保持在適宜的生長(zhǎng)濃度，不至于產(chǎn)生供氧矛盾，并且可以防止培養(yǎng)基中的有毒代謝物累積毒害菌體，造成代謝阻遏，與普通的連續(xù)發(fā)酵相比，對(duì)生產(chǎn)條件的要求相對(duì)較低，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)還大大延長(zhǎng)了細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，不會(huì)產(chǎn)生菌體老化衰變等問(wèn)題，是當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)中的重要技術(shù)手段，是獲得高品質(zhì)產(chǎn)品的重要工藝方式。
[0006]冷榨提油是當(dāng)前一種高品質(zhì)市售油的生產(chǎn)工藝，即與傳統(tǒng)熱榨方式不同，壓榨前，油料不需經(jīng)過(guò)高溫蒸炒等處理，以略高于常溫的溫度作為入榨溫度，并且在壓榨過(guò)程中的壓榨溫度也相對(duì)較低進(jìn)行的物理方式提油的油脂制取工藝。
[0007]通過(guò)冷榨工藝方式生產(chǎn)出的油具有較高的品質(zhì)，完整的保存了油料中所含有的生理活性物質(zhì)，如生育酚、異黃酮、以及植物留醇等有效物質(zhì)，由于這些生理活性物質(zhì)許多都具有一定的熱敏性，所以，只有采取冷榨工藝才能將其充分保留，與此同時(shí)，冷榨工藝還有效的避免了高溫壓榨工藝中，由于蛋白、糖類、脂類變性所產(chǎn)生的有害物質(zhì)，更有利于人體健康，油脂加工后的蛋白質(zhì)由于變性程度較小，也可以得到更加充分的利用。近年來(lái)相關(guān)報(bào)道顯示，經(jīng)冷榨處理的油，僅含有微量的磷與游離脂肪酸，色澤較淺，具有特殊的風(fēng)味，氣味柔和等優(yōu)點(diǎn)，由于磷與游離脂肪酸的含量很低，初榨的毛油基本無(wú)需經(jīng)過(guò)脫膠中和等處理就已經(jīng)可以達(dá)到食用油的標(biāo)準(zhǔn)，這也減少了與化學(xué)試劑的接觸，進(jìn)一步保證了油脂的綠色天然品質(zhì)。
[0008]德國(guó)的冷榨工藝與世界其他國(guó)家相比發(fā)展最為迅速，早在1991年就已經(jīng)研制出可大規(guī)模投入工業(yè)生產(chǎn)的配套冷榨設(shè)備，其所生產(chǎn)的壓榨油產(chǎn)品不需精煉即可達(dá)到使用油標(biāo)準(zhǔn)，并且研制出了一套配套的冷榨機(jī)冷卻設(shè)備。我國(guó)的武漢工業(yè)學(xué)院經(jīng)過(guò)長(zhǎng)年的技術(shù)研究，也已經(jīng)設(shè)計(jì)出一系列螺旋冷榨設(shè)備，但是僅僅在中試的基礎(chǔ)上取得了一些進(jìn)步，還無(wú)法大規(guī)模的投入到工業(yè)生產(chǎn)中，如何使技術(shù)進(jìn)一步得到完善，生產(chǎn)效率進(jìn)一步提升，生產(chǎn)成本進(jìn)一步降低，仍然處于一個(gè)探索的過(guò)程中，這不僅與設(shè)備的開(kāi)發(fā)有關(guān)，也與冷榨的自身局限性緊密相關(guān)，盡管冷榨油具有很好的油脂品質(zhì)，但是，由于入榨前，油料未經(jīng)高溫蒸炒處理，雖然避免了有害物質(zhì)的生成，但也使得油料中的油脂無(wú)法充分的以游離態(tài)存在，不容易在壓榨過(guò)程中提取出來(lái)，造成了出油率低的難題，導(dǎo)致生產(chǎn)陳本的提升，回榨雖然可在一定程度上提升冷榨工藝的出油率，但也存在問(wèn)題，經(jīng)回榨后，雖然出油率有所提高，但與此同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量的降低，無(wú)法從根本上降低生產(chǎn)成本，且由于采用回榨工藝，回榨油色澤加深，也無(wú)法保證油脂品質(zhì)，不能從根本上解決低出油率的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明涉及固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理油料冷榨提油領(lǐng)域，通過(guò)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的溫度、含水量、發(fā)酵時(shí)間、接種量等條件，結(jié)合添加金屬離子和碳源、氮源流加處理，提升微生物發(fā)酵破除油料作物細(xì)胞壁的能力，進(jìn)而提升壓榨出油率，達(dá)到改善油料作物特別是低含油率油料作物冷榨工藝出油率低的目的，降低冷榨提油的生產(chǎn)成本，提升油脂品質(zhì)，并獲得具有較高利用價(jià)值的副產(chǎn)物餅柏蛋白。
[0010]本發(fā)明采用流加預(yù)處理大豆片固態(tài)發(fā)酵輔助冷榨提油工藝包括以下步驟:一、將50g大豆片清理后裝入500ml三角瓶?jī)?nèi)，滅菌；二、調(diào)配滅菌后的基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分，添加微量元素 Mg2+、Zn2+、Fe2+、K+,添加比例為 Mg2+ 25.30mg/kg、Zn2+ 10.36mg/kg、Fe2+ 5.55mg/kg、K+ 14.95mg/kg ;三、種子液制備,發(fā)酵菌株選用少孢根霉,菌株采用平板分離的方式進(jìn)行活化，后挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于培養(yǎng)斜面，斜面與平板選用PDA培養(yǎng)基，制備方法如下:土豆洗凈去皮，稱取100g切成小塊，加蒸餾水煮沸20— 30min，以8層紗布過(guò)濾后加熱，加瓊脂10g，繼續(xù)加熱攪拌混勻，瓊脂完全溶解后，加葡萄糖10g，攪拌溶解后補(bǔ)足蒸餾水至500ml，分裝后，121 °C滅菌20min后，取出冷卻凝固備用。液體種子培養(yǎng)基:土豆洗凈去皮，稱取100g切成小塊，加蒸餾水煮沸20— 30min，以8層紗布過(guò)濾后加熱，加葡萄糖10g，攪拌溶解后補(bǔ)足蒸餾水至500ml，分裝于500ml三角瓶?jī)?nèi)，100ml/瓶，密封后，121°C下滅菌20min備用，冷卻后接入斜面培養(yǎng)的少孢根霉，以接種針挑取斜面菌株2— 3環(huán)，密封后于恒溫水浴震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件35~37°C搖床200rpm/min培養(yǎng)16 — 24h ;四、調(diào)整固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基基質(zhì)水分，水分添加量為基質(zhì)干重的25% — 30%，接入種子液并添加初始濃度的碳源與氮源，在37°C下于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)開(kāi)始發(fā)酵；碳源選擇葡萄糖，氮源選擇蛋白胨，碳源、氮源的初始添加量分別為基質(zhì)干重的4%和0.5%，種子液添加量為基質(zhì)干重的6—10% ;五、后續(xù)采用流加方式逐步添加碳源與氮源，碳源初始添加量為4% (占基質(zhì)干重)添加方式為二次補(bǔ)加，發(fā)酵到12h進(jìn)行一次補(bǔ)加，補(bǔ)加碳源含量至占基質(zhì)干重的6%，發(fā)酵進(jìn)行到24h進(jìn)行第二次補(bǔ)加，補(bǔ)加碳源含量至占基質(zhì)干重的8% ;氮源的初始添加量為0.5% (占基質(zhì)干重)，添加方式為分三次補(bǔ)加，發(fā)酵到12h進(jìn)行一次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的1%，發(fā)酵進(jìn)行到24h進(jìn)行第二次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的1.5%，發(fā)酵進(jìn)行到36h進(jìn)行第三次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的2%，繼續(xù)12h完成發(fā)酵。改變溫度至酶解溫度45°C，繼續(xù)酶解12h對(duì)物料進(jìn)行酶解。
[0011]發(fā)酵后對(duì)發(fā)酵物料進(jìn)行烘干，置于恒溫干燥箱內(nèi)50°C持續(xù)烘干24h，，烘干至12h翻攪物料使烘干均勻，于50°C條件下投入冷榨機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷榨，以有機(jī)溶劑浸提壓榨后餅柏測(cè)定殘油量為26.4% (占原料總含油量比例);以未經(jīng)發(fā)酵處理的豆片作為對(duì)照組，測(cè)定殘油為38%，結(jié)果顯示發(fā)酵處理后的豆片相比于未經(jīng)發(fā)酵處理的豆片冷榨出油率提高了 11.6個(gè)百分點(diǎn)。
[0012]本工藝通過(guò)對(duì)冷榨物料進(jìn)行壓榨前的預(yù)處理，使得入榨物料中的自由態(tài)存在的油脂比例大大增加 ，提升了冷榨工藝的提油率，與傳統(tǒng)冷榨方式相比，降低了冷榨油的生產(chǎn)成本，冷榨避免了熱榨工藝造成的餅柏蛋白極度變性造成的浪費(fèi)，經(jīng)過(guò)本工藝壓榨出的豆柏，具有相對(duì)較高的NSI值，經(jīng)檢測(cè)在47% — 50%，榨出油避免了浸提工藝溶劑殘留的缺點(diǎn)，基本不需進(jìn)一步精煉即可達(dá)到食用品質(zhì)，進(jìn)一步降低了油脂提取的成本，是一條極具開(kāi)發(fā)潛力的高品質(zhì)油脂制取工藝途徑，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0013]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1是本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖。
[0014]5【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】一:本發(fā)明流加預(yù)處理大豆片固態(tài)發(fā)酵輔助冷榨提油工藝包括以下步驟:一、將50g豆片清理后裝入500ml三角瓶?jī)?nèi)，滅菌；二、調(diào)配滅菌后的基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分，添加微量兀素 Mg、Zn、Fe、K,添加比例為 Mg2+ (15 ~35mg/kg)、Zn2+ (6 ~14mg/kg)、Fe2+(4.5~6.5mg/kg)、K+ (5~25mg/kg);三、種子液制備,發(fā)酵菌株選用少孢根霉,菌株采用平板分離的方式進(jìn)行活化，后挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于斜面，斜面與平板選用PDA培養(yǎng)基，制備方法如下:土豆洗凈去皮，稱取100g切成小塊,加蒸懼水煮沸20—30min,以8層紗布過(guò)濾后加熱，加瓊脂IOg,繼續(xù)加熱攪拌混勻，瓊脂完全溶解后，加葡萄糖IOg,攪拌溶解后補(bǔ)足蒸餾水至500ml，分裝后，121°C滅菌20min后，取出冷卻凝固備用；液體種子培養(yǎng)基:土豆洗凈去皮，稱取100g切成小塊，加蒸餾水煮沸20— 30min，以8層紗布過(guò)濾后加熱，加葡萄糖10g，攪拌溶解后補(bǔ)足蒸餾水至500ml，分裝于500ml三角瓶?jī)?nèi)，100ml/瓶，密封后，121°C下滅菌20min備用，冷卻后接入斜面培養(yǎng)的少孢根霉，以接種針挑取斜面菌株2—3環(huán)，密封后于恒溫水浴震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件35~37°C搖床200rpm/min培養(yǎng)16 — 24h備用；四、調(diào)整基質(zhì)水分，水分添加量為基質(zhì)干重的25% — 30%，接入種子液并添加初始濃度的碳源與氮源，在37°C下于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)開(kāi)始發(fā)酵，碳源選擇葡萄糖，氮源選擇蛋白胨，碳源初始添加量為4% (占基質(zhì)干重)添加方式為二次補(bǔ)加，發(fā)酵到12h進(jìn)行一次補(bǔ)加，補(bǔ)加碳源含量至占基質(zhì)干重的6%，發(fā)酵進(jìn)行到24h進(jìn)行第二次補(bǔ)加，補(bǔ)加碳源含量至占基質(zhì)干重的8% ;氮源的初始添加量為0.5% (占基質(zhì)干重)，添加方式為分三次補(bǔ)加，發(fā)酵到12h進(jìn)行一次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的1%，發(fā)酵進(jìn)行到24h進(jìn)行第二次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的1.5%，發(fā)酵進(jìn)行到36h進(jìn)行第三次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的2%。繼續(xù)發(fā)酵12h完成發(fā)酵。調(diào)節(jié)溫度至45°C，繼續(xù)發(fā)酵12h完成酶解。
[0015]本實(shí)施方式中，蛋白酶活性達(dá)2610U/ml，纖維素酶性達(dá)到11016U/ml。發(fā)酵物料在50°C下烘干至水分含量4% — 6%后，將發(fā)酵后物料投入冷榨機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷榨，壓榨溫度55°C，壓榨后采用有機(jī)溶劑浸提法測(cè)定壓榨后餅柏殘油量為26.4% (占原料總含油量比例)，提油率73.6% ；以未經(jīng)發(fā)酵處理的大豆片為對(duì)照組，對(duì)照組冷榨出油率為62%，結(jié)果表明冷榨提油率提升了 11.6個(gè)百分點(diǎn)；所得壓榨油色澤金黃，具有特殊的柔和香氣。
[0016]【具體實(shí)施方式】二:發(fā)酵溫度條件單因素實(shí)驗(yàn):在20%水分添加量、接種量5%、發(fā)酵時(shí)間48h條件下，分別在33°C、35°C、37°C、39°C、41°C條件下進(jìn)行發(fā)酵，以纖維素酶為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定蛋白酶酶活性，發(fā)酵至48h測(cè)定酶活性，其他發(fā)酵條件不變的條件下，于37°C下纖維素酶活性與蛋白酶活性峰值分別為6223Uml與1568U/ml，所以適宜的發(fā)酵溫度應(yīng)在37 °C。
[0017]【具體實(shí)施方式】三:發(fā)酵水分添加量單因素實(shí)驗(yàn):于25%、27%、29%、31%、33%水分添加量、37°C、接種量5%條件下，發(fā)酵至48h后，測(cè)定纖維素酶與蛋白酶活性，結(jié)果顯示纖維素酶與蛋白酶活性峰值分別出現(xiàn)于31%水分添加量與29%水分添加量，分別為5233U/ml、1431U/ml，所以適宜的水分添加量應(yīng)在29% — 31%。
[0018]【具體實(shí)施方式】四:發(fā)酵種子`液接種量單因素實(shí)驗(yàn):接種量于6%、7%、8%、9%、10% 5個(gè)水平下分別進(jìn)行發(fā)酵，水分添加量30%、溫度37°C，結(jié)果顯示纖維素酶與蛋白酶活性峰值在該5個(gè)水平下，分別在5600U/ml — 5640U/ml、1510U/ml — 1540U/ml范圍內(nèi)，變化較小，說(shuō)明在該范圍內(nèi)，種子液接種量水平對(duì)酶活性影響較小，所以適宜的接種量應(yīng)在6 —10%。
[0019]【具體實(shí)施方式】五:發(fā)酵時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn):于45h、47h、49h、51h、53h5個(gè)時(shí)間水平下進(jìn)行發(fā)酵，水分添加量30%、接種量6%、溫度37°C，結(jié)果顯示纖維素酶活性與蛋白酶活性峰值分別為5263U/ml、1420U/ml，分別出現(xiàn)于49h與47h，所以適宜的發(fā)酵時(shí)間應(yīng)在47h — 49h之間。
[0020]【具體實(shí)施方式】六:響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn):采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，溫度條件因素水平為:33°C、35°C、37°C、39°C、41°C ;水分添加量因素水平為:25%、27%、29%、31%、33% ;種子液接種量因素水平為:6%、7%、8%、9%、10% ;發(fā)酵時(shí)間因素水平為:45h、47h、49h、51h、53h，優(yōu)化結(jié)果顯示，在各因素相互作用條件下，采用聯(lián)合求解方法獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為:產(chǎn)酶時(shí)間為49.16h，水分添加量為29.96%，發(fā)酵溫度為37.23°C，接種量為8.01%，在此條件下，此時(shí)獲得蛋白酶酶活性為1743.96U/ml，纖維素酶酶活性為7219.25U/ml。
[0021]【具體實(shí)施方式】七:微量元素添加量響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn):發(fā)酵條件為:產(chǎn)酶時(shí)間為49.16h，水分添加量為29.96%，發(fā)酵溫度為37.23°C，接種量為8.01%。基質(zhì)內(nèi)添加微量元素為:]\%、2]1、卩6、1(,]\%2+添加量水平:15 (mg/kg)、20 (mg/kg)、25 (mg/kg)、30 (mg/kg)、35(mg/kg);Zn2+兀素添加量水平:6 (mg/kg)>8 (mg/kg)、10 (mg/kg)、12 (mg/kg)、14 (mg/kg)；Fe2+兀素添加量水平:4.5 (mg/kg)、5.0 (mg/kg)、5.5 (mg/kg)、6.0 (mg/kg)、6.5 (mg/kg)；K+兀素添加量水平 5 (mg/kg)、10 (mg/kg)、15 (mg/kg)、20 (mg/kg)、25 (mg/kg)。米用中心組合實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，采用聯(lián)合求解方法獲得微量元素添加量為Mg2+ (25.30mg/kg)> Zn2+ (10.36mg/kg)、Fe2+ (5.55mg/kg)、K+ (14.95mg/kg),在此條件下獲得纖維素酶活性峰值8530.64U/ml，蛋白酶活性峰值2122.84U/ml。
[0022]【具體實(shí)施方式】八:碳源選擇單因素試驗(yàn):備選碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖，發(fā)酵條件與【具體實(shí)施方式】六優(yōu)化后的條件相同，分別向基質(zhì)內(nèi)添加葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖，添加量分別為基質(zhì)干重的8%，結(jié)果顯示纖維素酶與蛋白酶活性峰值出現(xiàn)在添加葡萄糖的實(shí)驗(yàn)組，分別為6454U/ml與1456U/ml。所以外加碳源選擇葡萄糖。
[0023]【具體實(shí)施方式】九:氮源選擇單因素試驗(yàn):備選氮源為蛋白胨、牛肉膏、脲素、硝酸銨，添加量分別為基質(zhì)干重的2%，結(jié)果顯示纖維素酶與蛋白酶活性峰值出現(xiàn)在添加蛋白胨的實(shí)驗(yàn)組，分別為6136U/ml、1568U/ml。所以外加氮源選擇蛋白胨。
[0024]【具體實(shí)施方式】十:雙流加發(fā)酵試驗(yàn)方案:碳源、氮源采用流加的方式逐步加入培養(yǎng)基內(nèi)，外加碳源選用葡萄糖，外加氮源選用蛋白胨，以補(bǔ)加的方式進(jìn)行流加，具體為以下步驟:碳源的初始添加量為基質(zhì)干重的4%，添加方式為分二次補(bǔ)加，發(fā)酵到12h進(jìn)行一次補(bǔ)加，補(bǔ)加碳源含量至占基質(zhì)干重的6%，發(fā)酵進(jìn)行到24h進(jìn)行第二次補(bǔ)加，補(bǔ)加碳源含量至占基質(zhì)干重的8% ;氮源的初始添加量為0.5%，添加方式為分三次補(bǔ)加，發(fā)酵到12h進(jìn)行一次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的1%，發(fā)酵進(jìn)行到24h進(jìn)行第二次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的1.5%，發(fā)酵進(jìn)行到36h進(jìn)行第三次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的2%，繼續(xù)發(fā)酵12h完成發(fā)酵；對(duì) 照組采用直接添加氮源與碳源分別至基質(zhì)干重的8%與2%的實(shí)驗(yàn)組；兩組試驗(yàn)采用相同發(fā)酵條件發(fā)酵溫度35°C、水分添加量20%、發(fā)酵時(shí)間48h，種子液接種量10% ;結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組纖維素酶活性6332U/ml高于實(shí)驗(yàn)組纖維素酶活性4824U/ml，實(shí)驗(yàn)組蛋白酶活性1688U/m高于實(shí)驗(yàn)組蛋白酶活性1320U/m。所以碳源氮源采取流加的方式進(jìn)行添加。
[0025]【具體實(shí)施方式】十一:在本實(shí)施方式中，發(fā)酵條件與【具體實(shí)施方式】六獲得的優(yōu)化條件相同，微量元素成分與【具體實(shí)施方式】七獲得的優(yōu)化條件相同，碳源氮源的添加方式與【具體實(shí)施方式】十相同，結(jié)果表明纖維素酶性達(dá)到11016U/ml，蛋白酶活性達(dá)2610U/ml。
[0026]【具體實(shí)施方式】十二:酶解溫度試驗(yàn)方案:在實(shí)施方式十一結(jié)束后，進(jìn)行酶解溫度單因素試驗(yàn):于35°C、40°C、450C、50°C、55°C條件下進(jìn)行酶解12h，酶解結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵后物料進(jìn)行烘干，采用冷榨設(shè)備對(duì)發(fā)酵處理烘干后的物料進(jìn)行壓榨提油，以油脂提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用索氏抽提浸提壓榨餅柏測(cè)定油脂殘油率，五組壓榨殘油率分別為29.7%、28.4%,26.4%,27.1%、30.6%，結(jié)果表明，在45°C酶解條件下，餅柏殘油率為26.4%最低，以不經(jīng)發(fā)酵處理的原料直接榨后的提油率為對(duì)照組，對(duì)照組殘油率為38%，試驗(yàn)組油脂提取率比對(duì)照組提升了 11.6個(gè)百分點(diǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種提升菌株在固態(tài)發(fā)酵中所產(chǎn)酶活輔助提升冷榨提油出油率的工藝技術(shù)，其特征在于包括以下步驟:(I)利用市售大豆或大豆片作為發(fā)酵基質(zhì)，清理后的原料分裝滅菌；(2)調(diào)配發(fā)酵基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分，添加微量元素，接種菌株種子液，并流加碳源、氮源進(jìn)行發(fā)酵；(3)發(fā)酵結(jié)束后烘干發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行冷榨提油。
2.權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:步驟(1)中，所用原料為市售大豆片，也可用花生、芝麻、亞麻籽、向日葵等其他食用油料作物進(jìn)行發(fā)酵；權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:發(fā)酵原料分裝于500ml三角瓶中，裝量50g，高壓滅菌鍋內(nèi)于121 °C下滅菌15~20min，或采用其他滅菌方式至等效滅菌強(qiáng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:所述步驟(2)中，發(fā)酵條件為:產(chǎn)酶時(shí)間為49.16h，水分添加量為29.96%，發(fā)酵溫度為37.23°C，接種量為8.01% ;微量元素添加比例分別為:Mg2+ (25.30mg/kg)、Zn2+ (10.36mg/kg)、Fe2+ (5.55mg/kg)、K+ (14.95mg/kg)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所采用的發(fā)酵菌株為少孢根霉，采用平板分離對(duì)菌株進(jìn)行分離活化后接種于PDA斜面固體培養(yǎng)基，種子液采用PDA液體培養(yǎng)基；PDA固體培養(yǎng)基:土豆洗凈去皮，稱取100g切成小塊，加蒸餾水煮沸20—30min,以8層紗布過(guò)濾后加熱,加瓊脂IOg,繼續(xù)加熱攪拌混勻，瓊脂完全溶解后,加葡萄糖10g，攪拌溶解后補(bǔ)足蒸餾水至500ml，分裝后121°C滅菌20min后，取出冷卻凝固備用；PDA液體培養(yǎng)基:土豆洗凈去皮，稱取100g切成小塊，加蒸餾水煮沸20— 30min，以8層紗布過(guò)濾后加熱，加葡萄糖10g，攪拌溶解后補(bǔ)足蒸餾水至500ml，分裝于500ml三角瓶?jī)?nèi)，100ml/瓶，密封后，121°C下滅菌20min備用，從少孢根霉斜面培養(yǎng)基挑取2~3環(huán)純化菌體接入PDA液體種子培養(yǎng)基，于35~37°C搖床200rpm/min培養(yǎng)16 — 24h后備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:所述步驟(2)中，碳源氮源采用流加的方式逐步加入培養(yǎng)基內(nèi)，外加碳源選用葡萄糖，外加氮源選用蛋白胨，以補(bǔ)加的方式進(jìn)行流加，具體為以下步 驟:碳源的初始添加量為基質(zhì)干重的4%，添加方式為分二次補(bǔ)加，發(fā)酵到12h進(jìn)行一次補(bǔ)加，補(bǔ)加碳源含量至占基質(zhì)干重的6%，發(fā)酵進(jìn)行到24h進(jìn)行第二次補(bǔ)加，補(bǔ)加碳源含量至占基質(zhì)干重的8% ;氮源的初始添加量為0.5%，添加方式為分三次補(bǔ)加，發(fā)酵到12h進(jìn)行一次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的1%，發(fā)酵進(jìn)行到24h進(jìn)行第二次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的1.5%，發(fā)酵進(jìn)行到36h進(jìn)行第三次補(bǔ)加，補(bǔ)加氮源含量至占基質(zhì)干重的2%，繼續(xù)12h完成發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:所述步驟(2)中，發(fā)酵結(jié)束后，改變溫度至45 °C，繼續(xù)對(duì)物料進(jìn)行酶解12h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:所述步驟(3)中，烘干采取50°C，于恒溫干燥箱內(nèi)連續(xù)烘干24h后，投入冷榨機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷榨。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:所述步驟(2)中，發(fā)酵進(jìn)行至48h后，測(cè)定纖維素酶活達(dá)到11016U/ml，蛋白酶活性達(dá)到2610U/ml，溶劑浸提壓榨后餅柏殘油為26.4%，同時(shí)壓榨未經(jīng)發(fā)酵處理的豆片，測(cè)定殘油為38%，相比之下，經(jīng)發(fā)酵預(yù)處理的豆片冷榨出油率提高了 11.6個(gè)百分點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于:所得壓榨油色澤金黃，具有類似芝麻油的特殊香氣，無(wú)豆腥味，品質(zhì)均一穩(wěn)定。
10.權(quán)利要求1一9任意一項(xiàng)所述工藝方法制備的植物油脂。
【文檔編號(hào)】C11B1/06GK103627513SQ201310630696
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】江連洲, 徐速, 藺健學(xué), 于殿宇, 李楊, 王中江, 齊寶坤, 孫慧, 許亮 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)